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Revista Europeia de Ciências Farmacêuticas 59 (2014) 1–11

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Revista Europeia de Ciências Farmacêuticas

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A reação de Maillard do fumarato de bisoprolol com vários

carboidratos redutores
Mateusz Szalkauma,⇑, Jacek Lubczakb, Dorota Narogc, Marek Laskowskiuma, Krzysztof Kaczmarskid
umaDepartamento de Desenvolvimento de Produto, ICN Polfa Rzeszów SA, 35-959 Rzeszów, Polônia
bDepartamento de Química Orgânica, Universidade de Tecnologia de Rzeszów, 35-959 Rzeszów, Polônia
cDepartamento de Química Física, Universidade de Tecnologia de Rzeszów, 35-959 Rzeszów, Polônia
dDepartamento de Engenharia Química e de Processos, Universidade de Tecnologia de Rzeszów, 35-959 Rzeszów, Polônia

informações do artigo abstrato

Historia do artigo: A análise por HPLC de medicamentos contendo fumarato de bisoprolol e lactose revelou a presença de
Recebido em 25 de setembro de 2013 Recebido em forma Nformilbisoprolol, que é um produto final da reação de Maillard. As formulações contendo aminas secundárias e
revisada em 31 de março de 2014 Aceito em 7 de abril de
carboidratos redutores são propensas à condensação de grupos funcionais amina e carbonila e à formação de
2014
glicosilaminas em condições farmaceuticamente relevantes. O rearranjo adicional ocorre na presença de um
Disponível on-line em 16 de abril de 2014
nucleófilo e leva à formação de 1-desoxi-1-amino-2-cetose, também conhecido como Produto de Rearranjo Amadori
(ARP). A influência do teor de água, carboidratos e tipos de lubrificantes na taxa de reação foi testada. O progresso
Palavras-chave:
da reação foi monitorado por HPLC e espectrofotometria UV-Vis. As estruturas dos intermediários foram
Reação de Maillard
confirmadas por LC/MS2análise. N-formilbisoprolol – o produto final da reação – foi sintetizado e caracterizado por
Rearranjo de Amadori
Fumarato de bisoprolol LC/MS2, H1e C13RMN.
Glicosilamina
Incompatibilidade de excipiente de - 2014 Elsevier BV Todos os direitos reservados.
1-desoxi-1-amino-2-cetose

1. Introdução cápsulas e comprimidos (Rowe et al., 2003). Nas formulações de

Incompatibilidades comuns entre os ingredientes farmacêuticos ativos e
os excipientes (diluentes de comprimidos) ocorrem devido à reação de
Maillard, também conhecida como reação de escurecimento não enzimático.
Há mais de 100 anos, Louis Maillard relatou que os compostos carbonílicos
podem reagir com aminoácidos e proteínas para formar misturas complexas
de pigmentos marrons com um odor característico de malte.Maillard, 1912).
Essa reação vem sendo estudada há muitos anos e é descrita em detalhes
na literatura alimentar e nutricional.Ledl e Schleicher, 1990; Ledl, 1990).
Atualmente, a reação de Maillard também foi extensivamente estudada nos
sistemas farmacêuticos (Qiu et al., 2005; Monajjemzadeh et al., 2009) onde
glicose, lactose e maltose são comumente usados como enchimentos em
Abreviaturas:ACE, inibidores da enzima conversora de angiotensina; Al/PVdC,
alumínio/cloreto de polivinilideno; Ar, anel aromático; ARP, Produto de Rearranjo
Amadori; DMSO, dimetilsulfóxido; EMEA, Agência Europeia de Medicamentos; FDA, Food
and Drug Administration; GC, cromatografia gasosa; HPLC, cromatografia líquida de alta
eficiência; ICH, A Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos;
IR, espectroscopia de infravermelho; KF, titulação Karl Fischer; MS, espectrometria de
massa; RMN, Ressonância Magnética Nuclear; RT, tempo de retenção; Espectrofotometria
UV-Vis, ultravioleta-visível.
⇑Autor correspondente. Tel.: +48 795 521 562.
Endereço de email:mateusz.szalka@valeant.com (M. Szalka).
medicamentos, a reação de escurecimento não enzimático ocorre entre
um carboidrato redutor (principalmente mono ou dissacarídeo) que
pode existir na forma de aldeído de cadeia aberta e substâncias ativas
contendo grupos funcionais amina primários ou secundários.Hodge e
Rist, 1953). Por muitos anos as aminas terciárias não foram
consideradas como substratos para a reação de Maillard. No entanto,
como descrito porThumma e Repka (2009), a reação de prometazina e
lactose também resulta em escurecimento não enzimático.
O fumarato de bisoprolol pertence à classe dos betabloqueadores de
substâncias terapêuticas e é comumente usado no tratamento da
hipertensão, insuficiência coronariana e arritmia.Merck KGaA Darmstadt
Alemanha, 2001). Quimicamente o bisoprolol é um derivado do
fenoxiaminopropanol (amina secundária); é usado como uma mistura
racêmica para fins terapêuticos. O Concor-família de medicamentos foi
originalmente desenvolvida pelo Grupo Merck e atualmente está registrada
em mais de 90 países em todo o mundo. Recentemente, existem muitas
formulações genéricas de fumarato de bisoprolol disponíveis no mercado
europeu, a maioria delas contendo carboidratos redutores como
enchimentos primários de comprimidos – principalmente lactose devido ao
seu baixo preço e boa compressibilidade.
A Sociedade Europeia de Cardiologia reforçou a posição dos
betabloqueadores no tratamento das insuficiências cardíacas crônicas
e agudas nas diretrizes revisadas (McMurray et al., 2012). Há evidências

http://dx.doi.org/10.1016/j.ejps.2014.04.005 0928-0987/-
2014 Elsevier BV Todos os direitos reservados.
2 M. Szalka et ai. / Revista Europeia de Ciências Farmacêuticas 59 (2014) 1–11
que os betabloqueadores são complementares aos diuréticos ou inibidores
da ECA (a lista de abreviaturas está na primeira página deste trabalho), e
podem ser usados simultaneamente no tratamento da insuficiência
cardíaca diagnosticada. Assim, podemos esperar que muitas novas
formulações genéricas contendo duas substâncias ativas de diferentes
classes sejam desenvolvidas e registradas nas autoridades competentes. Os
cientistas da formulação não devem esquecer que uma combinação de
compostos de amina e carbonila pode resultar na reação de escurecimento
não enzimático e na formação de compostos químicos indesejáveis que
muitas vezes demonstram uma atividade biológica.
A primeira etapa da reação envolve a condensação de um grupo
funcional carbonila de carboidrato e um grupo amina da substância
ativa para formar uma glicosilamina e água. A segunda etapa dessa
reação foi proposta por Amadori, que comprovou que o aquecimento
DA glicose com aminas primárias leva à formação de dois isômeros: um
lábil que prontamente sofre rearranjo para o outro isômero mais
estável (Amador, 1925). Ambas as estruturas dos isômeros lábeis e
estáveis foram posteriormente identificadas como uma glicosilamina
e 1-desoxi-1-amino-2-cetose, respectivamente.Kuhn e Dansi, 1936;
Kuhn e Weygand, 1937). Outras etapas do escurecimento não
enzimático podem ocorrer através de muitas vias de reação diferentes,
incluindo a fragmentação e desidratação de carboidratos ou a
ciclização e formação de compostos aromáticos.Ledl et al., 1986). O
escurecimento não enzimático foi observado em taxas lentas nas
condições neutras e ácidas. No entanto, conforme relatado porHodge e
Rist (1953), as condições alcalinas são as mais favoráveis para esta
reação. Estudos da reação de Maillard em um sistema modelo líquido
confirmam que a adição de pequenas quantidades de hidróxidos
melhora significativamente a velocidade da reação e pode levar à
formação de novos produtos de degradação. Por exemplo, a formação
de N-formilfluoxetina foi observada na reação de lactose e cloridrato de
fluoxetina somente após a adição de hidróxido de potássio (Wirth et al.,
1998). É importante destacar que as glicosilaminas e os Produtos de
Rearranjo de Amadori (ARP) são suscetíveis à hidrólise. Assim, se o
estudo cinético da reação de Maillard está sendo realizado traçando o
ARP, então as condições da reação devem excluir soluções aquosas (
Wolfrom et ai., 1949; Mitts e Hixon, 1944).
O mecanismo geral da reação de Maillard (glicosilação) para glicose
e uma amina secundária é apresentado emFigura 1uma. O mecanismo
do rearranjo de Amadori na presença de quantidades catalíticas de
ácido foi originalmente proposto por Kuhn e Weygand.Kuhn e Dansi,
1936) e envolveu uma protonação de nitrogênio na glicosilamina, uma
formação de íon amônio que permanece em equilíbrio com uma base
de Schiff e depois rearranjo para 1-desoxi-1-amino-2-cetose. Esse
mecanismo também foi apresentado porHodge (1955), que observou
que a atração de um próton pelo nitrogênio é mais provável do que por
um oxigênio fracamente básico. Em 1950 Gottschalk (1952) eIsbell e
Frush (1958) propôs o mecanismo do rearranjo de Amadori que
Figura 1.Geralmente propostos: (a) Via de reação de Maillard – glicosilação e (b) mecanismo de rearranjo de Amadori em condições ácidas.
incluiu a protonação do átomo de oxigênio, abertura imediata do anel
da glicosilamina e posterior rearranjo para o produto Amadori (ARP).
Simon e Kraus (1970)em seus estudos mecanísticos sobre o rearranjo
de Amadori apontam que a O-protonação é muito mais favorável para
a abertura do anel do que a N-protonação. De fato, a protonação do
átomo de oxigênio o transforma em um grupo de saída melhor, assim,
a abertura do anel deve ocorrer mais prontamente. É difícil determinar
inequivocamente de acordo com qual mecanismo o rearranjo de
Amadori ocorre em sistemas farmacêuticos. Também pode ser possível
que o mecanismo de reação final inclua inicialmente a atração de um
próton pelo nitrogênio básico e quando a transferência de um próton
para o átomo de oxigênio e posterior rearranjo. O mecanismo geral do
rearranjo Amadori proposto por Kuhn e Weygand é apresentado em
Figura 1b.
O escopo do nosso estudo é demonstrar as reações de Maillard/Amadori
do bisoprolol com vários carboidratos redutores nos sistemas modelo
sólido. Que foram projetados para testar a influência da água, vários
diluentes de comprimidos e lubrificantes na taxa de reação. Alertamos
também que as reações de Maillard/Amadori podem ocorrer nos
comprimidos disponíveis comercialmente armazenados nas câmaras
climáticas com condições aceleradas conforme indicado pela Conferência
Internacional de Harmonização (ICH) (Agência Europeia de Medicamentos,
2003).
É difícil realizar os estudos cinéticos completos devido à
complexidade tanto da reação de Maillard quanto do rearranjo de
Amadori. Além disso, os intermediários e produtos finais de conversão
podem se degradar de acordo com várias vias de reação, que muitas
vezes levam à regeneração da fração amina.Labuza e Massaro, 1990;
Labuza e Baisier, 1992). Todos os resultados obtidos foram
cuidadosamente considerados e utilizados na preparação do
mecanismo teórico da reação.
Em nossos estudos a reação foi monitorada por HPLC de fase
reversa e espectrofotometria UV-Vis. O teor de água foi determinado
pela titulação Karl Fischer. As massas moleculares dos intermediários
foram confirmadas por LC/MS2. A estrutura do produto final foi
comparada a um padrão de trabalho sintetizado e confirmada por LC/
MS2e análise de RMN.
2. Materiais e métodos
2.1. Materiais
O fumarato de bisoprolol foi obtido de ICN Polfa Rzeszów SA,
Polônia.
Di-hidrogenofosfato de potássio (anidro), ácido fórmico e hidróxido
de sódio foram obtidos de POCH, Polônia.
Acetonitrila grau HPLC, dimetilsulfóxido para GC, álcool isopropílico
grau HPLC, reagente de titulação Karl Fischer 5.0, solvente livre de
metanol Karl Fischer foram obtidos da Merck GmbH Alemanha.
 M. Szalka et ai. / Revista Europeia de Ciências Farmacêuticas 59 (2014) 1–11
A trietilamina >99,0% foi obtida de Sigma Aldrich, Reino Unido.
Todos os excipientes utilizados para a preparação de misturas
sólidas e comprimidos estavam comercialmente disponíveis. Os
excipientes foram previamente testados de acordo com o Ph. Eur.
monografias e cumprir todos os requisitos.
O monohidrato de glicose e o amido de milho foram obtidos de
Roquette, França.
A maltose cristalina advantose 100 foi obtida da SPI Pharma, França.
A lactose anidra foi obtida da Friesland Campino DMV BV, Holanda.
A lactose monohidratada Super Tab 11SD foi obtida da DMV
Fonterra Excipients GmbH & Co., Alemanha.
Celulose microcristalina VIVAPUR tipo 200 e estearil fumarato de
sódio PRUV-foram obtidos da JRS Pharma, Alemanha.
O fosfato de cálcio foi obtido de cfb Budenheim, Alemanha.
Estearato de magnésio foi obtido de Faci Spa, Itália. Sorbitol Parteck
SI 400, ácido esteárico, talco foram obtidos da Merck, Alemanha.
Sílica coloidal hidrofóbica Aerosil R972 Pharma foi obtida da Evonik
Degussa GmbH, Alemanha.
Dois medicamentos populares (marcas A e B) contendo fumarato de
bisoprolol (força de 2,5 mg) e lactose foram obtidos no mercado
europeu, ambos os produtos não expiraram.
A coluna Synergi Hydro-RP 250 - 4,6 mm foi obtida de Phenomenex,
Shim-Pol, Polônia.
A titulação Karl Fischer foi realizada no Titulador Volumétrico KF
Mettler Toledo, o procedimento de acordo com o Ph. Eur. método
geral. Aproximadamente 0,5 g de uma mistura sólida foi usada para a
determinação do teor de água.
A análise UV-Vis foi realizada no espectrofotômetro Unicam 500 UV-
Visible, comprimento de onda 490 nm, cubeta com caminho óptico de 1 cm,
as soluções teste continham equivalência de 1,0 mg/ml de fumarato de
bisoprolol.
2.2. Método HPLC-UV
A análise por cromatografia líquida de alta eficiência foi realizada em um
Módulo de Separações Waters 2695 (pressão operacional máxima 350 bar)
com amostrador automático (25eu1 tamanho de seringa) e o detector de
arranjo de fotodiodos (2998) da Waters Corporation (Milford, MA). A coluna
Synergi Hydro-RP 250 - 4,6 mm com pré-coluna foi mantida a 50 C, a
temperatura do amostrador automático foi ajustada em 25 C, comprimento
de onda do detector UV 225 nm. Dois eluentes foram usados: o tampão
fosfato 0,05 M pH 3,1 (A) e acetonitrila grau HPLC (B). A taxa de fluxo foi
ajustada para 1,0 ml/min. O modo de bomba de gradiente com condições
iniciais 75:25 A:B por 10 min, mudança linear para 20:80 A:B em 23 min,
depois retornou para 75:25 A:B em 24 min e mantido até o equilíbrio das
condições iniciais . O tempo de execução da análise foi de 30 min, o volume
de injeção foi de 10eueu. Tempos de retenção aproximados: 7,5 min.
Produto de Rearranjo Amadori (ARP), 7,8 min. glicosilamina N-substituída
(Produto de Reação de Maillard), 11,8 min. Bisoprolol, 21,3 min. N-
formilbisoprolol. Os resultados obtidos foram avaliados pelo software
Empower 3.
A análise de HPLC/MS foi realizada no sistema LC/MS–MS 1200
Infinity Series Agilent Technologies 6460 Triple Quadrupolo: modo de
ionização por spray de elétrons, ionização positiva, voltagem capilar
4000 V, energia de colisão 30 eV, fragmentador 10 (modo de
varredura), fragmentador 135 (modo de íon de produto). As condições
de HPLC descritas acima foram aplicadas, exceto que o tampão fosfato
não era compatível com o detector MS, portanto, foi substituído por
uma mistura de água e ácido fórmico (pH 3,1).
A análise de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foi realizada no
FT-NMR Bruker Avance 500 MHz, Ultra Shield 500 MHz com
3
hexametildissiloxano como padrão interno. D2O foi adicionado em
alguns experimentos para identificar os prótons intercambiáveis.
2.3. A preparação da base de bisoprolol
O fumarato de bisoprolol (25 g) foi dissolvido em 125 ml de água
redestilada; solução aquosa de hidróxido de sódio a 30% (13 ml) foi
adicionada gota a gota e misturada. Esta solução turva foi extraída duas
vezes com cloreto de metileno (60 ml e 40 ml). As camadas orgânicas foram
combinadas e lavadas duas vezes com água redestilada (2-40 ml), as
camadas orgânicas foram combinadas novamente e secas com sulfato de
magnésio anidro durante 30 min. A mistura foi filtrada para remover o
agente de secagem; o cloreto de metileno foi evaporado usando um
evaporador rotativo para obter o resíduo oleoso. Bomba de vácuo foi usada
para remover o cloreto de metileno residual.
O peso molecular calculado 325,4 foi confirmado pela massa do íon
precursor de LC/MS (m/z) [M+H]+= 326,1 (foi observada a formação de
aduto de potássio [M+K]+= 364,0).
Sinais principais IR (placas KBr): -3380 cm1(sinal amplo forte devido
a OUMAH e sinal agudo fraco devido a NUMAH); -3030 centímetros1
(sinal fraco ArUMAligação H); 2855–2960 cm1(forte alcano CUMAsinais
H); 1879, 1743, 1709, 1607 (anel aromático de oscilação), 1580 (anel
aromático de oscilação), 1506 (anel aromático de oscilação), 1456 (CH2
vibrações de deformação), 1375 (CH3vibrações de deformação), 1328 (-
CHUMA),1295 (@CUMAOUMAC), 1250 (CUMAOUMAH), 1171 (terciário C
UMAOH), 1089 (não-planar no grupo fenileno para-substituído), 1031
(@CUMAOUMAC), 842 e 786 cm1(não planar no grupo fenileno
parasubstituído).
1H RMN (500 MHz, CDCl3) 7,24–7,27 (d, 2H), 6,86–6,89 (d, 2H),
4,50 (s, 2H), 4,09–4,14 (m, 1H), 3,93–3,99 (m, 2H), 3,58–3,59 (amplo, 2H,
prótons intercambiáveis:UMAOH e @NH), 3,59–3,63 (m, 1H), 3,57 (s,
4H), 2,84–2,91 (m, 2H), 2,72–2,76 (m, 1H), 1,16–1,17 (d, 6H), 1,11 -1,12 (d,
6H).
13C RMN (125 MHz, CDCl3)d =158,22, 130,84, 129,32, 114,40,
72,81, 71,87, 70,57, 69,45, 68,04, 67,45, 53,45, 49,27, 22,48,
22.43, 22.08.
2.4. A preparação de N-formilbisoprolol
A base de bisoprolol (23,09 g) foi dissolvida em 115 ml de
dimetilformamida, uma solução límpida foi obtida e aquecida sob
refluxo durante 48 h (temperatura aproximada 150°C). A mistura
reaccional escura foi arrefecida até à temperatura ambiente e filtrada.
O excesso de um solvente foi removido do filtrado com bomba de
vácuo. O N-formilbisoprolol foi separado da mistura reacional por
extração com cloreto de metileno – água. As camadas orgânicas foram
combinadas, secas com sulfato de magnésio anidro (2,0 g) durante 2 h
e filtradas; o cloreto de metileno foi evaporado usando um evaporador
rotativo. Uma bomba de vácuo foi usada para remover o solvente
residual. A pureza testada pelo método HPLC foi de 99,1%. O peso
molecular calculado 353,4 foi confirmado pela massa do íon precursor
de LC/MS (m/z) [M+H]+= 354,1, padrão de fragmentação LC/MS
confirmou a formilação do grupo funcional amina (m/z):250,1; 144,1;
102,0.
Sinais principais IR (placas KBr): 3390 cm1(sinal amplo forte devido a
OUMAH); -3030 centímetros1(sinal fraco ArUMAligação H); 2855– 2960
centímetros1(forte alcano CUMAsinais H); 2620 centímetros1(sinal fraco
CUMAH aldeído); 1882, 1766, 1649 (grupo carbonil de sinal forte, C@O ),
1606 e 1580 e 1506 (anel aromático de oscilação), 1456 (CH2
vibrações de deformação), 1417 (grupo aldeído), 1365 (CH3vibrações de
deformação), 1327 (-CHUMA),1293 (@CUMAOUMAC), 1243 (CUMAO
UMAH), 1180 (terciário CUMAOH), 1089 (não-planar no grupo fenileno
para-substituído), 1036 (@CUMAOUMAC), 843 e 776 cm1
(não planar em grupo fenileno para-substituído).
1H RMN (500 MHz, CDCl3) 8,24 (s, 1H), 7,26–7,28 (d, 2H), 6,86–
6,89 (d, 2H), 4,50 (s, 2H), 4,23 (s largo, 1H), 4,09-4,16 (m, 1H),
4 M. Szalka et ai. / Revista Europeia de Ciências Farmacêuticas 59 (2014) 1–11
4,01–4,08 (m, 1H), 3,80–3,90 (m, 2H), 3,58–3,67 (m, 1H), 3,60 (s, 4H),
3,47–3,52 (m, 2H), 1,23–1,30 (dd, 6H) ), 1,16–1,18 (d, 6H).
13C RMN (125 MHz, CDCl3)d =164,80, 157,89, 131,04, 129,37,
114,36, 72,78, 71,88, 71,03, 69,49, 69,36, 67,45, 51,15, 45,92,
22.08, 21.86, 21.71.
2.5. Estudos da reação de Maillard e rearranjo de Amadori em estado
líquido
Hidróxido de sódio (ensaioP98,8%, quantidades 0, 50, 100, 150, 200
mg) foi transferido para um recipiente de reação de 50 ml e combinado
com 20 ml de propan-2-ol; a temperatura inicial foi fixada em 75°C. A
mistura foi vigorosamente agitada até a dissolução completa do
hidróxido de sódio (foram obtidas soluções finais com concentração 0,
0,025, 0,05, 0,075 ou 0,1 M de NaOH). Adicionou-se dimetilsulfóxido (30
ml) ao recipiente reaccional e aumentou-se a temperatura até à
temperatura reaccional final (90, 100 ou 110°C). A glicose (5,58, 8,37 ou
11,16 g) foi transferida para o recipiente de reação; imediatamente
após a dissolução completa de um hidrato de carbono a base de
bisoprolol (0,5 g) foi adicionada. A reação foi realizada por 5 h, após
cada 30 min 1,0 ml de uma mistura de reação foi retirado do recipiente
de reação e diluído para 10 ml com a fase móvel. Os padrões de
trabalho da glicosilamina e do produto de rearranjo de Amadori não
estavam disponíveis, portanto, sua concentração foi calculada em
relação ao padrão de fumarato de bisoprolol. A concentração de N-
formilbisoprolol foi calculada em relação ao padrão de trabalho
sintetizado.
O vaso de reação foi um vaso cilíndrico encamisado com volume
aproximado de 50 ml, conectado ao banho termostatizado; glicerol foi
usado como meio de aquecimento circulante para garantir altas
temperaturas de reação. A temperatura foi controlada com
termômetro qualificado. A agitação vigorosa de uma mistura de reação
foi obtida pela aplicação de um agitador magnético. O vaso reaccional
foi bem fechado com uma rolha de vidro para evitar a evaporação dos
solventes reaccionais. Para simplificar o modelo de reação, usamos a
base de bisoprolol (amina livre) em vez de fumarato de bisoprolol.
2.6. Estudos de triagem
Amostras sólidas contendo 5% (p/p) da substância ativa foram
preparadas adicionando 7,5 g de fumarato de bisoprolol a 141 g de um
carboidrato (glicose, lactose anidra, lactose monohidratada, maltose
monohidratada) e misturadas. Na última etapa foram adicionados 1,5 g
de estearato de magnésio e misturados rapidamente. Cerca de 1,0 g de
uma mistura sólida foi transferido para um frasco Headspace de 20 ml
e fechado hermeticamente com um septo. As amostras foram
colocadas em um forno bem equilibrado a 95 C e removidas após 1, 2,
3, 4 e 6 h de aquecimento. As soluções de teste foram preparadas
pesando 200 mg de uma mistura sólida (equivalência de 10 mg de
fumarato de bisoprolol) em balão volumétrico de 10,0 ml, diluída com
fase móvel de HPLC e sonicada por 15 min. As amostras foram então
centrifugadas a 4000 rpm por 10 min, o sobrenadante foi transferido
para um frasco de vidro e analisado por HPLC. Como não há padrões
de trabalho da glicosilamina ou do produto de rearranjo Amadori
disponíveis, assumimos que ambos os compostos têm a mesma
resposta UV do bisoprolol. O escurecimento observado em cada
solução também foi analisado com o espectrofotômetro UV-Vis.
2.7. A reação de Maillard/rearranjo de Amadori em comprimidos –
desenvolvimento farmacêutico
Este estudo foi projetado para testar a influência de vários tipos de
enchimentos de comprimidos e lubrificantes, que são comumente usados
como excipientes na indústria farmacêutica. Também foi testada a influência
da proporção da substância ativa para o enchimento do comprimido. Para
este fim, as misturas sólidas contendo 5%, 20% e 40% (p/p) de bisoprolol
fumarato e enchimento de comprimido foram preparados. Quantidades
apropriadas da substância ativa e de um excipiente testado foram pesadas para o
recipiente, fechadas com tampa e misturadas por 60 min; no estágio final, 1% de
um lubrificante foi adicionado e misturado rapidamente. A ampla faixa de teor de
bisoprolol foi aplicada para evitar resultados ambíguos, entretanto,
medicamentos de referência e genéricos contêm aproximadamente 5% da
substância ativa. Os comprimidos foram preparados comprimindo as misturas
sólidas com Korsch PH 106 Rotary Tablet Press usando selos de 6 mm. A dureza
média dos comprimidos foi de 100 N.
Os comprimidos e as misturas sólidas soltas foram transferidos para os
recipientes de polietileno fechados com tampa e colocados nas câmaras
climáticas monitoradas a 30 C/65%RH, 40 C/75%RH e em estufa de
laboratório a 50 C. Nenhum dessecador foi usado. A umidade relativa em
um forno de laboratório medida manualmente foi de aprox. 10%RH. Todas
as amostras foram testadas por HPLC no início dos estudos de estabilidade e
após 3 e 6 meses de armazenamento.
Lubrificantes testados: sílica coloidal, talco, estearil fumarato de sódio,
estearato de magnésio, ácido esteárico. Os lubrificantes listados acima são
comumente usados para permitir a formação de comprimidos de pós,
evitando que os comprimidos grudem nos selos. Embora esses compostos
não tenham propriedades redutoras, alguns deles podem catalisar a reação
de Maillard.
Enchimentos de comprimidos testados: celulose microcristalina, amido
de milho, lactose anidra, lactose monohidratada, maltose monohidratada,
glicose monohidratada, sorbitol e fosfato de cálcio. Dos enchimentos
mencionados acima, apenas lactose, maltose e glicose podem existir em
formas de cadeia aberta com grupo aldeído livre, portanto, todos os três são
açúcares redutores. A celulose e o amido de milho são polímeros longos e
contêm muito poucos grupos carbonila terminais, ambos os compostos não
são carboidratos redutores. O sorbitol é um álcool de açúcar, não possui
propriedades redutoras. No entanto, o sorbitol é obtido pela redução do
grupo aldeído da glicose em um grupo hidroxila, pequenas quantidades de
glicose não reagida podem estar presentes no produto comercializado.
Fosfato de cálcio (CaHPO4) é um composto inorgânico e também não possui
propriedades redutoras.
3 Resultados e discussão
3.1. Reações em estado líquido
A reação de monohidrato de glicose e bisoprolol em estado líquido foi inicialmente realizada em
solução aquoso-etanólica aquecida a 60 C, conforme descrito por Wirth (Wirth et al., 1998). O
escurecimento das soluções foi observado indicando que o rearranjo Maillard/Amadori ocorre nestas
condições. No entanto, os estudos em uma mistura de água e etanol apresentam duas desvantagens
significativas. Primeiro, que a temperatura da reação deve ser mantida em um nível relativamente baixo,
abaixo do ponto de ebulição da solução de água-etanol, enquanto a velocidade da reação de Maillard
depende fortemente da temperatura. A segunda desvantagem importante é que tanto a glicosilamina
quanto a 1-desoxi-1-amino-2-cetose são muito suscetíveis à hidrólise. De fato, após a adição de hidróxido
de potássio foi observada a formação de N-formilbisoprolol, porém após 30 min a reação atingiu seu
equilíbrio e não prosseguiu. O bisoprolol N-formilado também é suscetível à hidrólise nas condições
alcalinas levando à base bisoprolol e ácido fórmico, que neutraliza lentamente as condições de reação.
Assumiu-se que a remoção de água da mistura reacional melhoraria o rearranjo de Maillard/Amadori,
porém a maioria dos solventes orgânicos foram restringidos devido à baixa solubilidade de carboidratos e
hidróxidos. Em temperaturas mais altas, uma quantidade suficiente de glicose pode ser dissolvida em
dimetilsulfóxido, enquanto o hidróxido de sódio pode ser dissolvido em propan-2-ol. Nos estudos
posteriores, a mistura de 30 ml de DMSO e 20 ml de propan-2-ol foi usada para garantir alta temperatura
de reação no entanto, a maioria dos solventes orgânicos foi restringida devido à baixa solubilidade de
carboidratos e hidróxidos. Em temperaturas mais altas, uma quantidade suficiente de glicose pode ser
dissolvida em dimetilsulfóxido, enquanto o hidróxido de sódio pode ser dissolvido em propan-2-ol. Nos
estudos posteriores, a mistura de 30 ml de DMSO e 20 ml de propan-2-ol foi usada para garantir alta
temperatura de reação no entanto, a maioria dos solventes orgânicos foi restringida devido à baixa
solubilidade de carboidratos e hidróxidos. Em temperaturas mais altas, uma quantidade suficiente de
glicose pode ser dissolvida em dimetilsulfóxido, enquanto o hidróxido de sódio pode ser dissolvido em
propan-2-ol. Nos estudos posteriores, a mistura de 30 ml de DMSO e 20 ml de propan-2-ol foi usada para
garantir alta temperatura de reação
 M. Szalka et ai. / Revista Europeia de Ciências Farmacêuticas 59 (2014) 1–11
(até 110 C), boa solubilidade dos substratos e baixo teor de água. É
difícil obter condições livres de água, pois algumas quantidades de
água podem ser introduzidas no recipiente de reação com
dimetilsulfóxido e glicose.
A primeira etapa da reação de Maillard inclui a condensação do
grupo amina do bisoprolol e do grupo carbonila da glicose. Esta reação
foi estudada em três temperaturas (90, 100, 110 C) e com excesso de
glicose. A análise por HPLC revelou a presença de uma glicosilamina
(7,8 min) em um cromatograma da mistura de reação após 30 min de
aquecimento, peso molecular 488,1 foi confirmado pela análise LC/MS.
Figura 2a representa espectros LC/MS de uma glicosilamina.
À medida que a reação prosseguia, um novo pico (7,5 min) apareceu
em um cromatograma da mistura de reação. A coeluição indicou
similaridade estrutural próxima que também foi confirmada pelos
estudos de LC/MS (a frente de um pico foi analisada). Novo pico foi
atribuído ao Produto de Rearranjo Amadori; seu peso molecular 488
[M+H]+(m/z)foi confirmado por estudos LC/MS.Tjan e Ouweland (1974)
em sua investigação sobre a estrutura de ARPs descobriram que esses
produtos podem existir em equilíbrio nas formas de piranose e
furanose. Os estudos detalhados provaram que a forma de piranose é
mais favorecida, provavelmente porque os anéis de seis membros são
mais estáveis. A forma piranose existe exclusivamente nab
conformação, pode-se supor que uma grande porção amina sempre
adotará a posição equatorial devido às grandes interações 1,3-diaxiais.
No entanto, a presença da forma furanose em ambosumaeb
conformações também foi confirmada nos estudos de Tjan.
Diferentes colunas de HPLC foram testadas, porém, a melhor
separação foi obtida pela aplicação do Synergi Hydro-RP C18 com
endcapping polar, que proporciona retenção adicional para compostos
polares. O método inicial de HPLC continha metanol na fase móvel, no
entanto, este solvente era muito forte, pois a glicosilamina e o ARP
eluíram com a frente da fase móvel. Tentativas de análise de HPLC com
acetonitrila deram melhor separação. Os padrões de fragmentação MS
obtidos para ambos os picos de glicosilamina e ARP foram muito
semelhantes. Algumas diferenças na intensidade de
Figura 2.Espectros de LC/MS de glicosilamina (a) e Produto de Rearranjo Amadori (b).
5
sinais foram percebidos. Em primeiro lugar, os íons precursores de
ambos os compostos têm peso molecular 488 [M+H]+(m/z)e
prontamente sofrem duas desidratação consecutivas para formar íons
470 e 452 (m/z),que foram encontrados no espectro de fragmentação.
A dupla desidratação também foi observada por Wang et al. em seus
estudos de MS de compostos Amadori (Wang et al., 2008). Em nossas
condições de MS, a clivagem da ligação covalente entre o oxigênio fenil
e o átomo de carbono vizinho levou à formação de íons fragmentados
com peso molecular 278 (m/z)que também pode sofrer duas
desidratação para íons 260 e 242 (m/z).Os espectros LC/MS de
glicosilamina e ARP são apresentados emFigura 2a e b,
respectivamente. A formação de adutos de potássio foi observada
durante a análise LC/MS.
No sistema modelo líquido sem hidróxido de sódio a concentração
de glicosilamina e ARP permaneceu baixa mesmo após 5 h de
aquecimento. N-formilbisoprolol não foi observado nestas condições.
No entanto, a adição de NaOH melhorou significativamente as taxas de
reação e a formação de N-formilbisoprolol. Este fato pode levar à
conclusão de que o nucleófilo desempenha um papel significativo no
rearranjo de Maillard/Amadori. Há informações na literatura de que
pequenas quantidades de água também podem promover a reação, no
entanto, nenhuma explicação mecanicista foi fornecida.Serajuddin et
al., 1999). Experimentos no sistema modelo líquido foram repetidos
com a adição de 50 mg (0,025 M) de hidróxido de sódio. Nestas
condições a formação da glicosilamina foi muito mais rápida, como
também era esperado, a taxa de rearranjo de Amadori aumentou. A
reação mais rápida foi observada em 110 C. Após 5 h de aquecimento
as concentrações de glicosilamina e ARP em todas as temperaturas
testadas (110, 100 e 90 C) foram semelhantes indicando que o estado
de equilíbrio foi alcançado. O N-formilbisoprolol foi observado como
produto final da reação, porém, a maior quantidade deste composto foi
formada em 90 C. Em altas temperaturas a hidrólise nas condições
alcalinas ocorre mais rapidamente do que a formação do N-
formilbisoprolol. A influência de várias concentrações de íons hidróxido
na velocidade da reação também foi testada. Os experimentos
adicionais com 100, 150,
6 M. Szalka et ai. / Revista Europeia de Ciências Farmacêuticas 59 (2014) 1–11
hidróxido (soluções 0,05, 0,075 e 0,1 M respectivamente) foram
realizadas a 90°C. As maiores quantidades de glicosilamina e ARP
foram formadas quando pequenas quantidades de um catalisador
foram usadas (0,025 M NaOH). Ambos os compostos foram observados
em concentrações mais baixas em soluções de hidróxido de sódio 0,05,
0,075 ou 0,1 M, provavelmente porque a taxa de hidrólise alcalina
melhorou. Finalmente, a menor quantidade de ARP foi formada na
reação sem o catalisador. Pode-se concluir que a reação de Maillard e o
rearranjo de Amadori são prontamente catalisados por pequenas
quantidades de nucleófilos.
A principal via de degradação do ARP leva ao N-formilbisoprolol,
reconhecido como o produto final da reação. As formamidas podem
surgir pela decomposição térmica dos Produtos de Rearranjo Amadori,
conforme descrito porMills et ai. (1970)ou por fissão oxidativa de C1
UMAC2ligação em uma fração de carboidrato como descrito por
Weygand e Bergmann (1947). A segunda via de degradação também foi
confirmada porKawakishi e Cheng (1994), que estudou a decomposição
oxidativa de ARP catalisada por íons de Cobre (II).Fig. 3apresenta as
taxas de formação de N-formilbisoprolol em misturas reacionais com
várias concentrações de hidróxido de sódio. Notavelmente, em todos
os experimentos realizados com glicose e hidróxido de sódio, picos
adicionais foram observados em um cromatograma da mistura de
reação. Os compostos foram identificados como glicosilaminas
formadas a partir de porções de açúcar C5, C4 e C3. Seus pesos
moleculares (m/z)foram respectivamente 458,1 (RT 8,6 min), 428,1 (RT
9,4 min) e 398,1 (RT 10,7 min). A degradação dos produtos de Maillard
pela fragmentação da molécula de carboidrato também foi observada
porLedl et ai. (1986).
Adicionalmente, foi testada a influência de um tipo de carboidrato
na taxa de reação de Maillard e rearranjo de Amadori. Para tanto, 0,03
mol de glicose, lactose ou maltose foram dissolvidos em uma mistura
reacional e aquecidos a 110°C por 5 h. A reação foi catalisada por 50
mg de hidróxido de sódio. A concentração de glicosilamina foi
semelhante para lactose e maltose, e muito menor para glicose. Foi
confirmado pela análise de HPLC que o rearranjo de Amadori ocorre
muito mais rápido para dissacarídeos do que para um monossacarídeo.
Por fim, as maiores quantidades de N-formilbisoprolol também foram
observadas para maltose e lactose, enquanto apenas uma pequena
quantidade deste produto final foi encontrada na mistura de reação
com glicose. Parece que o arranjo estrutural desempenha um papel
importante na via química estudada.
Com base nos resultados obtidos uma proposição para o
mecanismo da reação de Maillard e rearranjo de Amadori entre
Fig. 3.A taxa de formação de N-formilbisoprolol em misturas de reação com várias
concentrações de íons hidróxido a 90 C.
bisoprolol e glicose foi apresentado emFig. 4. O mecanismo representa a
reação em misturas sólidas (comprimidos, cápsulas), onde podem ser
encontradas condições levemente ácidas.
A condensação de bisoprolol e glicose leva à formação de uma
glicosilamina e água, esta etapa é promovida pela alta temperatura.
Não há prova de que a N-protonação ou a O-protonação ocorra
primeiro em condições ácidas, ambos os mecanismos são razoáveis. No
entanto, os resultados obtidos no estado líquido confirmam que a
presença de um nucleófilo é importante na reação de Maillard e no
rearranjo de Amadori. Em condições alcalinas, a protonação da
glicosilamina não pode ocorrer, no entanto, os íons hidróxido são
nucleófilos fortes o suficiente para atrair um próton de C2posição e
induzir o rearranjo. Da mesma forma, em reações em estado sólido, a
água atrai um próton de C2posição e força o rearranjo de Amadori, que
ocorre espontaneamente através do tautomerismo ceto-enol, para
formar ARP. A molécula de água é cerca de 16 k vezes menos nucleófilo
reativo do que o íon hidróxido, portanto, nem a O-protonação pode ser
necessária para melhorar a velocidade da reação, isso explica porque a
reação no estado sólido é prontamente catalisada por ácidos. O ARP
não existe como uma estrutura de cadeia aberta; rapidamente sofre
rearranjo para as formas de piranose ou furanose que coexistem em
equilíbrio. O mecanismo do rearranjo de Amadori é muito semelhante
ao mecanismo de formação da enamina a partir de uma cetona e uma
amina secundária, exceto que a presença do grupo hidroxila próximo à
dupla ligação força o tautomerismo ceto-enol.
3.2. Estudos de triagem
Os cientistas de formulação devem realizar testes de triagem simples
durante um desenvolvimento farmacêutico para detectar interações entre
substâncias ativas e excipientes. O aquecimento da mistura sólida por
algumas horas geralmente é suficiente para observar o escurecimento
intenso e o odor de malte – os sinais característicos da reação de Maillard.
Este método foi amplamente utilizado no passado para determinar
incompatibilidades de formulação (Castello e Mattock, 1962; Hammouda e
Salakawy, 1971). O escurecimento pode ser adicionalmente medido por
espectrofotometria UV em comprimento de onda de 490 nm (Martins e Van
Boekel, 2003), essa abordagem foi usada em nossos estudos com a análise
de HPLC para detectar em qual estágio do rearranjo de Maillard/Amadori a
cor marrom aparece. As misturas sólidas contendo 5% (p/p) de fumarato de
bisoprolol e carboidrato apropriado foram aquecidas a 95°C por 6 h em
frascos de headspace bem fechados para proteger a água da evaporação. O
conjunto de experimentos para lactose anidra, lactose monohidratada,
maltose monohidratada e glicose monohidratada foi realizado. Nos pontos
de tempo assumidos, os frascos foram removidos de um forno
termostatizado. As soluções de teste contendo equivalência de 1,0 mg/ml de
fumarato de bisoprolol foram preparadas conforme descrito na seção
experimental e analisadas por HPLC e espectrofotometria UV (a fase móvel
foi usada como solução de referência UV).
Resultados para monossacarídeos:A degradação mais intensa do
bisoprolol foi observada nas amostras com glicose, isso pode ser
facilmente explicado porque a razão molar de glicose para API é duas
vezes maior que a razão molar de lactose ou maltose para a substância
ativa. A glicosilamina sofre o rearranjo de Amadori, no entanto, a
formação adicional de N-formilbisoprolol prossegue muito lentamente.
De fato, a menor quantidade do produto final da reação foi observada
quando a glicose foi usada como carga. As misturas sólidas foram
testadas por LC/MS e os pesos moleculares de glicosilamina e ARP
foram confirmados (ambos 488 [M+H]+,m/z).
Resultados para dissacarídeos:A condensação de fumarato de bisoprolol
e lactose (anidro e monohidratado) ocorre com velocidade semelhante para
ambos os excipientes e foi estimada medindo a diminuição da concentração
da substância ativa. Grandes quantidades de uma glicosilamina e ARP foram
observadas nas amostras com monohidratos de lactose e maltose. A reação
foi muito mais lenta quando
 M. Szalka et ai. / Revista Europeia de Ciências Farmacêuticas 59 (2014) 1–11 7

Fig. 4.O mecanismo da reação de Maillard e rearranjo de Amadori de bisoprolol e glicose em condições ácidas.

foi utilizada lactose anidra; isso confirma que a água acelera a reação de
Maillard. A taxa de formação de N-formilbisoprolol foi a mais rápida para
lactose monohidratada de todos os excipientes usados nos estudos de
triagem. Comparando os resultados obtidos observamos que a maltose
monohidratada se comporta de forma muito semelhante à lactose
monohidratada. Todas as misturas sólidas também foram analisadas por LC/
MS. Picos devido à glicosilamina comm/z650 [M+H]+e ARP com m/z650
[M+H]+foram achados. A estrutura do N-formilbisoprolol também foi
confirmada por estudos LC/MS 354 [M+H]+foi encontrado, o tempo de
retenção do bisoprolol N-formilado correspondia ao tempo de retenção de
um padrão sintetizado.
O teor de água foi determinado pela titulação Karl Fischer em todas as
amostras usadas para os estudos de triagem no início do experimento. Os
resultados obtidos foram os seguintes: lactose anidra 0,12%, lactose
monohidratada 5,24%, maltose monohidratada 5,35%, glicose
monohidratada 8,82%. A taxa de rearranjo de Amadori aumentou com o
incremento do teor de água nas amostras testadas. Forte escurecimento das
misturas sólidas também foi observado durante o aquecimento. O aumento
da absorbância UV-Vis das soluções teste não se correlacionou com o
Fig. 5.Escurecimento das misturas sólidas durante o aquecimento monitorado pela
aumento da concentração de glicosilamina, ARP, nem N-formilbisoprolol. espectrofotometria UV-Vis (a 490 nm).
Não foram observadas outras impurezas conhecidas (de acordo com Ph.
Eur.) ou desconhecidas de fumarato de bisoprolol durante a análise de
HPLC. Assim, assumiu-se que o escurecimento ocorre devido à formação de fenômeno de escurecimento foi atribuído à formação de melanoidinas.
melanoidinas.Fig. 5. Amostras em branco contendo apenas carboidratos
apropriados também foram colocadas nos estudos de triagem para
observar a carmelização dos açúcares. No entanto, a lactose e a maltose 3.3. Os estudos de estabilidade de lotes de laboratório
permaneceram brancas mesmo após 6 h de aquecimento a 95°C. O
monohidrato de glicose se transformou em um sólido transparente vítreo, e Nossa próxima abordagem foi testar a estabilidade de misturas sólidas e
o escurecimento desta mistura também não foi observado. Uma vez que a comprimidos, para simular formulações simples de formas farmacêuticas
caramelização dos açúcares não ocorreu nestas condições, o sólidas orais de medicamentos. As amostras foram acondicionadas em
recipientes de polietileno e armazenadas por 6 meses em
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condições. As amostras testadas foram colocadas nas câmaras
climáticas com temperatura e umidade monitoradas e analisadas por
HPLC após 0, 3 e 6 meses de armazenamento. As condições aceleradas
(40 C/75%RH) e as condições intermediárias (30 C/65%RH) de acordo
com as diretrizes do ICH sobre os estudos de estabilidade foram
selecionadas. Os estudos de longa duração (25 C/60%RH) não foram
realizados devido à baixa taxa de reação. No entanto, é óbvio que a
reação de Maillard ocorre também nessas condições e grandes
quantidades de N-formilbisoprolol podem ser encontradas nos
medicamentos, especialmente no final do prazo de validade. Em vez
das condições de longo prazo, o armazenamento em um forno de
laboratório a 50 C/10%RH foi aplicado. A lista de cargas e lubrificantes
de comprimidos utilizados neste estudo foi apresentada na seção
experimental.
Inicialmente foi testada a influência da proporção de fumarato de
bisoprolol para o excipiente (glicose). Para isso foram preparados
comprimidos contendo 5%, 20% e 40% de bisoprolol e colocados nas
câmaras climáticas. As maiores quantidades de glicosilamina, ARP e N-
formilbisoprolol foram encontradas em amostras contendo 5% de fumarato
de bisoprolol, depois 20% e 40% em ordem decrescente. Resultados
semelhantes foram obtidos em todas as condições e para todos os
carboidratos. Pode-se concluir que a proporção de uma amina secundária
para carboidrato é um fator importante que determina a velocidade da
reação de Maillard. Infelizmente, as potências dos medicamentos contendo
bisoprolol usados para fins terapêuticos são relativamente pequenas:
comprimidos com 2,5, 5 e 10 mg da substância ativa estão disponíveis no
mercado. Baixo teor de bisoprolol (aprox. 5% do peso do comprimido) em
relação ao enchimento do comprimido promove a reação de Maillard em
medicamentos. Nossos resultados ficam em conformidade com os
resultados obtidos porMonajjemzadeh et ai. (2009)em estudos da reação de
Maillard entre baclofeno e lactose.
A segunda abordagem incluiu testes dos enchimentos mais populares
usados em uma indústria farmacêutica na taxa de reação de Maillard. Para
este fim foram preparadas misturas contendo 5% (p/p) de fumarato de
bisoprolol e vários excipientes, estearato de magnésio foi usado em todas as
amostras como lubrificante para permitir a formação de comprimidos.
Misturas sólidas não comprimidas e comprimidos foram colocados nas
câmaras climáticas e analisados após 0, 3 e 6 meses. Em todas as amostras
testadas a taxa de reação foi mais rápida nos comprimidos comprimidos do
que nos pós soltos, este fenômeno foi observado independentemente do
tipo de carboidrato. A compressão melhora o contato físico entre as
partículas o que resulta em uma condensação mais rápida dos grupos
funcionais carbonila e amina. A dureza do comprimido é outro fator
importante que influencia o Maillard
reação. É importante destacar que a reação de Maillard ocorre também
em misturas sólidas não comprimidas (nas condições aceleradas),
portanto, também pode ocorrer em cápsulas contendo fumarato de
bisoprolol e carboidrato redutor.
O tipo de preenchimento foi o parâmetro mais crítico que afetou a taxa
de reação de Maillard em nossos estudos. A degradação mais rápida
ocorreu nas amostras com glicose e foi explicada simplesmente pela alta
razão molar do excipiente para o bisoprolol. Apenas 64% e 89% do
bisoprolol restante foi determinado nas amostras armazenadas por 6 meses
a 50 C e 40 C, respectivamente. 6,5% de N-formilbisoprolol foi encontrado na
amostra anterior, esta quantidade apresenta o nível de qualificação da
impureza identificada mais de 40 vezes (de acordo com as diretrizes da
EMEA). Grandes quantidades de ARP foram observadas apenas quando a
glicose foi usada como enchimento, para os outros excipientes este produto
intermediário da reação foi encontrado apenas em pequenas quantidades
ou não foi encontrado, mesmo quando o bisoprolol N-formilado foi
detectado. A preparação dos lotes de laboratório não incluiu o revestimento
por película dos comprimidos para evitar a introdução de água ou solventes
orgânicos. Assumiu-se que os comprimidos não revestidos não são bem
protegidos do ar, portanto, a clivagem oxidativa ocorre prontamente após a
formação de ARP e leva ao N-formilbisoprolol. A comparação dos resultados
obtidos para comprimidos com dissacarídeos revelou que não apenas a
temperatura, mas também a umidade nas câmaras climáticas tem forte
efeito sobre a reação de Maillard. Em um forno de laboratório (RH aprox.
10%) as amostras com maltose e lactose monoidratada tiveram uma taxa de
reação muito mais rápida do que uma amostra com lactose anidra. Por
outro lado, as taxas de reação para todos os três excipientes são muito
semelhantes quando armazenados em uma câmara de alta umidade (RH
75%), levando à conclusão de que não há vantagem em usar lactose anidra
nessas condições. Frascos de polietileno foram usados como embalagem
imediata em nossos estudos de estabilidade, enquanto os medicamentos
geralmente são embalados em blisters de Al/PVC que garantem melhor
proteção contra umidade. Deve-se considerar que o uso de um material de
embalagem melhor pode revelar a vantagem da lactose anidra sobre o
monohidrato.
Quando monohidratos de glicose, maltose ou lactose foram usados
como excipientes, observou-se visualmente um intenso escurecimento
e aumento da umidade. Também foi determinada perda significativa
no ensaio de fumarato de bisoprolol pela análise de HPLC, que não foi
compensada pelo aumento de impurezas, por isso os resultados do
ensaio e impurezas não somam 100% emtabela 1. É duvidoso que o
fator de resposta da substância ativa e suas substâncias relacionadas
diferem tanto, assim, a explicação da formação de melanoidinas foi
aplicada com base no fato de que ocorreu escurecimento intensivo. As
melanoidinas são copolímeros e polímeros nitrogenados

tabela 1
Os resultados do estudo de estabilidade (± desvio padrão) para comprimidos contendo 5% de fumarato de bisoprolol e vários excipientes armazenados nas condições aceleradas (40 6 C/75%RH) para
meses.

Tempo de armazenamento Glicose Maltose Lactose Lactose Sorbitol (%) Cálcio hidrogênio
monohidrato (%) monohidrato (%) monohidrato (%) anidro (%) fosfato (%)

Inicial
Bisoprolol restante 99,7 ± 0,3 101,0 ± 0,1 98,0 ± 0,2 97,1 ± 0,1 98,8 ± 0,5 100,8 ± 0,2
Glicosilamina 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
ARP 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
N-formilbisoprolol 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3 meses
Bisoprolol restante 92,1 ± 0,3 91,9 ± 3,3 96,2 ± 0,1 96,6 ± 0,3 97,1 ± 0,1 103,2 ± 0,2
Glicosilamina 0,12 ± 0,01 0,05 ± 0,01 0,03 ± 0,02 0,00 0,00 0,00
ARP 0,89 ± 0,02 0,30 ± 0,07 0,00 0,03 ± 0,01 0,00 0,00
N-formilbisoprolol 0,30 ± 0,01 0,19 ± 0,00 0,13 ± 0,00 0,15 ± 0,00 0,02 ± 0,00 0,00
6 meses
Bisoprolol restante 89,6 ± 1,5 79,2 ± 1,7 97,5 ± 0,1 102,2 ± 0,3 96,5 ± 0,6 100,1 ± 0,1
Glicosilamina 0,42 ± 0,03 0,17 ± 0,01 0,12 ± 0,00 0,16 ± 0,01 0,03 ± 0,00 0,00
ARP 2,72 ± 0,02 0,22 ± 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
N-formilbisoprolol 0,82 ± 0,00 0,29 ± 0,01 0,29 ± 0,01 0,27 ± 0,00 0,03 ± 0,00 0,00
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que são considerados como o grupo de produtos finais da reação de

Maillard. As melanoidinas são moléculas grandes e não podem ser
determinadas pela análise de HPLC. Martin et ai. (Hammouda e Salakawy,
1971) provaram que o escurecimento é uma função da concentração de
melanoidinas. O resíduo da pasta marrom-escura foi encontrado no lugar
dos comprimidos em um frasco de polietileno contendo glicose e bisoprolol
após armazenamento por 6 meses a 50°C; o escurecimento e a formação
das melanoidinas podem ser um processo rápido.
As amostras com celulose microcristalina ou amido de milho foram
relativamente estáveis, aproximadamente 100% de fumarato de bisoprolol Fig. 6.Proposição para o complexo de íon magnésio e glicosilamina formado nas
foi determinado nessas amostras ao final dos estudos de estabilidade em amostras com estearato de magnésio.

todas as condições. Como se suspeitava, ambos os polissacarídeos são

o efeito catalisador do estearato de magnésio e atribuiu-o a mudanças
inertes à reação de Maillard devido a um pequeno número de grupos
localizadas no pH de misturas sólidas.Monajjemzadeh et ai. (2009)eQiu
carbonila terminais.
et ai. (2005)também se referem aos estudos de Wirth, embora suas
O sorbitol é um álcool de açúcar que pode ser obtido pela redução
considerações tenham caráter bastante hipotético. Em nossa opinião,
do grupo carbonila da glicose no grupo hidroxila. O sorbitol deve ser
pode haver outra explicação para esse fenômeno. Íons de magnésio (2+
inerte à reação de Maillard, porém, a análise dos comprimidos
) formam anéis de cinco membros estáveis com a glicosilamina
armazenados a 50 C revelou a presença de pequenas quantidades de
imitando a O-protonação, como mostrado emFig. 6. Essas forças fracas
glicosilamina e N-formilbisoprolol. Bisoprolol N-formilado também foi
catalisam ainda mais o rearranjo na presença de grandes quantidades
encontrado nas amostras armazenadas por 6 meses nas condições
de água, o que explica por que a reação é favorecida em uma câmara
aceleradas. Como foi explicado anteriormente, o sorbitol disponível
de alta umidade, enquanto não ocorre bem em um forno de
comercialmente pode conter glicose não reagida, que sofre a reação de
laboratório. Nas condições aceleradas, o ácido esteárico teve um efeito
Maillard em comprimidos.
catalisador muito menor na reação de Maillard do que em uma câmara
Finalmente, o hidrogenofosfato de cálcio foi o melhor enchimento
de baixa umidade. Assumiu-se que a água atua como um aceptor de
para comprimidos contendo fumarato de bisoprolol. Este excipiente
prótons, isso diminui a O-protonação da glicosilamina e inibe o
não é substrato para a reação de Maillard, portanto, não foi observada
rearranjo.
a formação da glicosilamina, ARP e bisoprolol N-formilado. Não ocorreu
Finalmente, nas condições aceleradas, a reação ocorre muito mais
degradação significativa da substância ativa, 100% do ensaio
lentamente quando se utiliza estearil fumarato de sódio, talco e sílica.
determinado pela análise de HPLC confirmou que esta formulação é
Esses lubrificantes devem ser considerados pelos cientistas de
muito estável. O resumo dos resultados obtidos para excipientes de
formulação para evitar a reação de Maillard. A influência de vários
uso frequente armazenados por 6 meses nas condições aceleradas é
lubrificantes na taxa de formação de N-formilbisoprolol é apresentada
apresentado emtabela 1.
emFig. 7.
O tipo de lubrificante usado no processo de fabricação também é um fator
importante que afeta a taxa de reação de Maillard. Os lubrificantes mais utilizados
foram testados: estearato de magnésio, ácido esteárico, talco, estearil fumarato 3.4. Os estudos de estabilidade de produtos comercialmente disponíveis

de sódio e sílica coloidal. Misturas sólidas e comprimidos contendo 20% (p/p) de

fumarato de bisoprolol e 79% de lactose monohidratada com adição de 1% de um Os estudos de estabilidade de 6 meses nas condições aceleradas (40 C/75%RH)
lubrificante testado foram preparados e armazenados por 6 meses em estufa de foram realizados para confirmar que a reação de Maillard ocorre também em
laboratório (50 C/10%RH) e em as condições aceleradas e intermediárias. Uma produtos comercialmente disponíveis. Para tanto, dois medicamentos populares
amostra em branco sem adição de lubrificante foi preparada para fins de contendo fumarato de bisoprolol (2,5 mg) e lactose monohidratada foram
comparação; nesta amostra o lubrificante foi substituído pela quantidade escolhidos e colocados em uma câmara climática. Ambos os produtos contêm
equivalente de lactose monohidratada. Os lotes de laboratório foram retirados estearato de magnésio como lubrificante. Os comprimidos revestidos por película
das câmaras climáticas e analisados por HPLC após 0, 3, 6 meses de foram mantidos na embalagem original de comercialização (blister de alumínio/
armazenamento. O N-formilbisoprolol foi o principal produto de degradação PVC colocado em um
encontrado em todas as amostras testadas, enquanto a glicosilamina e o ARP
foram encontrados apenas em níveis muito baixos ou não foram detectados. A
reação foi monitorada medindo a concentração do produto final da reação. Os
resultados obtidos para as misturas sólidas e comprimidos foram muito
semelhantes, assim, no próximo texto nos referiremos apenas aos pós sólidos não
comprimidos para evitar a influência de uma compressão física. Na estufa de
laboratório de baixa umidade (50 C/10%RH) 0,24% de bisoprolol N-formilado foi
observado quando o ácido esteárico foi usado como lubrificante. A taxa de reação
foi 15 vezes mais rápida do que em uma amostra em branco, esta observação
pode ser atribuída ao microambiente ácido criado pelo lubrificante. A adição de
ácido esteárico catalisa o rearranjo de Amadori por O- ou N-protonação. Outros
lubrificantes testados não tiveram influência significativa na degradação da
substância ativa em ambiente de baixa umidade. No entanto, a análise de
misturas armazenadas em câmara de alta umidade (40 C/75% UR) revelou que
nestas condições o estearato de magnésio tem o efeito catalisador mais forte.
Cerca de 0,06% de bisoprolol N-formilado foi encontrado nesta amostra, enquanto
apenas 0,01% e 0,04% foram encontrados em uma amostra em branco e em
mistura com ácido esteárico, respectivamente. Wirth et ai. ( 04% foram
encontrados em uma amostra em branco e em mistura com ácido esteárico,
respectivamente. Wirth et ai. ( 04% foram encontrados em uma amostra em
branco e em mistura com ácido esteárico, respectivamente. Wirth et ai. (Ledl et al., Fig. 7.Aumento de N-formilbisoprolol nas amostras com vários lubrificantes durante 6 meses de
1986) observado armazenamento (50 C/10%RH).
10 M. Szalka et ai. / Revista Europeia de Ciências Farmacêuticas 59 (2014) 1–11
mesa 2
A quantidade de N-formilbisoprolol e o ensaio da substância ativa (± desvio padrão) determinado em produtos comercialmente disponíveis durante os estudos de estabilidade acelerados.
Tempo de armazenamento (mês) Teor de N-formilbisoprolol (%)
Marca A
0 0,04 ± 0,02
3 0,14 ± 0,01
6 0,20 ± 0,02
Fig. 8.Aumento da concentração de N-formilbisoprolol em produtos comercialmente
disponíveis após armazenamento por 6 meses nas condições aceleradas.
box) para simular condições reais de armazenamento. Em outro texto, os
medicamentos foram marcados como marca A e marca B. Da mesma forma
que nossos lotes de laboratório (com lactose), nenhuma glicosilamina ou 1-
desoxi-1-amino-2-cetose foi detectada em ambos os produtos comerciais.
No entanto, quantidades significativas de N-formilbisoprolol foram
observadas em todas as amostras após 3 e 6 meses dos estudos de
estabilidade. A marca A continha bisoprolol N-formilado mesmo no ponto 0,
o que significa que a reação de Maillard pode ocorrer em comprimidos
fornecidos por uma farmácia. Os estudos de LC/MS confirmaram o peso
molecular 354 [M+H]+(m/z)para N-formilbisoprolol em ambos os
medicamentos genéricos.mesa 2eFig. 8presente comparação dos resultados
de estabilidade obtidos para as marcas A e B. A comparação completa dos
produtos comerciais é difícil devido à falta de conhecimento sobre o
processo de fabricação, por exemplo, a duração de um processo de
revestimento por filme pode aumentar o teor de água, o que melhora a taxa
da reação de Maillard.
4. Conclusões
A incompatibilidade da formulação entre o fumarato de bisoprolol e
vários carboidratos redutores usados como enchimentos de
comprimidos foi apresentada neste artigo. A análise HPLC-UV/MS
confirmou a presença de uma glicosilamina, 1-desoxi-1-amino-2-cetose
e N-formilbisoprolol. Indica que a reação de Maillard seguida pelo
rearranjo de Amadori ocorre prontamente em preparações
farmacêuticas. Os estudos de triagem de sólidos foram realizados para
testar a influência da água na taxa de reação. Foram preparados lotes
de laboratório de fumarato de bisoprolol com vários diluentes, a
degradação mais rápida foi observada para a glicose, indicando que a
alta razão molar do excipiente para a substância ativa desempenha um
papel importante na degradação. A taxa de reação foi muito mais
rápida para monohidratos do que para cargas anidras.
Ensaio de fumarato de bisoprolol (%)
Marca B Marca A Marca B
0,00 99,6 ± 0,1 99,9 ± 0,1
0,17 ± 0,02 98,6 ± 0,2 99,2 ± 0,1
0,38 ± 0,03 98,0 ± 0,1 98,5 ± 0,1
ou impurezas totais foram observadas, o medicamento manteve sua
potência inicial. Foram testados cinco lubrificantes comuns usados na
indústria farmacêutica, dos quais o estearato de magnésio e o ácido
esteárico provaram aumentar a taxa de reação em comprimidos e
misturas sólidas. Ambos os lubrificantes devem ser evitados nas
preparações farmacêuticas que contêm aminas e carboidratos
redutores. O complexo de íons de magnésio e glicosilamina acelera o
rearranjo de Amadori.
Em todas as amostras com carboidratos redutores o N-formilbisoprolol foi
identificado como produto final da reação. As aminas N-formiladas são
geralmente estáveis, podem ser facilmente sintetizadas e usadas como padrões
de referência. O escurecimento intenso de misturas sólidas e comprimidos foi
atribuído à formação de melanoidinas. Há informações na literatura disponível de
que os produtos da reação de Maillard podem ser genotóxicos, cancerígenos ou
citotóxicos.Delgado-Andrade et al., 2010; Zabala-Diaz et al., 2010). No entanto,
estudos toxicológicos detalhados para impurezas relacionadas ao bisoprolol
devem ser realizados para confirmar a atividade biológica. O N-formilbisoprolol foi
encontrado em dois produtos comercialmente disponíveis, indicando que a reação
de Maillard ocorre mesmo em comprimidos armazenados na embalagem original
de comercialização. De acordo com as diretrizes da EMEA e da FDA, as impurezas
em níveis elevados devem ser identificadas e qualificadas para garantir a
segurança de uma preparação medicinal. A segurança dos medicamentos
também pode ser alterada pela perda significativa da potência. É aconselhável
evitar a combinação de fumarato de bisoprolol com carboidratos redutores em
formulações de comprimidos e cápsulas.
Reconhecimento
Agradecemos ao PhD Edward Rokaszewski pelas valiosas
informações e conselhos técnicos sobre os estudos da reação de
Maillard em preparações farmacêuticas.
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