UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

FACULDADE DE FARMÁCIA
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Farmacêutica

Produto Técnico N° 06/2022

Este RELATÓRIO TÉCNICO, PRODUTO TÉCNICO foi gerado a partir da dissertação

Estudo de Biocarga nas Etapas do Processo de Purificação de um Produto
Intermediário da Vacina Pneumocócica sem restrição de publicação da aluna Érika
Souza de Lima Silva, do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia
Farmacêutica – Faculdade de Farmácia da UFRJ – CTECFAR – FF – UFRJ.

Orientador: Profª. Dra. Evelin Andrade Manoel

Coorientadora: Dra. Ana Maria Pereira

Rio de Janeiro

Dezembro/2022
Título. Estudo de Biocarga nas Etapas do Processo de Purificação de um Produto
Intermediário da Vacina Pneumocócica.
Tipo de Produto Técnico. Relatório Técnico
Finalidade. Avaliação de etapas na rota de obtenção de um produto intermediário que
compõe a vacina pneumocócica, para identificar focos mais críticos e a presença de
biocarga em amostras coletadas do processo, através da contagem e identificação dos
tipos de microrganismos presentes nas soluções e equipamentos. Isso será feito mantendo
o nível e/ou tipo dentro das especificações previamente estabelecidas pelo departamento
de qualidade.
Impacto econômico/social: Por meio de uma avaliação de risco realizada nos estágios
iniciais do processo e do desenvolvimento do produto, os pontos de controle podem ser
identificados e medidas de controle implementadas para mitigar os riscos. Dentro dessa
medida, o monitoramento da biocarga a cada lote produzido antes da esterilização terminal
(seja por calor úmido ou filtração) será conduzido. Esse processo visa melhorara qualidade
final do produto ofertado à comunidade.

UFRJ.
Dezembro de 2022.

Autores:

Érika Souza de Lima Silva – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia

Farmacêutica (CTECFAR/UFRJ) / Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos (Bio-
Manguinhos) / FIOCRUZ.

Ana Maria Pereira – Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos (Bio-Manguinhos) /

FIOCRUZ.

Evelin Andrade Manoel – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia

Farmacêutica (CTECFAR/UFRJ).

Empresa:

Nome: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos (Bio-Manguinhos) / FIOCRUZ.

Av. Brasil, 4365 - Manguinhos, Rio de Janeiro - RJ, 21040-900.
 RESUMO

O estudo de Biocarga das Etapas do Processo de Purificação de um Produto Intermediário

da Vacina Pneumocócica mostrou-se necessário devido a resultados insatisfatórios obtidos
durante os lotes produtivos, na qual foi detectada contaminação microbiológica. Portanto,
esse estudo teve como objetivo analisar os processos por etapas para identificar presença
de biocarga em corridas de simulação e levantar dados quantitativos nas rotas de produção
para iniciar a definição de parâmetros de biocarga por etapa para a construção do
documento de estratégia de monitoramento. Para isso, foram retiradas no total 30 amostras
de 100 mL tanto de WFI (água para injetáveis) quanto de solução de NaCl 0,15 M nas três
etapas desse estudo. É importante salientar que a solução de NaCl 0,15 M foi a escolhida
para as amostragens pois é a mais indicada para análises microbiológicas.Todas elas
foram coletadas seguindo os padrões de boas práticas de fabricação (BPF), armazenadas
em frascos apirogênicos de 125 mL e mantidas em temperatura de refrigeração de 2 a 8 °C
até a entrega ao setor responsável pelas analises, Controle de Qualidade, de acordo com o
Programa Interno. Essas amostras foram inoculadas em meio TSA (Ágar Triptona de Soja)
– indicado por tratar-se de um meio de cultura não seletivo que permite o crescimento
bacteriano – e em meio DSA (Ágar Sabouraud Dextrose) – indicado por tratar-se de meio
de cultura não seletivo que permite o crescimento de fungos leveduriformes e
filamentosos. As placas de TSA invertidas foram incubadas a (32,5 ± 2,5) °C, por não
menos que 5 dias e as de DSA foram incubadas a (22,5 ± 2,5)
°C, por não menos que 5 dias, de acordo com o documento interno de Monitoramento. Os
resultados obtidos nesse estudo são liberados em Unidade Formadora de Colônia (UFC),
foram considerados satisfatórios, pois em uma rotina de sanitização havia sido
implementada logo antes da execução desse estudo, o que permitiu mostrar que assoluções
saneantes e método utilizado são eficientes, apontando a necessidade de continuidade das
sanitizações para a manutenção do quadro microbiológico dos equipamentos. Dessa forma,
a partir desses resultados, foi adotada a estratégia de sanitização dos equipamentos a cada
11 dias, seguindo todas as recomendações quanto ao uso de soluções e tempo de contato
dos fornecedores dos equipamentos.

Palavras-chaves: Esterelidade, Sanitização, Biocarga e Plano de ação.

 1- INTRODUÇÃO

A esterilidade é uma característica crítica de qualidade para todas as substâncias,

produtos e recipientes estéreis. A esterilidade não pode ser garantida por testes, mas sim, pelo
uso de um processo de fabricação devidamente projetado, controlado e validado. A esterilidade
é atingida através de vários fatores adequadamente controlados, como a carga biológica
(biocarga), o processo de esterilização, a integridade do sistema de fechamento do da
embalagem final do produto e, no caso de processamento asséptico, o uso detécnica
asséptica e procedimentos adequados. O conhecimento do tipo, da quantidade eda fonte dos
contaminantes nos produtos, antes da esterilização, e a aplicação de métodos para minimizar
tal contaminação e preveni-la pós-processamento contribuem para assegurar o êxito da
esterilização.
Para garantir a qualidade do produto intermediário, o processo do controle de biocarga
deve ser projetado para minimizar ou mitigar a entrada, proliferação e persistência de
microrganismos nos processos, equipamentos e instalações. Os níveis de endotoxinas
bacteriana ou exotoxinas no produto final podem ser impactados pela biocarga e endotoxinas
bacterianas, por contaminantes microbiológicos provenientes do processo produtivo.
Com a finalidade de manter um nível aceitável de endotoxina ou exotoxina no produto final, o
nível de contaminantes microbiológicos dos componentes deve ser mínimo. Desta maneira, o
limite e o perfil microbiológico dos microrganismos identificados no ensaio de biocarga devem
ser listados de acordo com o produto de interesse a ser purificado. Os critérios de aceitação de
altos níveis de carga biológica ou presença de determinados microrganismos ou grupos de
microrganismos não devem ser justificados pelacapacidade do processo de esterilização ou
por qualquer etapa de redução da cargabiológica antes da esterilização. Com o objetivo de
avaliar a eficiência das medidas de controle de biocarga deve ser estabelecido o monitoramento
de biocarga através de um plano de estudo.

2- OBJETIVO

• Avaliar, através de simulação dos processos com solução salina, as etapas na rota de
obtenção de um produto intermediário que compõe a vacina pneumocócica, para
identificar focos mais críticos e a presença de biocarga em amostras coletadas.
• Levantar dados quantitativos de biocarga nas etapas rotas de produção;
 • Com esses dados, identificar melhor a contribuição de biocarga de cada um dos
principais equipamentos de processo permitindo iniciar a definição de parâmetros de
biocarga por etapa e construir uma estratégia de monitoramento.

Na rota de purificação para obtenção do produto intermediário, as operações avaliadas serão:

- Purificação com avaliação dos sistemas cromatográficos e colunas;
- Filtração, com avaliação dos recipientes de processo e coleta do material filtrado em dorna
de aço inox;
- Ultrafiltração, avaliando o sistema de filtração tangencial;

2- AÇÕES PRELIMINARES

2.1- Cronograma

DATA DE
AÇÕES RESPONSÁVEL
EXECUÇÃO
Elaboração do plano Setembro 2022 PRODUÇÃO
Cadastro do plano no sistema interno da
Setembro 2022 PRODUÇÃO
Qualidade
Cadastro das amostras de sanitização no
Setembro 2022 PRODUÇÃO
sistema da Qualidade
Realização das simulações na área e envio
Set/22 – Out/22 PRODUÇÃO
das amostras
Realização dos ensaios de biocarga e CONTROLE DE
Outubro 2022
emissão dos resultados QUALIDADE
Avaliação dos resultados obtidos Dezembro 2022 PRODUÇÃO

2.2- Itens necessários

2.2.1- Equipamentos
- Sistemas cromatográficos
- Colunas cromatográficas
- Sistema de filtração tangencial – cassetes
- Tanque inox
- pHmetro
- Condutivímetro
 Os processos alvo do estudo e os equipamentos empregados nas etapas de simulação do
processo foram seguidos de acordo com as instruções de trabalho dos equipamentos e de
processo.

2.2.2 - Soluções
- Solução de hidróxido de sódio 0,5 M
- Solução de hidróxido de sódio 0,1 M
- Solução de cloreto de sódio 0,15 M
- WFI (água para injetáves)

2.2.3 – Materiais
- Tanque de polipropileno para as soluções
- Tanque de polipropileno para descarte
- Mangueiras de silicone sanitizadas
- Conectores para mangueiras
- Pinças hemostáticas
- Frasco de vidro
- Frascos apirogênicos para coleta de amostras de biocarga
- Filtros de acetato de celulose - 30” (0,22 µm) - para filtração

3 – METODOLOGIA EMPREGADA
A metodologia será a simulação dos processos utilizando solução de NaCl 0,15 M, que
entraem contato com os equipamentos de processo, sendo carreada nos sistemas e transferida
pelos operadores de processo de forma similar ao realizado na rota de obtenção do produto
intermediário.
Amostras da solução de NaCl 0,15 M serão coletadas no momento do preparo, no momento
imediatamente anterior à utilização e após o tempo de contato com os sistemas a serem
avaliados.

3.1 – Processo da 1ª Purificação e Filtração

Nesta etapa, submete-se à avaliação a metodologia de sanitização do sistema
cromatográficoe coluna, avaliação do tempo de contato com o sistema e coluna, bem como
nos acessos do sistema pela válvula de injeção. Além disso, avalia-se a operação e manuseio
e coleta de
amostras após a sanitização e passagem pela coluna, assim como o recolhimento do eluído em
tanque de aço inox, simulando a coleta em tanque e reproduzindo a purificação do produto
intermediário.
Para a etapa de filtração, realiza-se a transferência da solução salina por pressurização
proveniente do tanque de processo, passando pelo filtro clarificante de 30” (0,22 µm) até o
tanque do filtrado, completando a etapa.

As amostras coletadas são:

A1: amostra da WFI imediatamente após a coleta da mesma; A2: amostra da solução
NaCl 0,15 M no momento do preparo; A3: amostra coletada no momento do uso; A4: amostra
coletada após sanitização da coluna; A5: amostra de NaCl 015 M imediatamente após o
preparo; A6: amostra coletada no momento do uso da solução NaCl 0,15 M; A7: amostra
coletada após simulação da cromatografia; A8: amostra coletada na saída do tanque, após 2h
de contato; A9: amostra coletada na saída do tanque, após 22h de contato; A10: amostra da
WFI imediatamente após a coleta da mesma; A11: amostra de NaCl 015 M imediatamente
após o preparo; A12: amostra coletada no momento do uso; A13: amostra coletada após
sanitização do cromatógrafo. Total de amostra da etapa: 13 amostras.
Processo está esquematizado a seguir (Figura 1).

Figura 1: Esquema do experimento e amostragens da etapa de 1ª Purificação cromatográfica e filtração.

3.2 – Processo de 2ª Purificação

Nesta etapa, avalia-se metodologia de sanitização do sistema cromatográfico e coluna,

o tempo de contato com o sistema e coluna, bem como nos acessos do sistema pela válvula de
injeção. Além disso, avalia-se a operação de manuseio e coleta de amostras após a sanitização.

As amostras coletadas são:

A1: amostra da WFI imediatamente após a coleta da mesma; A2: amostra da solução
NaCl 0,15 M no momento do preparo; A3: amostra coletada no momento do uso; A4: amostra
coletada após sanitização da coluna; A5: amostra da WFI imediatamente após a coleta da
mesma; A6: amostra de NaCl 015 M imediatamente após o preparo; A7: amostra coletada
no momento do uso; A8: amostra coletada após sanitização do cromatógrafo. Total de amostra
da etapa: 8 amostras.
A Figura 2 apresenta o esquema da etapa de simulação da 2ª Purificação, com o total
de 8 amostras.

Figura 2: Esquema do experimento de 2ª Purificação cromatográfica.

3.3 – Processo de Ultrafiltração
Nesta etapa avalia-se a metodologia de sanitização do sistema de ultrafiltração e
cassettes, o tempo de contato, bem como os acessos do sistema pela válvula de entrada. Além
disso, avalia-se a coleta de amostras após a sanitização, passando pelos cassettes e sendo
recolhido em garrafa de vidro.

As amostras coletadas são:

A1: amostra da WFI imediatamente após a coleta da mesma; A2: amostra da solução NaCl
0,15 M no momento do preparo; A3: amostra coletada no momento do uso; A4: amostra
coletada após sanitização da coluna; A5: amostra da solução NaCl 0,15 M no momento do
preparo; A6: amostra coletada no momento do uso; A7: amostra da solução antes da coleta na
garrafa de 10 L; A8: amostra coletada após contato de 2h com a garrafa de vidro. Total de
amostra da etapa: 8 amostras.
Processo está esquematizado a seguir (Figura 3).

Figura 3: Esquema do experimento de biocarga da etapa de Ultrafiltração

4. RESULTADOS
Nesse estudo de Biocarga das Etapas do Processo de Purificação de um Produto
Intermediário da Vacina Pneumocócica foram realizadas 3 simulações de processo.
 No processo da 1ª Purificação e Filtração foram coletadas 13 amostras para
análises de TSA e DSA, das quais as amostras A1 e A10 são de WFI – que foram
amostradas imediatamente após a coleta. Já as amostras A2, A3, A4, A5, A6, A7,
A8, A9, A11, A12 e A13 são referentes a solução de NaCl 0,15 M – que foram
amostradas no momento do uso, após a sanitização da coluna, após a simulação da
cromatografia e na saída do tanque. Os resultados de cada amostra podem ser vistos na
tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Resultados de Biocarga por lote de amostra para a 1ª purificação

Amostra Solução Resultado TSA Resultado DSA

A1 WFI 0 0

A2 NaCl 0,15 M 0 0

A3 NaCl 0,15 M 0 0

A4 NaCl 0,15 M Incontáveis 21

A5 NaCl 0,15 M 0 0

A6 NaCl 0,15 M 0 0

A7 NaCl 0,15 M 4 0

A8 NaCl 0,15 M 20 0

A9 NaCl 0,15 M Incontáveis 0

A10 WFI 0 0

A11 NaCl 0,15 M 0 0

A12 NaCl 0,15 M 0 0

A13 NaCl 0,15 M 0 0

 Para o processo da 2ª Purificação foram coletadas 8 amostras para análises de
TSA e DSA, das quais as amostras A1 e A5 são de WFI – que foram amostradas
imediatamente após a coleta. Para as amostras A2, A3, A4, A6, A7 e A8 são referentes a
solução de NaCl 0,15 M – que foram amostradas no momento do uso, após a sanitização
da coluna, após a simulação da cromatografia e na saída do tanque. Os resultados de cada
amostra podem ser vistos na tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Resultados de Biocarga por lote de amostra para a 2ª purificação

Amostra Solução Resultado TSA Resultado DSA

A1 WFI 0 0

A2 NaCl 0,15 M 4 0

A3 NaCl 0,15 M 2 0

A4 NaCl 0,15 M 0 0

A5 WFI 0 0

A6 NaCl 0,15 M 0 0

A7 NaCl 0,15 M 0 0

A8 NaCl 0,15 M 1 0

No processo da Ultrafiltração foram coletadas 9 amostras para análises de TSA e

DSA, das quais as amostras A1 e A9 são de WFI – que foram amostradas imediatamente
após a coleta. E as amostras A2, A3, A4, A5, A6, A7 e A8 são referentes a solução de NaCl
0,15 M – que foram amostradas no momento do uso, após a sanitização do TFF, após a
simulação da ultrafiltração e na saída do tanque. Os resultados de cada amostra podem ser
vistos na tabela 3 abaixo.
 Tabela 3: Resultados de Biocarga por lote de amostra para a ultrafiltração

Amostra Solução Resultado TSA Resultado DSA

A1 WFI 0 0

A2 NaCl 0,15 M 16 0

A3 NaCl 0,15 M 25 0

A4 NaCl 0,15 M 10 0

A5 NaCl 0,15 M 0 0

A6 NaCl 0,15 M 0 0

A7 NaCl 0,15 M 2 0

A8 NaCl 0,15 M 0 0

A9 WFI 0 0

A partir desses resultados, espera-se avaliar e discutir pontos de melhoria nas

condutas dos operadores, como também melhorias nos procedimentos de sanitização de
equipamentos e instrumentos utilizados no processo produtivo.

5. DISCUSSÃO
Ao analisar os resultados obtidos referentes a 1ª purificação, é possível observar a
presença de microrganismos após a etapa de sanitização da coluna cromatográfica, a de
passagem pela coluna cromatográfica e pelo cromatógrafo e a de saída do tanque após filtração.
O fluxo de processo e resultados de cada etapa podem ser vistos na Figura 4 abaixo.
Figura 4: Fluxo de processo da 1ª purificação com resultados das analises

Num primeiro momento, os resultados fazem sentido ao pensar que houve

crescimento microbiano no período em que a coluna estava estocada, justificando as
incontáveis colônias em meio TSA e 21 UFC em meio DSA na amostra A4. Além disso,
por ser a primeira cromatografia, todo o debri celular presente no produto é injetado em
alta concentração na coluna, o que possivelmente implica numa maior dificuldade de
limpeza, coincidindo com os valores encontrados nesse instante. Ao analisar a passagem
de solução de NaCl 0,15 M pela coluna cromatográfica e pelo cromatógrafo – referente a
amostra A7, foi observada uma diminuição na quantidade de colônias em meio TSA, sendo
apenas 4 UFC e de ausência de crescimento em meio DSA. A amostra A8 apresentou um
aumento no número de colônias, sendo igual a 20 UFC, mas ainda assim não foi
considerado tão significativo. Isso pode significar que a sanitização é eficiente, uma vez
que, logo após a passagem das soluções sanitizantes, os resultados melhoraram
significativamente. Apesar dessa melhora, os resultados do tanque após a filtração –
referente a amostra A9 – não foram satisfatórios como o esperado. Isso pode ser explicado
pelo alto tempo de contato de 22 horas em temperatura ambiente, favorecendo o
crescimento microbiano na solução de processo.
 É possível dizer que o método de sanitização utilizado é eficiente, apesar dos
resultados insatisfatórios obtidos após a sanitização da coluna. Devido ao fato de não se ter
estabelecido uma rotina de limpezas validadas nos equipamentos antes do estudo de
biocarga, é possível alegar que os resultados têm relação com um maior espaçamento entre
sanitizações, o que pode ser facilmente superado com uma rotina de limpezaestabelecida e
com o uso das soluções sanitizantes desse processo, já que se mostraram eficientes.

Comparativamente, com relação aos resultados referentes a 2ª purificação, eles

mostraram-se melhores que os da 1ª purificação. Houve crescimento em meio TSA no
tanque de solução de NaCl 0,15 M – referente a amostra A2 – e possivelmente, houve a
passagem dos microrganismos até a próxima etapa de sanitização da coluna – referente a
amostra A3. Com o passar do processo, os resultados permaneceram satisfatórios, com
crescimento de apenas 1 UFC em meio TSA na amostragem após sanitização do
cromatógrafo. O fluxo de processo e resultados de cada etapa podem ser vistos na Figura 5
abaixo.

Figura 5: Fluxo de processo da 2ª purificação com resultados das analises

 É possível dizer que a sanitização empregada é eficiente, pois consegue reduzir a
biocarga do processo e que, com a implementação de uma rotina de limpeza, a tendência
é que a biocarga seja cada vez mais reduzida.

Na última etapa de simulação do estudo de biocarga, a Ultrafiltração, também foram

obtidos resultados que indicam a presença de crescimento microbiano. Houve crescimento
de 16 UFC em meio TSA no tanque de solução imediatamente após opreparo –
referente a amostra A2 –, agregando, posteriormente, mais biocarga no mesmo tanque, já
que no momento do uso – amostra A3 – foi obtido o resultado de 25 UFC. Há a redução da
biocarga com o passar das etapas, sendo igual a 10 UFC na saída do sistemade filtração
tangencial após a sanitização – referente a amostra A4 – e igual a 02 UFC no tanque de
coleta antes da amostragem final. O fluxo de processo e resultados de cada etapa podem
ser vistos na Figura 6.

Figura 6: Fluxo de processo da Ultrafiltração com resultados das analises

Pode-se dizer que o balanço dessa sanitização é positivo, pois, mesmo que exista
um crescimento microbiano por conta das soluções de processo num primeiro momento
antes da sanitização, as soluções de limpeza utilizadas conseguem impedir a proliferação
 microbiológica. Além disso, pode-se dizer que a redução de biocarga foi tão
satisfatória que o frasco de vidro contendo o equivalente ao ultrafiltrado não
apresentou crescimento microbiano, indicando novamente a eficiência da
sanitização.

Analisando macroscopicamente, a biocarga é reduzida com o passar das

etapas, o que garante uma qualidade do produto final. Além disso, foi visto que
uma rotina de sanitização com soluções eficientes é a melhor forma de garantir
bons resultados microbiológicos. É preciso também ponderar que o
comportamento do operador continua sendo de grande importância para evitar
contaminação de soluções, por exemplo.

7. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos nesse estudo foram considerados satisfatórios, pois

em uma rotina de sanitização havia sido implementada logo antes da execução
desse estudo, o que permitiu mostrar que as soluções saneantes e metodologia
aplicada são eficientes, apontando a necessidade de continuidade das sanitizações
para a manutenção do quadro microbiológico dos equipamentos. Dessa forma, a
partir desses resultados, foi implemetada a estratégia de sanitização dos
equipamentos a cada 11 dias, seguindo todas as recomendações quanto ao uso de
soluções e tempo de contato dos fornecedores dos equipamentos.

8. REFERÊNCIAS

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

Resolução de Diretoria Colegiada nº 301, de 21 de agosto de 2019. Dispõe sobre
as Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos. Diário Oficial [da] República
Federativa do Brasil. Brasília,22 de agosto de 2019. Edição 162, Seção 1, p. 64.
2019.

PARENTERAL DRUG ASSOCIATION- PDA- Bioburden and Biofilm

Management in Pharmaceutical Manufacturing Operations- Technical Report nº
69, 2015.

SIGMA ALDRICH. Sabouraud dextrose broth. Sigma Aldrich, 2022.

Disponível em: https://www.sigmaaldrich.com/BR/pt/product/sial/s3306. Acesso
em: 19 dez. 2022.

SIGMA ALDRICH. Tryptic Soy Agar. Sigma Aldrich, 2022. Disponível em:
https://www.sigmaaldrich.com/BR/pt/product/sial/22091. Acesso em: 19 dez.
2022.