Tutorial 4
Objetivos:
1. estudar as micobactérias:
- estrutura e morfologia
- diagnósticos
- mecanismos de patogenicidade
- resposta imune
Referências:
- Microbiologia médica / Patrick R. Murray, Ken S.
Rosenthal, Michael A. Pfaller; [tradução Andreza
Martins]-7. ed. - Rio de Janeiro : Elsevier, 2014.
Micobactérias
- Bacilos aeróbios, imóveis, não formadores de esporos.
- A parede celular é rica em lipídios, o que torna a
superfície hidrofóbica e a micobactéria resistente a
vários desinfetantes e colorações comuns de laboratório.
- Uma vez corados, os bacilos não podem ser descorados
com soluções ácidas=> “bactérias ácido resistentes”.
- Muitas micobactérias crescem lentamente, dividindo-se
a cada 12-24 horas e requerendo um período de oito
semanas para que o crescimento seja detectado em
culturas de laboratório.
- Apesar da abundância de espécies de micobactérias,
apenas as seguintes espécies e grupos causam a maioria
das infecções humanas: M. tuberculosis, M. leprae,
complexo M. avium, M. kansasii, M. fortuitum, M.
chelonae e M. abscessus.
Fisiologia e Estrutura das Micobactérias
- As Mycobacterium são classificadas com base em:
- ácido resistência
- presença de ácidos micólicos contendo 70 a 90
carbonos
- alto conteúdo (61% a 71 mol%) de guanina mais
citosina (G+C) no ácido desoxirribonucleico
(DNA).
- Embora outras espécies de bactérias possam ser ácido
resistentes elas se coram menos intensamente (são
parcialmente ácido resistentes) e suas cadeias de ácidos
micólicos são mais curtas.
- Parede celular rica em lipídios. Essa parede celular é
responsável por muitas das propriedades características
da bactéria (p. ex., ácido resistente; crescimento lento;
resistência a detergentes, a antibióticos antibacterianos
comuns e à resposta imune do hospedeiro;
antigenicidade).
- Parede celular típica das Gram-positivas: uma
membrana plasmática interna recoberta por uma camada
espessa de peptidoglicano e ausência de membrana
externa.
- No entanto, a estrutura da parede celular das
micobactérias é mais complexa.
- Ancorados à parede celular estão proteínas, manosídios
de fosfatidilinositol e lipoarabinomanana (LAM).
- O LAM é funcionalmente relacionado aos
lipopolissacarídeos antigênicos O, presentes em outras
bactérias.
- Também encontram-se presentes lipídios, glicolipídios
e peptidoglicolipidios.
- Proteínas de transporte e porinas estão intercaladas por
todas as camadas da parede celular.
- As proteínas são antígenos que estimulam a resposta
imune celular do paciente à infecção.
- Preparações extraídas e parcialmente purificadas
desses derivados protéicos (derivados de proteína
purificada ou PPD) são utilizadas como reagentes de
testes de pele para medir a exposição a M. tuberculosis.
(A) membrana plasmática, (B) peptidoglicano, (C) arabinogalactana, (D)
lipoarabinomanana coberta por manose, (E) proteínas associadas à membrana
plasmática e à parede celular, (F) ácidos micólicos e (G) moléculas de
glicolipídios de superfície associadas aos ácidos micólicos.
- As colônias dessas micobactérias ou apresentam uma
coloração castanho-brilhante ou não são pigmentadas.
- As micobactérias pigmentadas produzem carotenóides
amarelos intensamente, que podem ser estimulados pela
exposição à luz (foto cromogênicos) ou produzidos na
ausência de luz (escotocromogênicos).
● foto cromógenos de crescimento lento)
 ● escotocromógenos de crescimento lento
● micobactérias não pigmentadas de crescimento
lento
● micobactérias de crescimento rápido
Micobactérias de Crescimento Lento
- Doenças como a AIDS, doenças malignas e
transplantes de órgãos com uso concomitante de
fármacos imunossupressores criaram uma população de
pacientes que são altamente suscetíveis aos organismos
com potencial de virulência relativamente baixo.
- Algumas micobactérias produzem doenças idênticas à
tuberculose pulmonar.
- Outras espécies causam infecções localizadas no tecido
linfático e outras, que crescem muito bem em
temperaturas frias, produzem principalmente infecções
cutâneas.
Micobactérias de Crescimento Rápido
- As espécies de crescimento rápido apresentam um
potencial de virulência relativamente baixo, coram-se de
forma irregular com as colorações tradicionais para
micobactérias e são mais suscetíveis aos antibióticos
antibacterianos “convencionais” do que aos fármacos
usados para tratar outras infecções causadas por
micobactérias.
- As micobactérias de crescimento rápido raramente
causam infecções disseminadas.
- Elas estão mais associadas a doenças que ocorrem após
as bactérias serem introduzidas em tecidos subcutâneos
profundos por trauma ou infecções iatrogênicas (p. ex.,
infecções associadas ao uso de cateter venoso, curativos
contaminados, dispositivos protéticos tais como válvula
cardíaca, diálise peritoneal ou broncoscopia).
- Infecções oportunistas em pacientes imunocompetentes
têm se tornado um lugar comum.
Diagnóstico Laboratorial
Imunodiagnóstico
● Teste cutâneo da tuberculina:
- O teste tradicional para avaliar a resposta do paciente à
exposição ao M. tuberculosis é o teste cutâneo da
tuberculina.
- A reatividade a uma injeção intradérmica de antígenos
micobacterianos pode diferenciar entre indivíduos
infectados e não infectados, com uma reação PPD
positiva desenvolvendo-se de três a quatro semanas após
exposição à M. tuberculosis.
- A única evidência de infecção por micobactérias na
maioria dos pacientes é uma reação positiva ao teste
cutâneo, que persiste por toda a vida, e a evidência
radiográfica de calcificação de granuloma nos pulmões
ou em outros órgãos.
- O antígeno tuberculina recomendado é um derivado de
proteína purificada (PPD) da parede celular da
micobactéria.
- No teste, uma quantidade específica de antígeno é
inoculada na camada intradérmica da pele do paciente.
- A reatividade do teste da pele (definida pelo diâmetro
da área de endurecimento da pele) é medida 48 horas
mais tarde.
- Os pacientes infectados por M. tuberculosis, podem
não apresentar uma resposta ao teste de pele da
tuberculina se eles forem anérgicos (não reativos a
antígenos; particularmente verdadeiro para pacientes
infectados pelo HIV).
- Desse modo, antígenos-controle devem sempre ser
utilizados com testes de tuberculina.
- Indivíduos de países em que a vacinação com M. bovis
atenuado (bacilo de Calmette-Guérin [BCG]) é
amplamente aplicada terão uma reação positiva ao teste
de pele.
● Ensaios de liberação de IFN-γ:
- Foram introduzidos como alternativas sensíveis e mais
específicas que o teste de pele PPD.
- Os testes usam imunoensaios para medir IFN-γ
produzido por células T sensibilizadas, estimuladas por
antígenos de M. tuberculosis.
- Se um indivíduo foi previamente infectado por M.
tuberculosis, a exposição aos antígenos específicos de
M. tuberculosis das células T sensibilizadas presentes no
sangue resulta na produção de IFN-γ.
- A reatividade à lepromina, que é preparada a partir de
M. leprae inativada, é viável para confirmar o
diagnóstico clínico da lepra tuberculóide.
- Um endurecimento papular se desenvolve de três a
quatro dias após a injeção intradérmica do antígeno.
- Esse teste não é útil para a identificação de pacientes
com lepra lepromatosa, pois estes são anérgicos ao
antígeno.
Microscopia
- É a maneira mais rápida de confirmar a doença causada
por micobactérias.
● Coloração de Ziehl-Neelsen (ácido resistência a
quente).
● Coloração de Kinyoun (acidorresistência a frio).
● Coloração ácido resistente do fluorocromo de
Truant.
- O espécime é corado com carbolfucsina (métodos de
Ziehl-Neelsen ou Kinyoun) ou com corantes
fluorescentes auramina-rodamina (método fluorocromo
de Truant), descorado com uma solução álcool-ácido e,
então, contrastado.
- Os espécimes são examinados ao microscópio óptico
ou, se corantes fluorescentes foram usados, ao
microscópio fluorescente.
- O método de fluorocromo é o mais sensível, porque o
espécime pode ser examinado rapidamente com aumento
baixo para pesquisa de áreas fluorescentes, e a presença
das bactérias ácido resistentes pode ser confirmada com
aumentos maiores.
- Bactérias ácido resistentes são detectadas por
microscopia em aproximadamente metade dos
espécimes positivos nas culturas.
- A sensibilidade deste teste é alta para espécimes
respiratórios (principalmente para pacientes com
evidência radiográfica de cavitação) e espécimes pelos
quais muitas colônias de micobactérias são isoladas em
cultura.
- Assim, uma reação positiva de coloração ácido
resistente corresponde a uma alta infectividade.
- A especificidade do teste é maior que 95% se realizado
cuidadosamente.
Testes com Ácidos Nucleicos
Testes de amplificação de ácidos nucleicos.
- Foram desenvolvidas técnicas para detectar sequências
específicas de ácidos nucleicos de micobactérias.
- Uma vez que apenas um número baixo de bactérias
pode estar presente, empresas comerciais desenvolveram
uma variedade de técnicas de amplificação de ácidos
nucleicos (p. ex., reação em cadeia da polimerase
[PCR]).
- Os testes comerciais atualmente utilizados são
específicos para M. tuberculosis e, relativamente, são
pouco sensíveis.
- Além disso, esses testes não podem ser utilizados para
identificar micobactérias não tuberculosas.
- Um gene que codifica uma proteína secretora, gene
SecA, foi demonstrado ser um alvo útil para identificar
todas as espécies de micobactérias diretamente em
espécimes clínicos.
- O gene pode ser amplificado por PCR, e a porção
espécie-específica do gene é sequenciada para
determinar a identidade da amostra isolada.
- O teste é altamente sensível e específico para
espécimes com esfregaços ácido resistentes positivos,
mas relativamente insensível para espécimes com
esfregaços negativos.
- Um teste de PCR com duração de uma hora é capaz de
detectar M. tuberculosis em espécimes clínicos e
determinar a suscetibilidade à rifampicina, um marcador
substituto de cepas multirresistentes.
Cultura
- As micobactérias que causam doença pulmonar, são
abundantes nas secreções respiratórias.
- A recuperação do microrganismo é virtualmente
assegurada em pacientes, nos quais espécimes
respiratórios são coletados pela manhã, durante três dias
consecutivos.
- No entanto, é mais difícil isolar M. tuberculosis e
espécies de NTM de outros sítios em pacientes com
doença disseminada (p. ex., trato geniturinário, tecidos,
líquido cefalorraquidiano).
- Nesses casos, espécimes adicionais devem ser
coletados para cultura e um grande volume de fluido ou
tecido deve ser processado.
- O crescimento in vitro de micobactérias é complicado
pelo fato de a maioria das amostras crescer lentamente e
poder ser obscurecida por bactérias de crescimento
rápido, que normalmente colonizam os indivíduos.
- Assim, espécimes como escarro são inicialmente
tratados com um reagente descontaminante para remover
os organismos que poderiam confundir o resultado.
- As micobactérias podem tolerar tratamentos breves
com álcali, que mata as bactérias de crescimento rápido
e permite o isolamento seletivo das micobactérias.
- A descontaminação estendida do espécime mata as
micobactérias.
- No passado, quando espécimes clínicos eram
inoculados em meios com base de ovo (p. ex.,
Löwentein-Jensen) ou meios com ágar (p. ex.,
Middlebrook), eram necessárias quatro a oito semanas
para que M. tuberculosis, complexo M. avium e outras
micobactérias de crescimento lento importantes fossem
detectados.
- Este tempo foi reduzido com o uso de culturas em
caldo (meio líquido), especialmente formuladas para o
crescimento rápido da maioria das micobactérias.
- O tempo médio do crescimento de micobactérias
diminuiu para 10 a 21 dias.
- A habilidade de M. tuberculosis crescer rapidamente
em caldos de culturas vem sendo usada para realizar
testes rápidos de suscetibilidade.
- A técnica MODS ou observação microscópica de
suscetibilidade aos fármacos utiliza um microscópio
óptico invertido para examinar placas de 24 orifícios
inoculadas com caldo Middlebrook e escarro
descontaminado.
- O crescimento de M. tuberculosis geralmente pode ser
detectado como emaranhados ou cordas de crescimento
no caldo, após uma semana de incubação.
- A incorporação de antimicobacterianos no caldo
possibilita testes de suscetibilidade diretos e rápidos.
- Algumas espécies de micobactérias requerem uma
temperatura de incubação mais baixa do que a usada
para a maioria das culturas (30 °C versus 37 °C).
- Além disso, M. haemophilum requer para o
crescimento a suplementação do meio com hemina ou
citrato férrico de amônio.
- Pelo fato de as infecções por esses microrganismos
envolverem caracteristicamente a pele, a maioria dos
laboratórios cultiva espécimes superficiais (p. ex.,
biópsia de pele e lesões) em ambas as temperaturas, 30
°C e 37 °C, e em pelo menos um meio suplementado
com hemina.
Identificação
● Propriedades morfológicas.
● Reações bioquímicas.
● Análise dos lipídios da parede celular.
● Sondas de ácidos nucleicos.
● Sequenciamento de ácidos nucleicos.
- As propriedades de crescimento e a morfologia das
colônias podem ser utilizadas para a identificação
preliminar das espécies mais comuns de micobactérias.
- O método padrão para a identificação das
micobactérias eram os testes bioquímicos.
- Porém, os resultados só são liberados após três
semanas ou mais e várias espécies não são diferenciadas
com esses testes.
- Atualmente, a forma mais utilizada para a identificação
das micobactérias isoladas consiste na utilização de
sondas moleculares espécie-específicas.
- Pelo fato de um número grande de microrganismos
estar presente na cultura nas etapas iniciais de detecção,
não é necessário amplificar a sequência genômica alvo.
- Os sistemas de identificação com sonda utilizados
atualmente são rápidos (2h), sensíveis e específicos.
- As espécies de micobactérias para as quais não há
sondas disponíveis podem ser identificadas pela
amplificação de sequências de genes espécie-específicos
(i.e., regiões hipervariáveis do gene 16S RNAr ou gene
SecA), seguida da análise das sequências para identificar
as espécies.
- Este método é rápido (um a dois dias) e não limitado
pela disponibilidade de sondas específicas.
Tratamento
- As micobactérias de crescimento lento são resistentes à
maioria dos antibióticos utilizados para tratar outras
infecções bacterianas.
- Os pacientes devem tomar múltiplos antibióticos por
um longo período de tempo (p. ex., um mínimo de 6-9
meses), ou cepas resistentes aos antibióticos se
desenvolverão.
- Novas cepas de M. tuberculosis resistentes, chamadas
de TB extremamente resistentes aos antimicrobianos
(XDR), emergiram na maioria das regiões do mundo.
- Essas cepas definidas como MDR-TB, resistentes a
fluoroquinolonas e a pelo menos um dos fármacos de
segunda linha (p. ex., canamicina, amicacina,
capreomicina), são potencialmente intratáveis.
- A maioria dos regimes terapêuticos inicia com dois
meses de isoniazida (isonicotinil-hidrazina [INH]),
etambutol, pirazinamida e rifampicina, seguidos por 4-6
meses de INH e rifampicina, ou combinação de
fármacos alternativos.
- Os regimes terapêuticos preconizados pela OMS se
distinguiram entre pacientes com a forma tuberculóide
(paucibacilar) e com a forma lepromatosa (multibacilar).
- A forma paucibacilar deve ser tratada com rifampicina
e dapsona por um período mínimo de 6 meses, enquanto
a forma multibacilar deve ter a clofazimina adicionada
ao regime e o tratamento deve ser estendido por 12
meses.
- Tratamento com um único antimicrobiano não deve ser
utilizado para nenhuma das formas.
- O complexo M. avium e muitas outras micobactérias
de crescimento lento são resistentes aos agentes
antimicobacterianos comuns.
- Um regime normalmente recomendado para as
infecções causadas por MAC é claritromicina ou
azitromicina, combinada com etambutol e rifampicina.
- A duração do tratamento e a seleção final dos
antimicobacterianos são determinadas pela resposta à
terapia e pelas interações entre esses fármacos e outros
fármacos que o paciente esteja recebendo.
- As espécies de crescimento rápido, apesar de serem
resistentes, são suscetíveis à claritromicina, imipenem,
amicacina, cefoxitina e sulfonamidas.
- Pelo fato de as infecções por essas micobactérias serem
geralmente confinadas à pele ou estarem associadas a
dispositivos protéticos, o desbridamento cirúrgico ou a
remoção da prótese também são necessários.
Quimioprofilaxia
- M. tuberculosis: O regime por eles recomendado inclui
uma dose diária ou duas vezes na semana de INH por
um período de 6-9 meses, ou doses diárias de
rifampicina por 4 meses.
- Os pacientes que foram expostos à M. tuberculosis
resistente aos antimicrobianos devem receber profilaxia
com pirazinamida combinada com etambutol ou
levofloxacina, por 6-12 meses.
- Pelo fato de as infecções intracelulares causadas pelo
complexo M. avium serem comuns em pacientes com
AIDS, a quimioprofilaxia é recomendada em pacientes
com contagem de células T CD4 menores que 50
células/µL.
- Nesses casos, é recomendada a profilaxia com
claritromicina ou azitromicina.
- A quimioprofilaxia não é necessária para pacientes
com outras infecções micobacterianas.
Imunoprofilaxia
- A vacinação com M. bovis atenuado (BCG) é usada em
países nos quais a tuberculose é endêmica e responsável
por morbidade e mortalidade significativas.
- Redução na incidência da tuberculose se a BCG é
administrada em indivíduos jovens (é menos eficaz em
adultos).
- A imunização com BCG não pode ser utilizada em
pacientes imunocomprometidos (p. ex., aqueles com
infecção por HIV).
- Outro problema relacionado à imunização com BCG é
que uma reação de pele positiva se desenvolve em todos
os pacientes e pode persistir por um período prolongado.
- Essa reação de pele é geralmente baixa e, portanto,
uma reação forte ao teste (p. ex., maior que 20 mm de
endurecimento) deve ser considerada significativa.
- Os testes de liberação de IFN-γ de segunda geração
não são afetados pela imunização com BCG, podendo
ser usados na triagem dessa população.
Controle
- Pelo fato de um terço da população mundial estar
infectado por M. tuberculosis, a erradicação dessa
doença é pouco provável.
- No entanto, a doença pode ser controlada com uma
combinação de vigilância ativa, intervenções
terapêuticas e profiláticas, e monitoramento cuidadoso
dos casos.
Mycobacterium leprae
Patogênese e Imunidade
● Biologia, Virulência e Doença
- Bacilos fracamente Gram-positivos, fortemente ácido
resistentes.
- Parede celular rica em lipídios.
- Não é capaz de ser cultivado em meios artificiais.
Formas de lepra tuberculóide (paucibacilar) e
lepromatosa (multibacilar).
- A forma lepromatosa da doença é altamente infecciosa
- Disseminação pessoa-pessoa por contato direto ou
inalação de aerossóis infecciosos.
● Diagnóstico
- A microscopia é sensível para a forma lepromatosa.
- O teste de pele é necessário para confirmar a lepra
tuberculóide.
- A cultura não é útil
● Tratamento, Prevenção e Controle
- A forma tuberculóide é tratada com rifampicina e
dapsona por seis meses; clofazimina é adicionada ao
regime para o tratamento da forma lepromatosa, e a
terapia é estendida por, no mínimo, 12 meses.
- A doença é controlada pelo pronto reconhecimento e
tratamento dos indivíduos infectados.
- Lepra/doença de Hansen.
- A bactéria se multiplica muito lentamente. O período
de incubação é prolongado e os sintomas
desenvolvem-se em até 20 anos após a infecção.
- As manifestações clínicas da lepra dependem da reação
imune do paciente à bactéria.
- A apresentação clínica da lepra varia da forma
tuberculóide à forma lepromatosa.
- Os pacientes com lepra tuberculóide (também chamada
doença de Hansen paucibacilar) apresentam uma forte
reação imune celular, com muitos linfócitos e
granulomas presentes nos tecidos e relativamente poucas
bactérias.
- Como acontece nas infecções por M. Tuberculosis, em
pacientes imunocompetentes as bactérias induzem a
produção de citocinas que medeiam a ativação de
macrófagos, fagocitose e eliminação dos bacilos.
- Os pacientes com lepra lepromatosa (doença de
Hansen multibacilar) possuem uma resposta forte aos
anticorpos, mas um defeito específico na resposta celular
aos antígenos de M. leprae. Assim, uma abundância de
bactérias é tipicamente observada nos macrófagos da
derme e nas células de Schwann dos nervos periféricos.
- Embora a rota mais importante de infecção seja
desconhecida, acredita-se que M. leprae seja
disseminada pela inalação de aerossóis infecciosos ou
pelo contato da pele com secreções respiratórias ou
exsudados de feridas.
- M. leprae não cresce em culturas livres de células.
Dessa forma, a confirmação laboratorial da lepra requer
achados histopatológicos consistentes com a doença
clínica, teste de pele de reatividade à lepromina na lepra Lepra tuberculóide. As lesões tuberculoides primárias são
caracterizadas por máculas anestésicas com hipopigmentação.
tuberculóide ou observação de bactérias ácido resistentes
em material coletado das lesões de pacientes com lepra
lepromatosa.
- A lepra é uma infecção crônica que afeta a pele e os
nervos periféricos.
- O espectro do envolvimento tecidual é influenciado
pelo estado imune do paciente.
- A forma tuberculóide é mais branda e caracterizada por
manchas de pele não pigmentadas.
- A forma lepromatosa está associada a lesões de pele
desfigurantes, nódulos, placas, espessamento da derme e
Lepra lepromatosa. Infiltração difusa da pele por múltiplos nódulos
envolvimento da mucosa nasal. de vários tamanhos, cada um deles com muitas amostras bacterianas.