Determinação de Lipídeos Séricos

Lipídeos são compostos orgânicos extraídos de tecidos biológicos com solventes de baixa polaridade
(solventes orgânicos, ex. metanol, éter, clorofórmio). Embora a dieta humana contenha uma gama de lipídeos
de origem animal e vegetal, os lipídeos de maior importância na dieta humana são:

Triacilgliceróis (TAG)
Ésteres de Glicerol
Fosfoglicerídeos
Colesterol ( C )
Esteróides Ésteres de Colesterol (CE)
Vitamina D
Cadeia Curta (2 - 3carbonos)
Ácidos Graxos Cadeia Média (4 – 12 carbonos)
Cadeia Longa (12 – 20 carbonos)
Esfingomielina
Esfingolipídeos
Glicoesfingolipídeos
Vitamina A
Terpenos Vitamina E
Vitamina K

Os triacilgliceróis constituem, quantitativamente, os principais lipídeos da dieta humana e,

consequentemente, a principal fonte de ácidos graxos. Os processos metabólicos da parede intestinal
direcionam a seleção de ácidos graxos e a biossíntese de TAG com ácidos graxos de cadeia longa. Os ácidos
graxos de cadeia curta e média são transferidos para o sangue e transportados através de ligação com a
albumina.
Embora todos os seres vivos apresentem algum tipo de esteróide na sua composição, o colesterol
é encontrado quase que exclusivamente nos animais. O colesterol é um álcool com 27 carbonos, os quais estão
dispostos na formação do núcleo do ciclopentanoperidrofenantreno. A dieta humana, normalmente, apresenta
colesterol na forma livre e esterificado a ácidos graxos. No processo de digestão ocorre a hidrólise dos ésteres
de colesterol disponibilizando o colesterol para absorção intestinal, o qual está limitado a aproximadamente
400mg de colesterol por dia.
Devido a baixa solubilidade dos lipídeos em sistemas aquosos, os TAG e colesterol são
encontrados no sangue associados a apoproteínas e outros lipídeos, constituindo estruturas denominadas de
lipoproteínas.

Níveis de Triacilgliceróis no Soro Sangüíneo

Os triacilgliceróis (TAG) estão presentes no soro sangüíneo como parte integrante das
lipoproteínas transportadoras de lipídeos no sangue, principalmente ligados às estruturas das VLDL
(lipoproteína de muita baixa densidade) e QM (Quilomícrons). Após as refeições, boa parte dos lipídeos da
dieta, sofrem digestão e os componentes lipídicos são utilizados pela parede intestinal na biossíntese de TAG.
Devido a sua baixa solubilidade em sistemas aquosos, os TAG produzidos na parede intestinal são utilizados
no retículo endoplasmático dos enterócitos para constituir QM através da associação com proteínas
específicas, fosfolipídeos e colesterol. Na seqüência, os QM são secretados no sistema linfático, atingindo o
sistema circulatório sangüíneo na veia subclavia, o que torna o plasma leitoso após as refeições. Por outro
lado, as VLDL são produzidas, principalmente, no fígado a partir de lipídeo endógeno e secretadas diretamente
no sangue dos capilares sinusóides. O gráfico abaixo ilustra a composição lipídica das principais lipoproteínas
séricas.

1
 100

Percentagem do Peso Total (%)

Triacilglicerol
Prote ína
Cole sterol
75
Coleste rol Este ríficado
Fosfolipíde o

50

25

0
QM VLDL IDL LDL HDL
Dentre os testes rotineiros para diagnóstico de doenças que afetam o metabolismo lipídico,
encontra-se a dosagem de TAG. Os valores de referência de TAG no soro dependem da idade e muitos
laboratórios estabelecem o limite superior da referência entre 130 a 200 mg/dL.
Vários métodos químicos e enzimáticos podem ser utilizados para determinação dos TAG no
soro. Os métodos químicos, os quais estão em desuso nos laboratórios de análises clínicas, envolvem extração
dos lipídeos com solventes orgânicos, hidrólise alcalina e quantificação de um dos componentes do TAG
(glicerol ou ácidos graxos).
Os métodos enzimáticos podem ser classificados como parcialmente enzimático, envolvendo
pelo menos uma etapa enzimática e reações químicas não enzimáticas que produzem cor ou totalmente
enzimático, onde todas as etapas envolvidas na determinação são catalisadas por enzimas. Os métodos
totalmente enzimáticos podem ser do tipo cinético, baseados em reações envolvendo reações de óxido-redução
+
com coenzimas (ex. NAD ), ou enzimático colorimétrico, onde a última etapa envolve a formação de compostos
coloridos.

Método Totalmente Enzimático

O TAG presente nas lipoproteínas séricas, basicamente QM e VLDL, é
hidrolisado a glicerol e ácidos graxos livres na presença da enzima lipase. O glicerol formado é convertido a
glicerol-fosfato pela enzima glicerol quinase. O glicerol-fosfato é convetido a dihidroxiacetona fosfato pela
glicerol-fosfato oxidase havendo liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2). O peróxido de hidrogênio reage
com 4-aminofenazona (4-AF) e e 3,5 dihidroclorobenzenosulfonato (3,5 HDCBS) na presença de peróxido de
hidrogênio oxidorredutase (POD), produzindo quinoneimina que absorve luz na faixa de 505 nm. A quantidade
de produto formado (quinoneimina) nesta reação é proporcional à quantidade de TAG no soro.
Dosagem de triglicerídeo

ATP
Glicerol quinase
4-AF + 3,5 HDCBS ADP
quinoneimina H2O2 O2
POD

O
=

λ= 505 nm Glicerol 3- O–P–O

-
fosfato oxidase -
O
Dihidroxiacetona 2
fosfato Glicerol 3-fosfato
Procedimento
As amostras de sangue devem ser colhidas com o paciente em jejum de 10 à 14h,
considerando o pronunciado efeito da dieta sobre os níveis séricos de TAG. A determinação do TAG pode ser
levada a efeito em soro ou plasma obtido com EDTA. Quando a dosagem for efetuada no plasma, os valores de
TAG devem ser corrigidos multiplicando-se pelo fator 1,03.

1) Colocar os reagentes nos tubos maiores como

indicados acima.
2) Homogeneizar e manter à 37oC em banho-maria
durante 15 minutos.
3) Zerar o espectrofotômetro com água destilada.
4) Passar o conteúdo dos tubos maiores para os tubos
menores
5) Ler e anotar a absorbância dos tubos: branco,
padrão e amostra.

Calcular a concentração de triglicerídeos sabendo-se que a concentração da solução-padrão de glicerol é 200

mg/ dL (= 200 mg/ 100 mL).

TG = (Amostra – Branco) x f onde

f= 200 / (Padrão – Branco)

Valores de Referência

2 a 19 anos ............................................................... abaixo de 100 mg/dL

A partir de de 20 anos .............................................. abaixo de 150 mg/dL

Níveis de Colesterol no Soro

A determinação do colesterol sérico pode ser levada a efeito utilizando-se métodos que
envolvem previamente a extração do colesterol ou métodos que envolvem a análise direta desse esteróide no
soro. Na prática laboratorial são utilizados normalmente os métodos diretos, os quais podem ser químicos ou
enzimáticos.
Os métodos químicos mais populares são aqueles baseados na reação de Liebermann-
Burchardt com ácidos fortes e a reação de Salkowski que envolve sais de ferro.
Os métodos enzimáticos estão baseados na utilização das enzimas colesterol esterase
(hidrolisa esteres de colesterol) e da colesterol oxidase, a qual oxida o colesterol formando água oxigenada.
Neste caso, a quantidade de água oxigenada formada é proporcional a quantidade de colesterol presente no
+
meio e pode ser quantificada através de reação colorimétrica ou da redução de nucleotídeos de piridina (NAD
+
ou NADP ).

3
 Método Enzimático-Colorimétrico para Determinação do Colesterol
O colesterol presente no plasma sangüíneo encontra-se distribuído na forma de
colesterol não esterificado (ou simplesmente colesterol) e colesterol esterificado (ligado a ácidos graxos). A
determinação do colesterol total envolve reação de hidrólise dos ésteres de colesterol, catalisada pela enzima
colesterol esterase, disponibilizando colesterol e ácidos graxos. O colesterol proveniente da hidrólise dos
esteres de colesterol, juntamente com o colesterol não esterificado, sob a ação da colesterol oxidase, sofre
oxidação originando colest-4-ene-3-ona e água oxigenada, a qual reage com a 4-aminofenazona na presença
de fenol, originando o pigmento o-quinoneimina, o qual absorve luz em 505nm.
A figura a seguir, reúne o conjunto de reações envolvidas na metodologia enzimática-
colorimétrica, baseada na reação de Trinder, para determinação do colesterol total em fluídos biológicos.

Colesterol oxidase
+ O2 Colest-4-ene-3-ona
HO +
Colesterol
H2O2
O
4-aminofenazona
R C OH
+
Ác. Graxo
Colesterol fenol
esterase Peroxidase

H2O

o-Quinoneimina
O (Produto colorido)
R C O

Acil Colesterol
Ester de Colesterol Ler em 505nm

Procedimento

Seqüência de Eventos Padrão Amostra Branco

Padrão 20µL ---- ----
Amostra ---- 20µL ----
Reativo de Trabalho 2,0mL 2,0mL 2,0mL

Após transferir os volumes indicados na tabela de procedimento, agitar os tubos e mante-los em

o
banho-maria a 37 C por 10 minutos. Decorrido o tempo, retirar os tubos do banho, zerar o espectrofotometro à
505nm com o tubo branco e proceder as leituras da amostra e padrão. Efetuar os cálculos de colesterol na
amostra, como preconizado nas atividades de espectrofotometria.

Valores de Referência
2 a 19 anos ................................................................ inferior a 150 mg/dL
A partir de 20 anos .................................................... inferior a 190 mg/dL