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A1 A2
G1
A1 = A2 A 1 A2 A1 A1 A2 A 2 A1 A2
Meiose: clulas de linha germinativa. Diviso de variao (na profase I no necessrio Meiose I existem 2 o conhecimento das vrias fases, para esta disciplina).
Em G1 encontramse clulas como oognias ou espermatognias.
4 3 2 1 0 G1 S M1
DNA / Ncleo
Fase G1
Fase S
Meiose I
Meiose II A1 A1 A2 A2
A1
homlogo
A1 A1
M2
A2 A1 A2 A1 A1 A2 A2
A2 A2
Meiose Sinapse dos cromossomas homlogos em Profase I Entrecruzamentos entre pares de homlogos Diviso de centrmeros apenas em anafase II Variao
Fases da Mitose Profase incio da condensao dos cromossomas. O ncleo desorganiza-se e a sntese proteica pra. Fora do ncleo, a rede de microtbulos que existia em interfase substituda pelo fuso mittico. Prometafase ruptura abrupta do invlucro nuclear, com o desaparecimento da lmina nuclear (fosforilao das laminas). Continuao da condensao dos cromossomas. Metafase cromossomas alinham-se no centro da clula, formando a placa equatorial. o momento onde h a condensao mxima dos cromossomas, e onde cada um dos cromatdios se liga a microtbulos plos opostos do fuso. Nesta fase existem foras bipolares equilibradas que mantm os cromossomas na placa equatorial. Anafase separao dos cromatdios que so arrastados para os plos. No fim desta fase inicia-se a citocinese. Anafase A encurtamento dos microtbulos do cinetocoro e movimento dos cromatdios para os plos; Anafase B afastamento dos plos provocada pelo alongamento dos microtbulos polares. Telofase invlucro nuclear reorganiza-se e os cromossomas comeam a descondensar-se.
Fases da Meiose Profase I cromossomas duplicados comeam a condensar-se; incio da sinapse e ocorre o crossing-over; desaparecimento do complexo sinaptonmico; pontos de quiasmata visveis; bivalentes prontos para a metafase. Metafase I cromossomas homlogos alinham-se na placa equatorial, atravs dos pontos de quiasmata. Anafase I pares homlogos separam-se com os cromatdios ainda juntos. Ou seja, migram 2 cromatdios (1 cromossoma), com constituies diferentes, para cada um dos plos. Telofase I formam-se duas clulas-filhas, cada uma contendo 1 cromossoma do par de homlogos. Profase II no h replicao do DNA. uma fase que pode no ocorrer para no existirem grandes gastos de energia. Recondensao dos cromossomas. Metafase II cromossomas alinham-se na placa equatorial, atravs dos centrmeros. Cada par de cromatdios alinha-se na placa equatorial, de cada clula. Anafase II dividem-se os centrmeros e cada cromatdio, do mesmo cromossoma, migra separadamente para cada plo. Os cromatdios so separados, originando clulas com arranjos genticos diferentes devido ao crossing-over ocorrido na profase I. Telofase II concluso da diviso da clula. Originam-se 4 clulas-filhas. Existe a organizao nuclear de cada clula, originando-se 4 clulas com um ncleo que possui um nmero haplide de cromossomas. Meiose em Mamferos A meiose para a formao dos gmetas femininos e masculinos, constitui uma excepo ao processo de meiose normal. Os precursores dos espermatozides formam 4 espermtides, onde cada uma delas evolui para um espermatozide. Assim, este um processo de meiose normal pois de 1 clula, de 2n cromossomas, vo ser formadas 4 clulas, de n cromossomas, possuindo este mecanismo um alto rendimento. No entanto, nas fmeas (cuja meiose comea no estado embrionrio) durante a primeira diviso meitica, da sua oognese, formam-se duas clulas: uma delas constitui o primeiro glbulo polar (que pode sofrer mitose) e a outra constitui uma clula que vai continuar para a segunda diviso meitica. Essa clula ento vai passar pela segunda diviso meitica, originando um ocito II e o segundo glbulo polar (apenas quando ocorre a fecundao). Assim, na formao de gmetas femininos apenas se forma, no final, uma nica clula, que na realidade nunca chega realmente a ficar haplide (necessita da fecundao de um espermatozide para completar a meiose). Os glbulos polares acabam por degenerar.
Clula Precursora
1 ocito secundrio
Clula Precursora
4 espermatozides
Cromatina Cromatina possui dois tipos consoante o seu grau de condensao, que tm como base a actividade de transcrio do mRNA. Eucromatina cromatina activa, descondensada, que corresponde s regies do genoma capazes de realizar transcrio. uma zona sensvel DNAse. Heterocromatina mantm o grau de condensao durante todo o ciclo celular. visvel no ncleo em interfase (crommeros heterocromatina na interfase que continua bastante condensada). As suas funes esto ainda mal estudadas, mas pensa-se que podero participar no emparelhamento, recombinao, segregao e, tambm, na estabilizao e proteco de certas regies cromossmicas. Na heterocromatina ainda se consideram outros dois tipos: Facultativa estado de condensao varivel em tipos diferentes de clulas e durante a fase precoce do desenvolvimento, ou seja, no est sempre ultracondensada. Pensa-se que poder ter origem em eucromatina que se inactivou. Os mamferos, pelo menos, at ao sexto ms de vida tm este tipo de heterocromatina. Constitutiva localizada em posies idnticas, nos cromossomas homlogos, de todas as clulas e de forma permanente, ou seja, aparece sempre ultraconcentrada. O DNA muito repetitivo e muito rico em adenina-timina. Dentro de uma mesma espcie este tipo de heterocromatina igual de indivduo para indivduo. Cromossoma Metafsico necessrio que os cromossomas estejam condensados, para os conseguirem estudar, uma vez que o momento onde os cromossomas no se encontram to repulsivos entre eles e a altura em que se encontram mais condensados. Desta forma, pode-se estudar a sua constituio, forma e anomalias que, eventualmente, possam surgir. O cromossoma metafsico possui uma forma muito tpica, constitudo por 2 cromtides, 1 centrmero (que se dividem longitudinalmente na Anafase) e 2 telmeros. Para alm de DNA, na sua constituio, possuem, tambm, algumas protenas cidas (muito raras) e algum RNA mensageiro.
Cromossoma metafsico Fibrila mais pequena Enrolamento em protenas bsicas (histonas) ou cidas (raras)
Cromtides
Fibrila
Nucleossoma
Cadeia de DNA
Cromossoma conjunto de fibras de DNA com protenas, as quais se enrolam, por sucessivos empacotamentos / enrolamentos, sobre si mesmo. Estrutura Molecular do Centrmero O centrmero possui uma variao considervel conforme as espcies. Esta estrutura tem de possuir a capacidade de reconhecimento dos microtbulos para que consiga ocorrer a ascenso de material, para os plos. Cromossomas holocntricos sequncias centromricas dispersas ao longo do cromossoma (centrmero difuso), ou seja, possuem vrios pontos de ligao. Os microtbulos unem-se ao longo de todo o comprimento, de cada cromtide (fragmentao com raios X). 4
Centrmeros localizados com uma nica regio que se une aos microtbulos. Podem ser constitudos por centenas de Kb de DNA (centrmeros regionais) ou por um reduzido nmero de pares de bases (centrmeros pontuais). Os eucariotas superiores possuem regies centromricas que contm grandes quantidades de heterocromatina. Estrutura Molecular do Telmero Telmero extremidade de cada cromtide que est associada morte celular programada. So regies terminais do cromossoma que formam uma espcie de cpsula, porque contm sequncias especficas repetitivas (ricas em guanina). So importantes para determinar a vida da clula, pois decide quantas vezes se replica. O DNA telomrico nos vertebrados possui uma repetio em tandem de 5-TTAGGG-3. Em cada diviso celular, o telmero vai ficando mais pequeno o que induz a sua prpria morte, nas clulas normais, ocorrendo uma perda de 50 200 nucletidos / ciclo mittico. Isto ocorre pois a telomerase est ausente nas clulas somticas normais, no entanto, expressa a sua actividade em clulas tumorais. Assim, em clulas cancerosas a existncia de telomerase faz com que as extremidades, que se vo perdendo em cada ciclo, sejam acrescentadas pela mesma, impedindo que ocorra essa morte programada das clulas, permitindo a sua multiplicao indefinida. Tipos de Cromossomas Metafsicos Os cromossomas metafsicos classificam-se consiante a posio do centrmero em relao aos telmeros. Cromossoma metacntrico o centrmero encontra-se no centro do cromossoma (centrmero ao meio). Os braos do cromossoma possuem o mesmo tamanho. Cromossoma submetacntrico o centrmero encontra-se acima do centro do cromossoma, ou seja, est mais perto de uma das extremidades. O cromossoma possui 2 braos grandes mas de diferente tamanho entre si, sendo um dos braos mais curto que o outro. Cromossoma acrocntrico o centrmero encontra-se muito acima do centro do cromossoma, estando praticamente na sua extremidade. O cromossoma possui 1 brao mesmo muito pequeno (extremamente pequeno) e outro muito grande. Cromossoma telocntrico o centrmero constitui um dos centrmeros. O cromossoma s possui um brao, ou seja, o telmero e o centrmero constituem uma das extremidades do cromossoma.
Identificao de Cromossomas Metafsicos Existem tcnicas para as bandas escuras e claras, dos cromossomas, serem identificadas. Existe, ento, uma nomenclatura para reconhecer esses cromossomas. Simbologia: p (brao curto); q (brao longo). Banda as regies dividem-se em bandas. Quando o nmero de uma banda 0, ento essa regio constitui um marco. Marco local onde se dividem as regies, logo vai pertencer a 2 regies em simultneo, pois o limite de ambas. Podem ser telmeros, centrmeros, constries e, por vezes, certas bandas que so mais escuras e que se vem facilmente. Assim sendo, so os locais do cromossoma que se conseguem identificar com mais facilidade. 5
Regio espao de cromatina situado entre 2 bandas seguidas. As vrias regies distinguem-se em reunies internacionais. 8 q 2 4 . 2
Nmero do cromossoma Sub-Banda Regio Banda Brao
O nmero de pares de cromossomas no est relacionado com a escala de evoluo, logo varia muito consoante espcies diferentes, e por vezes no mesmo grupo, podendo ser apresentados saltos devido a duplicaes do nmero de cromossomas, o que d origem a seres muito diferentes, que constituem uma nova espcie (hbridos que se tornam frteis). Cromossoma Y na sua maioria constitudo por heterocromatina no codificante: Cromossomas Sexuais Sistemas cromossmicos de determinao do sexo: XX (homozigtico), XY (heterozigtico) Drosophila, Mamferos; WZ (heterozigtico), WW (homozigtico) aves, alguns peixes, traa; XX (homozigtico), X0 (hemizigtico) muitas espcies de insectos. Cromossoma Y no Homem, constitudo por 2 regies pseudo-autossmicas (homlogas ao cromossoma X e que so importante no emparelhamento). Cromatina Sexual Estudando o sistema nervoso dos gatos, descobriu-se a cromatina sexual (Barr, 1949). Verificou-se que, no sexo feminino, aparecem estruturas (cromatina sexual / corpsculos de Barr). Desta forma, a investigao foi expandida a clulas sexuais. Esta cromatina sexual um tipo de heterocromatina facultativa. Hiptese de Lyon: Fmeas de mamferos mosaicos na expresso dos 2 cromossomas X. At cerca do 16 dia, os dois cromossomas X esto funcionais. A cerca do 16 dia ocorre a precipitao de 1 dos cromossomas X; Durante a gametognese ocorre a reactivao do cromossoma X condensado (heterocromatina facultativa). Na presena de 2 cromossomas X, ocorre a precipitao de determinadas zonas, que inactivam essas regies, e assim, apenas 1 cromossoma que se encontra activo. Os 2 cromossomas X apenas esto activos, em simultneo, no momento do zigoto. A escolha da inactivao aleatria, logo a precipitao feita tanto do X materno como do X paterno. Assim, haver clulas nas quais o X materno que est activo e outras nas quais o X paterno o activo. Exemplos: Hemofilia existe apenas metade da produo da protena, em mulheres heterozigticas (Hh apenas da protena antihemoflica esta protena suficiente para que se mantenha o equilbrio, promovendo assim a ausncia de mulheres hemoflicas). G-6-PD em cultura existem clones com produo de uma variante e outros clones com a produo da outra variante. Mula o cavalo e o burro possuem G-6-PD diferentes. Existem clones produzindo apenas a enzima tpica de uma das espcies, de cada vez. Este fenmeno de inactivao tambm acontece quando um indivduo possui 3 cromossomas sexuais, onde existem 2 corpsculos de Barr, favorecendo a concluso de que em todas as fmeas, apenas existe 1 nico cromossoma X activo, independentemente da situao cromossmica, desde que possua 2 ou mais cromossomas X. 6
Centrmero Heterocromatina
Quando apenas existe 1 cromossoma X (como nos gentipos X0, XY, XYY) no h formao de cromatina sexual. Lei de Ohno O cromossoma Y foi miniaturizado, variando apreciavelmente entre 2 espcies prximas evolutivamente. No entanto, a evoluo do cromossoma X tem sido muito mais conservativa, devido ao seu mecanismo de inactivao que o preservou intacto, ao longo da evoluo dos mamferos. Nem todo o cromossoma X permanece inactivo. Alguns genes localizados na extremidade do brao curto esto sempre activos. H portanto uma inactivao selectiva. Cromossoma Y O cromossoma Y (com poucas regies codificantes) possui o gene TDF no brao curto. TDF zona do cromossoma Y que bastante importante para o desenvolvimento do sexo masculino. Induz a produo de testosterona, que leva produo dos ductos Wolfianos, originando, assim, o desenvolvimento de um embrio do sexo masculino. Na ausncia do cromossoma Y, no existe o inibidor Mlleriano, e logo desenvolve-se um embrio do sexo feminino. Este gene constitui a nica diferena entre sexos, sendo a nica poro, muito pequena, que faz toda a diferena no desenvolvimento embrionrio. Quando no existe esta regio, no cromossoma Y, desenvolve-se um embrio do sexo feminino, por muito que o seu caritipo seja XY. Quando o X tem essa regio, desenvolve-se um embrio do sexo masculino, por muito que o seu caritipo seja XX. Cromossomas Politnicos (Gigantes) Os cromossomas politnicos so grandes em comprimento e espessura. Estes formamse quando as cromtides, em determinadas divises, no se separam totalmente, e vo sendo duplicadas sucessivamente, ou seja, no ocorre diviso celular nem nuclear completa. Cada cromossoma est fortemente ligado ao homlogo e o DNA replicado diversas vezes, excepto no centrmero e telmero. As bandas existentes so diferentes das bandas dos cromossomas humanos pois no necessitam de qualquer tipo de colorao para serem observadas. Correspondem, na realidade, a regies mais condensadas (escuras) e mais laxas de cromatina (clara). Forma-se, assim, um padro de bandas e inter-bandas (escuras e claras, respectivamente) devido forma como o DNA se encontra compactado e descompactado, ao longo de todo o seu comprimento. Constituem numerosas fibrilas (cromtides) at 2000 ciclos de endorreduplicao. O padro de bandas (alternncia de bandas) formado especfico para cada cromossoma, devido concentrao desigual de fibrilas de cromatina, ao longo de um cromossoma. Os puffs (zonas de dilatao associadas sntese de RNA) ou anis de Balbiani so expanses do cromossoma, comuns de se observar nas biopsias de determinados carcinomas, assim, os puffs esto associados activao gnica diferencial (sntese de RNA). Aparecem em glndulas de Drosophila, angiosprmicas, protozorios, dpteros e carcinomas.
Cromossomas Plumosos Cromossomas plumosos muito activos na sntese de RNA. Quando a laada est exposta, significa que est a ocorrer a sua transcrio. Estes cromossomas so revestidos por complexos de RNA e protenas Formam-se quando a fibrila de cromatina sai e volta a entrar no cromossoma, formando uma laada. Esta estrutura contnua, logo permanece sempre intacta. Aparece em ncleos de ocitos I de vertebrados (anfbios) e invertebrados durante o prolongado estado de diplteno, e, ocasionalmente, em espermatcitos de Drosophila. As expanses da maioria dos crommeros em forma de laos, so muito ricas em RNA. Tcnicas de Observao de Cromossomas Metafsicos Tcnicas directas observam-se cromossomas a partir do tecido. Por exemplo, medula ssea, mucosa intestinal, endomtrio, neoplasias, testculo, ovrio
Emparelhamento tpico dos cromossomas X e Y Humano Rato Humano
Tcnicas indirectas observam-se cromossomas a partir de uma cultura celular. Por exemplo, sangue perifrico, medula ssea, lquido amnitico, vilosidades do crion, pele, tumores slidos / lquidos Nesta tcnica a quantidade do caritipo muito maior, logo mais definida. As culturas tm de ser feitas em meios asspticos.
Linfcito Estudo dos crossing-over (pontos de quiasmata)
Mtodos de Colorao das Bandas Houve uma evoluo desde os mtodos que englobavam coloraes uniformes ao longo de todo o cromossoma, para tcnicas cuja colorao induz uma alternncia de bandas. Este desenvolvimento fez com que seja mais simples a realizao de determinados diagnsticos, pelo que muito mais fcil o seu estudo. Mtodos diferenciais alternncia de regies claras com regies escuras. Mtodos selectivos marcao de regies especficas, com corantes fluorescentes. Mtodos de Colorao das Bandas Bandas G Bandas G nome proveniente do nome Giemsa, que o corante utilizado. Esta tcnica consegue, atravs da utilizao de enzimas proteolticas, provocar a alternncia de bandas claras e escuras, quando este corante diludo. Faz com que as bandas correspondam disposio das protenas, formando bandas positivas ou negativas. Bandas positivas bandas mais escuras, ricas em adenina-timina. Bandas negativas bandas mais claras. Enzimas proteolticas: Distribuio de protenas; Bandas positivas histonas ricas em arg e protenas ricas em grupos dissulfitos Bandas negativas protenas ricas em grupos sulfidril.
muito utilizado na deteco de anomalias, como por exemplo mutaes. Permitindo observar os prottipos dos caritipos das espcies. Nesta tcnica, os cromossomas so sujeitos a um aquecimento moderado ou a uma breve protelise, e corados com Giemsa. Mtodos de Colorao das Bandas Bandas Q Quinacrina corante florescente: Zonas mais brilhantes 75% adenina-timina; Zonas brilhantes mais de 5% de guanina-citocina. Mtodos de Colorao das Bandas Bandas R Bandas R nome vem da palavra reverse. Esta tcnica baseia-se na desnaturao, da cromatina, a altas temperaturas. Quando se colocam numa soluo alcalina, sofrem uma renaturao de apenas algumas partes do cromossoma, logo considera-se a ocorrncia de uma renaturao selectiva. Correspondem a bandas inversas das bandas G, pois as bandas G claras so bandas R escuras, enquanto as bandas G escuras so bandas R claras. Assim, constituem bandas complementares das bandas G, e aparecem em conjunto nas legendas dos prottipos dos caritipos. Os cromossomas so tratados com uma soluo alcalina, a quente, e coradas com Giemsa. Formam barras claras, ricas em guanina-citosina. Mtodos de Colorao das Bandas Bandas C Este um tipo de tecnologia que no faz aparecer uma forma de bandas contnua em todo o cromossoma. Na realidade faz com que determinadas zonas do cromossoma apaream mais evidenciadas. Assim, no se estuda o caritipo de um indivduo, mas estudam-se determinadas zonas que se pretendem analisar. Nesta tcnica h uma desnaturao, com tratamento alcalino, ocorrendo, posteriormente, a renaturao das sequncias mais repetitivas. Bandas C o seu nome vem de centrmero. Evidencia, por exemplo, a heterocromatina constitutiva.
Anomalia 1 centrmero com posio correcta e o outro centrmero diferente Cromossomas onde existe grande quantidade de heterocromatina na regio centromrica (caso humano)
Mtodos de Colorao das Bandas Bandas NOR Bandas NOR o seu nome vem de nucleolo organizing region. Existem determinadas regies da cromatina que esto relacionadas com o nuclolo, ou seja, no produzem protenas mas so as responsveis pela produo de 2 tipos de RNA ribossmico. Utiliza-se um tampo a elevadas temperaturas e adiciona-se nitrato de prata que vai precipitar determinadas regies. Depositam-se em zonas dos cromossomas acrocnctricos, que produzem RNA ribossmico. So ento estas as zonas que se evidenciam. As protenas associadas ao DNA ribossmico, no nuclolo (RNA ribossmico 18s e 28s) so abundantes, nos braos curtos dos cromossomas. 9
Mtodos de Colorao das Bandas Bandas SCE Bandas SCE o seu nome provem de sister cromatide Exchange. So necessrios 2 ciclo mittitos para que seja evidenciada a imagem. Assim, BrdU (droga que bloqueia a metafase) aps 2 ciclo consecutivos a competir com a timina: 2 BrdU cromtide clara; BrdU + Timina cromtide escura. Este corante um composto que compete com a timina aquando da fase S, em cultura celular. Produz uma imagem do crossing-over, permite ento visualizar o entrecruzamento (cruzamento entre cromtides irms), atravs da identificao de 1 cromtide clara e 1 cromtide escura. possvel que ocorra raramente um aumento do crossing-over mittico, devido a um mutagnico associado.
2 Ciclo de diviso celular Adio de BrdU 2 Ciclo de diviso celular Banda Banda escura clara
Adio de BrdU
Mtodos de Colorao das Bandas Bandas Alta Resoluo Esta tcnica permite aumentar, em bandas, a resoluo de um cromossoma. Assim, consegue-se distinguir um maior nmero de bandas e tambm de sub-bandas, pois esticamse os cromossomas. A coquicina pra a metafase, logo deixa de existir a diviso celular. A coquicina deixa de ser til perante o metatraxato (droga), que bloqueia a fase do novo material gentico. Esta diviso interrompida numa profase tardia ou metafase precoce (desde que seja bem conhecido o tempo desde a fase S at metafase) onde os cromossomas esto compactados o suficiente para se verem, mas no to compactados para que possam aparecer esticados (em alta resoluo). Assim, passam-se de 300 bandas para 1000 bandas a observar, devido ao bloqueio da fase S pelo metatraxato, ficando cerca de 50% dos cromossomas em prometafase. Isto possvel por se ter uma cultura sincronizada, onde todas as clulas se encontram na mesma fase. Esta tcnica constitui uma vantagem quando se tem pouco material cromossmico. Pode ser importante no estudo de cancros. Mtodos de Colorao das Bandas Anticorpos Marcados Anti-5 metilcitosina e anti-centromricos. A base desta tcnica est no mecanismo de ligao dos anticorpos aos antignios. Permite detectar uma protena especfica numa cultura / extracto de protenas, hibridadas por anticorpos (sonda), no qual o primrio detecta a protena e o secundrio (que est marcado) detecta o anticorpo primrio, servindo, desta forma, para tornar o sinal de deteco mais forte.
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Mtodos de Colorao das Bandas Enzimas de Restrio Enzimas de restrio / Endonucleases enzimas que fragmentam o DNA por hidrlise em locais especficos. Reconhecem uma dada sequncia de nucleotdios / regies especficas, fragmentando o DNA sempre que essa mesma sequncia encontrada. Locais de restrio nucleotdios que as enzimas de restrio reconhecem, cortando o DNA nessa mesma sequncia. A mesma enzima de restrio corta sempre perante a mesma sequncia de nucleotdios em qualquer DNA. No entanto, no mesmo organismo, cortam no mesmo local, originando sempre o mesmo conjunto de fragmentos, mas noutro indivduo diferente originam fragmentos diferentes, pois cortam em regies diferentes. Ocorre a quebra se estiver presente a regio especfica, logo no ocorre a quebra se no estiver essa mesma regio especfica presente. O DNA nessas regies especficas adquire uma determinada cor. Mtodos de Colorao das Bandas Hibridizao in situ Hibridao in situ envolve hibridao de um fragmento de cido nucleico a uma preparao cromossmica de DNA desnaturado ou a uma seco de tecido de RNA. Deteco de sequncias de cidos nucleicos, atravs de sondas de DNA/RNA. As sondas hibridizam directamente com determinadas regies de cromossoma, originando uma fluorescncia, nessa mesma regio. Esta tcnica importante na anlise da presena, ou ausncia, de cromossomas em interfase. FISH (fluorescence in situ hybridization) tcnica citogentica utilizada para detectar e localizar a presena ou ausncia de uma sequncia de DNA especfica ou um cromossoma. Mtodos de Colorao das Bandas Pintura Cromossmica (Chromosome Painting) Cromossomas provenientes de vrias clulas (suspenso) so divididos em funo do seu tamanho. H a hibridao com sondas de DNA ligadas a fluorocromos. Estes fluorocromos so especficos para determinadas sequncias, podendo, desta forma, permitir a observao de anomalias cromossmicas, devido presena de uma cor indesejada na anlise. Ocorre a extraco de DNA (que tem de ser purificado pela extraco de protenas e sua desnaturao), atravs da primeira mquina, que corresponde a um determinado cromossoma, adicionando-se um corante flurescente. Hibridizao deste DNA com cromossomas parcialmente desnaturados. A colocao dos cromossomas na mquina com os 24 tubos (para os 22 autossomas + X + Y) faz com que os cromossomas se distribuam por esses mesmos tubos (cromossoma 1 no tubo 1, cromossoma 2 no tubo 2, ). Permite a abertura dos cromossomas parcialmente desnaturados (cadeias abertas), obtendo-se homlogos com cores diferentes.
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Formam-se embrites e no embries, os quais possuem uma resistncia muito mais baixa que uma planta diplide. Um dos processos de produo de plantas monoplides atravs de uma cultura de clulas haplides. Neste caso, os gros de plen so colocados em meios de cultura (agar) juntamente com algumas hormonas. O crescimento destas clulas d origem a tecidos e, posteriormente, a plntulas haplides.
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Normal Mitose num monoplide, n = 3 Com colquicina por uma diviso celular
Clulas monoplides podem ser transformadas em diplides atravs da aplicao da colquicina. Esta substncia impede a formao do fuso acromtico duplicando, assim, o nmero de cromossomas. realizada, ento, uma mitose no acabada (duas clulas que se unem com a informao gentica de 2 monoplides). Estas clulas podem proliferar e dar origem a tecidos diplides.
Plantas monoplides sensveis Clulas somticas em cultura, num meio selectivo Crescimento de uma plntula resistente Planta monoplide resistente (estril) Colquicina Planta diplide resistente (frtil)
A colquicina no permite a polimerizao do centro acromtico, mas induz a duplicao, logo vai originar a fertilidade. O meio selectivo garante que apenas as clulas resistentes a determinado factor selectivo so aquelas capazes de se proliferar. Consegue-se ento de uma certa forma, manipular determinado nmero de cromossomas, para a planta ser mais rentvel. Conseguindo-se induzir a diploidia (atravs da colquicina, que interrompe a mitose). Este processo em nada est relacionado com o processo de formao dos organismos geneticamente modificados. As plantas monoplides podem ser utilizadas em programas de mutao-seleco utilizando tcnicas de microbiologia. Uma populao de clulas monoplides isolada e as paredes celulares so destrudas enzimaticamente, sendo posteriormente sujeitas a um tratamento com um agente mutagnico. So em seguida colocadas num meio selectivo de cultura que apenas permite o crescimento do fentipo desejado (exemplo, a resistncia a determinada substncia txica como um herbicida). Atravs do tratamento com colquicina as plntulas monoplides so transformadas em plantas diplides (frteis). Euploidias Triploidias Formam-se / originam-se atravs de: Tetraplide Diplide (um tetraplide, normalmente, produz gmetas diplides); Reteno do segundo glbulo polar, que normalmente seria expulso (exemplo colquicina, choques trmicos / presso).
Ocorre esterilidade (que normalmente est associada a triplides), pois a probabilidade de se formarem gmetas no normais muito baixa. Os trs cromossomas vo ser divididos em 2 combinaes diferentes: trivalente ou univalente e bivalente. Interrompe-se a meiose para ser retido o glbulo polar.
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Euploidias Tetraploidias Interessantes para a produo de diplides, pois do cruzamento entre tetraplides e diplides surge uma descendncia consideravelmente diplide, o que pode ser de interesse. Espontaneamente, onde 2n desenvolve-se para 4n. Induzidos (exemplo colquicina, choques trmicos / presso). Ocorre a produo, ou no, de gmetas equilibrados.
Euploidias Alopoliploidias Um indivduo de 4n cromossomas que se cruza com uma das espcies originais, origina um alotriplide estril (por ser um hbrido e por ser tetraplide). Este novo tipo de ser vivo pode ser bastante rentvel. Especiao processo evolutivo pela qual as espcies vivas se formam. Pode constituir uma transformao gradual de uma espcie noutra ou pela diviso de uma espcie em duas. Pode ser induzida artificialmente atravs de cruzamentos seleccionados. Hibridizao celular fuso de protoplastos. Ginognese processo muito raro, no qual existe a possibilidade de produo de seres vivos sem a necessidade da informao gentica masculina, ou seja, origina-se um indivduo apenas a partir da informao gentica feminina. Origina seres com um grau de homozigotia elevadssimo, o que bastante perigoso para a variabilidade dessas espcies. No nada semelhante ao processo de partenognese (sem formao de gmetas), pois h a formao do gmeta feminino que origina as novas fmeas. A informao provm toda do gmeta feminino, o espermatozide apenas contribui com o centrossoma.
Espcies Originais
O burro que nasceu de um burro coxo e de uma me mula, que por sua vez era filha de um burro e de uma gua (hbrida) deita por terra tudo o que foi estudado sobre a infertilidade dos hbridos inter-especficos. Neste caso, houve provavelmente uma meiose que conseguiu chegar at ao fim, na hbrida (descendente do cruzamento inter-especfico de um burro com uma gua), originando um gmeta feminino que s possua a informao da espcie burro. Esse gmeta conseguiu ser fecundado por um espermatozide de um burro. Este fenmeno algo muitssimo raro, sendo necessrio muita coincidncia e sorte para que acontea.
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Variao no Nmero Aneuploidia Aneuploidia mudana de parte do nmero monoplide herdado (no disjuno). Caritipo com cromossomas a mais ou a menos: Nulissomia (n-1) cromossomas, (2n-2) cromossomas perda de um par de cromossomas homlogos; Monossomia (2n-1) cromossomas, (3n-2) cromossomas perda de um cromossoma; Dissomia (3n-1) cromossomas, (n+1) cromossomas ; Trissomia (n+2) cromossomas, (2n+1) cromossomas um cromossoma extra; Tetrassomia (n+3) cromossomas, (2n+2) cromossomas Variao no Nmero Aneuploidia (Causas)
No disjuno em meiose I
No disjuno em meiose II
Sndrome de Down fruto de no disjuno meitica em meiose I ou meiose II, normalmente por parte da me (erros devido aos vulos serem velhos numa gravidez tardia). A idade materna com maior nmero de nascimentos por volta dos 35 anos. medida que a idade da me aumenta, a frequncia de meioses erradas, tambm, aumenta.
Se a probabilidade das clulas se dividirem for a mesma, o indivduo torna-se um mosaico (por vezes a capacidade das clulas de se dividir fica comprometida). 15
Estes mosaicos resultam em indivduos que podem ter uma doena com menor gravidade. Gmetas Trissomia A: n (50%); n + A (50%) ou n + 2A; n A (muito mais raro). Monossomia A: n (50%); n A (50%). Tetrassomia A: n + A (100%) ou n + 3A; n A ou n + 2A; n. Dupla trissomia (A e B):
3A 3A 3B 2B 1B 0B 3B 2B 0A 1B 0B
Mais comum
3A
ou
3B 2B
2A 1B 0B 3B 2B
1A 1B 0B
Variao na Estrutura Deleco falta de material gentico. Exciso de uma poro de um cromossoma, ou seja, perda no material cromossmico. Esto associadas a grandes incapacidades: Terminal perda de material gentico, numa das extremidades telomricas do cromossoma. A extremidade (2) possui bastante instabilidade porque no tem a regio cromossmica telomrica caracterstica. O segmento (1) acaba por desaparecer ao longo das divises celulares porque no tem centrmero e por isso no tem como se ligar ao fuso acromtico. Este segmento (1) costuma conter DNA nobre pelo que a sua perda implica o desaparecimento de informao importante. O cromossoma no tem telmero e procura ligar-se a outro material gentico (instabilidade). Intersticial perda de material gentico, no meio de uma sequncia cromossmica. O segmento (1) acaba por desaparecer (pelas mesmas razes que o segmento na deleco terminal), se no englobar o centrmero, levando a alteraes fenotpicas. Provoca uma funo deficiente nos tecidos que contm este material gentico, podendo ditar a infertilidade.
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Duplicao pode ocorrer devido a um erro na Fase S ou no emparelhamento dos cromossomas durante a meiose. Duplicao de uma poro de um cromossoma, ou seja, h repetio de uma poro de cromossoma. Fornecem uma informao gentica complementar, potencialmente capaz de assumir novas funes. Quanto maior for o nmero de repeties e a sequncia repetida, maior pode ser o grau de gravidade de certa doena. Inverso inverso de uma poro de um cromossoma, ou seja, h uma rotao, de um segmento cromossmico, em relao posio normal, sem alterar a sua localizao no cromossoma. Quando a inverso no ocorre a meio de uma sequncia de um gene estrutural (zona no codificante), no ocorre nenhuma consequncia malfica, ou seja, o cromossoma continua funcional em termos somticos. Estas rupturas em genes estruturais so as mais raras. No h perda nem ganho de material gentico. Pericntrica tipo de inverso que envolve o centrmero. Com este tipo de inverso, h na mesma o emparelhamento das cadeias.
Translocao troca de uma poro de um cromossoma por outra poro de outro cromossoma. Ocorre entre 2 cromossomas diferentes e no homlogos: Simples translocao em apenas 1 cromossoma. o mesmo que insero, de um cromossoma para o outro.
Recproca troca de segmentos entre 2 cromossomas no homlogos, ou seja, de um cromossoma para o outro e desse cromossoma para o primeiro. A sequncia translocada pode conter o centrmero (ficando um dos cromossomas com 2 centrmeros e o outro cromossoma sem qualquer cromossoma, aps a translocao: este fenmeno cria uma anomalia cromossmica secundria, pois a separao do cromossoma com 2 centrmeros provoca uma deficincia na informao gentica das 2 clulas originadas) ou no conter o centrmero (cada um dos cromossomas fica com 1 centrmero aps a translocao).
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Robertsoneana pode estender-se a qualquer espcie, tanto animal como vegetal. Ocorre quando, em cromossomas acrocntricos, h uma ruptura na regio do centrmero, ou acima do mesmo. Estes 2 cromossomas vo, ento, sofrer uma tendncia para se unir. Ou seja, vai ocorrer a fuso dos braos longos de ambos os cromossomas, sem os braos curtos que se perdem. Esta ruptura no possui precursores fenotpicos, uma vez que os braos curtos no codificam, praticamente, informao e os braos longos continuam a ser transcritos normalmente. No entanto existem repercusses graves a nvel meitico. suficiente para o equilbrio gentico. Os braos curtos podem persistir e formar um cromossoma marcador, ou ento podem degenerar e desaparecer. Isocromossoma ocorre quando existe a duplicao de toda a cromatina, em cromossomas. H uma diviso do centrmero horizontal, em vez de ser vertical. Esta anomalia pode ocorrer em qualquer tipo de cromossoma, formando-se, no fim, 2 cromossomas metacntricos, por excelncia (1 s dos genes do brao curto e outro s de genes do brao longo). Sem problemas meiticos mas com problemas a nvel celular.
Anel cromossoma com forma de um crculo. um cromossoma normal no qual, por um motivo qualquer, surge uma ruptura, e as suas extremidades unem-se, ou seja, ocorre a juno de duas partes cromossmicas que sofrem deleces terminais. As implicaes dependem do local onde ocorrem as rupturas, ou seja, existem reflexos fenotpicos quando a ruptura ocorre em locais codificantes importantes. Em termos meiticos possui uma grande influncia. Estes anis formados possuem na mesma um centrmero.
Meiose Por vezes, ocorre toro das duas cadeias, formando anis entrelaados, que quando se puxam os centrmeros, para migrarem para plos opostos, ocorre algures uma ruptura do cromossoma, que pode levar a uma perda de material gentico importante, e formao de um supercromossoma. Importncia em Termos Evolutivos A inverso (pericntrica e paracntrica) e a translocao (simples, recproca e robertsoneana) so as variaes mais importantes a nvel evolutivo, pois favorecem a evoluo (vantagem evolutiva). De seguida est a deleco (terminal e intersticial) e a duplicao, pois a probabilidade de ocorrer um indivduo de fentipo normal e muito inferior. Em ltimo lugar, como variaes menos importantes ao nvel evolutivo, aparece o isocromossoma e o anel, pois ambos provocam anomalias na estrutura, as quais podem ser mais ou menos graves, consoante as rupturas que ocorram. 18
Para que os genes B e F se aproximem, e emparelhem correctamente, a cadeia normal de DNA (verde), tende a formar uma ansa. Pode ocorrer uma ligao (a tracejado) devido grande proximidade entre as extremidades das ansas. Estas ligaes vo levar formao de um microcromossoma circular e sem centrmero (CDE), que tende a desaparecer. Assim, o cromossoma homlogo faz uma ansa para que exista emparelhamento. A duplicao destes pares de cromossomas (CDE em anel e ABF linear) pode levar sua duplicao e formao de mais 1 cromossoma de cada um deles. As ansas tambm podem formar cromossomas em anel sem centrmero, provocando uma deleco no homlogo. Variao na Estrutura Duplicao Este mecanismo inverso ao mecanismo da deleco, no entanto a predisposio de ambos semelhante. Assim, pode formar, na mesma, um microcromossoma (3 4) juntamente com o cromossoma linear (1 2 3 4 5), mas ao contrrio do anterior, a perda desse microcromossoma, no provoca implicaes, uma vez que os genes perdidos (3 4) deixam uma cpia no cromossoma linear, pois foi duplicado. Assim, o fragmento duplicado forma a ansa, e se ocorrer a deleco dessa ansa, tornase uma vantagem selectiva, pois a duplicao eliminada. Esta perda constitui uma mais-valia para o cromossoma, pois elimina os genes em duplicado, quase que anulando a variao do cromossoma. Variao na Estrutura Inverso Paracntrica
Interfase
Existe grande probabilidade de ocorrer crossing-over Crossing-over Cromossoma normal (vermelho) faz uma ansa e o cromossoma invertido (azul) faz um looping Com crossing-over o resultado catastrfico (ocorrem deleces e duplicaes)
Sinapse Anafase I Segmentos C, D e F revertem por ruptura em dois pontos. O cromossoma sofre por mudanas radicais, de forma a conseguir emparelhar os segmentos correspondentes. Em termos fenotpicos, so indivduos normais, mas o grande problema ocorre na meiose. Pois no fim, vo ser obtidos cromossomas muito diversos e anormais, possuindo, por exemplo, 2 centrmeros no mesmo cromossoma, nenhum centrmeros ou com duplicaes.
Sem crossing-over o indivduo comporta-se normalmente pois est l todo o seu material gentico
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Produtos de um duplo cruzamento (recombinao dupla) numa zona invertida, envolvendo diferentes combinaes de cromtides existem 2 pontos de quiasmata na ansa, logo vo originar cromossomas 100% anormais: Com recombinao dupla entre 2 cromtides: GMETAS
50% Normal 50% Anormais No problemtico
Com dupla recombinao entre 3 cromtides: GMETAS Com dupla recombinao entre 4 cromtides: GMETAS
100% Anormais Pior caso 25% Normal 75% Anormais Muito grave
Variao na Estrutura Inverso Pericntrica O centrmero aparece na regio da ansa. menos prejudicial que a situao quando o centrmero est fora da ansa / inverso, pois assim no existe o perigo de se formarem cromossomas com 2 centrmeros, na meiose. A posio do centrmero atenua a gravidade da situao (se todos os cromossomas tm um centrmero cada, o caso muito menos grave). Recombinao: GMETAS Recombinao dupla: GMETAS
Normal Com crossing-over Com inverso Com crossing-over e inverso Normal Modificado Normal Com inverso
Variao na Estrutura Translocao Simples (Insero) Emparelhamento A origem de uma ansa no gene inserido provoca a origem de uma ansa na sequncia que emparelha com esse gene. Os cromossomas emparelham desta forma pois o gene Y forma uma ansa para que todo o cromossoma normal (azul escuro) consiga emparelhar normalmente. Os genes X e Z vo emparelhar em forma de V para o lado oposto do plano. Esta forma de emparelhamento faz com que seja possvel formar um cromossoma em anel apenas com o gene Y. Este tipo de transcrio no leva, normalmente, condio de infertilidade mas em alguns casos pode levar a um estado de sub-fertilidade, pois a meiose estagna em determinada fase de diviso, no prosseguindo mais. 20
Variao na Estrutura Translocao Recproca O mecanismo semelhante ao da translocao simples, mas ocorre a formao de 2 ansas. As ansas formam-se devido necessidade do cromossoma (azul escuro) emparelhar correctamente. Como no caso anterior, pode originar algumas clulas com sub-fertilidade, ou seja, originar clulas que parem a sua meiose, nunca a concluindo. No entanto, em alguns casos (raros) podem levar infertilidade. A seleco natural consegue identificar, seleccionar e eliminar estes casos. Emparelhamento Envolvendo os telmeros dos dois pares ocorre um emparelhamento num sentido perfeito (neste nvel), de regio a regio: Existem 3 modos de segregao dos cromossomas (para se formarem gmetas), para este caso (consoante as linhas a tracejado). Nas vrias clulas onde ocorre a meiose podem estar a ocorrer as diversas segregaes, pois no obrigatrio todas as clulas (com este erro) em meiose, de um indivduo, estarem / possurem o mesmo tipo de segregao.
Assim os 3 tipos de segregao so: Adjacente 1 para plos opostos vo centrmeros homlogos; Adjacente 2 para o mesmo plo vo centrmeros homlogos; Alterna a melhor segregao pois origina um gmeta equilibrado j que tem todo o material gentico e apenas a estrutura cromossmica trocada. Segregaes:
Adjacente 1 cromossomas II e III para um dos plos, e cromossomas I e IV para o outro plo.
Adjacente 2 cromossomas I e III para um dos plos, e cromossomas II e IV para o outro plo.
Alterna cromossomas III e IV para um dos plos, e cromossomas I e II para o outro plo.
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Gmetas
Zigotos
O resultado pode levar formao de um indivduo normal, equilibrado ou com alteraes cromossmicas, considerando o seu cruzamento com indivduos normais. Gmeta equilibrado no um gmeta normal, mas um gmeta que no tem duplicaes ou falta de material gentico. Ou seja, uma clula que apresenta um equilbrio de material gentico, que embora fora do local correcto, possui toda a informao gentica respectiva. O problema deste gmeta ocorrer no incio da fase germinativa ou do zigoto. Variao na Estrutura Translocao Robertsoneana
Segregaes segue o mesmo mecanismo que a translocao recproca. Pode ento ocorrer de 3 formas diferentes (adjacente 1, adjacente 2 e alterna): Adjacente 1 cromossomas II e III para um dos plos, e cromossoma I para o outro plo. Adjacente 2 cromossomas I e III para um dos plos, e cromossoma II para o outro plo. Alterna cromossoma III para um dos plos, e cromossomas I e II para o outro plo.
Esta trissomia 21 no total, pois o que ocorre a presena de 3 braos longos do cromossoma 21. Leva a situaes inviveis vida mas tambm, a outras situaes perfeitamente aceitveis. Por definio de translocao robertsoniana, so os braos longos os translocados entre os 2 cromossomas. 22
O prprio cromossoma emparelha-se sobre si mesmo, ou seja, dobra-se sobre o seu prprio centrmero e emparelha.
Variao na Estrutura Anel Aquando da duplicao do seu material gentico e da meiose I, h uma grande predisposio para as cadeias se entrelaarem, levando a uma ruptura, algures, durante a ascenso do cromossoma para os plos opostos. Origina 2 anis completamente desproporcionais.
Entrecruzamento meitico
Pode ento ocorrer a juno dos 2 anis rompendo num ponto qualquer, e na anafase ocorrer um ganho de um dos plos e perda do outro plo.
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Incidncia de cerca 1/6700. Caractersticas: baixo peso (inferior a 2,5 quilogramas); implantao baixa das orelhas; microretrognatismo; crnio alongado no sentido anteroposterior; pele laxa e abundante no pescoo; plvis estreita; cardiopatia congnita; malformaes renais; atraso mental marcado. Cerca de 70% dos indivduos morrem entre o primeiro e o dcimo anos, pelo que possui uma elevada mortalidade. Monossomia X Sndrome de Turner nica monossomia compatvel com a vida. Incidncia de cerca 0,3/1000. Caractersticas: meninas eternas; atraso no desenvolvimento (permanece infantil); pterigium coli (prega no pescoo); trax alargado; amenorreia primria (no tem ovrios mas tem tero, logo so estreis); ausncia de caracteres sexuais secundrios; rgos genitais internos imaturos e sem epitlio germinativo. Como possuem tero, podem ter filhos no biolgicos por implantao de um embrio. Existem tratamentos para alguns casos, como administrar suplementos hormonais o que permite o desenvolvimento de caracteres sexuais. Trissomia X Anomalias nos cromossomas sexuais so bem toleradas nos mamferos. Incidncia de cerca 1/1000. Por vezes, as mulheres formadas podem ser frteis. Caractersticas: amenorreia secundria; hipoplasia dos lbios vaginais; frequentes alteraes neuro-psquicas; ciclos menstruais irregulares. Por vezes so frteis tendo grande probabilidade de terem filhos normais.
Sndrome de Klinefelter 47, XXY Incidncia de cerca 1,4/1000. Caractersticas: hbito eunucide; ginecomastia; hipogonadismo (gnadas pequenas) que afecta os caracteres sexuais secundrios e a funo testicular; plo pbico de implantao horizontal; azoospermia em mais de 95% dos casos; diminuio dos nveis de testosterona; elevao dos nveis das hormonas folculo-estimulantes (FSH) e luteoestimulantes (LH); indivduos estreis mas no impotentes que apresentam uma mistura de caractersticas masculinas e femininas. 24
Sndrome da super-masculinidade. Incidncia de cerca 1/2000. Caractersticas: estatura elevada; ginecomastia; sub-fertilidade; pnis de dimenses reduzidas; por vezes ligeiro atraso mental; indivduos com comportamentos agressivos.
Deleco de uma regio do brao curto do cromossoma 5. Os recm nascidos possuem um choro semelhante ao mio de um gato (da o nome da doena). Origina crianas com bastantes defeitos de qualidade de vida. Caractersticas: baixo peso ao nascimento; microcefalia; estrabismo; atraso psicomotor marcado; possvel associao de malformaes renais e cardacas.
18 p- (Deleco do Brao Curto do Cromossoma 18) Ocorre a deleco de uma regio do brao curto do cromossoma 18. Caractersticas: atraso mental acentuado; microcefalia; lbio leporino (esta fenda labial por vezes pode passar para o palato originando uma fenda palatina); pavilhes auriculares mal-formados. X Frgil Origina-se devido a uma constrio na parte distal (Xq27), ou seja, ocorre um estrangulamento na parte distal do brao longo do cromossoma X. Caractersticas: baixo QI (50-60); mulheres com macro-orquidia; testa larga; palato muito arqueado.
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Abertura da Zona Pelcida necessrio que exista um buraco na zona pelcida para que a pipeta penetre dentro do ocito e recolha as clulas. Para tal, utilizam-se algumas tcnicas / solues que dissolvem a regio em contacto: Soluo cida de Tyrod (pH 2,2); Laser; Disseco parcial microcirurgia. Pegam-se em pipetas para segurar o ocito, e com muita calma e vagar vo sendo retiradas clulas, sucessivamente, at se fazer um buraco na camada. Para que esta abertura seja feita, os ocitos necessitam de se encontrar num meio especial, sem clcio (Ca2+) e magnsio (Mg2+) Diagnstico Unicelular A clula retirada a que vai ser estudada atravs de mtodos citogenticos. FISH - tcnica citogentica utilizada para detectar e localizar a presena ou ausncia de uma sequncia de DNA especfica ou um cromossoma. Possibilita o estudo a determinados cromossomas problemticos atravs da hibridizao in situ. Permite identificar anomalias cromossmicas: Nmero; Translocaes (recprocas, inseres e robertsoneanas); Reconhecimento de XX e XY em Portugal ilegal a utilizao deste mtodo para serem implantadas as clulas apenas de um dos sexos por deciso de determinado casal. Este apenas se realiza no caso de existir na famlia alguma doena que esteja associada a qualquer um dos sexos. So estudados, principalmente, os cromossomas 13, 16, 18, X, Y. Sondas: Sequncias repetitivas ou sondas -satlite; Sondas loci especficas; Pintura cromossmica. Atravs das cores originadas, sabe-se o nmero de cromossomas iguais, existente naquele caritipo. Existem 6 cpias do cromossoma azul, 5 cpias do cromossoma verde, e 2 cpias dos cromossomas a vermelho e a amarelo, o que se traduz em graves erros cromossmicos. As 5 e 6 cpias do mesmo cromossoma provavelmente sero devidas a uma no-disjuno mittica ps-zigticas. Transferncia de Embries Ocorre no quarto ou quinto dia aps a puno folicular. Taxa de gravidez clnica em DGPI 22,4 %.
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Tipo selvagem
Corpos frutferos
Tubos de meio completo inoculados com um nico ascsporo. Tubos de meio mnimo (com poucos nutrientes) sem crescimento. Identificao de um mutante nutricional. Concluram que haveria algo no tubo de meio completo favorvel ao desenvolvimento do fungo. Os esporos crescidos em meio completo so ento inoculados em meio mnimo, com diferentes meios suplementares: Meio mnimo controlo. Meio mnimo com aminocidos com crescimento. Obtiveram-se resultados importantes, pois nuns tubos havia o desenvolvimento do fungos, mas noutros tubos, isso no se verificava. Meio mnimo com vitaminas sem crescimento; Meio completo controlo. Para se averiguar que aminocido intervinha no crescimento do fungo, foram feitos vrios testes de meio mnimo com 1 aminocido de cada vez (glicina, alzinina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilanina, prolina, arginina, lisina, cido glutmico, cido aspartico, glutamina, asparagina, serina, treonina, cisteina). A repetio desta experincia n vezes levou concluso de que h uma dependncia da adio de arginina: ARG1 desenvolvimento com ARG, CITR ou ORN; ARG2 desenvolvimento com ARG ou CITR; ARG3 desenvolvimento com ARG.
Precursor X ORN Y CITR Z ARG
ARG1 deficincia da enzima X; ARG2 deficincia da enzima Y; ARG3 deficincia da enzima Z. Esta sequncia metablica foi a razo de terem chegado hiptese um gene uma enzima.
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Estrutura das Protenas Protenas sequncias de aminocidos com uma estrutura muito mais complexa e diversificada que o DNA, ou seja, so polmeros de aminocidos em cadeia linear. Diferentes nveis da estrutura de uma protena: Estrutura primria sequncia linear de aminocidos, ou seja, a sequncia de aminocidos da cadeia polipeptdica. Estrutura secundria formao de cadeias alfa e beta atravs de pontes de hidrognio. H uma organizao localizada em partes da cadeia polipeptdica, estabilizada por pontes de hidrognio. Estrutura terciria estrutura tridimensional. A conformao global da cadeia polipeptdica (arranjo tridimensional) estabilizada por pontes de hidrognio, ligaes inicas, interaces hidrofbicas e pontes de dissulfito. Estrutura quaternria ligao de vrias cadeias polipetdicas. O nmero e posio das subunidades de protenas multimricas so estabilizados por pontes de hidrognio, ligaes inicas, interaces hidrofbicas e pontes de dissulfito. Modelo da Relao Gentipo Fentipo As caractersticas de um organismo so determinadas pelo fentipo das suas partes, que por sua vez so determinadas pelo fentipo das clulas que o constituem. O fentipo de uma clula determinado pelos processos bioqumicos controlados por enzimas que catalisam as reaces metablicas. As funes de uma enzima dependem da sua estrutura tridimensional, que por sua vez depende da sequncia linear dos aminocidos. As enzimas presentes numa clula, bem como as protenas estruturais, so determinadas pelo gentipo dessa clula. Os genes determinam a sequncia linear de aminocidos na cadeia polipeptdica e, consequentemente, da protena. Assim, os genes determinam os fentipos, a qualquer nvel.
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Protenas Isoenzimas formas similares e funcionais de enzimas, que podem ser produzidas por loci diferentes ou por alelos diferentes do mesmo locus. Aloenzimas um subconjunto das isoenzimas, que so variantes de polipeptdeos representando diferentes alternativas allicas do mesmo locus. So duas protenas do mesmo locus que produzem enzimas diferentes, mas com a mesma funo (exemplo: peptidades (PEP), esterases (EST), adenosina deaminase (ADA), creatinina quinase (CK), isocitrato dehidrogenase(IDH), etc). Protenas plasmticas e dos glbulos vermelhos (exemplo: albumina (ALB), transferrina (TF), -hemoglobina, -hemoglobina, etc). Protenas monomricas possui uma cadeia polipeptdica. Considera-se apenas 1 subunidade. Protenas multimricas possui mais que uma cadeia polipeptdica. Consideram-se 2 subunuidades. Subunidades: Homomricas idnticas na sequncia de aminocidos; Heteromricas no idnticas na sequncia de aminocidos.
Monmero L1 L2 Dmero L1 L1 L1 L2 L2 L2 Trmero L1 L1 L1 L1 L1 L2 L1 L2 L2 L2 L2 L2 Tetrmero L1 L1 L1 L1 L1 L1 L1 L2 L1 L1 L2 L2 L1 L2 L2 L2 L2 L2 L2 L2
Electroforese Electroforese mtodo de separao baseado nas diferenas de carga. Electroforese de protenas utilizado na classificao dos aminocidos: Hidrofbicos pouco solveis, no tm grupos polares; Polares possuem grupos polares, com elevada solubilidade: o Neutros no so ionizveis; o Positivos comportam-se como bases e so ionizveis, podendo ficar carregados positivamente (lisina e arginina, histidina); o Negativos comportam-se como cidos e so ionizveis, podendo ficar negativamente carregados (cido asprtico, cido glutmico). Electroforese de Protenas Mtodo Convencional
Homozigtico Monmero Heterozigtico Homozigtico
Dmero
Trmero
Geralmente realizadas em matriz de amido ou agarose. Sistemas electroforticos contnuos, a pH constante. Por vezes, apresentam pouca resoluo nas bandas dos diferentes alelos, principalmente quando a diferena de carga entre eles muito pequena. As bandas difundem-se e ficam arredondadas. Perfis electroforticos
Tetrmero
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Electroforese de Protenas Focagem Isoelctrica Mtodo altamente resolvente no qual as protenas so separadas na presena de um gradiente de pH. As protenas migram de acordo com o seu ponto isoelctrico (PI). Baseada na utilizao de substncias sintticas de carcter anfotrico que se designam por anflitos. Os anflitos diferem muito ligeiramente no seu ponto isoelctrico. Matriz de separao em gel (poliacrilamida ou agarose). Os anflitos criam um gradiente de pH no gel. Utilizam-se solues de elctrodos (cido para o nodo e base para o ctodo). Permite a separao de alelos com diferenas muito pequenas de pH, at 0,02 unidades de pH. Mtodos de Deteco Directos colorao de protenas. Indirectos deteco funcional, imunolgico ou por marcadores (radioactivos, fluorescentes, fosforescentes). Hemoglobina Possui 4 cadeias polipeptdicas: 2 cadeias de 141 aminocidos e 2 cadeias de 146 de aminocidos, codificadas por loci diferentes (cadeias codificadas no cromossoma 16 e cadeias codificadas no cromossoma 11). Hemoglobina A na posio 6 da cadeia existe cido glutmico. Hemoglobina B na posio 6 da cadeia existe valina (causa da anemia falciforme). Segregao do tipo mendeliano: Hopkin-2 HbS anomalia na cadeia ; HbS + Hopkins-2 HbS Hopkins-2 anomalia na cadeia . Alterao aminoacdica envolvida na formao da hemoglobina S, no Homem, responsvel pela anemia falciforme (posio 6 da cadeia ):
Algumas substituies aminoacdicas encontradas na hemoglobina humana. Cada mutao, que resulta na mudana do aminocido indicado, provoca uma doena.
Arquitectura das protenas chave da funo do gene. Mutao substituio de um ou mais aminocidos: Protena no funcional; Protena funcional.
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A A
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Os genes esto localizados nos cromossomas, os quais possuem como componentes estruturais, protenas e DNA. Definio possvel de gene unidade fsica, funcional e bsica da hereditariedade, que contm e transfere informao de gerao para gerao. Molecularmente, e numa aproximao simples, pode ser considerada como uma sequncia de nucletidos que codifica uma protena ou um RNA. DNA como Suporte da Informao Gentica Os genes considerados os factores hereditrios descritos por Mendel que estavam associados a caracteres especficos, mas cuja natureza fsica era desconhecida (em 1953). A teoria um gene uma enzima, postulava que os genes controlavam a estrutura das protenas. As investigaes de Griffith e Avery apontavam para o facto de o DNA ser o material gentico. Todas as experincias demonstravam que as clulas bacterianas que expressavam um determinado fentipo podiam ser transformadas em clulas com outro fentipo e que o agente transformador era o DNA. Assim, como concluso, averigua-se que o material gentico o DNA. Estrutura do DNA A descoberta da estrutura em dupla hlice: Chargaff conclui que no DNA, o total de timina era sempre igual ao total de adenina, e o total de citosina era sempre igual ao de guanina, no entanto a quantidade de adenina com timina, no era igual guanina com citosina, e a razo variava de espcie para espcie. Rosalind Franklin obteve fotos raio-X de DNA, que mostravam o DNA como uma molcula longa e helicoidal. Os dados de raios X mostravam que o DNA era uma molcula longa e helicoidal (Franklin). No entanto, dos trabalho de Chargaff conclui-se que: O total de nucletidos pirimidina (timina e citosina) era sempre igual ao total de nucletidos purina (adenina e guanina), em todos os organismos estudados, apesar de a razo variar de organismo para organismo. O total de timina era sempre igual ao total de adenina, e o total d citosina era sempre igual ao de guanina. No entanto, a quantidade de adenina mais timina no necessariamente igual a guanina mais citosina e esta razo variava de espcie para espcie. Assim: ; ; e . Cada cadeia de DNA um longo polmero. Os monmeros so os nucletidos. Nas cadeias anti-paralelas existe complementaridade de bases. Nucletidos constitudos por uma pentose, uma base e um grupo fosfato. No DNA ou RNA a pentose est associada a um s fosfato, no entanto os nucletidos celulares livres podem conter 2 / 3 fosfatos (ADP, ATP). Nucleosdeo = Base + Pentose; Nucletido = Nucleosdeo + Fosfato. Pentose:
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Pirimidinas 1 anel:
Cadeia de cidos nucleicos numa cadeia, 2 nucletidos esto unidos por uma ligao fosfodister. Uma molcula de DNA possui 2 cadeia unidas por pontes de hidrognio entre bases. As cadeias so antiparalelas, logo tm polaridade oposta. As cadeias tm orientao / polaridade: Extremidade 5 grupo fosfato (PO4) livre; Extremidade 3 grupo hidroxil (OH) livre. Regras de emparelhamento entre bases determinam que as duas cadeias sejam complementares. Adenina e timina ligam-se segundo 2 pontes de hidrognio, enquanto guanina e citosina ligam-se atravs de 3 pontes de hidrognio. Baseando-se nestas pistas, Watson e Crick propuseram uma estrutura de dupla hlice para o DNA: Cada hlice uma cadeia de nucleotdeos ligados por pontes fosfodisteres, nos quais o grupo fosfato forma uma ponte com o grupo hidrxido (OH). Cada cadeia tem uma polaridade: uma extremidade 5 do grupo fosfato e a outra 3 do grupo hidrxido. As cadeias da hlice de DNA so complementares e esto unidas por ligaes de pontes de hidrognio entre as bases. As ligaes so muito especficas e apenas existem entre: adenina timina e entre guanina citosina (mais fortes por terem as 3 pontes de hidrognio). Dogma Central da Biologia Molecular
Replicao
DNA
Transcrio
RNA
Traduo
Protena
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O diagrama (proposto por Crick) sumaria o processo bsico de transferncia unidireccional de informao numa clula. O fluxo de informao DNA protena, no tem retorno, pois o cdigo de DNA convertido em protena mas no pode ser desconvertido. Algumas descobertas posteriores no coincidiram com este Dogma: O RNA pode sofrer replicao em alguns vrus e plantas; O RNA viral, atravs de uma enzima denominada transcriptase reversa, pode ser transcrito em DNA; O DNA pode directamente traduzir protenas especficas sem passar pelo processo de transcrio, porm o processo ainda no est bem claro.
Os retrovrus (HIV) usam a enzima transcriptase reversa para, dentro de uma clula hospedeira, sintetizar DNA tendo como molde o seu prprio material gentico RNA. O RNA ultrapassa muito o papel de mero intermedirio que sugeria a formulao inicial do dogma central. A sua importante funo no controlo da expresso gnica tem vindo a ser cada vez mais evidenciada. Replicao do DNA manuteno da informao gentica. Existem 3 modelos possveis de replicao: b. Dispersivo: c. Conservativo: b. Semi-conservativo:
Replicao do DNA: Duplicao semi-conservativa; Cada uma das cadeias actua como molde para uma nova cadeia, originando assim 2 duplas hlices; Cada molcula de DNA contm uma cadeia nova e outra antiga.
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Replicao do DNA Manuteno da informao Gentica O processo de replicao do DNA muito conservado, pois basicamente o mesmo, desde Escherichia coli, em qualquer mamfero. No entanto, nos mamferos a complexidade maior, o que se reflecte no aumento do nmero de polimerases ou de outros componentes proteicos intervenientes no processo. Replico unidade de replicao. Forquilha durante a duplicao, as cadeias vo-se separando, formando uma forquilha de duplicao onde so adicionados nucleotdios livres, formando, por complementaridade, a nova cadeia. Processo de replicao do DNA: Cromossoma circular: Bactrias (procariotas) possuem um nico cromossoma circular. A replicao ocorre apenas a partir de um ponto de origem da replicao e ocorre nos 2 sentidos, at regio terminus (TER). So necessrios cerca de 40 minutos para completar a replicao, que ocorre a cerca de 1000 pares de base / segundo. Ori incio da replicao. So regies ricas e Ats. Cromossoma linear: Eucariotas mltiplos pontos de origem de replicao, onde o processo pode ocorrer em simultneo. A clula de um mamfero pode conter entre 50 000 100 000 replices, unidades de replicao (cada uma com 40 200 Kb). O ciclo de replicao varia entre 1 hora / 4 horas a 24 horas. Polimerases Polimerases catalisam a ligao de nucletidos livres a uma cadeia de DNA. Procariotas: Polimerase I preenchimento de pequenos segmentos de DNA (replicao e reparao); actividade exonuclesica. Polimerase II enzima de reparao. Polimerase III funo principal durante o processo de replicao; elevada processividade; actividade exonuclesica.
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Eucariotas: Polimerase incio da replicao; baixa processividade; actividade primase. Polimerase enzima de reparao. Polimerase funo principal durante o processo de replicao; elevada processividade; actividade exonuclesica. Polimerase enzima de reparao. Polimerase - funo principal durante o processo de replicao do DNA mitocondrial; elevada processividade; actividade exonuclesica. As polimerases actuam sempre na direco 5 3. Apenas conseguem catalisar a ligao entre um 5-PO4 de um nucletido livre com 3OH de um nucletido j inserido numa cadeia. Processo de Replicao
Incio da replicao as polimerases no conseguem iniciar a sntese de novo a partir de um molde de cadeia simples. Precisam de um grupo 3OH livre ao qual possam adicionar um dNTP. Este grupo 3OH livre designa-se por primer, que sintetizado por uma primase, que A outra cadeia uma polimerase de RNA. parental permanece em cadeia simples. Replicao contnua (leading strand). Sntese progride no sentido da replication fork. Replicao descontnua com formao de fregmentos Okazaki (Lagging strand). Em cada fragmento a sntese processase no sentido contrrio ao movimento da forquilha de replicao mas, no global, o crescimento da nova cadeia acompanha a direco da abertura das cadeias. Fragmentos Okazaki: Procariotas cerca de 1500 pares de bases. Eucariotas cerca de 150 pares de bases.
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A enzima DNA polimerase inspecciona (proofreads) as bases adicionadas e substitui os nucletidos incorrectos.
Actividade polimersica da polimerase de DNA preenche os gaps. Ligase forma ligaes no esqueleto acar-fosfato.
Leading strand cadeia contnua. Lagging strand cadeia descontnua. Fragmentos de Okasaki RNA primer juntamente com DNA. Fragmentos de Okazaki Aps a sntese de um fragmento de Okasaki, fica um gap na extremidade 3. O segmento de Okasaki adjacente tem em 5 um primer de RNA. Esta sequncia removida e o gap preenchido, ambas pela polimerase I. a ligao fosfodister final entre 2 fragmentos de Okasaki formada pela ligase de DNA.
Concluso da sntese de fragmentos de Okasaki forma um intervalo entre o fragmento de Okasaki e o RNA primer precedente na lagging strand DNA polimerase I aumenta o fragmento Okasaki enquanto a actividade da exonuclease 5' 3' remove o RNA primer. Resulta num movimento do intervalo ao longo da lagging strand DNA polimerase I dissocia aps a extenso do fragmento Okasaki. A DNA ligase liga-se ao intervalo DNA ligase cataliza a formao de ligaes fosfodister, enquanto fecha o intervalo, creando uma lagging strand contnua. A enzima ento dissocia-se do DNA
Intervenientes no Processo de Replicao Incio da replicao protenas iniciadoras da replicao que quebram pontes de hidrognio no local de iniciao. Topoisomerases iniciam o processo de desdobramento do DNA quebrando uma das cadeias do DNA. Em consequncia, o DNA liberta-se da tenso na hlice no estado de super-enrolamento. Girase topoisomerase que actua sobre o estado de super-enrolamento do DNA.
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Helicases ajudam a desdobrar o DNA de cadeia dupla, depois de eliminado o estado de super-enrolamento. Single strand binding proteins (SSB) estabilizam o DNA de cadeia simples. Inibidores da girase de DNA inibidores da replicao bacteriana e tm actividade antibitica. Replicao em Eucariotas e Procariotas Cromossomas circulares Procariotas:
Replicao no Fim dos Telmeros Na extermidade dos cromossomas (telmeros) h um problema com a replicao do DNA. Na leading strand a cadeia nova pode crescer at ao final, no entanto, o gap que fica aps a remoo dos primers de RNA no consegue ser preenchido. Em consequncia os cromossomas encurtam em cada ciclo de replicao. Estrutura dos telmeros:
O encurtamento dos telmeros pode funcionar como um relgico mittico que contabiliza o nmero de divises e limita o fim da proliferao celular sinalizando a entrada em senescncia, levando apoptose (processo natural de morte das clulas). Modelo da telomerase representado como um complexo ribonucleoproteco (RNA + protenas) com actividade de transcriptase reversa. A telomerase no se expressa na maioria das clulas somticas, mas apresenta nveis reduzidos em clulas estaminais e est activa em clulas germinativas. Nas clulas cancergenas, a telomerase est activa expresso de telomerase mantm os telmeros com o comprimento compatvel com a proliferao celular, atravs da adio de sequncias telomricas de repetio. Assim, a clula cancergema torna-se imortal. 41
Passagem da informao gentica contida no DNA dos cromossomas no ncleo para o citoplasma, onde se encontram os ribossomas. O RNA processado no ncleo mas depois transportado para o citoplasma.
RNA cido Ribonucleico Os produtos iniciais de todos os genes so os cidos ribonucleicos (RNA). O RNA similar ao DNA, com excepo da molcula de acar ser a ribose (em vez de desoxirribose), ter a base uracilo em vez de timina e ser uma molcula de cadeia simples em vez de dupla. O RNA produzido por um processo que se baseia numa cpia do DNA (processo de transcrio sntese de RNA). Tipos de RNA RNA informativo: mRNA (RNA mensageiro) intermedirio no processo de descodificao dos genes em cadeias de polipeptdeos. Apresenta diferenas entre procariotas e eucariotas. RNA funcional nunca traduzido em polipeptdeos, possuindo funo ao nvel do RNA. Existem 2 tipos de RNA funcional (tRNA e rRNA) e mais outros 2 tipos nos eucariotas (snRNA e scRNA): tRNA (RNA de transferncia) molcula que transporta os aminocidos para o mRNA durante a sntese proteica. rRNA (RNA ribossmico) forma os ribossomas em conjunto com umas protenas especficas, so as mquinas usadas na sntese de protenas. snRNA (RNA nuclear pequeno) faz parte do processo de splicing no ncleo. scNA (RNA citoplasmtico pequeno) trfico das protenas na clula. Processo de Transcrio A transcrio catalizada por uma enzima, a RNA polimerase, e segue regras similares replicao. Apenas uma cadeia de DNA usada como molde para a transcrio de um dado gene. O RNA sintetizado na direco 5 3, ou seja, um novo nucletido encaixa sempre a extremidade 5 (do RNA) na extremidade 3 (do DNA) de um nucletido de uma cadeia em crescimento. Novos nucletidos apenas podem ser adicionados extremidade 3 de uma cadeia; Na extremidade 5 de uma nova cadeia de RNA (com 3 grupos fosfato livres) a polimerse de RNA no consegue adicionar nucletidos. Uma cadeia de RNA tem a mesma orientao que a cadeia de DNA que no usada como molde: Cadeia de DNA molde antisense; Outra cadeia de DNA sense.
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Ana Cristina Ribeiro Gomes Na polimerizao do RNA, nucletidos novos so sempre adicionados na extremidade 3 da molcula em crescimento. A RNA polimerase move-se a partir da extremidade 3 do molde do DNA, e o RNA forma-se na direco 5 para 3.
Incio
Alongamento
Terminao
Transcrio em Procariotas Nos procariotas, existe um nico tipo de RNA polimerase que transcreve todos os tipos de RNA. . A adio da subunidade sigma permite, ento, a iniciao no local promotor.
Quando um promotor encontrado, a holoenzima e o promotor formam um complexo fechado Mudana conformacional para um complexo aberto, produz uma bolha de transcrio no local de iniciao. Um pequeno RNA sintetizado A subunidade dissociase da enzima core e a RNA polimerase elimina o promotor. Protenas Acessrio, incluindo NusA, ligam-se polimerase
No necessrio um primer para iniciar a sntese de RNA. Quando o factor se liberta da holoenzima, ocorre a ligao de um factor de alongamento (NusA) essencial para a progresso da sntese da cadeia de RNA.
Closed complex = polimerase + + regio promotora. Open complex = polimerase + NusA + cadeia separada. Iniciao regio do DNA que d o sinal de iniciao da transcrio (promotores). Quando a transcrio inicia, o complexo sai. Elongao: O RNA sempre sintetizado de 5 para 3. Logo aps a iniciao o factor dissocia-se da RNA polimerase. Terminao a RNA polimerase reconhece sinais de terminao de 2 tipos. Diferentes factores sigma reconhecem e so especficos de diferentes promotores. Transcrio em Eucariotas 3 tipos de RNA polimerase: RNA polimerase I sintetiza o rRNA. RNA polimerase II sintetiza o mRNA. RNA polimerase III sintetiza o tRNA e pequenas molculas de RNA nuclear e citoplasmtico. 43
Em funo do que necessitam, diferentes clulas transcrevem diferentes segmentos de DNA, designados unidades de transcrio. Unidade de transcrio unidades discretas, espaadas irregularmente no DNA, que consistem em genes e bases flanqueadoras que regulam a sua expresso. No esto presentes no produto proteico. Nestes organismos, apenas uma fraco mnima do DNA total transcrita. Expresso gentica nos eucariotas o RNA processado no ncleo mas depois +e transportado para o citoplasma. Promotores nos Eucariotas Sequncias de DNA localizadas a montante de um gene que sinalizam o incio de transcrio. So reconhecidas por factores proteicos especficos (factores de transcrio) que a se ligam despoletando a organizao da maquinaria de transcrio. TATA box heptanucleotdeo composto por adeninas e timinas (TATATAA ou variantes) presente na maioria dos genes que levam produo de mRNA. Mutaes nesta sequncia diminuem a eficincia do promotor e, consequentemente, a taxa de transcrio do gene. A maioria das mutaes no impede o incio da transcrio mas muitas alteram o ponto de partida do processo. CAAT box geralmente, a sequncia com mais peso na eficincia do promotor. Cada gene tem o seu promotor. A complexidade dos promotores eucariotas muito varivel: Silencers sequncias que reprimem a actividade transcricional de um gene. Unidade de transcrio simples encontrada em eucariotas unicelulares (simples) como leveduras. Enhancers sequncias que aumentam a actividade transcricional de um gene. Podem localizar-se nas regies reguladoras 3 ou 5, ou nos intres. Mdulos complesxos de controlo da transcrio encontrados nos metazoa (eucariontes complexos). Esta organizao elaborada do DNA regulador garante um controlo fino da expresso gnica. Factores de Transcrio As RNA polimerases no tm autonomia para iniciar sozinhas o processo de transcrio. Necessitam da colaborao de uma srie de factores de transcrio (TF) que se ligam a sequncias sinalizadoras localizadas no promotores dos genes. Factores de transcrio (TF) factores proteicos que no fazem parte do complexo holoenzimtico da RNA polimerase, mas so essenciais para o incio da transcrio. Ligam-se ao DNA, com o qual interagem e desepenham um papel fundamental na regulao da expresso gnica. So trans-acting factores por estarem sob o controlo de genes com localizaes diversas, mais ou menos afastados do gene cuja expresso regulam, e por terem de migrar para os seus locais de aco. Para alm disso podem ser activados por factores intra ou extracelulares. Surgem diferentes categorias de factores de transcrio em funo do domnio funcional que ligam ao DNA. Elementos dos promotores cis-acting factores porque a sua funo est limitada ao DNA duplex onde se localizam. TFs e RNA polimerases envolvem-se de forma complexa, acabando por despoletar o incio da transcrio. 44
Processo de Transcrio em Eucariotas O incio mais complexo e requer muitos intervenientes: TBT TATA binding protein. CTD (carboxy terminal domain da subunidade maior da RNA polimerase II. TFs (general transcription factores). Incio de transcrio no promotor da transtirretina. Diferenas entre a transcrio em procariotas e eucariotas: mRNA procaritico (mRNA policistrnico) mRNA directamente traduzido codificando diversos polipeptdeos,ou seja, um mTNA codifica muitas protenas. mRNA eucaritico (mRNA monocistrnico) mRNA processado antes da traduo e codifica apenas uma protena, ou seja, um mRNA codifica uma nica protena. Transcrio em Eucariotas Processamento do RNA compreende vrias modificaes ps-transcrio: Adio de Cap no extremo 5 do pr-mRNA. Adio de cauda poli-A (adenlica) em 3; Splicing dos intres. O processo inicia-se ainda durante a fase de alongamento da transcrio. Adio de 5 Cap a primeira modificao acontece aps a sntese dos primeiros 25 nt. Consiste, por exemplo, na adio de nucletidos modificados, 7-metilguanosina, com direco 5-5. Mas h diferentes tipos de CAPs. Cap sinal que ajuda o ribossoma a reconhecer o incio do mRNA e que protege a extremidade do mRNA da aco de exonucleases. Poli-adenilao adio de adenosinas na extremidade 3. Sequncia consenso de poli-adenilao. Aps o corte, a denilao ocorre, nesse local de corte. Possvel papel da poli (A) estabilidade e sobrevida (rmeoo da poli A parece preceder a degradao de certos mRNAs, logo a poli (A) protege a degradao de mRNA). Adio de adenosinas na extremidade 3 . Poliadenilao em 3, sinal de corte. Splicing, remoo de partes internas do pr-mRNA, os intres. Diferenas entre os Genes Gene procaritico sem intres:
Gene eucaritico:
RNA Splicing Distinguir exes de intres sequncias consensuais (sinalizadoras) permitem que o spliceosoma identifique as terminaes 5 e 3 do intro. Cada espcie tem bases adicionais associadas aos locais de splice (AGGUAAGU presente em todos os Vertebrados). branch site outra sequncia sinalizadora. Cadeia de pirimidinas com adenina, localizadas a cerca de 50 pares de bases antes do local de splice 3. Maquinaria de splicing (spliceosoma) 6 ou mais snRNP (complexo de RNA e protenas):
U1 reconhece o local de splice 5'. Emparelhamento entre prmRNA e RNA de U1 U2 reconhece e liga-se ao branch site U1 e U2 complexam-se, aproximando a terminao 5' e o branch site U4, U5 e U6 juntam-se a U1 e U2, formando o spliceosoma
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Splicing Alternativo Processo de origem de mltiplas variantes de splice a partir de uma cadeia de DNA: Splice / Dont splice um iontro pode ser cortado ou no:se o intro contiver um codo stop, a variante roteica ser mais curta e no funcional, resultando o corte do intro no produto proteico normal; dois produtos proteicos diferentes podem ser originados (com ou sem funcionalidade alterada). Competing 5 ou 3 splice sites presena de 2 locais de splice em 5 (proximal e distal) competindo com um s local em 3, ou vice-versa. Exon splicing quando um exo deveria ser incluido no mRNA maduro cortado juntamente com intres vizinhos. Mutually exclusive exons quando o mRNA pode incluir os exes 1 ou 2, mas no os dois em simultneo. Outros Tipos de RNA O mRNA, por si s no produz os polipeptdeos. tRNA (RNA de transferncia) transporta os aminocidos para o mRNA (nos ribossomas) durante a sntese proteica. rRNA (RNA ribossmico) forma os ribossomas em conjunto com uma protinas especficas. So as mquinas usadas na sntese de protenas. Traduo Mecanismo que ocorre no citoplasma nas clulas eucariticas. Durante a sntese proteica, o mRNA liga-se aos ribossomas. Os aminocidos so levados para os ribossomas ligados ao tRNA. Uma vez que apenas existem 4 bases, a sequncia de uma ou duas bases no suficiente para a codificao dos aminocidos (20), sendo assim so necessrias pelo menos 3 bases. O cdigo gentico lido em conjuntos de trs bases do mRNA (os codes). Os nucleotdeos do codo do mRNA so complementares com uma sequncia de 3 bases no tRNA (o anticodo). tRNA Cada tRNA transporta um aminocido especfico. A especificidade do cdigo gentico reconhecida pelo tRNA. O aminocido correcto , ento, ligado ao tRNA por um grupo de enzimas (aminoacyl-tRNA sintetases). Existindo uma aminoacyl-tRNA sintetase especfica para cada aminocido. Mas, cada sintetase pode reconhecer mais do que um tRNA, uma vez que h mais tRNA (e codes, 64) do que aminocidos (s 20). O tRNA surge de regies do DNA que produzem tRNA em vez de mRNA. O tRNA tem loops que do estabilidade molcula, e possui bases diferentes nos seus nucletidos.
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3 Nucleotdios consecutivos de DNA constituem o codogene, tripleto que representa a mais pequena unidade de mensagem gentica necessria codificao de um aminocido. So apenas sequncias de 3 nucleotdios, mas a partir destes existem possibilidades suficientes para codificar os aminocidos conhecidos. Essas sequncias vo permitir codificar a ordenao de sries de aminocidos que caracterizam diversas protenas. Assim, um cdigo de tripletos forma 1 codo. H 3 grelhas de leitura possveis para uma determinada sequncia de DNA, no entanto, a nica possvel na realidade determinada pelo codo de iniciao (AUG) e a sua localizao. O cdigo gentico degenerado, mas a sinonimia no aleatria:
Relao da 3 base Irrelevante Purinas Pirimidinas 3 em 4 nicas 3 base com igual significado U, C, A, G U ou C A ou G U, C, A G A Nmero de codes 32 (8 famlias) 14 (7 pares) 12 (6 pares) 3 (AU = Ile) 2 (AUG = Met) (UGG = Trp) 1 (UGA = fim)
O cdigo gentico: degenerado (contm redundncias); universal; ambguo; tem codes de finalizao; tem tripletos com dupla funo; o terceiro nucletido de cada codo o menos especfico; codes sinnimos (codes que codificam protenas iguais). Fenmeno de Wobbling Alguns aminocidos podem ser transportados para o ribossoma por formas alternativas de tRNA, com diferentes anti-codes. Alguns tRNA podem transportar o seu aminocido especfico em resposta a diferentes codes, devido a alteraes no emparelhamento da ltima base do anticodo (extremidade 5). Esta flexibilidade designa-se de fenmeno de wobbling. A guanina pode ter 2 posies, nomeadamente emparelhar com uracilo ou citosina. Isto significa que um nico tRNA com um aminocido (neste caso a serina) pode reconhecer 2 codes (UCU e UCC). Codes STOP e Universalidade do Cdigo Gentico Alguns codes no codificam aminocidos. So chamados os codes STOP (codes sem sentido nonsense codons): UAG (codo amber); UGA (codo opal); UAA (codo ocre). A universalidade do cdigo gentico est quebrada parcialmente nas mitocndrias:
UGA AGG , AGA AUA Ncleo STOP Ariginina Isoleicina Mitocndria Triptofano STOP Metionina
Ribossomas RNA ribossmico (rRNA) papel estrutural e funcional no ribossoma (cerca de 1003000 pares de bases). Para uma traduo rpida do mRNa para protena requerida uma molcula capaz de migrar ao longo da cadeia de mRNA, capturar o tRNA complementar a cada codo e ligar os aminocidos para formar uma cadeia, este processo realizado pelo ribossomas. 47
Estes ribossomas so constitudos por 2 subunidades, uma grande e outra pequena, que so construdas no ncleo e exportadas para o citoplasma, mais especificamente, estas subunidades so montadas no nuclolo e exportadas para o citoplasma onde se unem apenas quando esto a sintetizar uma protena a partir da informao de um mRNA. Subunidade pequena emparelha o tRNA com o codo do mRNA; Subunidade grande catalisa a formao das ligaes peptdicas. Constituio em procariotas (70S): Subunidade pequena (30 S) 21 protenas + rRNA (16 S); Subunidade grande (50S) 34 protenas + rRNA (23S + 5S). Constituio em eucariotas (80S): Subunidade pequena (40S) protenas (30S) + rRNA (18S); Subunidade grande (60S) protenas (40S) + rRNA (5S + 5,8 S + 28 S). RNA ribossmico molcula com 100 3000 pares de bases que desempenham um papel estrutural e funcional essencial no ribossoma. Possuem estruturas secundrias com padres complexos. Sntese Proteica
O mRNA liga-se unidade pequena do ribossoma. O tRNA transportando o aminocido entra pelo local A. O tRNA deixa o aminocido, para se ligar ao polipeptdeo em formao, e passa para o local P. Pode-se dividir em: iniciao, elongao e terminao. A estrutura em trevo decorre da composio de bases dos tRNA. As cadeias simples de tRNA contm entre 73 a 94 nucletidos.
Sntese Proteica - Iniciao As sequncias Shine-Dalgarno localizam-se imediatamente antes dos codes de iniciao (AUG e GUG). O emparelhamento complementar ocorre entre 3 de 16 S rRNA e a regio perto da extremidade 5 do mRNA. Esta ligao ajuda a encontrar a grelha de leitura correcta durante a traduo, posicionando o codo de iniciao no local P. Assim, o primeiro aminocido a metionina. Sequncias Shine-Dalgarno.
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Eucariotas: codes de iniciao AUG. Numerosos IFs. Procariotas codes de iniciao AUG, GUG. Significado dependente da posio: AUG no incio tRNA fMet; AUG no interior tRNA Met; GUG no incio tRNA fMet; GUG no interior tRNA Val.
IF-2 + GPT liga-se a fMettRNA. Estabelecem-se pontes de hidrognio entre rRNA de 30 S e sequncias ShineDalgarno 5' do mRNA Produtos dos passos 1 e 2 combinam-se. Forma-se o complexo de iniciao 30S. A subunidade 50 S junta-se a este complexo. IF-1 e IF-3 so libertados e GTP ligado a IF-2 hidrolisado em GDP + Pi. Forma-se um ribossoma 70 S com fMet-tRNAfMet posicionado no local P O ribossoma fica apto a polimerizar um polipeptdeo aceitando o amino-acyl-tRNA seguinte no local A
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So respostas deteco de leses no genoma que impedem que se convertam em mutaes permanentes. Mutao alterao permanente numa sequncia de DNA. As mutaes irreversveis contribuem para a oncognese, envelhecimento, As mutaes so transmissveis quando ocorrem em clulas germinativas. Para minimizar alguns efeitos do metabolismo celular, existem intricados sistemas de defesa antioxidante (siperxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, etc). Diversas enzimas celulares destoxificam potenciais agentes mutagnicos antes de exercerem qualquer aco. Mecanismos de Reparao Os mecanismos de reparao so capazes de reverter as alteraes no DNA (a nica molcula que os seres vivos podem reparar em vez de substituir. Correco pelas polimerases as polimerases tm capacidade de auto-correco diminuindo a taxa de erro. Quando um nucletido mal incorporado, a enzima reconhece o erro, corta o nucletido errado (capacidade exonuclesica) e prossegue a sntese da nova cadeia de DNA. Principais Mecanismos de Reparao Reverso directa mecanismo de reparao de leso que consiste na sua reverso directa gerando as bases normais: Remocao de grupos Fotorreactivao dmeros uma metiltransferase pode de timina podem ser transferir o grupo metil de quebrados por uma enzima uma O-6-metilguanina activada pela luz, para um resduo cistena degenerando as bases do local activo da enzima. originais (Escherichia coli). Base-excision repair (BER) mecanismo de reparao para pequenas leses envolvendo uma s base (metilao, desaminao, oxidao, perda espontnea de bases, ). Leses sujeitas a este mtodo so maioritariamente provocadas por agentes endgenos. Envolve a interveno de glicosilases de DNA que quebram ligaes base-acar, libertando a base danificada e criando locais apurnicos ou apirimidnicos (AP). A enzima AP endonuclease corta a cadeia lesionada em AP e um desoxirribofosfodiesterase, limpa a regio para que uma DNA polimerase possa preencher o local vazio com um nucletido complementar ao da outra cadeia. Uma ligase faz a ligao final entre o 3OH e 5 fosfato livre. Nucleotide-excision repair (NER) mecanismo de reparao para leses de maior extenso, que distorcem o DNA ou segmentos geralmente com mais de uma base danificada. Se no forem corrigidos, bloqueiam a sntese de DNA ou a transcrio. Leses sujeitas a este mtodo so maioritariamente provocadas por agentes exgenos. um processo verstil mas complexo, envolvendo dezenas de participantes proteicos que cooperam em 4 fases principais: 1. Reconhecimento da leso; 2. Juno do complexo multiproteico no local; 3. Corte da cadeia danificada incluindo vrios nucletidos flaqueantes das bases lesadas; 4. Sntese do fragmento pela polimerase usando a outra cadeia como molde.
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Mismatch repair (MMR) principal mecanismo de reparao de erros de emparelhamento (substituio de base nica), que ocorrem durante a replicao do DNA, diminuindo a taxa de incorporao nucleotdica incorrecta. Este sistema tem capacidade para reconhecer qual das 2 cadeias deve ser utilizada como molde para a correco do erro. Um dos sinais que permite reconhecer a cadeia que serviu de molde (no mutada) a presena de bases metiladas. O padro de metilao numa cadeia nascente de DNA ir ser idntico ao da cadeia-me mas h um afastamento temporal entre a sntese de DNA e a metilao de algumas bases. Em regies de DNA repetitivo, erros devidos a slippage durante a replicao so frequentes e podem ser corrigidos por este mtodo. Alteraes genticas que afectam este sistema aumentam a taxa de mutao. Mutaes em genes desta via esto associadas a cancro do colo-rectal hereditrio no poliptico que se caracteriza por instabilidade de microssatlites. Reparao de leses que provocam quebras na cadeia dupla (DSB-double strand breaks) podem ser provocadas por radiao ionizante, raios X, radicais livres, Algumas mutaes em genes envolvidos nos seus mecanismos esto associados a aumento da predisposio a cancros (BRCA1 e BRCA2 no cancro da mama). Dois mecanismos principais de reparao: Recombinao homloga o segmento de DNA danificado excisado e o cromossoma homlogo usado como molde para a sntese de novas cadeias. Juno de extremidades mecanismo mais simples que consiste na ligao das extremidades sem recurso a qualquer molde. Frequentemente acompanhado de perda ou ganho de alguns nucletidos. Os sistemas de reparao no so infalveis. Existem mutaes somticas e mutaes germinativas. No entanto, apenas as mutaes nas clulas germinativas se transmitem descendncia. Mutaes Somticas Durante o desenvolvimento somtico, quanto mais cedo ocorrer a mutao, maior a poro afectada de tecido do indivduo. Por exemplo ma red delicious e gold delicious (mutante de red delicious). Mutaes Germinativas As mutaes germinativas so mutaes que ocorrem em clulas que do origem a gmetas. Se os gmetas mutados participarem na fecundao, a mutao passar para a gerao seguinte. Por exemplo ptalas brancas de Echium vulgare. 52
Tipos de Pequenas Mutaes Nvel do DNA Substituies substituio de bases, mutaes pontuais, por vezes sem sentido (missense). Substituies nucleotdicas so muito frequentes: Transies pirimidina por pirimidina ou purina por purina: o Adenina Guanina (purina purina); o Citosina Timina (pirimidina pirimidina). Transverso: purina pirimidina (por exemplo Adenina Citosina). Adio ou deleco de nucletidos: InDels (geralmente 1-10 pares de bases) mudana na estrutura (frameshift mutations). Erro na replicao ou na recombinao. Ocorrem frequentemente em sequncias repetitivas. As transverses deveriam ser 2 vezes mais frequentes que as transies, mas tal no se verifica. Em regies codificantes, as transies podem ser favorecidas porque em mdia induzem alteraes menos drsticas quanto estrutura qumica dos aminocidos sendo, portanto, mais toleradas que as transverses. O excesso geral de transies pode estar relacionado com a elevada instabilidade em dinucletidos CpG (a citosina est frequentemente metilada e 5-metilcitosina muito susceptvel a desaminao espontnea, originando timina). H um aumento das frequncias das transies quando CpG TpG. Tipos de Mutao Nvel de Protena Mutaes ocorrem aleatoriamente no DNA. No entanto, as consequncias mais graves verificam-se quando afectam DNA codificante ou outro muito conservado que inclui sequncias reguladoras. Mutao sinnima / silenciosa (silence mutation) sem consequncias na composio de um aminocido de uma protena. Deve-se sinonmia do cdigo gentico logo no h alterao do aminocido.
Mutao no sinnima (missense mutation) substituio de um aminocido por outro numa protena.
Mutao no sinnima (Nonsense mutation) criao do codo STOP. Quanto mais prxima da 3 ORF (open reading frame) maior a probabilidade de a protena manter alguma funcionalidade.
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Frameshift mutation alterao da grelha de leitura e da sequncia de aminocidos na protena. Insertion mutation consequncia da adio de um nucletido, que provoca a alterao da sequncia de aminocidos na protena, a partir da insero. Deletion mutation consequncia da deleco de um nucletido que provoca a alterao da sequncia de aminocidos na protena, a partir da deleco.
Mutaes Silenciosas com Consequncias No-Silenciosas Uma mutao aparentemente silenciosa pode ser patognica. A substituio activa uma sequncia crptica de splicing no exo de que resulta splicing aberrante (vai ser lida como se fosse o intro) com perda de sequncias codificantes (deixa um nucletido livre que vai formar um codo com o exo e alterar a sequncia de aminocidos) e introduo de frameshift no outro exo. Mutaes em regies intrnicas podem induzir alterao do splicing. A activao de sequncias crpticas de splicing no interior de um intro pode criar um local de splicing alternativo levando ao aparecimento de novos exes. Taxas de Mutaes As taxas de mutaes so muito variveis. No entanto so geralmente superiores no sexo masculino. Este facto deve-se s diferenas na maturao de vulos e espermatozides. Os espermatozides passam por mltiplos ciclos de diviso mittica que comeam na puberdade e continuam durante toda a vida adulta. No entanto os ocitos concluem as divises mitticas durante a vida fetal. Ou seja, se no ocorre mutao na fase fetal, e muito raro que ocorra depois.
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Genoma:
Gene, Locus:
Alelo:
Hapltipo:
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mtDNA mais susceptvel deriva gentica, uma vez que s um hapltipo e s se passa atravs da me. DNA nuclear transmitido dos seus progenitores, no entanto o DNA mitocondrial transmitido de uma nica linhagem, a materna. O DNA mitocondrial haplide de transmisso materna, e no possui recombinao. Representa do tamanho efectivo populacional, possuindo uma grande deriva gentica, com taxa de mutao variveis. O seu tamanho atinge cerca de 16000 pares de bases e aparece em elevada quantidade nas clulas. A regio controlo, ou D-loop, , em geral, a regio mais varivel do DNA mitocondrial, sendo composta por zonas variveis, nos extremos, e uma mais conservada, central. Transmisso uniparental de parte materna, podendo originar filhos e filhas afectados, mas s as filhas tm a capacidade de transmitir os genes sua descendncia. Durante o processo de fecundao, o espermatozide no contribui com mitocndrias, pois, praticamente, s o ncleo deste que penetra no ocito. O vulo fecundado retm apenas as mitocndrias que estavam presentes no ocito. Esporadicamente, algumas mitocndrias do espermatozide entram no ocito, mas parece serem selectivamente destrudas, numa fase precoce da embriognese. O impacto daquelas que escapam a este mecanismo praticamente nulo face ao factor de diluio no conjunto de mitocndrias de origem, esmagadoramente, materna. DNA Nuclear O DNA nuclear diplide (ou haplide): Autossomas 2 cpias (origem materna e paterna); Cromossomas sexuais 1 ou 2 cpias (exemplo Y e X). Possui maior nmero de genes, maior tamanho. Esto dispersos pelos diferentes cromossomas e sujeitos a recombinao. Constitudo por zonas codificantes e no codificantes e zonas repetitivas e no repetitivas. Genoma Animal e Vegetal Animais gene mitocondrial e nuclear. Plantas genoma mitocondrial, nuclear e cloroplastidial. Nas plantas o genoma mitocondrial muito maior do que o animal, e pode recombinar. DNA dos Cloroplastos O genoma cloroplastidial tem cerca de 150 kb (120-160) e est muito mais conservado do que o DNA mitocondrial animal. Tem zonas repetitivas mas no ocorre recombinao.
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Extraco de DNA a partir de ossos, clulas em suporte de papel ou plos. Extraco de DNA de material em coleces museolgicas (espcimes, peles, fsseis, mmias). Preservao de Material Biolgico Congelao; Desidratao; Mtodos qumicos; lcool; DMSO dimetilsulfoxido; Tampo lise. A preservao de tecidos em formol provoca danos irreversveis no DNA, pelo que pode haver grande dificuldade, ou mesmo impossibilidade, de extraco do DNA. Mtodos de Extraco do DNA Alguns mtodos so mais adequados quando existe uma grande quantidade de tecidos, outros a situaes na qual existem pequenas quantidades de DNA. Diferentes tipos de tecidos requerem diferentes mtodos de extraco de DNA. Em geral, os mtodos de extraco de DNA baseiam-se: Na destruio fsica das clulas por homogeneizao de tecidos (grandes quantidades de material biolgico, gramas). Uso de uma enzima, proteinase K, para destruio de protenas (fenol-clorofrmio e o mtodo salino). No uso de resinas (Chelex) aplicvel a amostras com muita pequena quantidade de DNA (gotas de sangue em papel, plos, restos fsseis, ). Utilizado em cincias forenses, investigao criminal. Necessita de cuidados redobrados para evitar contaminaes. No uso de slica, guanidina-tiocianeto. Deteco do DNA O DNA (genmico ou amplificado) pode ser detectado pelo seu tamanho e/ou conformao atravs de electroforese. A um pH neutro, o DNA tem carga negativa, migrando para o plo positivo quando sujeito a um campo elctrico. O DNA migra atravs de uma matriz densa (gel de agarose ou de poliacrilamida) na qual os fragmentos de menor tamanho se movem mais rapidamente do que os maiores. 57
Fragmentos de tamanho conhecido (ladders) so utilizados juntamente com as amostras para facilitar a determinao do tamanhos dos fragmentos de DNA. O DNA pode ser visualizado sob a aco de luz ultra-violeta aps colorao com Brometo de Etdio (ou aps oxidao com nitrato de prata no caso dos gis de poliacrilamida). Amplificao do DNA Reaco em Cadeia da Polimerase (PCR) Geralmente, a enzima que se utiliza nas reaces de PCR a Taq DNA polimerase, extrada da bactria Thermus aquaticus que vive em fontes hidrotermais e resistente a temperaturas elevadas (96 C). As suas enzimas, incluindo a polimerase, resistem s variaes de temperatura, sendo apenas necessrio adicionar a enzima no incio da experincia pois esta resistir a todos os ciclos de aquecimento e arrefecimento. Conceito de PCR amplificao de determinado fragmento de DNA relativamente pequeno (em geral menor que 1000 pares de bases) para manipulao ou sequenciao. Desnaturao da dupla hlice conseguido com a incubao do DNA a uma temperatura de 95 C, formando 2 cadeias simples a partir de ma dupla hlice; Emparelhamento dos iniciadores necessrio diminuir a temperatura (55 C) para ocorrer a ligao dos pequenos fragmentos iniciadores (primers delimitam a zona a copiar); Polimerizao (sntese) de DNA ocorre na temperatura ptima de actividade da Taq polimerase (70 C). Esta liga-se na regio dos iniciadores e promove a polimerizao da cadeia de DNA, servindo a outra como molde. Principal fenmeno do PCR aquecimento e arrefecimento do DNA: Aquecimento a cadeia dupla de DNA separa-se. Tambm designado por desnaturao (Melting); Arrefecimento as cadeias complementares do DNA juntam-se de novo. Renaturao, hibridao ou annealing. Componentes necessrios para a reaco em cadeia da polimerase: DNA que serve de molde e se vai multiplicar. Pode ser extrada de qualquer parte do organismo, sem ser necessria a extraco de clulas vivas, mas quanto mais puro for, mais fcil a sua multiplicao; Oligonucletidos de iniciao (primers F e R) permitem a ligao da DNA polimerase para efectuar a replicao; Tampo (Mg2+) DNA polimerase (Taq polimerase) enzima que replica o DNA, e que bastante resistente s variaes de temperatura.
Passos de uma reaco de PCR: 1. Separao das cadeias de DNA (94 96 C); 2. Annealing do primer (55 65 C); 3. Extenso da cadeia (72 C).
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Base molecular do PCR actividade da polimerase (enzima que sintetiza DNA): 1. DNA s pode ser sintetizado usando a cadeia complementar; 2. Polimerase sintetiza o DNA na direco 5 3 .
Uma reaco de PCR necessita dos seguintes componentes para amplificar os fragmentos de DNA pretendidos: DNA molde; Polimerase (Taq); Nucleotdeos livres (dNTPs que so incorporados durante a sntese de DNA); Primers par de oligonucleotdeos que so complementares a uma zona do molde do DNA. Termociclador:
Numa reaco de PCR com 36 ciclos (236 = 68 bilies) so formadas 236 cpias (687 bilies) da sequncia molde de DNA.
Desenho dos Primers de PCR Requer o conhecimento, total ou aproximado, da sequncia alvo que se quer amplificar. Os primers devero ter uma temperatura de renaturao (anneling) semelhante (60 C por exemplo). Tm (melting temperature) temperatura qual ocorre o desemparelhamento entre bases: Tm aumenta com o nmero de nucletidos do primer. Primers muito grandes requerem temperaturas altas (mas acima de 80 C interfere com a actividade da DNA polimerase). Os primers devem ter valores de Tm idnticos (2 a 4 C de diferena). Tm ideal entre 55 a 70 C. Tanneling (anneling temperatura) temperatura qual ocorre o emparelhamento entre o primer e a cadeia simples de DNA (temperatura determinada pela Tm 4 C). Deve ser baixa o suficiente para que ocorra hibridao e elevada o suficiente para evitar a formao de mismatches. Clculo da temperatura de melting limitado a pequenas sequncias:
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Primers so escritos sempre na direco 5 para 3: Forward primer: Reverse primer: Contedo em guanina-citocina: ; A composio de bases dever estar na proporo de 45% GC para 55% AT. Poly Guaninas ou Citocinas podem resultar em ligaes no especficas. Se os primers emparelharem com eles mesmos, ou emparelharem um com o outro mais facilmente do que com o DNA molde, ento a eficincia do PCR ir ser reduzida significativamente. Primers com estas caractersticas devem ser evitados.
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uma tcnica com bastantes restries pois colocam-se primers ao acaso e de vrias quantidades sem preocupaes do local onde se ligam e pois determinado primer pode ligarse demais. No interessa de onde so os fragmentos que formaram as bandas, pois apenas se quer comparar. Uma banda a mais significa que esse primer, nesse indivduo, teve a capacidade de formar um fragmento a mais (na zona onde se ligaram esses primers no outro indivduo no se ligaram devido a uma variao / mutao). Tcnica: Uso de primers pequenos; Amplificao de vrios fragmentos; Electroforese dos fragmentos amplificados. Vantagens: mtodo simples e til quando no se conhece o genoma de determinada espcie. Desvantagens: Leitura muito complexa do gel (muitas bandas); Subjectivo e no especfico no se sabe o que se est a amplificar; Pouco reproduzvel. AFLPs Antes de serem usados os primers, usam-se uma enzimas que vo actuar e cortar pequenos fragmentos de DNA. O primer, devido ao adaptador, vai-se ligar nas extremidades das zonas cortadas pelas enzimas de restrio utilizadas e permite amplificar o que est no fragmento. As extremidades so conhecidas. O adaptador liga-se extremidade e prolonga-se um pouco. Permite amplificar uma determinada sequncia que se quer e se delimita com enzimas de restrio. Comea a existir alguma especificidade. Tcnica: Aplicao de enzimas de restrio; Aplicao de um adaptador que vai permitir a ligao dos primers; Electroforese e determinao dos tamanhos dos fragmentos amplificados; DNA-fringerprinting. Vantagens: Simples; No necessrio conhecimento prvio do genoma da espcie; H uma certa especificidade das zonas que se esto a amplificar, devido ao uso dos adaptadores. Desvantagens: Padres por vezes complexos (no tanto como os dos RAPDs); Dificuldade em se saber o que se est a amplificar. AFLP DNA fingerprinting:
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Tcnica: Amplificao por PCR; Aplicao de enzimas de restrio que cortam determinadas sequncias de DNA, originando fragmentos de diferentes tamanhos. RFLP polimorfismo de fragmentos de restrio, assenta na ideia de que cada indivduo tem regies em que h variao dos locais das zonas de restrio, logo origina perfis de restrio (bandas na electroforese) diferentes de indivduo para indivduo. O DNA genmico de um eucarionte muito grande, por isso, em vez de aparecerem bandas padro, nos resultados da electroforese, aparece um arrastamento. A sonda utilizada um fragmento de DNA que reconhece a regio em questo. Existe um polimorfismo devido aos mltiplos perfis que se originam. Enzimas de restrio cortam o DNA de um modo consistente e reprodutvel. As pores de genoma idnticas entre todos os indivduos, originam perfis de DNA idnticos quando cortadas com enzimas de restrio. No entanto, se ocorre uma mutao (e desaparece um local de restrio na poro de DNA), originam-se fragmentos de tamanhos diferentes. A tcnica designada por polimorfismo dos fragmentos de restrio devido variao do tamanho desses mltiplos perfis. PCR-RFLP Usa-se as enzimas de restrio. Analisam-se os padres. Ladder marcao das unidades (quantidade de pares de base). Tcnica: Amplificao de determinado fragmento de DNA por PCR; Uso de enzimas de restrio; Electroforese e anlise do tamanho de fragmentos. Vantagens: Simples; Barato; Rpido pode-se genotipar muitas amostras em pouco tempo). Desvantagens apenas se detectam as mutaes nos locais de corte das enzimas de restrio e pode originar padres complexos ou muito simples, logo pouco informativos.
SSCP Baseia-se no princpio que uma mutao numa base altera a conformao da cadeia de DNA. Amplificam-se fragmentos pequenos, desnatura-se (separa-se a cadeia de DNA), electroforese, colorao, desnaturao. 63
2 bandas no significa que seja heterozigtico, significa sim uma e outra cadeia pois o DNA est desnaturado. Heterozigtico 4 cadeias de DNA diferentes (2 cromossomas diferentes, logo 2 cadeias de DNA diferentes, e ento 4 cadeias diferentes de DNA). Tcnica: Amplificao de um fragmento pequeno de DNA (menor que 300 pares de bases) por PCR; Desnaturao; Electroforese vertical em gel de poliacrilamida; Colorao do gel (em geral por nitrato de prata); Leitura das bandas (homozigtico com 2 bandas, uma de cada cadeia do DNA, heterozigticos 4 bandas). Deteco de Polimorfismos do DNA (os VNTRs) VNTRs variable number of tandem repeats: Satlites repeties de milhares de pares de bases; Minissatlites repeties de 10 a 100 pares de bases; STR (short tandem repeat) microssatlites (repeties de motivos de DNA de 2 a 9 pares de bases). Os VNTRs possuem um nmero varivel de repeties:
VNTR / STR zonas variveis que se repetem no genoma de 1 indivduo. A diferena entre os mtodos est no nmero de Nucletidos que as compe. As repeties so obtidas dos pais e podem ser considerados como alelos. VNTR (minisatlites) / STR (microsatlites), o tamanho depende do nmero de pares de bases que o compem e do nmero de vezes que estas se repetem. Aps o tratamento de uma regio autossmica de um indivduo heterozigtico com uma enzima de restrio, originam-se fragmentos de DNA mais pequeno e desiguais, que podem ser identificados por Southern-blotting (um de origem paternal e outro maternal). Short Tandem Repeats (STRs) Microssatlites Motivo de repetio entre 2 6 pares de bases. Tamanho do conjunto de repeties 30 300 pares de bases. (CA)n dinucleotdico; (CAG)n trinucleotdico; (CTTA)n tetranucleotdico; (GTTCA)n pentanucleotdico; (CAGTTC)n hexanucleotdico. Vrios alelos / locus. Elevada heterozigotia. Taxa de mutao cerca de por locus por gerao.
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Minissatlites: Motivo de repetio superior a 9 pares de bases. Tamanho do conjunto de repeties 1 20 kb. Grande heterozigotia devido a uma taxa de mutao muito elevada (recorrncia frequente). Mecanismo mutacional mais complexo, por exemplo, recombinao intracromossmica igual ou desigual pode causar deleco ou duplicao de motivos. Os STRs (microssatlites): Grande heterozigotia devido a uma elevada taxa de mutao (cerca de ) por locus por gerao. Padro de segregao mendeliano; Bastante frequentes no genoma (genoma nuclear humano 1/cerca de 30 000 pares de bases). No STR o principal mecanismo mutacional resulta de replication slippage: Durante a sntese de DNA podem formar-se ansas resultando em expanses ou contraces do nmero de motivos de repetio. Certos motivos (por exemplo CAG) tendem a favorecer especialmente a formao de estruturas no DNA.
Microssatlites anlise do polimorfismo em sequenciador automtico: Homozigtico: Heterozigtico: Heterozigtico: Microssatlites marcadores muito utilizados em estudos de gentica populacional, identificao individual, paternidades, etc. Aplicaes mais comuns: Determinao de estrutura populacional (quantas populaes, isolamento, fragmentao, etc); Histria evolutiva e demografia; Filogeografia (relaciona a filogenia e a distribuio espacial das espcies / populaes); Deteco de hibridao; Anlises de paternidades; E outras mltiplas utilidades para os estudos de ecologia e conservao. 65
SINEs e LINEs Pores de DNA, que em geral resultam da reverso do RNA, e se encontram dispersos pelo genoma. No codificam protenas, pelo que so considerados pseudogenes (cpias de genes sem actividade codificadora de protenas). SINEs single interspersed elements: ALU, fragmento de cerca de 300 pares de bases que se encontra disperso pelo genoma. Comum no genoma Humano e usado como marcador gentico. Pode estar associado a patologia. LINEs long interspersed elements: 45% do genoma composto por elementos repetidos dispersos pelos vrios cromossomas. Estimam-se cerca de 868 000 LINEs e 1 558 000 SINEs. Sequenciao
SNP SNP (single nucleotide polymorphism) polimorfismo baseado na alterao de uma nica base (por exemplo, Timina-Citosina).
Tipos estruturais de marcadores genticos usados em investigaes genticas (SNP): Marcadores biallicos, Nvel de polimorfismo relativamente baixo; Taxa de mutao baixa (acontecimentos nicos) por locus e gerao. InDels de base nica includos na categoria de SNP.
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Tcnicas de RFLP Sequenciao (restriction fragment directa. length polymorphism) so usadas para detectar mutaes em sequncias de DNA que so reconhecidas por enzimas de restrio especficas. SNPSTRS marcador molecular composto, formado por SNP e microssatlites, detectados num fragmento pequeno de DNA (marcadores ligados).
Aplicaes dos Marcadores Moleculares Determinao de estrutura populacional (quantas populaes, isolamento, fragmentao, etc). Histria evolutiva e demografia. Relaes filogenticas taxonomia molecular. Filogeografia relaciona a filogenia e a distribuio espacial das espcies / populaes. Determinao de unidades populacionais a conservar. Deteco de hibridao. Determinao do sexo. Anlises de paternidade. Diagnstico de doenas genticas. Gentica forense. Outros.
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H mais transies que transverses. As transies mais comuns so: C T e G A . H nucleotdeos que mudam mais que outros: G e C por exemplo. H nucleotdeos que substituem outros mais frequentemente que o esperado maior parte da percentagem das mutaes resultam em A ou T. 68
Alterao da frequncia allica devido a mutao recorrente: A para a a uma taxa de mutao . - taxa de mutao; t nmero de geraes: p0 frequncia do alelo p na populao original. Tipos de substituies patognicas:
Tipo de mutao Substituio de bases Substituio de aminocidos Gerao de codo STOP Abolio de codo STOP Mutaes em locais de processamento Mutaes em locais de regulao Pequenas deleces Pequenas inseres Nmero 21 000 14 756 3 198 24 2976 246 5049 1922 Percentagem 75% do total 52% das substituies de bases 11% das substituies de bases Menos que 1% das substituies de bases 11% das substituies de bases 1% das substituies de bases 18% do total 7% do total
Seleco Positiva Evoluo da frequncia de um alelo que tenha uma probabilidade de ser escolhido em cada gerao superior de outros alelos.
Selective sweep reduz a variabilidade gentica dos locais neutrais que esto ligados aos loci sobre seleco.
Bottleneck:
Seleco positiva:
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Seleco Equilibrada Evoluo da frequncia de um alelo que tenha uma probabilidade de ser escolhido em cada gerao caso ocorra em heterozigotia.
A malria e a anemia falciforme constituem um exemplo de mutao equilibrada. Recombinao Recombinao gentica refere-se mais a uma rearranjo em larga-escala da molcula de DNA. Este processo envolve um emparelhamento entre duas cadeias complementares de dois progenitores ou da dupla cadeia de DNa, e resulta de uma mudana fsica do material cromossmico. Gera novas combinaes de alelos na mesma molcula de DNA, aumentando assim a diversidade haplotpica. No ocorre em marcadores haplides. H regies do cromossoma em que ocorre com maior frequncia do que outras. muito mais frequente em zona telomricas do cromossoma do que centromricas. Provoca uma grande mistura de hapltipos. Pode indicar a existncia ancestral de hibridao entre espcies. Deriva Gentica Deriva gentica processo estocstico, na medida em que impossvel prever a direco das alteraes em cada gerao. Quanto menor o efectivo populacional (Ne), maior o efeito da deriva gentica, isto , maior a probabilidade de um alelo se fixar ou extinguir.
Nas populaes grandes h uma certa alterao nas frequncias corresponde alguma diferenciao, enquanto numa populao pequena vo existir alelos que se distinguem e outros se fixam. Pode ser um caso grave quando ao alelo que se fixa prejudicial ao organismo, podendo levar uma populao extino. As populaes podem, ento, perder a sua diversidade, por meros efeitos do acaso, ou seja, h uma perda substancial da diversidade da populao, por meros efeitos aleatrios. Apenas nas situaes em que h a perda total da variabilidade que se deixa de verificar o fenmeno de deriva gentica. Em populaes de tamanho grande, os efeitos de deriva gentica so menos acentuados, ou seja, quanto menor o tamanho da populao, maiores so os erros que podem ocorrer, logo, maior a probabilidade da perda de factores, pela populao. 70
Bottleneck / Efeito Fundador Perda de variabilidade e diferenciao populacional. Bottleneck a populao ao longo do tempo sofrer uma diminuio drstica e os que sobrevuvem (por mero acaso) vo continuar a populao que muito diferente na sua composio populao antes do efeito, podendo ser eliminados alelos e fixados outros. Reduo drstica do efectivo populacional, em consequncias de fomes, epidemias, desastres naturais, Efeito fundador numa populao muito grande ao longo do tempo, existe a determinado momento alguns indivduos ao acaso que tomam uma via diferente e fundam uma nova populao muito diferente da original, pois os alelos desses indivduos so to aleatrios que tambm podem levar eliminao de alelos e fixao de outros. Pode ocorrer ao acaso, devido a migraes sucessivas de uma populao-me, que do origem a sub-populaes que diferem muito da populao fundadora. Quando indivduos abandonam a populao-me para estabelecer a sua prpria populao, os erros de amostragem dessa populao-me refletem-se em cada uma dessas novas populaes. Isto tudo origina a variabilidade encontrada, marcando a variabilidade genticos. Consanguinidade Probabilidade de ser homozigtico para um alelo derivado do mesmo ancestral maior que em casos normais. Tem de existir ancestrais comuns, logo existe algures um cruzamento de indivduos aparentados.
Possveis causas: Pelo nmero muito pequeno do tamanho efectivo da populao (populao reprodutora Ne). Efeito de forte seleco. Cruzamentos no ao acaso. Consequncias: Aumenta a homozigotia. Diminui a heterozigotia. Desaparecimento dos alelos de menor frequncia. Aumento de risco de doenas ou anomalias. Migrao No muda obrigatoriamente as frequncias dos alelos dentro das grandes populaes (por exemplo espcies), nem forma novos alelos, mas pode provocar alteraes significativas das frequncias allicas dentro das subpopulaes. Provoca o fluxo gnico o que contraria a diferenciao populacional. A migrao de poucos indivduos, desde que se reproduzam e tenham descendentes frteis, suficiente para contrariar a diferenciao populacional. Assim, no forma propriamente novos alelos, mas muda significativamente a frequncia dos alelos. Quando um indivduo de uma populao entra em contacto com outra populao diferentes, mas entanto se se reproduz porque deixa l o seu gene e isso j importante. Para existir um fluxo basta uma pouca quantidade do indivduo. 71
Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011) Fluxo gnico modelos: Ilha migrao radicular
Diferencial entre os sexos em teoria, os machos migram mais que as fmeas. Numa populao matrilocal a diferenciao encontrada a nvel de marcadores genticos, no entanto numa patrilocal essas diferenciaes so apenas no Y. A migrao provoca uma diferena nas frequncias entre as duas populaes. A proporo de genes migrantes que so incorporados em cada gerao: q0 frequncia inicial do gene na populao receptora; Q frequncia do mesmo gene na populao migrante; m proporo de novos genes introduzidos em cada gerao. Existe um equilbrio (fenotpico e genotpico) se houver migrao da populao dadora para a receptora, acompanhada de uma migrao da populao receptora para a dadora.
N1m1 N2m2
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Uma rvore tem ramos internos e externos (ou terminais) e folhas. O ponto de ramificao de duas linhagens evolutivas o n. Um grupo de organismos com um ancestral comum um clado.
O padro de ramificao de uma rvore chamada topologia. Devido ao grande tamanho da maioria das bases de dados moleculares, utiliza-se programas de computador para calcular os parmetros populacionais, matrizes de distncias e algoritmos filogenticos. Entre vrios programas, os mais usados so: PHYLIP, PAUP, BIOSYS-1, MEGA, MODELTEST para determinar o modelo de evoluo que est mais ajustado aos dados moleculares (entre os vrios possveis: Jukes-cantor, Kimura 2 parmetros, etc). Clustal e Bioedit programas informticos para alinhamento de sequncias.
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Filogenias Usando Sequncias de DNA Utiliza-se um ou vrios marcadores. H diversas metodologias para a determinao da melhor rvore filogentica que descreve os dados (diferentes critrios e modos de construo. O resultado uma hiptese que pode ser bem ou mal suportada (dependendo por exemplo se a maior parte dos caracteres suporta ou no uma determinada topologia. A rvore evolutiva de um gene no corresponde necessariamente rvore evolutiva da espcie. A identificao de padres filogenticos (e de variao de sequncias) discordantes entre marcadores pode ento servir processos evolutivos que tm um efeito regional no genoma. Relaes Filogenticas Monofilia:
Polifilia:
Parafilia espcie A tem 2 hapltipos que esto mais prximos dos outros hapltipos de B, mais do que est dos de A. logo algo se passou para que um hapltipo semelhante a A, seja muito mais prximo de B. Rooted cladogram: Unrooted network:
Filogenia A inferncia de uma filogenia muitas vezes no o objectivo final de uma anlise filogentica. utilizada como uma ferramenta para interpretar processos ecolgicos e evolutivos (determinao de taxas de evoluo, configuraes biogeogrficas de populaes, evoluo reticulada, etc). Importante em diferentes reas da biologia (evoluo, conservao, sistemtica, ecologia, etc). rvores
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Populao constante ter tido uma maior constncia de indivduos. Anlise de Mismatchs
Populao expandida
V-se par a par as diferenas que existem de mutaes. medida que a curva se movimenta para a direita induz que a populao possui uma maior variao e consequentemente mais antiga. Bimodais h muitas variaes e pequenas. Projecto BARCODE Analisar um gene mitocondrial para o mximo de indivduos e espcies possveis. A ideia criar uma base de dados o mais robusta possvel para se conseguir ao mximo diferenciar tipos de espcies. Projecto que pretende de uma forma padronizada identificar todos os animais e plantas atravs da anlise de uma sequncia de DNA. O gene do barcode o DNA mitocondrial citocromo oxidase I. Barcode nos Humanos: Barcode em aves:
O polimorfismo intraespecfico importante na procura de novas espcies pois se alto porque, ou no so a mesma espcie, ou o marcador no o mais adequado, pois em indivduos de espcies diferentes h polimorfismo intraespecfico reduzido e interespecfico elevado, se tal no ocorre, algo est mal.
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Filogeografia estuda as causas histricas da distribuio espacial das linhagens. Anlise filogentica do DNA mitocondrial do coro na Pennsula Ibrica e Europa Central. Distribuio geogrfica das linhagens mitocondriais de coro na Pennsula Ibrica.
Rede Network de haplotipos: Traduz a relao genealgica entre os diferentes hapltipos. Os diferentes grupos (clados) podem ser relacionados com a geografia. Quando h um hapltipo mais comum, em situao central e com vrios subhapltipos que divergem deste por poucas mutaes (Starlike) este facto sugere uma colonizao recente. Representao Espacial da Variao Gentica Gentica da paisagem:
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A variao gentica pode ser quantificada pelo nvel de heterozigotia num determinado locus, que dado pelo total da frequncia de heterozigticos nesse locus. Se num locus com 2 alelos, um alelo muito frequente e o outro zero, ento no haver heterozigticos. Assim, espera-se que a heterozigotia seja mxima quanto maior for o nmero de alelos num locus e que as suas frequncias sejam iguais. Diagrama que mostra as propores de homozigticas e heterozigticos numa populao com diferentes frequncias allicas:
Na ausncia de cruzamentos ao acaso existem 2 tipos de desvios panmixia: Consanguinidade (inbreeding) se o cruzamento entre indivduos aparentados ocorre com maior frequncia do que seria esperado acontecer ao acaso. Assortative mating os indivduos podem cruzar-se preferencialmente com outros que partilhem uma mesma caracterstica (positivo), ou que no a partilhem (negativo). Gene pool da populao existem metade dos gmetas com o alelo A e a outra metade com o alelo B, logo os 2 genes so equifrequentes: No gene pool de uma populao, existem gmetas femininos na proporo de 25 AA, 50 AB e 25 BB. Os gmetas masculinos aparecem na mesma proporo (25 AA, 50 AB e 25 BB).
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Factores que Alteram Diversidade Gentica, ao Nvel Populacional Ecologia, comportamento reprodutivo. Consanguinidade: Desvios aos cruzamentos aleatrios; Cruzamentos entre indivduos aparentados superior ao que seria esperado; Cruzamentos selectivos escolha no aleatria do par tem consequncias em termos populacionais (aumento da homozigotia relativamente ao que seria de esperar de acordo com o equilbrio de hardy-Weinberg). Migrao troca de genes entre populaes. Tende a eliminar diferenas genticas entre populaes. H um aumento da variabilidade intra-populacional e uma diminuio da variabilidade inter-populacional (origina misturas populacionais). Fluxo gnico troca de genes entre populaes. Tende a eliminar diferenas genticas entre populaes. Aumento da variabilidade intra-populacional e diminuio da variabilidade inter-populacional.
Seleco reproduo diferencial de indivduos com diferentes fentipos numa populao. Alguns fentipos / gentipos conferem maior ou menor adaptabilidade a condies ambientais particulares. Reproduo diferencial pode ser determinada por diferenas entre indivduos, quanto a factores como mortalidade, fertilidade, fecundidade, sucesso no cruzamento ou viabilidade da descendncia. A seleco de determinado gene ir provocar alteraes nas frequncias dos genes das populaes:
Seleco reproduo diferencial de indivduos com diferentes fentipos numa populao: Alguns fentipos / gentipos conferem maior ou menor adaptabilidade a condies ambientais particulares. Reproduo diferencial pode ser determinada por diferenas entre indivduos quanto a factores como mortalidade, fertilidade, fecundidade, sucesso no cruzamento ou viabilidade da descendncia.
Deriva gentica alterao aleatria das frequncias numa populao, de gerao em gerao. Simulaes sobre o efeito da deriva gentica nas frequncias allicas (frequncia do alelo A) em populaes de baixo e elevado efectivo.
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Clculo das Parties da Diversidade HPOP heterozigotia calculada em cada populao. HGRUPO heterozigotia calculada em cada grupo de populaes. HTOTAL heterozigotia calculada em todas as populaes da espcie. Parties da diversidade gentica: Nas populaes: Entre populaes: Em grandes grupos: Estrutura de uma populao:
. .
P frequncia dos alelos; K nmero de subpopulaes. HT heterozigotia esperada na populao total . Mdia das frequncias dos alelos nas subpopulaes. Subestruturao Populacional Uma das mais importantes consequncias da subestruturao populacional a reduo de heterozigticos. A reduo de heterozigticos resultante da subestruturao est intimamente relacionada com a reduo da heterozigotia provocada pelo cruzamento entre indivduos aparentados partilha de ancestrais comuns. 79
Se Fis > 0 deficincia de heterozigticos (inbreeding). Se Fis < 0 excesso de heterozigticos (pode estar associado a uma populao pequena). Fst Indicador de subestruturao das populaes, se as populao so diferenciadas. Varia entre 0 e 1. 0 populao sem qualquer estruturao; 1 populaes completamente diferentes. Fst entre 0 e 1 nveis diferenciao populacional. Distncias genticas entre populaes e a sua distncia mdia: Estas populaes esto mais prximas mdia, mostrando que no so muito diferentes umas das outras Estas populaes esto mais dispersas da mdia, mostrando que so mais diferentes umas das outras A migrao (m) contribui para diminuir o valor de Fst:
Structure O programa structure implementa um modelo base do mtodo clustering para enferir a estrutura da populao e atribuir indivduos a populaes usando os dados do gentipo consistindo em marcadores ligados (structure 2) ou desligado (structure).
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Objectivos do programa: Inferir a presena de estrutura populacional Atribuir indivduos a populaes; Identificar indivduos migradores ou misturados (structure); Inferir a taxa de deriva gentica; Inferir o tempo desde que a populao se misturou (structure 2)
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