Universidade Estadual de Maringá

Departamento de Farmacologia e Terapêutica

Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas

EVIDÊNCIA DO EFEITO ANTI-

INFLAMATÓRIO E DA PERMEAÇÃO
CUTÂNEA DA PREPARAÇÃO DE ÓLEO
DE PEIXE APLICADA TOPICAMENTE:
UM ESTUDO POR ESPECTROSCOPIA
FOTOACÚSTICA

Me. Franciele Queiroz Ames

Suplementação na dieta
Introdução
 Introdução

Doenças
Inflamatórias

Suplementação na dieta

SIMOPOULOS, 2002; CALDER, 2015; PROUDMAN et al., 2015

 Introdução
PUFA ÔMEGA -3 (n-3) :

ÓLEO DE PEIXE (OP)

DHA: Ácido Docosahexaenóico; EPA: Ácido Eicosapentaenóico

SIMOPOULOS, 2002; CALDER, 2015

 ulo
st í m
E EP
se
i pa o A
s fol DH u
Fo A2 A
G
PR
12
EPA 0
ou
AA EPA DHA DHA
Ci

PPARγ
t

15-LOX
P-
X

NF-kB
4
CO

50

Cit P- 450
5-L
15-LOX

PGE2 PGF2 16-20- COX MaR1,2

OX

HETE
PGI2 TXB2
PD1

RvD1,2
LTA4, B4, C4, D4

Expressão de genes
18R- Pró- inflamatórios:
HETE
Citocinas,
5-LOX

COX-2

PROCESSO
INFLAMATÓRIO
RvE1,2
Modificado de RAPHAEL ; SORDILO, 2013 e CALDER, 2012
 Introdução
TRATAMENTO
COM A
PREPARAÇÃO DE
ÓLEO DE PEIXE
EDEMA EDEMA DE PATA
VIA ORAL RECRUTAMENTO (Carragenina)
DOSE ÚNICA EDEMA DE PATA
DE LEUCÓCITOS

PRODUÇÃO/
LIBERAÇÃO
CITOCINAS E
ÓXIDO NÍTRICO PLEURISIA (Carragenina)

ARRUDA et al., 2017

 Introdução
TRATAMENTO
COM A
PREPARAÇÃO DE
ÓLEO DE PEIXE

RECRUTAMENTO
DE LEUCÓCITOS

-
COMPORTAMENTO
DE rolling E ADESÃO ARTRITE INDUZIDA
DE LEUCÓCITOS POR ADJUVANTE

ESTEVÃO-SILVA et al., 2015

 Introdução

VIA ORAL:

DOSE ÚNICA OU
SUPLEMENTADO NA DIETA

Será que o óleo de peixe tem atividade anti-inflamatória

quando administrado por via tópica, na inflamação
cutânea?
Uso de medicamentos por via tópica:
- Minimizar os efeitos adversos
Poucos estudos realizados
causados pela administração sistêmica
de fármacos

YOGANATHAN et al., 2003; PUGLIA et al., 2005

 Introdução

MODELO DE EDEMA DE
ORELHA
UTILIZADO PARA AVALIAR A
INDUZIDO PELO ÓLEO
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
DE CRÓTON TÓPICA DE COMPOSTOS COM
PERSPECTIVA DE USO PARA O
TRATAMENTO DE DOENÇAS
INFLAMATÓRIAS QUE
ACOMETEM A PELE

GÁBOR, 2OOO
 Introdução

Penetração das substâncias

Região da pele onde o processo inflamatório acontece

Eficácia Anti-Inflamatória

Método eficaz para :

- Caracterização do tecido ou lesão
Técnica de Espectroscopia - Avaliar a penetração e distribuição
Fotoacústica das substâncias na pele

SWEARINGEN et al., 2010; MELO et al., 2011; MOTA et al., 2011

 Objetivo

1) Investigar o efeito anti-inflamatório tópico

da preparação de óleo de peixe no
modelo de inflamação cutânea induzida
por óleo de cróton;
2) Avaliar a permeação cutânea da
preparação de óleo de peixe utilizando a
técnica de espectroscopia fotoacústica.
Materiais e Métodos
 Materiais e Métodos
Animais

- Camundongos Swiss (machos 25-30 g)

- Temperatura controlada 22 ± 2 ºC
- Ciclo claro/escuro de 12 h
- Água e ração ad libitum

*CEAE/UEM 045/2012
 Materiais e Métodos
Tratamento dos Animais

500 mg do produto: AZEITE DE OLIVA (AO)

250 mg DHA;
50 mg EPA
(i) 0,25 mg de DHA e 0,05 mg de EPA
(ii) 0,5 mg de DHA e 0,1 mg de EPA

a
orelh
(iii) 1 mg de DHA e 0,2 mg de EPA
PREPARAÇÕES DE ÓLEO
DE PEIXE DILUÍDO EM AO (iv) 2 mg de DHA e 0,4 mg de EPA
(POPAO) (v) 4 mg de DHA e 0,8 mg de EPA

ARRUDA et al., 2017

 Materiais e Métodos
Edema de Orelha
OE OD

Óleo de cróton (200 µg/orelha); Veículo (20 L)

(20 L)
+
POP AO : 0,25; 0,5; 1; 2 ou 4 mg/orelha (20 µl)
ou 6 horas após OC:
AO (20 µl) camundongos foram anestesiados, submetidos à
ou eutanásia, as orelhas seccionadas em discos
circulares de 6,0 mm de diâmetro e pesadas
Dexametasona (0,1 mg /orelha)
(mg) em balança analítica
(20 µl)
ou Cálculo da % de inibição do edema
Indometacina (1 mg /orelha)
(20 µl) % Inibição: OE controle – OE tratado x100
ou OE controle – OD veículo
Veículo (20 L) Folch et al .,1957
 Materiais e Métodos
Preparo do tecido da Orelha

Tecido da orelha

Sobrenadante
Homogeneizador Centrifugado
Separado
 Materiais e Métodos
Atividade da Mieloperoxidase (MPO):
Sobrenadante
solução tampão contendo o-dianisidina e
das secções
H2O2 1%
das orelhas

H2O2 quebrado pela MPO liberada do O radical de oxigênio (O –) combina

tecidos com a o-dianisidina (doador de
hidrogênio), a qual é convertida para
Formação de um radical de oxigênio um composto colorido (oxidada)

A atividade da enzima
foi determinada através
da medida de
absorbância (460 nm)
 Materiais e Métodos
Análise da Permeação Cutânea (Espectroscopia Fotoacústica):

15 Hz
 Materiais e Métodos
Análise da Permeação Cutânea (Espectroscopia Fotoacústica):

Tecido da orelha
-Veículo
- Óleo de Cróton -Controle Inflamada
- Preparação de Óleo -Tratadas:
de peixe diluído em •POPAO 4 mg
azeite
•Azeite de Oliva
-Azeite de oliva

Luz modulada
Luz modulada Banda de Luz modulada
absorção
da
Face interna (aplicação) POPAO Face externa (lado oposto )
 Análise Estatística
- Resultados do edema e da atividade da MPO foram
apresentados como média  erro padrão da média (E.P.M.)
- Comparação estatística dos dados foi realizada
utilizando a análise de variância (ANOVA), seguida pelo
teste de Tukey
- p  0,05 considerado como nível de significância
Resultados
 Resultados
Efeito da Preparação de Óleo de Peixe no edema de orelha induzido
por óleo de cróton (OC):
Azeite de oliva como diluente Acetona 70% como diluente

%
%

%
%
%

%
%

%
%

31
51

74
72
%
85

93

81
85

83
72

60
%
%
98
98
 Resultados
Efeito da Preparação de Óleo de Peixe na atividade da enzima mieloperoxidase
(MPO):

Azeite de oliva como diluente Acetona 70% como diluente

%
%
%
80

%
%
76
%

86
91
96
92
%
93

80
%

%
%

%
%

%
99

97
89

99
98

48
 Resultados
Análise da Permeação Cutânea da Preparação de Óleo de Peixe e seu
efeito na Resposta Inflamatória Tópica por Espectroscopia
Fotoacústica:
273 Detecção destas bandas  marcador
246 da presença
OC
AO
1,5
234 POPAO
Sinal Fotoacústico (u.a.)

1,0

0,5

0,0

200 250 300 350

Comprimento de Onda (nm)
 Resultados
Análise da Permeação Cutânea da Preparação de Óleo de Peixe e seu
efeito na Resposta Inflamatória Tópica por Espectroscopia
Fotoacústica:
4,0
270 Pele ventral
Sinal Fotoacústico (u.a.)

3,5 Pele dorsal

Pele + OC ventral (6h)
3,0 225 Pele + OC dorsal (6h)

2,5 Controle
Inflamada
2,0

1,5 PAS detecta a resposta inflamatória

1,0

0,5

0,0
200 250 300 350 400 450
Comprimento de Onda (nm)
 Resultados
Análise da Permeação Cutânea da Preparação de Óleo de Peixe e seu
efeito na Resposta Inflamatória Tópica por Espectroscopia
Fotoacústica:
1,0
(A) Pele + OC + POPAO

Sinal Fotoacústico (u.a.)

Ajuste gaussiano (B)
0,8
Soma das curvas gaussianas ajustadas
1,5 0,6
Sinal Fotoacústico (u.a.)

POPAO
0,4
POPAO
0,2

1,0
0,0

200 250 300 350 400 450

Comprimento de Onda (nm)

 Presença da POP, indicando

0,5
sua permeação;
Pele ventral  atividade anti-inflamatória da
Pele + OC ventral
Pele + OC + AO ventral
POP na face ventral
0,0 Pele + OC + POPAO ventral

200 250 300 350 400 450

Comprimento de Onda (nm)
 Resultados
Análise da Permeação Cutânea da Preparação de Óleo de Peixe e seu
efeito na Resposta Inflamatória Tópica por Espectroscopia
Fotoacústica:
(A)

Sinal Fotoacústico (u.a.)

Pele + OC + POPAO
3,0 2,0
Ajuste gaussiano
(B)
Soma das curvas gaussianas ajustadas
1,5

2,5
Sinal Fotoacústico (u.a.)

1,0 POPAO

POPAO
2,0 0,5

0,0
1,5 200 250 300 350 400 450

 Presença
Comprimento de da
OndaPOP
(nm) na face dorsal,
1,0 indicando sua permeação, uma
vez que sua aplicação foi na face
0,5 Pele dorsal
ventral;
Pele + OC dorsal  atividade anti-inflamatória na
Pele + OC + AO dorsal
0,0 Pele + OC + POPAO dorsal face dorsal
200 250 300 350 400 450
Comprimento de Onda (nm)
 Resultados
Áreas das bandas características do tecido inflamado (u.a.)

Análise da Permeação Cutânea da Preparação de Óleo de Peixe e seu

efeito na Resposta Inflamatória Tópica por Espectroscopia
Fotoacústica:
Face Ventral
(A) Banda em 225 nm
15000
Banda em 270 nm

10000
225 225
5000 270 270 225
0
270
Pele + OC Pele + OC + AO Pele + OC + POPAO

(B) Banda em 225 nm

15000
Banda em 270 nm

10000

5000

0
Pele + OC Pele + OC + AO Pele + OC + POPAO

Face Dorsal
Discussão
 Discussão
Ativação de vias
enzimáticas:
-Prostaglandinas
-Leucotrienos
-Citocinas

Óleo de Cróton: Resposta

Croton tiglium Mistura de lipídeos Inflamatória:
12-O-teradecanoilforbol-13- -EDEMA
acetato (TPA) -RECRUTAMENTO
e outros ésteres de forbol DE
LEUCÓCITOS
EDEMA
TRATAMENTO COM A
PREPARAÇÃO DE ÓLEO DE PEIXE ATIVIDADE DA ENZIMA
MIELOPEROXIDASE
GARG et al., 2008
 Discussão
Recrutamento de leucócitos:

Resposta Inflamatória Excessiva:

Neutrófilos podem levar ao dano tecidual :
- produção espécies reativas do oxigênio
- enzimas proteolíticas

Determinação da Atividade da
MPO:
Avaliação indireta do
RECRUTAMENTO/ ATIVAÇÃO
dos neutrófilos no local da lesão

Fonte:http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/averhoff- MPO pela POP importante efeito

petra-2006-05-24/HTML/image002.gif
benéfico
 Discussão
depende das
características Composição e estrutura
Sinal Fotoacústico ópticas e térmicas das amostras
das amostras
4,0

225 270
LeucócitosPele ventral
3,5 Pele dorsal
Pele + OC ventral (6h)
Pele + OC dorsal (6h)
3,0
Sinal Fotoacústico (u.a.)

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0
200 250 300 350 400 450

Pele normal Comprimento de Onda (nm)

Pele Inflamada
- Edema
- Recrutamento de
leucócitos
- Mediadores Inflamatórios
 Discussão

Permeação cutânea da
Preparação de óleo de Peixe

ANÁLISE DO SINAL Determinação das

FOTOACÚSTICO características fotoacústicas do
tecido da orelha inflamada

Área das bandas

características do tecido inflamado
nas orelhas tratadas com a
preparação
 Considerações Finais
Edema de orelha EDEMA
induzido pelo POP ATIVIDADE DA
Óleo de Cróton ENZIMA
MIELOPEROXIDASE

FORTE CORRELAÇÃO COM O EFEITO INIBITÓRIO OBSERVADO

PELA TÉCNICA DE ESPECTROSCOPIA FOTOACÚSTICA

ESTA TÉCNICA FOI UTILIZADA PARA EXPLORAR ALGUMAS

CARACTERÍSTICAS DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA NESTE
MODELO
 Conclusão

No conjunto, os resultados deste estudo demonstraram

evidências que a aplicação tópica da POPAO inibe a
resposta inflamatória no modelo de edema de orelha
induzido pelo OC. A técnica de PAS demonstrou que
esta atividade anti-inflamatória pode estar associada à
penetração cutânea da POPAO.
 Perspectivas Futuras
1) A técnica de espectroscopia fotoacústica pode ser
utilizada como ferramenta para a avaliação da atividade
anti-inflamatória tópica e permeação de compostos no
modelo de edema de orelha induzido pelo óleo de cróton

2) Outros estudos podem ser realizados para avaliar a

aplicabilidade desta técnica para detectar a resposta
inflamatória em outros modelos experimentais.
 Referências Bibliográficas
Arruda LLM. Efeito do óleo de peixe sobre a resposta inflamatória aguda não imune. 57 p. Dissertação de
Mestrado (Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas), Universidade Estadual de Maringá,
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Zlotnik A, Yoshie O. Chemokines: a new classification system and their role in

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croton oil inflammation by topical emu oil in CD-1 mice. Lipids. 2003;38(6):603-607.

Zlotnik A, Yoshie O. Chemokines: a new classification system and their role in

immunity. Immunity. 2000;12:121-127.
 Agradecimentos:
Dedico este trabalho aos meus amados pais, José Luiz Ames
(in memorian) e Francisca Cordeiro de Queiroz Ames, por
toda garra, carinho, amor e esforço para que eu conquistasse
este título. Tudo o que sou, aonde cheguei e o que ainda vou
conquistar, devo à vocês. Meu muito obrigada, por tudo! Amo
imensamente vocês, verdadeiro amor e base de tudo...
Agradecimentos:
Agradecimentos:
Agradecimentos:
Agradecimentos:
Agradecimentos:
Agradecimentos: