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ARTIGOS DE PESQUISA

Cite como: C. Maucourant et ai., Sei. Immunol.

10.1126/sciimmunol.abd6832 (2020).

CORONAVÍRUS

Imunótipos de células natural killer relacionados à

gravidade da doença COVID-19
Christopher Maucourant1 *, Iva Filipovic1 *, Andrea Ponzetta1 *, Soo Aleman2,3, Martin Cornillet1, Laura Hertwig1 ,
Benedict Strunz1 , Antonio Lentini4, Björn Reinius4, Demi Brownlie1 , Angélica Cuapio Gomez1, Eivind
Heggernes Ask5,6, Ryan M. Hull7 , Álvaro Haroun-Izquierdo1 , Marie Schaffer 1, Jonas Klingström1 , Elin
Folkesson2,8, Marcus Buggert1 , Johann K. Sandberg1, Lars I. Eriksson9,10, Olav Rooyackers10,11, Hans-
Ramo de urze1, Karl-Johan Malmberg1,5,6, Jakob Michaëlsson1 , Christopher
, Nicole Marquardt1 , Gustaf Quirin Hammer1
Strålin2,3, Niklas K. Björkström1 †; e o Grupo de Estudo Karolinska COVID-19‡
1 Centro de Medicina Infecciosa, Departamento de Medicina Huddinge, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, Estocolmo, Suécia. 2Departamento de Doenças
Infecciosas, Hospital Universitário Karolinska, Estocolmo, Suécia. 3 Divisão de Doenças Infecciosas e Dermatologia, Departamento de Medicina Huddinge, Karolinska Institutet,
Estocolmo, Suécia. 4Departamento de Bioquímica Médica e Biofísica, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suécia. 5Departamento de Imunologia do Câncer, Instituto de Pesquisa
do Câncer, Hospital Universitário de Oslo, Oslo, Noruega. 6KG Jebsen Center for Cancer Imunoterapia, Instituto de Medicina Clínica, Universidade de Oslo, Oslo, Noruega.
7 SciLifeLab, Departamento de Microbiologia, Tumor e Biologia Celular, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suécia. 8Divisão de Doenças Infecciosas, Departamento
de Medicina Solna, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suécia. 9Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Seção de Anestesiologia e Terapia Intensiva, Karolinska Institutet,
Estocolmo, Suécia. 10Function Perioperative Medicine and Intensive Care, Karolinska University Hospital, Estocolmo, Suécia. 11Departamento de Intervenções Clínicas e
Tecnologia CLINTEC, Divisão de Anestesiologia e Terapia Intensiva, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suécia.

* Contribuições iguais.

† Autor correspondente. E-mail: niklas.bjorkstrom@ki.se

‡Os membros do Karolinska COVID-19 Study Group podem ser encontrados no final dos Agradecimentos.

Compreender as respostas imunes inatas no COVID-19 é importante para decifrar os mecanismos das
respostas do hospedeiro e interpretar a patogênese da doença. As células natural killer (NK) são linfócitos
efetores inatos que respondem a infecções virais agudas, mas também podem contribuir para a imunopatologia.
Usando citometria de fluxo de 28 cores, revelamos aqui uma forte ativação de células NK em subconjuntos distintos
no sangue periférico de pacientes com COVID-19. Esse padrão foi espelhado nas assinaturas de scRNA-seq de
células NK no lavado broncoalveolar de pacientes com COVID-19. A análise de alta dimensão não supervisionada
de células NK do sangue periférico identificou, além disso, imunotipos distintos de células NK que estavam ligados
à gravidade da doença. As características desses imunotipos foram a alta expressão de perforina, NKG2C e Ksp37,
refletindo o aumento da presença de células NK adaptativas na circulação de pacientes com doença grave.
Finalmente, o armamento de células NK CD56bright foi observado em todos os estados de doença COVID-19,
impulsionado por uma rede definida de interação proteína-proteína de fatores solúveis inflamatórios. Este estudo
fornece um mapa detalhado do cenário de ativação de células NK na doença COVID-19.

INTRODUÇÃO 9), muito menos se sabe sobre as respostas iniciais de linfócitos

A pandemia de SARS-CoV-2 em curso está apresentando à inatos à infecção por SARS-CoV-2 e como elas se relacionam com
população humana desafios profundos. O SARS-CoV-2 pode as respostas do hospedeiro e a progressão da doença. Neste
causar a doença COVID-19, que nos piores casos leva a estudo, avaliamos a ativação de células natural killer (NK) no
manifestações graves, como síndrome do desconforto respiratório contexto da infecção por SARS-CoV-2 e da doença COVID-19 resultante.
agudo (SDRA), falência de múltiplos órgãos e morte (1). Essas As células NK são linfócitos efetores inatos que são tipicamente
manifestações podem ser causadas por respostas imunes divididos em células NK produtoras de citocinas CD56bright e
hiperativadas e mal direcionadas. De fato, altos níveis de IL-6 e células NK CD56dim citotóxicas ( 10). A evidência de um papel
uma tempestade de citocinas resultante na ausência de respostas direto das células NK na proteção contra infecções virais vem de
apropriadas de interferon tipo I e III associam-se à doença grave pacientes com deficiências seletivas de células NK, pois estes
de COVID-19 (1-6). Considerando que relatórios emergentes desenvolvem infecções virais fulminantes, predominantemente com
sugerem que a imunidade protetora é formada em pacientes vírus do herpes (11, 12). As células NK humanas também
convalescentes com anticorpos neutralizantes e células T específicasdemonstraram
para SARS-CoV-2 (7– rapidamente durante a fase aguda de infecções em
responder

Primeiro lançamento: 21 de agosto de 2020 immunology.sciencemag.org (Números de página não definitivos no momento do primeiro lançamento) 1
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hantavírus, vírus da encefalite transmitida por carrapatos, vírus influenza A (IAV)
e vírus da dengue, bem como após a vacinação com febre amarela viva atenuada
(13-16). As células NK não apenas têm a capacidade de atingir e matar
diretamente as células infectadas, mas também podem influenciar as respostas
adaptativas das células T. De fato, o grau de ativação das células NK pode
funcionar como um reostato na regulação das células T, onde um certo nível de
ativação das células NK pode promover o controle da infecção enquanto outro
grau de ativação está relacionado à imunopatologia (17). Comparado ao sangue
periférico, o pulmão humano é enriquecido em células NK (16, 18, 19). As células
NK do pulmão humano apresentam um fenótipo diferenciado e também têm a
capacidade de responder a infecções virais, como IAV (16, 18, 19).
No COVID-19, estudos emergentes relataram baixo número de células NK no
sangue periférico em pacientes com doença moderada e grave (4, 20-23).
Curiosamente, dois relatórios recentes avaliando a paisagem de células únicas
de células imunes no líquido de lavagem broncoalveolar (LBA) de pacientes com
COVID-19 sugeriram que o número de células NK está aumentado neste local
de infecção (24, 25). No entanto, um mapa detalhado do cenário de células NK
na infecção clínica por SARS-CoV-2 ainda não foi estabelecido.
Dado o importante papel das células NK em infecções virais agudas, sua
presença relativamente alta no tecido pulmonar, bem como as ligações entre a
ativação das células NK, as respostas das células T e o desenvolvimento de
imunopatologia, aqui realizamos uma avaliação detalhada das células NK em
pacientes com doença COVID-19 moderada e grave. Usando critérios rigorosos
de inclusão e exclusão, os pacientes com doença COVID-19 moderada e grave
foram recrutados no início da doença, amostrados para sangue periférico e
analisados por citometria de fluxo de 28 cores para avaliar a ativação das células
NK, educação e presença de NK adaptativo células. Os resultados obtidos são
discutidos em relação ao papel das respostas das células NK na infecção aguda
por SARS-CoV-2 e na imunopatogênese da doença COVID-19 associada.
RESULTADOS
Desenho do estudo, coorte clínica e ativação geral de células NK em
COVID-19
Vinte e sete pacientes internados com doença de COVID-19 (10 moderados
e 17 graves) foram recrutados prospectivamente após a admissão no Hospital
Universitário Karolinska como parte de um esforço maior de atlas de células
imunes (Karolinska COVID-19 Im mune Atlas). Critérios rigorosos de inclusão e
exclusão foram usados para garantir a configuração de coortes homogêneas de
pacientes, incluindo o tempo desde o início dos sintomas em relação à admissão
hospitalar e o estadiamento da gravidade da doença (Fig. 1, A e B). Dezessete
controles saudáveis que eram soronegativos para SARS-CoV-2 IgG e sem
sintomas no momento da amostragem foram incluídos como controles.
Para minimizar a variabilidade interexperimental e os efeitos de lote entre
pacientes e controles, todas as amostras (n = 44) foram adquiridas, processadas
e analisadas frescas em três semanas consecutivas em abril e maio de 2020, no
pico da pandemia de COVID-19 em Estocolmo, Suécia (Fig. 1B). Mais detalhado
Primeiro lançamento: 21 de agosto de 2020 immunology.sciencemag.org
as características do paciente são fornecidas nos Materiais e Métodos e nas
tabelas S1 e S2.
Para estudar a resposta das células NK, as células mononu claras do
sangue periférico foram analisadas com um painel de citometria de fluxo focado
nas células NK de 28 cores (tabela S3, estratégia de bloqueio na fig S1A).
Nenhuma alteração nas porcentagens totais de células NK, ou a porcentagem
de células NK CD56dim e CD56bright foi observada em pacientes comparados
aos controles. No entanto, as contagens absolutas de células NK totais, CD56dim
e células NK CD56bright foram severamente reduzidas em pacientes em
comparação com controles (Fig. 1C, fig. S1A). A ativação das células NK foi
avaliada analisando a expressão de Ki-67, HLA-DR e CD69 (Fig. 1D). Uma
ativação robusta de células NK foi observada em pacientes com COVID-19, onde
o grau de ativação foi semelhante em pacientes moderados e graves (Fig. 1, E e
F).
As células NK CD56dim sofrem diferenciação contínua a partir de células
NKG2A+ e CD62L+ menos diferenciadas em transição para células NK CD57+
mais terminalmente diferenciadas (26, 27). Uma porcentagem maior de NKG2A+
e CD62L+
As células NK CD56dim expressaram Ki67 em comparação com as células
NKG2A- e CD62L- em pacientes com COVID-19 (Fig. 1, G e H). Uma análise
booleana subsequente, levando simultaneamente em consideração os padrões
de coexpressão de NKG2A, CD62L e CD57, revelou que a resposta das células
NK em pacientes com COVID-19 ocorreu principalmente entre as células NK
CD62L+ menos diferenciadas (fig. S1B).
Em conjunto, usando critérios rigorosos de inclusão e exclusão e
recrutamento de pacientes durante um período de tempo definido, obtivemos
uma coorte bem controlada de pacientes com COVID-19 moderado e grave. As
células NK do sangue periférico nesses pacientes foram ativadas de forma
robusta em comparação com controles saudáveis. O grau geral de ativação, no
entanto, não foi diretamente associado à gravidade da doença.
Avaliação fenotípica de células NK em COVID-19
Em seguida, realizamos uma avaliação fenotípica detalhada das células NK
CD56bright e CD56dim nos pacientes com COVID-19. Por análise de
componentes principais (PCA) de células CD56bright (incluindo 26 parâmetros
fenotípicos) e CD56dim NK (27 parâmetros fenotípicos), os pacientes foram
agrupados separadamente dos controles saudáveis (Fig. 2, A e B). Isso foi, entre
outros marcadores fenotípicos, impulsionado por alterações na expressão de
CD98, Ki-67 e Ksp37 em CD56bright (fig. S2A) e Tim-3, CD98, CD38, CD69 e
Ksp37 em células CD56dim NK (fig. S2B). A análise de citometria de fluxo por
gating manual revelou ainda maior expressão de perforina, Ksp37, MIP-1ÿ, CD98,
Tim-3 e granzima B em células NK CD56bright de pacientes com COVID-19,
bem como CD98, Tim-3, NKG2C, MIP-1ÿ e CD62L, entre outros marcadores, em
células CD56dim NK (Fig. 2, C e D, fig. S2, C e D). De acordo com o perfil de
ativação (Fig. 1, E e F), o PCA não destacou uma separação óbvia entre
pacientes COVID-19 moderados e graves (Fig. 2B), e resultados semelhantes
foram obtidos quando o agrupamento hierárquico não supervisionado foi realizado
usando expressão de todos os fenotípicos estudados
(Números de página não finais no momento do primeiro lançamento) 2
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marcadores dentro de células NK CD56bright e CD56dim (Fig. 2, E e F).
É importante notar que o agrupamento distinguiu claramente os controles
saudáveis dos pacientes com COVID-19. Finalmente, os fenótipos de
células NK respondentes (Ki -67 positivo) em comparação com não
respondentes (Ki-67 negativos) foram comparados. Esta análise revelou
que as células NK CD56bright responsivas coexpressaram níveis mais
altos de granzima B, CD25, HLA-DR e Ksp37 quando comparadas às
células não responsivas e que as células NK CD56dim responsivas
expressaram níveis mais altos de Tim-3 e HLA-DR ( fig. S2E).
O status ativado das células NK também foi confirmado no lavado
broncoalveolar (LBA) de pacientes com COVID-19 por análise de dados
de sequenciamento de RNA de célula única publicamente disponíveis
(scRNA-seq) (Fig. 2, G e H, fig. S2F) (24 ). O agrupamento de genes
diferencialmente expressos (DEGs) em pacientes moderados e graves,
seguido de análise de enriquecimento da ontologia gênica de DEGs,
revelou seis módulos de genes distintos onde as funções efetoras/
quimiotaxia, ativação/proliferação e resposta de interferon foram
enriquecidas em pacientes em comparação com controles ( FIG.
2I, fig. S2, G e H, tabela S4). Curiosamente, a resposta do interferon e
assinaturas de ativação/proliferação foram mais enriquecidas em células
BAL NK de pacientes com doença moderada, enquanto pacientes graves
tiveram uma assinatura gênica de função efetora mais alta (Fig. 2I, fig.
S2, G e H). A análise de enriquecimento do conjunto de genes destacou
ainda mais as células NK do fluido BAL de pacientes graves para exibir
um perfil ativado e inflamado (Fig. 2J, fig. S2I). Finalmente, várias das
proteínas que foram aumentadas nas células NK do sangue periférico de
pacientes com COVID-19 (Fig. 2, CF, fig. S2, C e D) também foram
identificadas como DEGs em células NK BAL de pacientes com COVID-19
em comparação para controles, incluindo GZMB (granzima B), PRF1
(perforina), HAVCR2 (Tim-3) e CCL4 (MIP-1ÿ) (Fig. 2K).
Em resumo, as células NK CD56bright e CD56dim do sangue
periférico exibiram um fenótipo efetor ativado de natureza semelhante na células NK adaptativas (Fig. 3E) (30, 32). A expansão de células NK
doença COVID-19 moderada e grave, e isso pode ser corroborado pela
análise das células NK do líquido BAL de pacientes com COVID-19.
Impacto da expressão de KIR e educação de células NK na resposta
de células NK COVID-19
A função das células NK CD56dim é regulada por receptores
inibitórios. Subconjuntos dessas células que expressam receptores
inibitórios na presença de ligantes auto-HLA classe I são educados e,
portanto, mais funcionais (28, 29). Em seguida, avaliamos o impacto da
expressão de KIRs inibitórios e NKG2A, bem como da educação das
células NK na resposta aguda ao COVID-19 (fig. S3A, tabela S5). Não
foram encontradas diferenças significativas nas frações de células NK
que expressam diferentes combinações de KIRs inibitórios e NKG2A em
pacientes com COVID-19 em comparação com os controles (fig. S3B).
Além disso, o tamanho dos subconjuntos de células NK CD56dim
educados por meio de KIRs ou NKG2A também foi semelhante em
pacientes e controles (fig. S3C). Finalmente, avaliamos a resposta das
células NK medindo a regulação positiva de Ki-67 em subconjuntos de
células NK CD56dim, seja apenas com base na expressão de KIR e NKG2A pacientes
Primeiro lançamento: 21 de agosto de 2020 immunology.sciencemag.org
integrando informações sobre haplótipos de ligantes de MHC classe I
(fig. S3, DF). Essa comparação indicou que a resposta das células NK
no COVID-19 agudo ocorreu independentemente da expressão inibitória
de KIR e do status de educação das células NK.
Aumento da frequência de células NK adaptativas em COVID-19
grave Nossas análises até agora revelaram ativação robusta de células
NK com um fenótipo efetor em pacientes com COVID-19. A resposta
apareceu em grande parte independente da gravidade da doença, pois
poucas diferenças foram observadas ao comparar pacientes moderados
e graves. No entanto, notamos que pacientes graves apresentavam
frequências aumentadas de células NKG2C+ NK (fig. S2D). Isso indicou
uma frequência aumentada de células NK adaptativas, que são
frequentemente associadas à infecção por CMV e podem se expandir
quando pacientes soropositivos para CMV sofrem outras infecções virais
agudas graves (13, 30, 31). As células NK adaptativas são caracterizadas
por uma assinatura fenotípica terminalmente diferenciada, e a grande
maioria delas coexpressa NKG2C e CD57 (30).
Em pacientes graves, mas não moderados com COVID-19, detectamos
frequências mais altas de células NKG2C+CD57+ CD56dim NK, em
comparação com controles saudáveis (Fig. 3, A e B). Além disso,
enquanto o número absoluto de células NKG2C CD57- diminuiu em
pacientes com COVID-19, as células NKG2C+CD57+ NK permaneceram
estáveis mesmo em pacientes com doença grave (Fig. 3, C e D). Uma
análise fenotípica mais profunda de células NKG2C+CD57+ NK, em
comparação com suas contrapartes NKG2C CD57- , destacou a
modulação de vários marcadores relacionados à maturação e ativação,
por exemplo NKG2A e CD38 (Fig. 3E, fig S4A). Ao aplicar um limite
arbitrário com base na porcentagem de células NKG2C+CD57+ NK sobre
a população CD56dim (aqui definido como > 5%, fig. S4B), fomos capazes
de identificar pacientes em que as células NKG2C+CD57+ NK exibiram
um padrão fenotípico amplamente sobreposto com o observado em
adaptativas foi confinada a indivíduos soropositivos para CMV (Fig. 3F,
tabela S5).
Nossa estratégia para identificar expansões no grupo controle saudável
menor mostrou boa correspondência com um estudo anterior avaliando
expansões semelhantes em uma grande coorte de mais de 150 indivíduos
saudáveis (Fig. 3G) (30). Surpreendentemente, aproximadamente dois
terços dos pacientes COVID-19 graves soropositivos para CMV tinham
uma população de células NK adaptativas tão expandida em comparação
com um terço nos controles e ainda menos nos pacientes COVID-19
moderados (Fig. 3, F e G, fig. S4C). Treze dos 16 pacientes graves com
COVID-19 foram negativos para DNA de CMV no soro (tabela S5),
indicando que a proporção aumentada de células NK adaptativas em
pacientes graves não dependeu da reativação de CMV secundária ao
COVID-19. De acordo com essa hipótese, nem a porcentagem nem as
contagens absolutas, ou a fração de células NKG2C+CD57+ em
proliferação mostraram qualquer correlação com os níveis de IgG de
CMV detectados nos soros dos pacientes (fig.
S4D e tabela S5). Notavelmente, o quadro clínico foi semelhante em
ou também graves
por com e sem expansões de células NK adaptativas
(Números de página não definitivos no momento do primeiro lançamento) 3
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(fig. S4, EF, tabela S6, S7).
As células NKG2C+CD57+ NK encontradas em pacientes com
COVID-19 apresentaram sinais de proliferação, embora em níveis mais
baixos em comparação com as células NKG2C CD57- NK (Fig. 3, H e I, fig. S4,esteróides,
HJ).
As células NKG2C+CD57+ NK que responderam expressaram níveis mais
altos de HLA-DR, CD38, CD62L e MIP-1ÿ, mas mostraram menor
expressão de NKG2A, NKG2D, TIGIT e CD25 em comparação com as
células NKG2C+CD57+ não responsivas (Fig. 3J, fig. S4K).
Em seguida, nos propusemos a abordar mais especificamente o que estava
impulsionando o surgimento de expansões adaptativas de células NK. A
reanálise dos dados publicados de scRNA-seq revelou que os tipos de
células imunes e não imunes apresentaram expressão regulada de genes
que codificam HLA-E e HLA-A, B e C no líquido BAL de pacientes com
COVID-19 moderados e graves em comparação aos controles (Fig. 3K e
fig. S4L). O número de células NKG2C+CD57+ NK foi inversamente
correlacionado com vários fatores solúveis, incluindo LT-ÿ, IL-12ÿ, IFN-ÿ e
anfirregulina (AREG) (Fig.
3L). No entanto, ao comparar especificamente os fatores solúveis em
pacientes graves com e sem expansões, apenas um número limitado de
fatores foi expresso diferencialmente (fig. S4M). Em consonância com isso,
as associações entre características fenotípicas e fatores solúveis foram
na maioria dos casos semelhantes para células NK adaptativas e não
adaptativas (fig. S4N).
Em conjunto, a doença COVID-19 grave, mas não moderada, está
associada a frequências mais altas de células NK adaptativas que exibem
sinais de proliferação e ativação sem reativação simultânea de CMV
detectável.
Análise de redução de dimensionalidade de células NK separa
pacientes graves de moderados
Exceto pelas expansões de células NK adaptativas serem mais
prevalentes em pacientes graves com COVID-19, a análise de citometria
de fluxo baseada em gating manual não identificou características
específicas para pacientes com COVID-19 moderados ou graves. Em uma
tentativa adicional de identificar tais características por meio de uma
abordagem não supervisionada, realizamos análise de Aproximação e
Projeção de Manifold Uniforme (UMAP) em todos os pacientes e controles (Fig.
4, A e B, fig. S5). Isso revelou regiões topológicas distintas entre pacientes características de expansões de células NK adaptativas que também
e controles (Fig. 4A). Aplicamos o Pheno Graph às nossas amostras para
descrever melhor as subpopulações de células NK e quantificar as
diferenças em sua abundância relativa entre os grupos de pacientes com
COVID-19. O agrupamento PhenoGraph identificou 36 agrupamentos
distintos (Fig. 4C). Aproximadamente metade desses grupos foi igualmente
compartilhada entre controles e pacientes moderados e graves (Fig. 4D), e
alguns grupos foram específicos do paciente. Além disso, essa análise
também revelou clusters que continham células NK predominantemente de
controles, pacientes com COVID-19 moderados ou graves (Fig. 4, C e D).
O fenótipo de células NK em clusters com abundância relativa semelhante
nos três grupos foi homogêneo, mas maiores diferenças foram observadas
ao avaliar clusters única e significativamente enriquecidos em pacientes
moderados ou graves (Fig. 4, E e F, fig. S5D).
Primeiro lançamento: 21 de agosto de 2020 immunology.sciencemag.org
Em seguida, cada agrupamento do PhenoGraph foi estratificado
dentro dos pacientes com base em seis parâmetros categóricos clínicos
(viremia, soroconversão, necessidade de oxigênio, tratamento com
comorbidades subjacentes e desfecho) (Fig. 4G) da mesma
maneira que as categorias de pacientes moderados e graves foram
definidas (Materiais e métodos). Aqui, a maioria dos agrupamentos mostrou
uma abundância relativa significativamente diferente entre as categorias
de pacientes e controles saudáveis em pelo menos um dos grupos de
pacientes definidos por parâmetros clínicos (Fig. 4G, fig. S6A, tabela S8).
Importante, para alguns clusters, as abundâncias relativas foram diferentes
dependendo do parâmetro clínico. Essa abordagem foi fundamental para
nossa compreensão, pois nos permitiu deixar de olhar para a gravidade da
doença como um todo e, em vez disso, analisar os parâmetros clínicos
definidores separadamente.
Por exemplo, o cluster 21 com alta expressão de CD25 e CD98 (Fig. 4H)
estava quase completamente ausente dos pacientes que estavam em
ventilação mecânica e dos que morreram de COVID-19. Por outro lado, o
cluster 22 que expressa CD69 e os quatro clusters que mais expressam
Ki-67 representaram uma porcentagem semelhante em todas as categorias
de pacientes em nosso conjunto de dados (Fig. 4H, fig. S6, BF). O
agrupamento hierárquico da abundância relativa dos agrupamentos do
PhenoGraph em todos os parâmetros categóricos clínicos revelou a
presença de dois “imunotipos” nos pacientes. Um deles continha parâmetros
categóricos atribuídos ao curso mais leve da doença, e o outro foi
enriquecido para viremia, doenças crônicas subjacentes, tratamento com
esteróides, ventilação mecânica e desfecho fatal (fig.
4I). De fato, um agrupamento semelhante foi obtido quando o status da
doença moderada e grave foi incluído (fig. S6G). Finalmente, foram
avaliados os fenótipos de células NK associados à doença moderada
(imunotipo 1) versus grave (imunotipo 2). Isso revelou MIP-1ÿ, CD98 e
TIGIT regulados positivamente no imunotipo moderado e, inversamente,
alta expressão de perforina, NKG2C e Ksp37 no imunotipo grave, enquanto
os marcadores de ativação Ki67 e CD69 permaneceram inalterados (Fig.
4J). Curiosamente, alta perforina, NKG2C e Ksp37 são
estavam associadas a doença grave (Fig. 3).
Em resumo, a análise de alta dimensão não supervisionada da resposta
das células NK no COVID-19 separa os fenótipos das células NK associados
à gravidade da doença.
O armamento de células NK CD56bright está associado à gravidade
da doença
Por fim, realizamos uma análise mais detalhada da resposta das
células NK em relação aos parâmetros laboratoriais clínicos e sistemas de
pontuação clínica. A PCA de pacientes moderados e graves com base em
parâmetros laboratoriais clínicos revelou separação entre os dois grupos
(fig. 5A). Isso foi impulsionado principalmente por altos níveis sistêmicos
de neutrófilos, IL-6, D-dímero e proteína C reativa, dados laboratoriais
clínicos tipicamente associados a doença grave (Fig. 5B). Fora dos
parâmetros fenotípicos de células NK alterados (Fig. 2, fig. S2), os níveis
de expressão de
(Números de página não definitivos no momento do primeiro lançamento) 4
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perforina e granzima B em células NK CD56bright correlacionadas com os
níveis de IL-6 nos pacientes (Fig. 5C). Perforina em CD56bright
As células NK nos pacientes com COVID-19 também se correlacionaram
positivamente com a Avaliação de Falha de Órgão Sequencial (SOFA) e
pontuações SOFA R, bem como a contagem de neutrófilos e negativamente
com a relação PaO2/FiO2 (Fig. 5D). Da mesma forma, pacientes com viremia
de SARS-CoV-2 em curso no soro também apresentaram maior expressão de
perforina de células NK CD56bright , e esses pacientes virêmicos tiveram
doença mais grave (fig S7A). A regulação positiva de perforina e granzima B
em células NK CD56bright (Fig. 2) foi ainda positivamente associada a uma
ativação geral e regulação ascendente de moléculas efetoras dentro de
CD56bright e CD56dim
células NK e inversamente correlacionadas com a expressão da molécula
inibitória do check-point TIGIT (Fig. 5E, fig. S7, B e C). Como tal, a associação
com alta perforina estava de acordo com o imunotipo grave identificado por
meio de análise de alta dimensão não supervisionada (Fig. 4).
Assim, a integração de parâmetros laboratoriais clínicos na análise
fenotípica de células NK revelou que o armamento de células CD56bright com
moléculas citotóxicas se correlacionou com parâmetros associados a um curso
grave da doença.
Rede de interação proteína-proteína que conduz CD56bright
Armamento de células NK em
COVID-19 Para entender melhor o significado do fenótipo de células NK
CD56bright ativado e sua associação com a gravidade da doença, aproveitamos células NK não tenha sido realizada na infecção aguda por SARS CoV-2
uma extensa caracterização de proteínas séricas solúveis que foram realizadas
nos mesmos 27 pacientes por meio do Karolinska COVID -19 Esforço do Atlas
Imune. Dos 276 fatores solúveis quantificados, as concentrações de 58 foram
significativamente associadas à expressão de perforina e granzima B em
células CD56bright e 9 mostraram correlações fortes, principalmente positivas
(fig. S7D). Para entender a base biológica da assinatura de proteína periférica
que se correlacionou com a ativação de células NK CD56bright , analisamos
as redes de interação proteína-proteína. Identificamos 337 interações (tabela
S9) que foram integradas em uma rede de 959 elementos (nós, Fig. 5F, tabela
S10). Muitos deles relacionados a infecções virais, sugerindo redundância
entre diferentes infecções virais no modo de ativação de células NK (Fig. 5G,
tabela S11). Além disso, foram identificadas várias vias de sinalização distintas
potencialmente envolvidas na condução da resposta das células NK CD56bright
no COVID-19, juntamente com os fatores solúveis (Fig. 5H, fig. S7F, tabela
S11). Isso incluiu sinalização NF-ÿB, PI3K-Akt e FoxO (Fig. 5H). Ao todo,
nossos achados indicam que as vias de ativação NK podem ser compartilhadas
com outras infecções virais, conectando traços fenotípicos específicos de
células NK a componentes do meio inflamatório sistêmico relacionado à
patogênese da doença COVID-19.
DISCUSSÃO
Usando citometria de fluxo de alta dimensão, integração de análise de
fator solúvel e complementando com a análise
Primeiro lançamento: 21 de agosto de 2020 immunology.sciencemag.org
de dados de scRNA-seq publicamente disponíveis, aqui caracterizamos a
resposta das células NK hospedeiras à infecção por SARS-CoV-2 em pacientes
com COVID-19 moderados e graves na circulação.
Os resultados revelaram baixo número de células NK, mas um fenótipo de
células NK fortemente ativado em pacientes com COVID-19. Os estados de
ativação das células NK do sangue periférico foram espelhados nas assinaturas
transcricionais das células NK BAL de pacientes com COVID-19 de outra
coorte (24). Além disso, a análise de alta dimensão não supervisionada revelou
aglomerados de células NK que estavam ligadas ao estado da doença.
Finalmente, hiperinflamação grave, definida por parâmetros clínicos, foi
associada a uma alta presença de expansões de células NK adaptativas e
armamento de CD56bright
células NK. Essas alterações imunes sistêmicas foram ligadas a uma rede de
interação de proteína de fator solúvel exibindo uma assinatura de ativação
viral canônica, bem como vias de sinalização distintas. Ao todo, os resultados
fornecem um mapa abrangente do cenário das respostas das células NK no
SARS-CoV-2 em pacientes infectados com COVID-19 nos estágios iniciais da
doença e fornecem informações sobre as respostas do hospedeiro em relação
a infecções virais e patologia de doenças associadas.
Sabe-se que as células NK respondem rapidamente durante diversas
infecções virais agudas em humanos, incluindo aquelas causadas pelo vírus
da dengue, hantavírus, vírus da encefalite transmitida por carrapatos e vírus
da febre amarela (13-15, 33). Embora uma análise igualmente detalhada das
causando COVID-19, os primeiros relatórios da pandemia indicaram baixo
número de células NK circulantes em pacientes com doença moderada e grave
(20, 21, 23) . Esses relatórios estão de acordo com o que é relatado aqui.
Números de células NK reduzidos transitoriamente durante a fase aguda das
infecções também foram demonstrados na infecção por SARS-CoV-1 (34) e
na infecção aguda por hantavírus (13). A magnitude da presente resposta de
células NK detectada, com um quarto das células circulantes exibindo sinais
de proliferação ou ativação, reflete as respostas observadas durante a dengue
aguda, bem como na infecção aguda por hantavírus (13, 14). A avaliação
fenotípica presente em profundidade das células NK em pacientes com
COVID-19 moderado e grave revelou um fenótipo ativado com níveis regulados
para cima de moléculas efetoras e quimiocinas, receptores de ativação e
receptores de nutrientes. Também observamos sinais de regulação positiva do
receptor de check-point imunológico inibitório através do aumento dos níveis
de TIGIT e Tim-3. Como tal, os presentes resultados confirmam e estendem, a
nível proteico, o que foi relatado recentemente para células NK de sangue
periférico usando sequenciamento de RNA de célula única (20).
As células NK humanas são enriquecidas no pulmão em comparação
com o sangue periférico (18, 19). Os pacientes com COVID-19 apresentam
ativação imunológica significativa no trato respiratório, onde a doença
moderada está associada a um alto número de células T e células NK,
enquanto neutrófilos e monócitos inflamatórios são enriquecidos nesses locais
em pacientes com doença grave (24, 25, 35 ). ). Ao analisar dados de scRNA-
seq publicamente disponíveis no BAL
(Números de página não definitivos no momento do primeiro lançamento) 5
Machine Translated by Google
Células NK de pacientes com COVID-19 (24), descobrimos que essas células são
fortemente ativadas. Curiosamente, a resposta do interferon parecia mais forte nas
células BAL NK de pacientes moderados com COVID-19. Isso está de acordo com o
COVID-19 grave associado a uma resposta de interferon embotada (6). Confirmamos
ainda que um fenótipo similarmente ativado de células NK estava presente no fluido BAL
como foi observado no sangue periférico, incluindo alta expressão de moléculas efetoras
e quimiocinas. O homing de células NK para o local da infecção é importante para a
eliminação de patógenos em modelos murinos, onde vários receptores de quimiocinas
demonstraram mediar o homing de tecido de células NK (36-
39). Os números reduzidos de células NK que observamos em circulação podem, até
certo ponto, refletir uma redistribuição para o pulmão. De fato, a quimiotaxia foi outro
módulo de ontologia gênica que, juntamente com a citotoxicidade, foi enriquecido em
células BAL NK de pacientes graves com COVID-19. Além disso, o líquido BAL de
pacientes com COVID-19 contém níveis elevados de quimiocinas que potencialmente
podem atrair células NK, incluindo CCL3, CCL3L1, CCL4, CXCL9, CXCL10 e CXCL11
(24). Trabalhos futuros devem dissecar o tráfico de células NK para o pulmão no COVID
19 com mais detalhes e em relação à gravidade da doença COVID-19.
Para esse fim, descobertas indiretas e relacionadas sugerem que as células NK podem
ter um papel na resposta imune inicial do hospedeiro para combater o SARS-CoV-2 no
local da infecção.
Esta é a primeira vez que um aumento de células NK adaptativas é descrito em
pacientes com COVID-19. Surpreendentemente, esse recurso foi encontrado quase
exclusivamente em pacientes infectados por SARS-CoV-2 com doença grave. A
porcentagem de expansões de células NK adaptativas na presente coorte de controle
saudável foi comparável a descobertas anteriores em coortes humanas soropositivas
para CMV saudáveis maiores (30, 40), fortalecendo nossas observações em pacientes
com COVID-19. A falta de qualquer correlação entre o surgimento de expansões de
células NK adaptativas e títulos de CMV IgG, bem como a ocorrência de reativação de
CMV devido a uma possível disfunção imune induzida por COVID-19 é digna de nota,
uma vez que as expansões de células NK adaptativas demonstraram estar associadas
com imunidade antiviral CMV (32, 40). A ausência de uma resposta imune direcionada
ao CMV em andamento é ainda corroborada pela falta de proliferação observada nas
células T CD8+ específicas do CMV em pacientes agudos com COVID-19 (8). De fato,
essas descobertas podem sugerir um envolvimento direto e específico do vírus de células
NK adaptativas durante a infecção por SARS-CoV-2, embora estudos futuros sejam
necessários para provar formalmente essas hipóteses. Além disso, trabalhos futuros
devem avaliar com mais detalhes o fenótipo e a função das células NK adaptativas no
COVID-19 em comparação com aquelas encontradas apenas em indivíduos soropositivos
para CMV, bem como a possível manutenção a longo prazo das células adaptativas após
a recuperação do SARS-CoV- 2 infecção.
Embora um estudo recente tenha relatado um aumento na expressão de NKG2C e
uma expressão diminuída correspondente do marcador relacionado à célula NK adaptativa
FcÿR1ÿ (41), nós aqui fornecemos uma dissecção profunda do fenótipo de célula NK
adaptativa,
Primeiro lançamento: 21 de agosto de 2020 immunology.sciencemag.org
destacando que, apesar de sua menor capacidade de resposta às citocinas (40), uma
porcentagem significativa de células NK adaptativas (até 45%) prolifera ativamente em
pacientes com COVID-19, embora a uma taxa menor em comparação com células NK
não adaptativas. Além disso, em contraste com a robusta redução numérica observada
de células NK não adaptativas, bem como em muitos outros subconjuntos de linfócitos
durante a infecção aguda por SARS-CoV-2 (42, 43), os números de células NK adaptativas
permaneceram inalterados no sangue periférico em se verdadeiros pacientes com
COVID-19. Isso sugere que seu acúmulo relativo no sangue durante a infecção por SARS-
CoV-2 pode estar relacionado à maior resistência à apoptose induzida por citocinas (40)
ou a uma sensibilidade diferente aos sinais quimiotáticos em comparação com as células
NK não adaptativas. De fato, células NK CD62L NKG2A- CD56dim mais maduras
expressam níveis mais altos de CX3CR1 em comparação com NKG2A+ e CD62L+ menos
maduras
Células NK CD56dim (44) e o ligante CX3CR1 CX3CL1 foi uma das poucas quimiocinas
que não foram induzidas no LBA de pacientes com COVID-19 (25). Por outro lado,
CXCR3, ligantes para os quais foram regulados positivamente no LBA de pacientes com
COVID-19 (24), é expresso em níveis baixos por células NK CD57+ CD56dim maduras
(45). Como as células NK CD56dim adaptativas exibem um fenótipo altamente maduro,
é provável que elas expressem CX3CR1 alto, mas CXCR3 baixo em comparação com
células NK CD56dim não adaptativas menos maduras e, portanto, podem ser mais
propensas a se manter em circulação.
As células NK adaptativas podem detectar células alvo via NKG2C reconhecendo
diretamente o HLA-E. Aqui, encontramos HLA E regulado positivamente em células
imunes e estromais no líquido BAL de pacientes com COVID-19, sugerindo uma
expansão de células NK adaptativas impulsionada por ligante de receptor. A expansão
de células NK adaptativas em pacientes soropositivos para CMV foi previamente relatada
na infecção aguda pelo hanta vírus (13), e foi associada à regulação positiva tanto do
MHC classe I quanto do HLA-E nas células infectadas pelo vírus. A ausência de fortes
ligações entre proteínas solúveis do soro e expansões adaptativas de células NK sugere
que seu fenótipo é, em vez disso, impulsionado por interações receptor-ligante no
COVID-19. De fato, na infecção por CMV, os peptídeos codificados por vírus apresentados
no HLA-E servem como um ativador chave das células NKG2C+ e, juntamente com as
citocinas, contribuem para sua expansão e diferenciação (46). Curiosamente, a potencial
relevância do eixo NKG2C-HLA-E no contexto da infecção por SARS-CoV-2 é destacada
por um estudo recente que mostra um aumento da prevalência da variante alélica
NKG2Cdel, associada a uma expressão reduzida de NKG2C, entre COVID grave -19
pacientes, em comparação com a população saudável (47). Além disso, uma maior
frequência do alelo HLA-E*0103 foi encontrada em pacientes internados em UTI da
mesma coorte. Em conjunto, nossa hipótese de trabalho é que uma porcentagem maior
de células NKG2C+ NK pode ser funcionalmente necessária para desencadear atividade
antiviral de células NK na infecção por SARS-CoV-2, particularmente em pacientes mais
graves, enquanto a predisposição genética leva à redução de NKG2C pode causar mais
(Números de página não finais no momento do primeiro lançamento) 6
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manifestações clínicas graves.
Incluímos viremia e outros dados categóricos clínicos que se associam à
gravidade da doença na análise UMAP de células NK em pacientes com
COVID-19. Essas naturezas de sinais imunológicos integrados nos permitiram,
sem conhecimento prévio do estágio da doença, identificar dois imunotipos
associados à gravidade do COVID-19 . O imunotipo associado à doença grave
apresentou alta expressão de perforina, Ksp37 e NKG2C. Isso corroborou nossa
descoberta de aumento de células NK adaptativas em COVID-19 grave, uma
vez que uma ligação entre NKG2C e gravidade da doença foi descoberta em
dois tipos independentes de análises. Da mesma forma, tanto a perforina quanto
a Ksp37 faziam parte do fenótipo composto de células NK CD56bright armadas
que encontramos associadas à doença grave e a análise de scRNA-seq
identificou a função efetora como o módulo de ontologia gênica mais altamente
detectado em pacientes graves. O papel exato do Ksp37 na resposta (adaptativa)
das células NK ao COVID-19 precisa ser determinado em estudos futuros. O
imunotipo ligado à doença moderada, por outro lado, foi associado à maior
expressão de MIP-1ÿ, CD98 e TIGIT. A associação entre alta expressão do
checkpoint inibitório TIGIT e doença moderada foi reforçada pelo fato de que o
fenótipo de células NK CD56bright armadas correlacionou- se negativamente
com a expressão de TIGIT. Trabalhos futuros devem abordar se a contenção de
células NK por pontos de verificação inibitórios pode ajudar a conter
hiperinflamação e doenças graves de COVID-19
facilidade.
Foi observada uma forte associação entre o armamento das células NK e
a gravidade da doença, que foi acoplada aos níveis de IL-6, mas também a
vários escores de gravidade clínica da doença. Nossa rede proteína-proteína
ligada a este armamento revelou que as interações ativas no COVID-19 foram
compartilhadas com outras infecções virais, como hepatite B e vírus influenza
A. Na mesma linha, o armamento de células NK CD56bright ocorreu
principalmente em pacientes com COVID-19 com viremia por SARS-CoV-2 em
andamento, sugerindo que este seja um recurso comum de resposta do
hospedeiro de células NK contra várias infecções virais. Além disso, a sinalização
de NF-ÿB foi fortemente enriquecida na rede proteína-proteína. A sinalização de
NF-ÿB é importante para a transcrição dos genes que codificam perforina e
granzima B em células NK (48, 49), possivelmente fornecendo um pool de
mRNAs que equipam CD56bright
Células NK com potencial de citotoxicidade (50) , bem como sinais finais de
citotoxicidade no reconhecimento da célula alvo (51). Por fim, IL-6 associou-se
à sinalização de PI3K-Akt e FoxO em células NK.
Ambas as vias são conhecidas por coordenar o ciclo celular e já foram relatadas
como ativadas em células NK durante a infecção aguda por dengue em humanos
(14). Ao todo, nossa análise de rede proteína-proteína de fatores solúveis
forneceu insights sobre características compartilhadas entre células NK ativadas
em diversas infecções virais, bem como vias de sinalização que contribuem para
o armamento de células NK CD56bright .
Embora certos aspectos da resposta das células NK,
Primeiro lançamento: 21 de agosto de 2020 immunology.sciencemag.org
incluindo o surgimento de expansões de células NK adaptativas e o armamento
de células NK CD56bright pareceram específicos para COVID-19 grave, a
contribuição dessas características para a patogênese da doença precisa ser
confirmada em relação aos altos níveis de citocinas pró-inflamatórias presentes
nesses pacientes (52). Assim, estudos futuros devem ter como objetivo avaliar
longitudinalmente a resposta das células NK desde muito cedo na fase aguda
da infecção e mapear simultaneamente outras células imunes inatas, como
monócitos e neutrófilos, que estão desreguladas na COVID-19 grave (52, 53) .
No geral, observamos uma resposta robusta das células NK à infecção por
SARS-CoV-2 e características específicas exclusivas da COVID-19 grave e
hiperinflamação, fornecendo uma base para entender o papel das células NK
em pacientes com COVID-19.
MATERIAIS E MÉTODOS
Características do paciente
Pacientes com SARS-CoV-2 RNA+ com doença COVID-19 moderada ou
grave internados no Hospital da Universidade Karolinska, Estocolmo, Suécia,
foram recrutados para o estudo.
Os pacientes com COVID-19 foram amostrados 5-24 dias após o sintoma e
0-8 dias após serem admitidos no hospital. Os pacientes classificados como
com doença moderada de COVID-19 tinham saturação de oxigênio de 90-94%
ou estavam recebendo 0,5-3 L/min de oxigênio na inclusão. Pacientes com
doença grave de COVID-19 foram tratados em unidade de terapia intensiva ou
unidade de alta dependência, necessitando de ventilação não invasiva ou
mecânica. Os pacientes incluídos tinham entre 18 e 78 anos. Para ambos os
grupos, foram excluídos os pacientes com doença maligna atual e/ou em
tratamento imunomodulador em andamento antes da internação. Os pacientes
foram ainda descritos pelo escore Se quential Organ Failure Assessment (SOFA)
(54) e pela escala ordinal do National Institute of Health (NIH) (55). Os controles
saudáveis eram soronegativos para SARS-CoV-2 IgG no momento da inclusão,
a idade média era de 50-59 anos e 11 de 17 eram do sexo masculino (65%).
Todas as análises laboratoriais clínicas, incluindo sorologia e PCR para CMV e
SARS-CoV-2, foram realizadas usando ensaios de rotina clínica nos laboratórios
clínicos do Hospital Universitário Karolinska, Estocolmo, Suécia. O estudo foi
aprovado pela Autoridade Sueca de Revisão Ética e todos os pacientes deram
o consentimento informado. Para informações clínicas detalhadas, consulte as
tabelas S1 e S2.
Preparação celular e citometria de fluxo
Amostras de sangue venoso foram coletadas em tubos de heparina e
células mononucleares de sangue periférico (PBMC) isoladas por centrifugação
em gradiente de Fi col. As PBMC foram posteriormente coradas frescas com a
mistura de anticorpos (para anticorpos ver tabela S3).
A discriminação de células vivas/mortas foi realizada usando corante de
viabilidade fixável (Invitrogen). As células foram permeabilizadas com o kit
Foxp3/Transcription Factor Staining (eBioscience). Após a coloração, as células
foram fixadas com paraformaldeído a 1% por duas horas antes de serem
adquiridas em um BD FACSsymphony com 355
(Números de página não definitivos no momento do primeiro lançamento) 7
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lasers nm, 405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm. Além disso, 50 ÿl de sangue
total de cada paciente e controle saudável foram usados com BD Trucount
Tubes para obter contagens absolutas de células NK no sangue de acordo
com as instruções do fabricante.
Análise de dados de citometria de fluxo
Os arquivos FCS3.0 foram exportados do FACSDiva e importados
para o FlowJo v.10.6.2 para análise posterior. Foram utilizados os
seguintes plugins: FlowAI (2.1), DownSample (3.2), UMAP (3.1),
PhenoGraph (2.4). Primeiro, os dados foram pré-processados usando
FlowAI (todas as verificações, segunda fração FR = 0,1, alfa FR = 0,01,
pontos de mudança máximos = 3, penalidade de ponto de mudança = 500,
lado de verificação de faixa dinâmica = ambos) para remover quaisquer
anomalias presentes em arquivos FCS. Em seguida, a matriz de
compensação para o painel de citometria de fluxo de 28 cores foi gerada
usando AutoSpill (56) e aplicada aos arquivos. O conjunto de dados como
tal foi usado para a análise a jusante tanto na análise manual quanto na
análise automatizada. Para a análise automatizada, os eventos foram
primeiro reduzidos da porta NK em todas as amostras usando DownSample
(fig. S5, A e B). Os valores categóricos dos parâmetros clínicos para cada
amostra foram adicionados às populações reduzidas como metadados
para permitir a identificação desses grupos, e estes foram então
concatenados para análise. O UMAP foi executado usando todos os
parâmetros do painel, exceto BV510 (Live/dead, CD14, CD15, CD19) e PE-
Cy5 (CD3). O Pheno Graph foi executado usando os mesmos parâmetros
do painel que UMAP (e k = 30). Quinze mil células/amostra foram
exportadas do portão NK, além de seis amostras de pacientes com menos
eventos onde todas as células foram retiradas. Ao atribuir grupos
categóricos formados por diferentes parâmetros clínicos, houve um número
ímpar de pacientes representados em cada grupo (por exemplo, 17
'controles saudáveis', 12 'virêmicos' e 12 'não virêmicos'). Grupos de
entrada super e sub-representados serão ponderados de forma semelhante
nos clusters de saída do PhenoGraph. Portanto, normalizamos os clusters
de saída do PhenoGraph para contabilizar o número total de células de
cada grupo de entrada.
Algumas figuras foram geradas em R (versões 3.6.0 e 3.6.1) com os
pacotes factoextra (v1.0.5), RColorBrewer (v1.1-2), ggplot2 (v3.2.1 e
v3.3.0), arrumador (v.1.0 .2), randomcoloR (v.1.1.0.1), reshape2 (v.1.4.3),
viridis (v.0.5.1) e pheatmap (v.10.12).
Genotipagem do ligante KIR
O DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) foi usado para extrair DNA
genômico do controle e do sangue total do paciente (coletado nos tubos
de sangue EDTA). O DNA foi extraído de 100 ÿl de sangue total de acordo
com as instruções do fabricante. O DNA foi precipitado a partir do eluato
obtido após a última etapa do protocolo DNeasy Blood & Tissue Kit, com
2,5x volume de etanol 100% e 0,1x volume de acetato de sódio 3M por
reação e lavado com etanol 70%. A concentração de DNA foi determinada
com Qubit 4. A genotipagem do ligante KIR foi realizada usando o kit de
ligante KIR HLA (Olerup
Primeiro lançamento: 21 de agosto de 2020 immunology.sciencemag.org
SSP/CareDx) de acordo com as instruções do fabricante.
Quantificação de proteínas séricas usando PEA
Soros de todos os pacientes foram avaliados para fatores solúveis
usando tecnologia de ensaio de extensão de proximidade (PEA, OLINK
AB, Uppsala), onde 276 fatores solúveis selecionados foram analisados.
Estratégia para identificar expansões de células NK adaptativas
Controles saudáveis soropositivos para CMV e pacientes com
COVID-19 exibindo mais de 5% de células NKG2C+CD57+ dentro de sua
população de células NK CD56dim foram considerados como tendo
expansões de células NK adaptativas (fig. S5a). Em todos os indivíduos
com expansões adaptativas, as células NK adaptativas apresentaram
frequências mais altas (> 20%) de CD57, CD38 ou KIRs simples em
comparação com as células NK não adaptativas (e também em um caso de NKG2A a
Um paciente apresentou percentual de células NK adaptativas inferior a
5% (3,64%), mas foi incluído no grupo de expansão, pois a coexpressão
dos demais marcadores fenotípicos (expressão diferencial de NKG2A,
CD57, CD38 e KIR) estava de acordo com o que foi descrito para células
NK adaptativas.
análise de dados scRNA-seq
Os dados de scRNA-seq pré-processados foram obtidos de um
conjunto de dados publicado (24). Os dados no formato h5 foram lidos
usando Seurat (v3.1.5) e depois filtrados para genes de variância zero e
fator de tamanho normalizado usando scater v1.12.2/scran v1.12.1. As
células T CD8 foram excluídas das análises de células NK a jusante com
base em k significa agrupamento de marcadores de células CD8 e NK do
conjunto de dados de referência de PBMC do atlas de células humanas
(57) seguido de renormalização dos dados. Os 1000 principais genes
altamente variáveis foram identificados usando scran (classificado por
variância biológica e FDR) e usados para redução de dimensionalidade
UMAP. A expressão diferencial em pares de genes detectados em pelo
menos 20% das células foi realizada usando MAST (v1.10.0) e os genes
com FDR < 10-3 em qualquer comparação foram agrupados em seis
clusters (determinados pela estatística de intervalo) por k- significa
agrupamento de escores Z. O enriquecimento de ontologia gênica de
clusters gênicos foi realizado usando testes de super-representação
PANTHER (versão 20200407) usando o banco de dados de ontologia
gênica 2020-03-23. O enriquecimento do conjunto de genes para conjuntos
de genes de assinatura de células NK da medula óssea e do sangue (58)
foi realizado usando MAST contra um modelo de controle de inicialização
(n = 100) dos dados e as estatísticas de teste foram combinadas usando o
método Stouffer. Os dados foram visualizados usando ComplexHeatmap
(v2.0.0) e ggplot2 (v3.2.1).
Análise de rede
Para análises de rede, foram usadas interações com curadoria de
literatura do banco de dados de interagentes do International Molecular
Exchange Consortium (IMEx), Innate DB. A análise da rede de interação
proteína proteína genérica foi realizada usando a rede Steiner Forest e
visualizada usando NetworkAna lyst3.0.
Análise estatística
A significância estatística foi determinada usando GraphPad
Prisma v8. Para comparações entre três grupos, one-way
(Números de página não definitivos no momento do primeiro lançamento) 8
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ANOVA e teste de Kruskal-Wallis seguido do teste de comparações múltiplas de Dunn foram
utilizados. Para dois grupos, foram realizados testes paramétricos ou não paramétricos
pareados ou não pareados. Quando indicado, o escore z da intensidade de fluorescência
mediana (MFI) ou da porcentagem da expressão do marcador foi ( ÿ )
calculado da seguinte forma: = , sendo x = escore bruto, ÿ = média da
distribuição amostral e ÿ = desvio padrão. Para as comparações categóricas, foi utilizado o
teste exato de Fisher. Agrupamentos significativos do PhenoGraph (P ÿ 0,05) foram
determinados por testes de ajuste do Qui-Quadrado comparando a abundância relativa de cada
grupo categórico em cada agrupamento individual do PhenoGraph em relação à entrada. Para
análise de citometria de fluxo, os dados de expressão para marcadores múltiplos (tanto MFI
quanto porcentagem de idade das células que expressam proteínas) derivados de portões
contendo menos de 100 eventos foram excluídos da análise. Ao analisar a porcentagem de
células que expressam Ki67, os dados derivados de portas contendo menos de 50 células
foram excluídos da análise. Mais detalhes sobre os testes estatísticos exatos usados são
mencionados nas respectivas legendas de texto/figura.
MATERIAIS SUPLEMENTARES
immunology.sciencemag.org/cgi/content/full/5/50/eabd6832/DC1
Fig. S1. Diferenciação de células NK na doença COVID-19
FIG. S2. Ativação de células NK na doença COVID-19
Fig. S3. Educação de KIRs e células NK na doença COVID-19
Fig. S4. Expansões adaptativas de células NK no COVID-19
Fig. S5. Estratégia para análise UMAP e expressão de marcadores representativos
Fig. S6. Clusters PhenoGraph selecionados e seus marcadores são expressos diferencialmente
em grupos de pacientes definidos por parâmetros clínicos
Fig. S7. Correlações entre armação de células CD56brightNK , fenótipo de células NK e
Fatores no COVID-19
Tabela S1. Características clínicas de pacientes com COVID-19
Tabela S2. Resultados laboratoriais clínicos de pacientes com COVID-19
Tabela S3. Painel de citometria de fluxo
Tabela S4. Análise de ontologia gênica de DEGs a partir de análise de scRNA-seq de células BAL NK em
COVID-19 (planilha Excel)
Tabela S5. Características do ligante KIR e CMV
Tabela S6. Resultados laboratoriais clínicos de todos os pacientes com e sem célula NK adaptativa
expansões
Tabela S7. Resultados laboratoriais clínicos de pacientes graves com e sem NK adaptativo
expansões celulares
Tabela S8. Análise da distribuição observada de agrupamentos PhenoGraph em toda clínica
grupos definidos por parâmetros
Tabela S9. Interações com curadoria de literatura do banco de dados de interatividade do International
Molecular Exchange Consortium (IMEx) (planilha do Excel)
Tabela S10. Nós e graus relacionados e intermediação (planilha do Excel)
Tabela S11. Visão geral dos caminhos KEGG (planilha Excel)
Tabela S12. Arquivo de dados brutos (planilha do Excel)
REFERÊNCIAS E NOTAS
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ACGJM, NM, KS, Recursos: SA, BR, EHA, LH, AHI, MS, JK, EF, MB, JKS, LIE, OR, HGL, KJM;
Israelow, T. Takahashi, M. Tokuyama, P. Lu , A. Venkataraman, A. Park, S. Mohanty, H. Wang,
Redação – Rascunho Original, NKB; Redação – Revisão e Edição, Todos os autores; Supervisão,
AL Wyllie, CBF Vogels, R. Earnest, S. Lapidus, IM Ott, AJ Moore, MC Muenker, JB Fournier, M.
NKB Interesses concorrentes: Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de
Campbell, CD Odio, UMA.
quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial
Casanovas-Massana, Yale IMPACT Team, R. Herbst, AC Shaw, R. Medzhitov, W.
conflito de interesses. KJM é um consultor científico e tem uma bolsa de pesquisa da Fate
L. Schulz, ND Grubaugh, C. Dela Cruz, S. Farhadian, AI Ko, SB Omer, A.
Therapeutics e é membro do Conselho Consultivo Científico da Vycellix, Inc. HGL é membro do
Iwasaki, Análises longitudinais revelam falha imunológica em COVID 19 grave. Nature 584,
conselho da XNK Therapeutics AB e Vycellix, Inc. Disponibilidade de dados: Dados de citometria
463-469 (2020).
de fluxo com curadoria será disponibilizado para exploração através do Atlas Imunológico
53. J. Schulte-Schrepping, N. Reusch, D. Paclik, D. Bassler, K. Schlickeiser, S. Schlickeiser, B. Zhang,
Karolinska COVID-19. Todos os outros dados necessários para avaliar as conclusões do artigo
B. Kramer, T. Krammer, S. Brumhard, S., Bonaguro L. , E. De Domenico, D Wendisch, Grasshoff
estão presentes no artigo ou nos Materiais Suplementares. Esta obra está licenciada sob uma
M, Kapellos TS, Beckstette M, Pecht T, Saglam A, Dietrich O. HE
licença Creative Commons Atribuição 4.0 Internacional (CC BY 4.0), que permite uso, distribuição
Mei, AR Schulz, C. Conrad, D. Kunkel, E. Vafadarnejad, C.-J. Xu, A. Horne, M.
e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.
Herbert, A. Drews, C. Thibeault, M. Pfeiffer, S. Hippenstiel, A. Hocke, H. Müller Redetzky, K.ÿM.
Para ver uma cópia desta licença, visite https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Esta
Heim, F. Machleidt, A. Uhrig, L. Bosquillon de Jarcy, L. Jürgens, M. Stegemann, CR Glösenkamp,
licença não se aplica a figuras/fotos/obras de arte ou outros conteúdos incluídos no artigo que
H.-D. Volk, C. Goffinet, M. Landthaler, E. Wyler, P. Georg, M. Schneider, C. Dang-Heine, N.
sejam creditados a terceiros; obter autorização do detentor dos direitos antes de usar tal material.
Neuwinger, K. Kappert, R. Tauber, V.
Os membros do Karolinska COVID-19 Study Group são: John Tyler Sandberg, Helena Bergsten,
Corman , Raabe J, Kaiser KM , Vinh MT , Rieke G, Meisel C, Ulas T, Becker M, Geffers R,
Niklas K Björkström, Susanna Brighenti, Marcus Buggert, Marta Butrym, Benedict Chambers,
Witzenrath M, Drosten C, Suttorp N, von Kalle C, F Kurth, K. Händler, JL Schultze, AC
Puran Chen, Martin Cornillet, Angelica Cuapio Gomez, Isabel Diaz Lozano, Majda Dzidic, Johanna
Aschenbrenner, Y. Li, J. Nattermann, B. Sawitzki, AE. Saliba,
Emgård, Malin Flodström Tullberg, Jean-Baptiste Gorin, Sara Gredmark Russ, Alvaro Haroun-
LE Sander; Iniciativa Deutsche COVID-19 OMICS (DeCOI), Severe COVID-19 é marcada por um
Izquierdo, Laura Hertwig, Sadaf Kalsum, Jonas Klingström, Efthymia Kokkinou, Egle Kvedaraite,
compartimento de células mieloides desregulado. Célula
Hans-Gustaf Ljunggren, Magdalini Lourda, Kimia T Maleki, Karl-Johan Malmberg, Jakob
10.1016/j.cell.2020.08.001 (2020). Medline
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Laura Palma Medina, Tiphaine Parrot, Lena Radler, Emma Ringqvist, Johan Sandberg, Takuya
Bauer, R. Bellomo, GR Bernard, J.-D. Chiche, CM Coopersmith, RS Hotchkiss, MM Levy, JC
Sekine, Tea Soini, Mattias Svensson, Janne Tynell , Andreas Von Kries, David Wullimann, André
Marshall, GS Martin, SM Opal, GD Rubenfeld, T. van der Poll, J.-L. Vincent, DC Angus, As
Perez-Potti, Olga Rivera-Ballesteros, Christopher Maucourant, Renata Varnaite, Mira Akber, Lena
Definições do Terceiro Consenso Internacional para Sepse e Choque Séptico, Sepse-3. JAMA
Berglin, Demi Brownlie, Marco Giulio Loreti, Ebba Sohlberg, Tobias Kammann, Elisabeth Hen
315, 801-810 (2016). doi:10.1001/jama.2016.0287 Medline
riksson, Nicole Marquardt, Kristoffer Strålin, Soo Aleman, Anders Sönneborg, Lena Dillner, Anna
Färnert, Hedvig Glans, Pontus Nauclér, Olav Rooyackers, Johan Mårtensson, Lars I Eriksson,
55. JH Beigel, KM Tomashek, LE Dodd, AK Mehta, BS Zingman, AC Kalil, E.
Björn Persson, Jonathan Grip e Christian Unge.
Hohmann, HY Chu, A. Luetkemeyer, S. Kline, D. Lopez de Castilla, RW Finberg, K. Dierberg, V.
Tapson, L. Hsieh, TF Patterson, R. Paredes, DA Sweeney, WR
Short, G. Touloumi, DC Lye, N. Ohmagari, M.-D. Oh, GM Ruiz-Palacios, T.
Benfield, G. Fätkenheuer, MG Kortepeter, RL Atmar, CB Creech, J. Lundgren, AG Babiker, S.
Pett, JD Neaton, TH Burgess, T. Bonnett, M. Green, M.
Makowski, A. Osinusi, S. Nayak, HC Lane, Membros do Grupo de Estudo ACTT-1,

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Enviado em 6 de julho de 2020

Aceito em 19 de agosto de 2020
Primeira versão publicada em 21 de agosto de 2020
10.1126/sciimmunol.abd6832

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Fig. 1. As células NK são ativadas de forma robusta na doença COVID-19 moderada e grave. (UMA)
Visão geral esquemática do desenho do estudo, critérios de inclusão e exclusão. (B) Swimmer plot do início
dos sintomas, admissão hospitalar e coleta de sangue em relação a outros eventos clínicos principais e
características clínicas. (C) Porcentagens e contagens absolutas de células NK e subconjuntos de células
NK para controles saudáveis (n = 17), moderados (n = 10) e graves (n = 15-16) pacientes com COVID-19.
(D) Gráficos de citometria de fluxo da expressão de Ki-67, HLA-DR e CD69 em células NK em um controle
saudável e um paciente com COVID-19. (E e F) Dados resumidos para expressão dos marcadores indicados
nas células (E) CD56bright e (F) CD56dim NK em controles saudáveis, pacientes com COVID-19 moderado
e grave. (G) Gráficos de citometria de fluxo da expressão de NKG2A, CD57 e CD62L em células CD56dim
NK. (H) Dados resumidos para a expressão de Ki-67, HLA-DR e CD69 nas células NKG2A+/ÿ, CD57+/ÿ ou
CD62L+/ÿ CD56dim NK de todos os pacientes com COVID-19 moderados e graves (n = 24-26). Em C e E,
teste de Kruskal-Wallis e teste de comparações múltiplas de Dunn; em H, teste de classificação sinalizada
com pares pareados de Wilcoxon. Os números nos gráficos de citometria de fluxo indicam a porcentagem,
as barras representam a mediana, *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

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Fig. 2. Análise detalhada da ativação de células NK na doença COVID-19. (A) Expressão de proteínas indicadas em células CD56dim NK. (B) PCA do
fenótipo de expressão proteica de células NK CD56bright e CD56dim em controles saudáveis, pacientes com COVID-19 moderado e grave. (C)
Expressão de proteínas indicadas em células NK CD56bright em controles saudáveis (n = 17), moderados (n = 10) e graves (n = 15) pacientes com
COVID-19. Todas as medições de citometria de fluxo, incluindo citocinas (MIP-1ÿ, IFN-ÿ) foram realizadas diretamente ex vivo sem estimulação
adicional. (D) Expressão de proteínas indicadas em células NK CD56dim em controles saudáveis (n = 17), moderados (n = 10) e graves (n = 16)
pacientes com COVID-19. (E e F) Mapas de calor de agrupamento hierárquico mostrando a expressão de proteínas indicadas em comparação com a

mediana de controles saudáveis em células NK (E) CD56bright e (F) CD56dim . (G) Estratégia para análise de scRNA-seq de células BAL NK de
controles e pacientes com COVID-19. (H) UMAP de dados de scRNA-seq para células BAL NK dos grupos indicados. (I) Mapa de calor de agrupamentos
de genes indicados após análise de enriquecimento de ontologia gênica em genes diferencialmente expressos. (J) Escores Z de conjuntos de genes de
células NK após análise de enriquecimento de conjuntos de genes. (K) Gráficos de violino de genes expressos diferencialmente indicados. Em C e D,
teste de Kruskal-Wallis e teste de comparações múltiplas de Dunn, as barras representam a mediana, *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

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Fig. 3. Aumento de células NK adaptativas na doença grave de COVID-19. (A) Expressão de CD57 e NKG2C
em células CD56dim NK nos grupos experimentais indicados. (B) Porcentagem de células NKG2C+CD57+ em
controles soropositivos para CMV (n = 11), moderados (n = 8) e graves (n = 15) pacientes com COVID-19. (C e D)
Contagens absolutas dos subconjuntos indicados em controles (n = 17), moderado (n = 10) e grave (n = 16)
Pacientes COVID-19. Quadrados e círculos representam indivíduos com e sem expansões adaptativas de
células NK, respectivamente. (E) Histogramas representativos da expressão proteica indicada em células
NKG2C+CD57+ e NKG2C CD57- CD56dim NK. (F e G) Indivíduos dos grupos indicados tendo ou não
expansões adaptativas de células NK. (H e I) Gráficos representativos e dados resumidos para a expressão de
Ki-67 em células NKG2C+CD57+ e NKG2C CD57- CD56dim em controles (n = 17) e pacientes com COVID-19
(n = 26). (J) Expressão z-score de proteínas indicadas em células NKG2C+CD57+ NK de controles (n = 10) e
pacientes com COVID-19 (n = 17). As caixas vermelhas destacam os marcadores com expressão
significativamente diferente na fração Ki67+ ou Ki67- . (K) Expressão de HLA-E a partir de dados de scRNA-seq
dos tipos de células indicados. (L) Correlação de Spearman entre os números de células NKG2C+CD57+
CD56dim NK e os fatores solúveis indicados em pacientes com COVID-19. Em BD, teste de Kruskal-Wallis
seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn, no teste exato de FG Fisher, no teste de postos
sinalizados de pares pareados IJ Wilcoxon e em K comparações pareadas (ver Materiais e Métodos). As barras
representam a mediana, *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

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Fig. 4. A análise automatizada de células NK em COVID-19 identifica 'imunotipos' putativos de NK diferencialmente enriquecidos em
dois grupos principais de pacientes. (A) UMAP de todos os eventos, de controles e pacientes, e de pacientes divididos em moderados
e graves. (B) Expressão representativa de marcadores fenotípicos em todas as células do UMAP. (C) Porcentagem de 36 agrupamentos
PhenoGraph dentro do total de células dos grupos indicados. (D) Abundância relativa de grupos de controle, moderados e graves
dentro de cada agrupamento do PhenoGraph. (E) Expressão de marcadores selecionados de agrupamentos representativos do
PhenoGraph que não exibiram abundância relativa diferencial significativa entre grupos saudáveis, moderados e graves (topo) e
agrupamentos significativos que eram mais abundantes em pacientes graves com COVID-19 (abaixo). (F)
Expressão de marcadores fenotípicos em clusters PhenoGraph (como coluna z-score de valores de expressão mediana).
(G) Porcentagem de aglomerados de células NK de pacientes com COVID-19 estratificados de acordo com os parâmetros categóricos
clínicos indicados. Círculos roxos com borda indicam agrupamentos significativos do PhenoGraph em uma comparação particular (p ÿ
0,05) e círculos cinza claro sem borda indicam agrupamentos não significativos (Materiais e Métodos, tabela S8).
As linhas verticais indicam comparações separadas. (H) Agrupamentos de PhenoGraph selecionados sobrepostos no UMAP, bem
como histogramas de citometria de fluxo representativos mostrando a expressão dos marcadores indicados dentro dos agrupamentos. (EU)
Agrupamento hierárquico de agrupamentos do PhenoGraph e parâmetros categóricos clínicos. O mapa de calor foi calculado como o
escore z da coluna de porcentagens de cluster. Os imunotipos NK putativos são indicados. (J) Expressão de marcadores de separação
e não separação dentro dos grupos de imunotipo 1 e 2 de células NK.

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Fig. 5. Armamento de células NK CD56bright associado à gravidade da doença COVID-19. (A) PCA de pacientes com
COVID-19 com base em parâmetros laboratoriais clínicos. (B) Gráfico de barras mostrando os parâmetros laboratoriais
clínicos que contribuem para a dimensão 1 (dim 1) em (A). (C) Correlações de Spearman entre os parâmetros fenotípicos
de células NK CD56bright indicados em pacientes com COVID-19 e níveis séricos de IL-6 (n = 24). (D) Correlações de
Spearman entre os parâmetros fenotípicos de células NK CD56bright indicados e os parâmetros clínicos (n = 25). (E)
Matriz de correlação mostrando correlações de Spearman entre a expressão de perforina e granzima (MFI) em células NK
CD56bright e os outros parâmetros fenotípicos de células NK indicados (n = 25). A cor indica o valor R e os asteriscos indicam os valore
(F) Topologia e conteúdo da rede de interação proteína-proteína impulsionada por fatores solúveis (sementes)
correlacionados com a expressão de perforina e granzima B em células NK CD56bright . Sobreposição de nós envolvidos
em (G) infecção viral e (H) vias de sinalização na rede de interação proteína-proteína identificada.

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Imunótipos de células natural killer relacionados à gravidade da doença COVID-19

Christopher Maucourant, Iva Filipovic, Andrea Ponzetta, Soo Aleman, Martin Cornillet, Laura Hertwig, Benedikt Strunz, Antonio
Lentini, Björn Reinius, Demi Brownlie, Angelica Cuapio Gomez, Eivind Heggernes Ask, Ryan M. Hull, Alvaro Haroun-Izquierdo, Marie Schaffer,
Jonas Klingström, Elin Folkesson, Marcus Buggert, Johan K. Sandberg, Lars I. Eriksson, Olav Rooyackers ,
Hans-Gustaf Ljunggren, Karl-Johan Malmberg, Jakob Michaëlsson, Nicole Marquardt, Quirin Hammer, Kristoffer Strålin, Niklas K.
Grupo de Estudo Björkström e Karolinska COVID-19

Sci. Immunol. 5, eabd6832.

DOI: 10.1126/sciimmunol.abd6832

FERRAMENTAS DE ARTIGO http://immunology.sciencemag.org/content/5/50/eabd6832

SUPLEMENTAR http://immunology.sciencemag.org/content/suppl/2020/08/20/5.50.eabd6832.DC1
MATERIAIS

REFERÊNCIAS Este artigo cita 54 artigos, 15 dos quais você pode acessar gratuitamente
http://immunology.sciencemag.org/content/5/50/eabd6832#BIBL

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Science Immunology (ISSN 2470-9468) é publicado pela American Association for the Advancement of Science, 1200 New
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