Conceitos HPLC 2010

CONSELHO REGIONAL DE
QUMICA - IV REGIO (SP)

Ministrante: Ayrton Argenton
CEP Curso
Contatos: ayrtonargenton@hotmail.com
So Jos do Rio Preto, 29 de maio de 2010
Conceitos fundamentais de
Cromatografia a lquido de
Alto Desempenho (HPLC)
Apoio
Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formato
PDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
M i ni cur so s C R Q -I V -2010
Conceit os f undament ais de HPLC
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
CONCEITOS DE CROMATOGRAFIA A LQUIDO
DE ALTO DESEMPENHO(HPLC)
AYRTON ARGENTON
Prof. Ayrton Argenton: Qumico formado pela USP. Pesquisador Snior pela
REPUSA Petrobrs, Chefe do Centro de Pesquisa da Oxiteno, Chefe de
Pesquisas e Laboratrio da CGS Instrumentao Ltda. Ministrou
treinamentos tcnicos para centenas de empresas brasileiras. Mais de 20
anos de experincia e especializao em treinamento de Cromatografia a
Lquido e a Gs em Inds. Qumicas, Farmacuticas, Alimentcias,
Destilarias e Usinas de Acar e lcool e Empresas relacionadas.
Atualmente aplica Treinamentos e Consultoria pelo CEP CURSOS Centro
de Educao Profissional www.cepcursos.com
Nas indstrias qumicas, farmacuticas,
alimentcias, refinarias, petroqumicas,
laboratrios de anlises clnicas,
ambiental e forense entre outras,
frequentemente necessrio separar,
isolar, purificar, identificar e quantificar
os componentes de misturas muitas
vezes bastante complexas.
SEPARAO
Operao pela qual uma mistura dividida em pelo menos duas fraes com
diferentes composies.
obtida por meios fsicos embora reaes qumicas podem ser envolvidas no
processo.
Os mtodos fsico-quimicos de separao so baseados na utilizao de alguma
propriedade fsica das substncias a serem separadas.
Exemplos:
TIPO DE SEPARAO PROPRIEDADE FSICA
Destilao fracionada Diferena de ponto de ebulio
Extrao com solvente
Diferena na constante de distribuio
(partio) dos componentes em dois
solventes
Cromatografia
Diferena de afinidade das substncias por
um material ativo ou adsorvente
IMPORTNCIA DA CROMATOGRAFIA
Velocidade
Poder de resoluo
Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10
-9
10
-15
g)
Simplicidade da tcnica
EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS
EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS
VISO GERAL DE CROMATOGRAFIA
O objetivo da cromatografia separar individualmente os diversos
constituintes de uma mistura de substncias seja para identificao,
quantificaoou obteno da substnciapura para os mais diversos fins.
Tal separao d-se atravs da migrao da amostra atravs de uma fase
estacionriapor intermdio de umfluido (fase mvel).
Aps a introduo da amostra no sistema cromatogrfico, os
componentes da amostra se distribuementre as duas fases e viajammais
lentamente que a fase mvel devido ao efeito retardante da fase
estacionria.
O equilbrio de distribuio determina a velocidade com a qual cada
componentemigra atravs do sistema.
COLUNA CROMATOGRFICA
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
I
N
A
L
DETECTOR
DETECTOR
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
I
N
A
L
DETECTOR
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
I
N
A
L
DETECTOR
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
I
N
A
L
DETECTOR
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
I
N
A
L
CLASSIFICAO DOS MTODOS CROMATOGRFICOS
CROMATOGRAFIA
PLANAR EMCOLUNA
LQUIDO
LQUIDO SLIDO FASE LIGADA
GS
FLUIDO
SUPERCRTICO
LQUIDO
LQUIDO SLIDO FASE LIGADA SLIDO FASE LIGADA LQUIDO SLIDO FASE LIGADA
FASE
MVEL
FASE
ESTACIONRIA
TCNICA
High Performance Liquid Chromatography
CLAD = Cromatografia a Lquido de Alto Desempenho
CLAE = Cromatografia a Lquido de Alta Eficincia
DESCRIO GERAL DE HPLC
A amostra dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatogrfica
preenchida com a fase estacionria (FE)
Um solvente (FM) bombeado com vazo constante e desloca os componentes
da mistura atravs da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo
com suas afinidades
As substncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. J as
substncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente.
Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal
eltrico o qual registrado, constituindo um cromatograma.
EXEMPLOS DE CROMATOGRAMA HPLC
Mistura de aminocidos
High Performance Liquid Chromatography
APLICAO
HPLC utilizada em anlises de compostos no volteis ou instveis termicamente onde a
cromatografia a gs no pode ser utilizada.
Como cerca de 80% dos compostos apresentamessas caractersticas, o campo de aplicao de HPLC
extremamente vasto.
Indstria Analitos
Alimentos
Acares, cido ascrbico, cido benzico,
parabenos, vitaminas, protenas, peptdeos,
aminocidos
Tintas Resinas, Tensoativos, biocidas
Qumica Polmeros
Clnicas Metablitos, protenas, peptdeos, aminocidos
Farmacutica Princpios ativos
ALGUNS EXEMPLOS DE APLICAES E ANALITOS
COMPARATIVO HPLC / CG
Fator CG HPLC
Requisitos da amostra
Amostra ou derivado voltil
estvel termicamente na
temperatura de trabalho
Amostra solvel na fase mvel
Tipo de Amostra
Gases, lquidos e slidos
baixo peso molecular
Lquidos e slidos
Inicos ou covalentes
Baixo e alto peso molecular
Tempo de anlise relativo Em geral mais rpidas que HPLC Em geral mais lentas que CG
Pratos tericos por coluna At 300000 At 30000
Capacidade preparativa Pobre Boa
Sensibilidade 10
-12
g (DIC / DCE)
10
-9
g (UV)
10
-15
g (coulomtrico)
RESERVATRIO
FASE MVEL
BOMBA
INJ ETOR COLUNA DETECTOR
AQUISIO
DE DADOS
INSTRUMENTAO EM HPLC
DIAGRAMA DE UM CROMATGRAFO A LQUIDO
O cromatgrafo a lquido constitudo dos seguintes componentes:
1. Reservatrio e sistema de bombeamento da fase mvel
2. Sistema de introduo de amostra
3. Sistema analtico: coluna cromatogrfica e termostato
4. Sistema de deteco (um ou mais detectores)
5. Sistema de registro e tratamento de dados.
DIAGRAMA DETALHADO DE UM HPLC
FOTO ILUSTRATIVA DE UM HPLC
RESERVATRIO DA FASE MVEL
A figura abaixo ilustra o reservatrio da fase mvel e seus componentes:
tampa de teflon
CONSIDERAO IMPORTANTE 1:
A fase mvel no pode conter partculas para evitar danos bomba, injetor e
coluna, logo necessrio filtrao antes de armazenar a fase mvel no
reservatrio.
Afigura abaixo ilustra umfiltro para HPLC:
A escolha do filtro funo da natureza da fase mvel. Usualmente utiliza-se
membranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5
m)
CONSIDERAO IMPORTANTE 2:
A fase mvel deve ser degaseificada para evitar a formao de bolhas no processo
de separao o que pode interferir no desempenhoda anlise.
As tcnicas de degaseificaoso:
Ultrasom
Refluxo comresistnciade aquecimento
Vcuo (trompa dgua)
Purga comHlio
Uso de membrana semipermevel e vcuo online.
CONSIDERAES IMPORTANTES
Vazo constante essencial para qualquer separao por HPLC. Alta presso necessria para
impulsionar o solvente atravs da coluna cromatogrfica vencendo a enorme resistncia imposta pela fase
estacionria.
Normalmente se utiliza bombas recprocas com um ou preferencialmente dois pistes o que minimiza
pulsao.
Preferencialmente devem operar com programao de vazo e deve ser possvel a interrupo do
processo empresses fora dos limites mximos e mnimos pr-estabelecidos.
importante introduzir fatores de correo de compressibilidade para a fase mvel utilizada ainda que os
lquidos tenhambaixa compressibilidade. Caso contrrio, a vazo real pode diferir da selecionada.
BOMBA
CARACTERSTICAS PRINCIPAIS
Leva a fase mvel desde o reservatrio at a coluna
Alta reprodutibilidade e exatido
Vazo contnua sem pulso de 0,01ml /min - 10ml /min
Vazo constante independentemente da presso
Alta resistncia corroso inrcia qumica a solventes comuns
Opera a altas presses (6000 psi)
BOMBEAMENTO ISOCRTICO OU POR GRADIENTE
BOMBEAMENTO ISOCRTICO
A composio da fase mvel mantida constante durante toda anlise cromatogrfica.
Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. A figura abaixo ilustra o equipamento
necessriopara uma anlise isocrtica.
BOMBEAMENTO POR GRADIENTE
Alguma anlises necessitam alterao da composio da fase mvel, sem alterao da
vazo total, coma finalidade de diminuir tempo de anlise e/ou melhorar a separao dos
componentes da amostra.
O bombeamentopor gradiente pode ocorrer baixa presso ou a alta presso.
No caso de baixa presso utiliza-se uma nica bomba e a seleo do solvente a ser
utilizado d-se atravs de vlvula de multiplas vias controladas pelo software do sistema.
J no caso do bombeamento de alta presso, cada solvente temuma bomba especfica.
A figura abaixo ilustra o equipamento necessrio para o a anlise por gradiente a baixa e
alta presso.
BOMBEAMENTO POR GRADIENTE BAIXA PRESSO
BOMBEAMENTO POR GRADIENTE ALTA PRESSO
BOMBEAMENTO ISOCRTICO OU POR GRADIENTE
A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por anlises isocrtica e por gradiente.
ISOCRTICA GRADIENTE
INJETOR
SISTEMA DE INTRODUO DE AMOSTRA
Em HPLC, a injeo de amostra realizada com auxlio de vlvulas especiais que
permitemintroduo comgrande preciso e exatido de volumes que variam, emgeral, de
5 a 20l. A figura abaixo, mostra umesquema de uma vlvula tpica nas posies de carga
e de injeo.
A amostra introduzida na vlvula comauxlio de uma microseringa comagulha semponta
e a injeo efetuada pela rotao da vlvula da posio de carga para a posio de
injeo.
COLUNAS CROMATOGRFICAS
COLUNAS ANALTICAS E PRE-COLUNAS
A separao efetuada nas colunas cromatogrficas, feitas em ao e resistentes a altas
presses(at 500 atm)
Os tubos das colunas so preenchidos coma fase estacionria conveniente, geralmente
slica ou seus derivados, comgranulometria de 3, 5, 7 ou 10 m(emalguns casos, at de
1m) de dimetro mdio.
Devido a queda de presso elevada nos tubos, as colunas so relativamente curtas e de
paredes espessas.
COMPRIMENTO: 3 60 cm
DIMETROINTERNO: 0,2 8 mm
As colunas normais apresentamdimetro interno variando de 4 6 mm e comprimento
que depende da granulometria da fase estacionriacomo mostra a tabela abaixo.
Granulometria (m) Comprimento (cm)
3 - 5 10 15
7 10 At 25 cm (em casos
especiais, at 60 cm)
COLUNAS ANALTICAS CONSIDERAES IMPORTANTES:
Como o tempo de reteno depende da temperatura, as colunas devem ser mantidas
termostatizadas em umforno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada para a
separao.
Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua eficincia, esto sendo introduzidas
colunas de dimetro interno de 1 3 mm, de forma que possa operar-se com fluxos
menores o que resulta em diminuio substancial do custo de operao e aumento de
sensibilidadecomoilustrado na figura abaixo.
PR-COLUNAS (GUARD COLUMNS)
SEMPRE USE PR-COLUNAS PARA PROTEGER E AUMENTAR A VIDA DA COLUNA
ANALTICA
CARACTERSTICAS PRINCIPAIS:
Protege a coluna analtica contra contaminaes qumicas
Mesmo material de empacotamento da coluna
Comprimento Tpico: 25 mm
Descartveis
O uso de pr-colunas de importncia vital para a vida til da coluna analtica. A filtrao da
fase mvel e da amostra nem sempre so suficientes para a eliminao de impurezas
prejudiciais coluna. Dependendo das caractersticas da fase estacionria e da natureza da
amostra, pode acontecer o que se chama de reteno irreversvel, ou seja, a afinidade do
contaminante pela coluna to grande que ele no elui, ficando retido nos primeiros
centmetros do empacotamento. Retido na cabea da coluna, o contaminate pode provocar
perda da eficincia, aumento de presso e cauda nos picos. Como uso da pr-coluna, o
contaminante no atingir a coluna analtica. Ao perceber os sintomas de contaminao (os
mais comuns so aumento de presso e elevao no nvel de rudo), o analista substitui a
pr-coluna, que emmdia custa 10 vezes menos que a coluna analtica.
DETECTORES
O detector um dispositivo conectado na sada da coluna que percebe a presena de componentes e emite um sinal
eltrico a ser registrado na forma de um pico cuja rea proporcional a quantidade do componente analisado.
Um detector ideal deve possuir as seguintes caractersticas:
Alta Sensibilidade
Estabilidade
Mudanas de temperatura e vazo de fase mvel no devem alterar o sinal
Reprodutibilidade
Resposta Linear
A resposta do detector deve variar linearmente com a concentrao do analito numa extensa faixa
de concentrao
Resposta rpida aos analitos
No contribuir para o alargamento do pico
O volume da cela do detector deve ser o menor possvel para evitar a perda de eficincia do sistema.
Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a sensibilidade.
Confiabilidade
Facilidade de manuseio
No destrutivo
Condio necessria para cromatografia preparativa
Seletividade
Habilidade relativa de um detector medir um composto e no outro.
DETECTORES
TIPOS DE DETECTORES
Os principais detectores utilizados em HPLC so:
ndice de refrao
Espectrofotometira UV-Visvel
Fluorescncia
Eletroqumico
Espectrometria de massa LC/MS
DETECTORES
NDICE DE REFRAO
No momento da passagemdo analito pelo detector, pode ocorrer uma alterao do ndice
de refrao. Essa alterao emrelao ao valor da fase mvel livre de analito detectada.
A deteco s possvel quando o ndice de refrao do analito diferente do IR da fase
mvel.
Esse detector normalmente utilizado quando os analitos no absorvem na regio de
comprimentode onda do UV-VIS.
Apresentaas seguintes desvantagens:
baixa sensibilidade
no permite a utilizao emanlises por gradiente (pois o IR varia coma composio da
fase mvel)
temperatura deve ser constante (pois o IR varia coma temperatura)
APLICAO
Anlises de carbohidratos e acares emgeral.
DETECTORES
ESPECTROFOTMETRO UV-Visvel (UV-VIS)
Baseia-sena absorbncia da luz pelo analito ao passar pelo detector.
umdetector seletivo pois s detecta os compostos que absorvemno comprimento de onda
emque o detector for ajustado.
o detector mais utilizado emHPLC pois grande maioria das substncias absorvemradiao
UV. Exemplos de substncias so: olefinas, aromticos, compostos contendo ligaes C=O,
C=S, N=O.
CONSIDERAES IMPORTANTES:
Afase mvel utilizada no pode absorver no comprimentode onda selecionado
A pureza da fase mvel extremamente importante (traos de impurezas podemabsorver
intensamenteno comprimentode onda utilizado): UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC
TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:
Fotomtricos comprimentode onda fixo: 254nme 280nm
Espectrofotomtricos comprimentode onda varivel: 00nma190nm
DETECTORES
Espectrofotomtricos
O comprimento de onda varivel entre 190nm e 800nm selecionado atravs do
monocromador (UV =lmpada de deutrio e VIS =lmpada de tungstnio).
Possui maior aplicao pois permite selecionar o comprimento de onda mais
adequado para os componentes a seremanalisados.
Maior sensibilidade: escolha do comprimentode onda de maior absorbncia.
Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de interesse
absorve e outros no.
Permite a utilizao de anlise por gradiente: escolha do comprimento de onda onde
os constituintes da fase mvel no apresentamvariao de absorbncia.
Permite obter o espectro de absorbncia de cada componente separado
interrompendo o fluxo da fase mvel e assim selecionar o melhor comprimento de
onda.
DETECTORES
Como mostra o esquema do
detector, o comprimento de onda
selecionado atravs do
monocromador do feixe de luz
emitido pela lmpada de deutrio
ou tungstnio e incide na cela por
onde passam os componentes da
amostra que absorve parte da luz
dependendo de sua absortividade
molar e concentrao. A quantidade
de luz no absorvida detectada
pela fotomultiplicadora.
40
DETECTORES
Espectrofotomtricos (REDE DE DIODOS DIODE ARRAY)
Nesse tipo de detector, toda luz passa pela cela. A luz emergente dispersada em uma grade
hologrfica e os comprimentos de onda resultantes so focalizados emuma rede de fotodiodos (256 a
1024). Assim, todo o espectro do componente pode ser armazenado. Como auxlio de umcomputador,
pode-se reproduzir um cromatograma para um determinado comprimento de onda ou produzir uma
srie de espectros emintervalos de tempo fixos.
DETECTORES
REDE DE DIODOS: VANTAGENS EM
RELAO AO DETECTOR UV-VIS
No detector UV-VIS, seleciona-se o
comprimento de onda que pode no ser o
mais adequado para todos os
componentes da amostra. Isso resulta na
perda de sensibilidade de alguns
componentes da amostra.
A figura ao lado ilustra a diferena de
intensidade do pico para um composto
emfunodo comprimentode onda.
Como DAD, pode-se selecionar o melhor
comprimento de onda para cada umdos
componentes, otimizando dessa forma a
sensibilidade. Isso extremamente
importante na determinao de
impurezas nas snteses e controle de
qualidade de princpios ativos de
produtos farmacuticos.
DETECTORES
ELETROQUMICOS
Baseia-se na possibilidade de muitos compostos seremoxidados ou reduzidos quando se
aplicaumpotencial eltrico.
Emumprocesso eletroqumico, umpar de eletrodos colocado na cela e umpotencial
suficientemente elevado aplicado provocando uma reao de oxidao ou reduo
gerando uma corrente que medida emumdetector eletroqumico. A corrente gerada
proporcional a concentraodo composto.
TIPOS DE DETECTORES
Amperomtrico
O elemento flui pela superfcie do eletrodo onde uma frao das espcies
eletroativas oxidada oureduzida (15-20%).
Coulomtrico
O elemento flui atravs de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente
100% das espcies eletroativas so oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade
muitomaior (10
-15
mol =fentomol).
DETECTORES
ELETROQUMICOS COULOMTRICO
A figura abaixo representa um esquema de uma cela coulomtrica:
DETECTORES
ELETROQUMICOS COULOMTRICO COULARRAY
possvel montar umconjuntos de detectores coulomtricos emsrie o que permite aplicar um
potencial crescente emcada cela de forma a oxidar ou reduzir seletivamente cada componente
emcada uma das celas. Assim, compostos que eluemjuntos podemser quantificados apesar de
no teremsidos separados.
possvel o arranjode 4a 16celas eletroquimicas obtendo-secromatogramas tridimensionais.
Tais detectores tem grande aplicao na anlise de produtos farmacuticos, bebidas e
alimentos, anlises ambientais e emneurocincia(neurotransmissores, drogas).
DETECTORES
ELETROQUMICOS COULOMTRICO COULARRAY
COMPARAO DE DETECTORES HPLC
ndice de Refrao
Espectrofotometria UV-
VIS Fluorescncia Eletroqumico
Princpio de operao
Mudana do IR da fase
mvel
Absorbncia de luz UV-
VIS
Excitao com luz produz
emisso fluorescente
Oxidao ou reduo em
um potencial fixo
Tipo Universal Seletivo Seletivo Seletivo
Quantidade mnima
detectvel
Micrograma Nanograma <picograma Fentograma
Faixa de linearidade 10
3
10
4
10
4
10
5
10
3
10
5
10
5
Volume da cela
(microlitro)
3-15 1-20 8-25 5-10
Sensibilidade a
temperatura
Alta Baixa Baixa Mdia
Aplicaes Geral
Compostos que
absorvem na regio UV-
VIS
Compostos ou derivados
que fluorescem
Espcies que oxidam ou
reduzem
ELSD EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR
Detector universal para compostos no volteis.
Baseado na habilidade das partculas causarem espalhamento(scattering) de
ftons, quando elas atravessam um feixe de luz policromtica.
O lquido efluente do HPLC primeiro nebulizado e a mistura aerosol
resultante contendo as partculas dos analitos dirigida a um feixe de luz. As
partculas causam espalhamento da luz. gerado um sinal, que proporcional
massa presente, e independe da presena ou ausncia de grupos
cromforos, fluorforos ou eletroativos.
Qualquer analito no voltil pode ser detectado.
Pode ser usado acoplado a um espectrmetro de massa, para fornecer uma
anlise completa da amostra.
Aplicaes para o elsd:
Lpidios, acidos graxos, carbohidratos, polmeros, esteroides, aminocidos,
aditivos de plsticos, produtos farmacuticos, etc.
ELSD EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR
CHARGED AEROSOL DETECTOR
CORONA
Este detector oferece os benefcios de desempenho que cada um dos detectores:
ndice de refrao, UV de baixo comprimento de onda, ELS de quimiluminescncia
de nitrognio num nico detector.
O eluente primeiro nebulizado com nitrognio, e as gotas so secas para remover
a fase mvel, produzindo as partculas dos analitos.
Uma corrente secundria de nitrognio passa por um sistema de alta voltagem e
carregado positivamente.
Esta carga transferida para as partculas do analto, que flue em sentido oposto.
A carga transferida para um coletor onde medida por um eletrmetro altamente
sensvel, gerando um sinal que diretamente proporcional quantidade de analito
presente.
O fator de resposta do analito independente da estrutura qumica.
Aplicaes do CAD:
Ideal para uma larga faixa de aplicaes de compostos no volteis e semi-volteis:
drogas, carbohidratos, lipdios, esterides, peptdios, protenas, polmeros.
Indstrias farmacuticas, alimentcias, qumicas, pesquisa life science,etc.
QUADRO COMPARATIVO DE DETECTORES
Sensibilidade Faixa Dinmica Consistncia de
Resposta
Aplicabilidade Reprodutibilidade Compatibilidade
Cromatogrfica
Facilidade
de Uso
Charged Aerosol

UV

Evaporative Light
Scattering

Chemiluminescence
Nitrogen

Refractive Index

AQUISIO DE DADOS
Atualmente utilizam-se softwares que permitem:
Processar os dados de cromatograma
Armazenar e registrar
Controlar a composio da fase mvel (isocrtica e por gradiente), vazo da bomba,
amostrador automtico, temperatura da coluna
Realizar clculos para System Suitability Test (SST)
SEPARAO CROMATOGRFICA
Em funo da fase estacionria utilizada tem-se os seguintes
mecanismos de separao:
Adsoro
Partio
Troca inica
Excluso
Bioafinidade
ADSORO
A fase estacionria um slido contendo grupos (stios ativos) que podem adsorver certas
substncias.
Na adsorotem-seo seguinteequilbrio:
Compostos comdiferentes constantes de adsoroso separados.
K
ads
=
[adsorvido na FE]
[desorvido na FM]
FM
FE
PARTIO
Afase estacionria umlquido depositado ouquimicamenteligado a umsuporte slido.
As molculas dos componentes a seremseparados se distribuementre a fase estacionria
ligada e a fase mvel lquida de acordo comsua afinidade relativa:
Compostos comdiferentes constantes de partio so separados.
K
part
=
[dissolvido na FE]
[dissolvido na FM]
PARTIO
FM
FE
A FM carrega as molculas nela dissolvidas. Para reestabelecer o equilbrio,
molculas na FE passam para a FM e so arrastadas. Tem-se um equilbrio
dinmico emcada segmento da coluna. Como a FMest emcontnuo movimento,
esta acaba retirando todas as molculas da coluna.
TROCA INICA
Afase estacionria uma resina catinicaou aninica.
O esquema abaixo ilustra o processo:
-
+
+
-
+
+
POR EXCLUSO
A separao efetuada de acordo com o tamanho das molculas.
A fase estacionria tem poros de tamanho controlado
Molculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros e apresentam um maior tempo de
reteno
Molculas grandes movem-se rapidamente atravs da coluna pois no entram nos poros
A tcnica utilizada na anlise de compostos de alta massa molecular
O mecanismo da excluso forma a base da cromatografia gel (permeao de gel e filtrao
de gel) utilizada na determinao de distribuio de peso molecular de polmeros e protenas
BIOAFINIDADE
Nessa tcnica somente componentes que possuem
bioafinidade com a fase estacionria so retidos.
PARMETROS CROMATOGRFICOS
Uma srie de parmetros cromatogrficos so importantes para serem utilizados na
identificao dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatogrfico e auxiliar na
otimizaodo processo de separao.
Os parmetros cromatogrficos a seremdiscutidos so:
TEMPO DE RETENO
FATOR DE RETENO
FATOR DE SEPARAO
NMERO DE PRATOS
RESOLUO
TEMPO DE RETENO
Por definio chamamos de TEMPO DE RETENO, tr, de uma substncia ao tempo
decorrido do instante emque a amostra foi introduzida at o instante do mximo do pico.
Na anlise cromatogrfica, mantido constantes a vazo da fase mvel e a temperatura da
coluna, o tempo de reteno constante.
A partir da figura acima, definimos os seguintes parmetros cromatogrficos de acordo com
as equaes abaixo:
Parmetro Cromatogrfico Definio
Fator de reteno k = tr / to
Fator de separao = tr2 / tr1
Nmero de pratos N = 16 ( tr / Wb )
2
Resoluo Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 +Wb2)
NMERO DE PRATOS
N = 16 ( tr / Wb)
2
Nmero indicativo da performance da coluna. a medida da largura do pico em relao ao seu tempo
de reteno. o parmetro que mais precisamente define a qualidade de um sistema cromatogrfico.
Outra medida da eficincia da coluna dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um
prato terico.
onde L =comprimento da coluna
N =nmero de pratos
H =
L
N
RESOLUO
Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 +Wb2)
Fornece uma medida
quantitativa da
habilidade da coluna
em separar duas
substncias.
EFICINCIA DA COLUNA
A introduo da amostra na coluna leva menos de 1 segundo. Como o equilbrio
entre FE e FM muito rpido, a largura dos picos tambm deveria ser
aproximadamente 1 segundo. Entretanto, isso no ocorre devido a processos de
transporte de massa que altera a velocidade das molculas de ummesmo composto
dentro da coluna. Estatisticamente algumas molculas viajam mais rapidamente e
outras mais lentamente que a mdia das molculas, atingindo o detector emtempos
diferentes. Consequentemente, o pico registrado alargado.
Alm dos processos de transporte de massa, causas externas coluna, tambm
contribuempara o alargamento dos picos.
Quanto maior o valor de N maior a eficinciada coluna.
A altura equivalente a umprato terico outra maneira de considerar a eficincia da
coluna. Quanto menor H, maior a eficinciada coluna.
H o resultado da somatria das contribuies de cada um dos processos de
alargamentointra-coluna(Hi) e extra-coluna(He).
EFICINCIA DA COLUNA
Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos:
1-Difuso catica(Eddy diffusion) caminhos preferenciais diferentes H=Ce.dp, onde Ce
uma constante do processo e dp o dimetro da particula.
2- Transferncia de massa na fase mvel ao passar no interstcio das partculas, as
molculas que viajam perto das paredes da FE tero velocidades menores das que
viajam no centro H=Cm.dp2.u/Dm, onde u a velocidade da fase mvel, Dm o
coeficiente de difuso da substncia na fase mvel.
3- Contribuio da FM estagnada.Dentro dos poros das partculas, algumas molculas
so mais retidas do que outras. H =Csm.dp2.u/Dm
4- Influncia de transferncia de massa com a FE aps a difuso das molculas dentro
dos poros, elas penetram na FE. As que penetram mais profundamente dentro da
FE, tambm demoraro mais para sair e se atrasaro em relao a outras,
consequentemente, o pico se alargar. H =s.u.df2/Ds, onde df a espessura do
filme e Ds o coeficiente de difuso da substncia da fase estacionria.
EFICINCIA DA COLUNA
Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos (cont.):
5- Difuso longitudinal na fase mvel H =Cd.Dm/u
A somatria desses fatores contribuem para aumentar o valor de H e portanto
diminuio da eficincia da coluna.
De modo geral as seguintes variveis contribuem para o alargamento do pico:
Substncia i, FM, FE, u, Dm. Ds, 1/u, dp, dp2, df2, dimetro do poro, rea superficial,
Tcoluna).
A velocidade da fase mvel tem efeito prejudicial para alguns fatores e benficos para
outros. Portanto, a avaliao de H em funo da velocidade da FM passa por um
mnimo.
Entre as causas externas, podemos citar: comprimento e dimetro interno dos tubos
que ligam a vlvula de introduo da amostra coluna, volume das conexes
envolvidas, volume da cela do detector, etc.
EFICINCIA DA COLUNA
EFICINCIA DA COLUNA
OTIMIZANDO EFICINCIA DA COLUNA
Os seguintes fatores devemser considerados na otimizaoda eficinciada coluna:
Tamanhode partcula
Viscosidadeda fase mvel
Temperatura
Empacotamento
A equao de Van Deemter mostra que quanto menor a partcula, menor H e menor a
influnciada vazo na eficinciada coluna:
3
5
10
Vazo
H
FASES ESTACIONRIAS
As FE so constitudas de material slido, granulado, finamente dividido e densamente
empacotado dentro de umtubo feito de material inerte, normalmente ao. O material slido
pode estar revestido ou ligado quimicamentea umlquido.
TIPOS DE FASES ESTACIONRIA
FE SLIDA
FE POR EXCLUSO
FE POR TROCA INICA
FE POR BIOAFINIDADE
FE QUIMICAMENTE LIGADA
NORMAL
REVERSA
FASE ESTACIONRIA SLIDA
Separao realizada por mecanismo de adsoro
Utiliza partculas porosas em geral de 5 micra ou 10 micra
Indicada para compostos com peso molecular menor que 2000 Daltons
Solventes mais utilizados so de mdia e baixa polaridade
Adsorventes mais utilizados: alumina e principalmente slica
SLICA
A slica possui grupos siloxano, Si-O-Si e grupos silanol, Si-
OH vicinal e germinal. Os grupos silanol so os mais
importantes devido a sua polaridade. Quanto mais polar o
composto, maior a reteno.
A ordem de eluio em slica : hidrocarbonetos saturados <
olefinas < aromticos < teres< steres < aldedos cetonas
<lcoois <aminas <amidas <cidos carboxlicos.
Dependendo do procedimento de produo da slica, suas
caractersticas, como volume de poro, dimetro de poro, rea
superficial, nmero de grupos silanol, variam resultando em
reteno varivel.
FASE ESTACIONRIA POR EXCLUSO
A separao baseia-se no tamanho das molculas dos componentes da amostra emrelao
ao dimetro dos poros da fase estacionria.
As fases estacionrias podem ser slica ou polmeros de poliestireno-divinilbenzeno,
poliacrilamidas e outros, comdistribuiode dimetro dos poros controlada.
Molculas pequenas entram nos poros pequenos enquanto as molculas grandes no
conseguementrar nos poros. Desta forma elas so permeadas seletivamente.
Atcnica denominada cromatografiade excluso por tamanho.
FASES ESTACIONRIAS
Afigura abaixo ilustra o processo de separao:
FASES ESTACIONRIAS
APLICAES:
PERMEAO EM GEL
(FM orgnica)
FILTRAO EM GEL
(FM aquosa)
Resinas alqudicas Peptdeos
Epxidos Proteinas
Poliestirenos Enzimas
Borracha natural cidos Nucleicos
Silicones Lipdios
Colunas de permeao de gel fabricadas comsais de clcio ou chumbo de resinas sulfnicas
comdimetro de poro controlado, so usadas nas anlises de dextrana, oligossacardeos e
acares.
FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA POR TROCA INICA
A separao baseia-se na interao eletrosttica dos componentes da amostras com
grupos inicos da FE.
A FE normalmente uma resina de poliestireno-divinilbenzeno a qual esto ligados
grupos inicos, ou a FE slica recoberta com uma fina camada de poliestireno-
divinilbenzeno onde grupos inicos esto ligados.
Os grupos quimicamenteligados presentes emtodo tipo de material de troca inica so:
SO
3
-
: trocadores fortes de ctions
CO
2
-
: trocadores fracos de ctions
NR
3
+
: trocadores fortes de nions
NH
2
R
+
: trocadores fracos de nions
FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA POR TROCA INICA
FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA QUIMICAMENTE LIGADA
So as fases mais importantes da cromatografia lquida Obtidas pela reao dos
grupos silanois da slica comcompostos contendo grupos polares(Fase Normal)
ounao polares(FaseReversa).
Na Fase Quimicamente Ligada, a slica gel, atravs dos grupamentos Si - OH, se
liga quimicamente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidade
qumica.
A Cromatografia de Fase Ligada subdividida emFase Normal e Fase Reversa
de acordo coma polaridade dos grupos funcionais ligados slica gel.
As notveis propriedades deste tipo de material fazemda Cromatografia de Fase
Ligada a mais utilizada emtodo o mundo.
FASES ESTACIONRIAS
-Si-O-Si- (R)
-Si-O-Si- (R)
-Si-O-Si- (R)
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-OH
-Si-OH
Grupos silanis so responsveis por retenes no especficas que
provocam alargamento dos picos.
FASES ESTACIONRIAS
Para a produo das Fases Quimicamente Ligadas, a slica gel submetida a um
processo de hidrlise formando grupos silanis SiOH, grupo quimicamente ativo
no qual se ligar o grupo funcional atravs de reaes de silanizao, utilizando
organosilanos(ex. dimetilcloroocatadecilsilano), mono, di ou trifuncionais,
dependendo do numero de grupos no silano que pode reagir. Obtem-se fase
monomricaou polimrica.
Infelizmente, devido a efeitos estricos, muitos grupos SiOH no reagem
permanecendoativos e provocando encaudamentodos picos.
Ligao qumica tradicional usando silano monofuncional alcana ummximo de
50%ou uma densidadede ligante de ~4mol/m2.
Para atenuar este problema, emprega-se um processo conhecido como
Endcapping.
FASES ESTACIONARIAS
ENDCAPPING
Para minimizar o efeito dos grupos silanol residuais necessrio umpasso
secundriode ligao para cobrir esses grupos ainda presentes na slica.
O processo denominado endcapping efetua-se em geral com
trimetilclorosilano(TMS). Ainda assimrestamgrupos silanol livres
As slicas usuais s podem ser utilizadas na faixa de pH 2 8, pois os
grupos TMS sofremhidrolise a pH menor que 2 e a slica se dissolve em
fase mvel contendo gua empH maior que 8.
Muitos desses problemas: cauda nos picos de analitos bsicos, limitao
de pH, baixo tempo de vida da coluna, temsido resolvidos ou minimizados
atravs de desenvolvimentos mais recentes, tais como: slica de alta
pureza, partculas hibridas, slica tipo C(slica hidreto) e novas quimicas
ligantes.
ENDCAPPING
FASES ESTACIONRIAS - NOVOS DESENVOLVIMENTOS
SLICA DE ALTA PUREZA(slica tipo B) maior que 99.995%, com menos de 50ppm de
metais, (metais causamcaudas pois tornamos silanols extremamentecidos).
PARTCULAS HBRIDAS desenvolvido pela Waters, essas partculas so um hbrido
orgnico/inorgnico.Contmambos slica e organosiloxane. produzida pela misturade
dois monomeros de alta pureza: (RO)4Si +(RO)3SiR. O produto da reao contm
unidades de SiO2 e unidades RSiO1.5 combinados a nvel molecular. O teor de carbono
cercade 7%, antes de modificaes da superfcie. Colunas Xterra so produzidas com
essas partculas.
Permitemuso na faixa de pH 1 a 12, semperda de eficincia oucapacidade e devido ao
teor reduzido de grupos silanol, fornecemexcepcional forma de picos para analitos
bsicos.
slica TIPO C slica HIDRETO desenvolvida pela Microsolv. Produzida a partir de slica
ultra pura(baixo teor de metais), atravs de uma tecnologia prpria, a slica tipo B
convertidaemslica tipo C, hidreto de silicio, livre de carbono, contmmenos de 3% de
grupos SiOH. Por isso no forma ligaes fortes com gua o que permiteutiliza-la como
fase Normal com solventes Hexano/Acetato de etila e at Agua/Acetonitrila com excelente
preciso.
FASES ESTACIONARIAS NOVOS DESENVOLVIMENTOS
SLICA MONOLTICA MONOLITHIC slica
GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS Grupos di-isopropil e di-isobutil
incorporados aos reagentes ligantes para proteger as ligaes Si-O contra hidrlise
cida.
QUMICA SILANO POLIFUNCIONAL O uso de silanos di-funcional ou tri-funcional
para criar grupos ligados com dois ou tres pontos conduzindo a fases com maior
estabilidade em baixo e alto pH e menor sangramento para LC/MS. Porm os silanos
polifuncionais so de controle mais difcil.
GRUPOS POLARES EMBEBIDOS A incorporao de um grupo polar( ex.
Carbamato, amida, urea, eter, sulfonamida) na cadeia hidroflica de reagentes
ligantes tem conduzido a uma nova classe de fases populares com diferente
seletividade e melhor forma de pico para analitos bsicos devido a blindagem dos
silanois pelo grupo polar embebido. Essas colunas so geralmente menos retentivas
do que as C18 e C8 comuns, para analitos neutros e bsicos. Esto se tornando
muito populares para o desenvolvimento de mtodos de difceis separaes.
SLICA DE ALTA PUREZA
PARTICULAS HIBRIDAS
SLICA MONOLITICA MONOLITHIC SLICA
SLICA FUSED CORE PARTICLE
Tecnologia de partcula fused core, desenvolvida para cromatografia hiper rpida.
Uma camada de slica porosa fundida na superfcie de slica slida.
A particula tem diametro total de 2.7m e a camada porosa 0.5m, rea superficial
de 150m2/g, diametro de poro: 90a e pode ser usada na faixa de pH: 2 9.
As ligaes da fase estacionria so monomricas e endcapped maximinizado.
Como o passo de difuso de apenas 0.5m, reduz a disperso axial e minimiza o
alargamento de pico.
Possui eficincia de particulas sub-2m sem a queda de presso que estas
particulas apresentam e portanto no necessita de equipamento uhplc.
www.sigmaaldrich.com/supelco/the_reporter/207002-ascentis-express.Pdf
www.mac-mod.com/pb/halo -pb.Hmtl
Site da sigmaaldrich supelco the report volume 25.2
Colunas ascentis express particle e colunas halo
GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS
ADSORVENTES DE
HPLC E
CARACTERSTICAS
FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA NORMAL
Grupos Funcionais Polares so ligados matriz de slica. A tcnica, em
geral, substitui comvantagens a Cromatografia por Adsoro.
GRUPOS FUNCIONAIS MAIS COMUNS:
DIOL
CIANO
AMINO
FASE ESTACIONRIA REVERSA
Em Cromatografia de Fase Reversa, os grupos funcionais ligados base de slica so apolares. Os
analitos so atraidos para a superficie pelos seus grupos funcionais no polares. O analito mais polar elui
primeiro, seguidos pelos outros emordemdecrescente de polaridade. Os grupos butil, octil, octadecil e
fenila so os mais utilizados. O grupo octadecil responsvel pela maioria das separaes em
fase reversa.
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
O
O
O
O
O
O
C
18
C
18
C
18
C
18
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
O
O
O
O
O
O
C
8
C
8
C
8
C
8
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
O
O
O
O
O
O
CH
2
-
CH
2
-
CH
2
-
CH
2
-
OCTADECIL OCTIL FENIL
FASE MVEL
ESCOLHADO SOLVENTE EMHPLC
O sucesso da separao cromatogrfica s possvel se for aplicada uma FM
correta a uma FE conveniente.
Aescolha da composioda FMleva emconta vrios fatores, tais como:
Propriedades fsico-qumicas que afetama solubilidade, partio e adsoro e,
portanto, a separao
Propriedades fsicas que afetama possibilidadede deteco dos componentes
Propriedades fsicas que dificultamo manuseio das bombas, detectores ecoluna
Propriedades que afetama segurana (toxidez e inflamabilidade)
Custo
FASE MVEL
SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS
Os seguintes parmetros devemser considerados para uma escolha adequada da
FM:
Viscosidade
Compressibilidade
Presso de vapor
Toxidez
ndice de Refrao
Corte de UV (cut off) espectro de absoro UV-VIS
Miscibilidade de solventes e outras caractersticas importantes
Fora dos Solventes
94
FASE MVEL
VISCOSIDADE
A viscosidade do solvente ou misturas de solventes temimportncia fundamental
durante o bombeamento isocrtico ou por gradiente. A figura abaixo apresenta a
viscosidadede alguns solventes.
FASE MVEL
VISCOSIDADE
P da coluna depende da vazo, temperatura, viscosidade da FM e empacotamento da
coluna.
Viscosidadeelevada acarreta emdificuldades no bombeamentoe elevamo P.
Exemplo da influncia da viscosidade emcoluna fase reversa C
8
- 5 m 25cm
4.6mm:
Solvente Viscosidade (cP) Vazo (ml/min) P (atm)
Metanol 1.1 1.00 102
Isopropanol 2.2 1.00 460
FASE MVEL
VISCOSIDADE
gua, metanol, hidrocarbonetos e outros
compostos comviscosidade menor que 1cP
so timos solventes no parmetro
viscosidade.
A viscosidade influncia na eficincia pois
afeta o coeficiente de difuso acarretando
em perda de nmero de pratos tericos da
coluna.
A viscosidade de misturas de solventes no
varia linearmente coma composio.
FASE MVEL
CORTE UV (CUT OFF)
O UV cut off o comprimento de onda abaixo do qual o solvente absorve mais que uma
unidade de absorbncia emuma cela de 1cmde caminhoptico.
uma referncia para a seleo do solvente da FMquando se usa detector UV.
importante determinar o espectro de absoro do solvente antes de us-lo como FM, pois
eventuais impurezas podemalterar muito o valor do cut off.
MISCIBILIDADE DE SOLVENTES E OUTRAS CARACTERSTICAS
Almdas propriedades discutidas, outros cuidados especiais devemser tomados na escolha
dos solventes:
Os componentes devem se dissolver na FM para que sejam transportados
atravs da coluna
Imiscibilidadecoma FE
Inrcia qumica coma FE e os componentes da amostra
Pureza condizente como detector utilizado.
Mistura de solventes devemproduzir solues homogneas fator importante
nas anlises por gradiente (o mesmo cuidado deve ser tomado na troca de
solventes; em caso de troca de dois solventes imiscveis, deve-se usar um
solvente intermediriosolvel emambos).
Sistemas no miscveis prejudicam o desempenho da bomba, da coluna e
induzem rudos no detector alm de alterar os tempos de reteno e prejudicar
anlises quantitativas.
FORA DOS SOLVENTES
A interao das molculas dos compostos analisados (analitos) com o solvente (FM) e
consequentemente suas solubilidades depende basicamente das seguintes foras de
interao:
Disperso
Interao dieltrica
Dipolos
Pontes de hidrognio
Miscibilidade
em gua
UV cut off IR 20C
Fora do
Solvente
Viscosidade
a 20C, cP
Hexano no 200 1.3750 0.00 0.33
Isooctano no 200 1.3910 0.01 0.50
Tetracloreto de carbono no 263 1.4595 0.14 0.97
Clorofrmio no 245 1.4460 0.31 0.57
Cloreto de metileno no 235 1.4240 0.32 0.44
Tetrahidrofurano sim 215 1.4070 0.35 0.55
ter dietlico no 215 1.3530 0.29 0.23
Acetona sim 330 1.3590 0.43 0.32
Acetato de etila pobre 260 1.3720 0.45 0.45
Dioxano sim 215 1.4220 0.49 1.54
Acetonitrila sim 190 1.3440 0.50 0.37
2-Propanol sim 210 1.3770 0.63 2.30
Metanol sim 205 1.3290 0.73 0.60
gua sim - 1.3328 >0.73 1.00
FASE MVEL
RELAO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Ao variar a polaridade da
fase mvel, varia o fator
capacidade(k=tr/to) e
consequentemente a
seletividade na separao.
Variao de tr e resoluo
com a composio do
solvente em anlise de
metil, etil, propil e butil
parabenos. coluna ODS
(10cm x 0.6 cm), UV
254nm, 40C, gua/metanol
RELAO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Variao do fator capacidade com a composio da fase mvel
FASE MVEL
SELEO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MTODOANALTICO
Abaixo descreve-se umprocedimento tpico para seleo de FM emseparaes isocrticas
comfase reversa:
Escolher a coluna conveniente (C
8
C
18
)
Fixar a temperatura da coluna (40C)
Para compostos cidos ou bsicos ajustar a FM gua comcido fosfrico 0.05M ajustando
o pH a 3.5 comhidrxido de sdio
Equilibrar a coluna comsolvente orgnico puro (acetonitrila ou metanol, vazo =1.5ml/min)
Injetar 10-20 l da amostra
Se os componentes elurem perto de to, repetir as anlises alterando a concentrao de
gua crescentementeat o obter separao satisfatria.
Afigura abaixo ilustra esse teste utilizando acetonitrila:
SELEO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MTODOANALTICO
Constata-sea fora do solvente na separao.
FASE ESTACIONRIA REVERSA
ORIENTAO PARA OTIMIZAO DA SEPARAO
Fase mvel
100% Orgnica
Adicione gua
(incrementos de
20%) at k
=5
Ajuste a >1.2
Diminua vazo
Aumente a coluna
Diminua as partculas
Tente outra Fase
estacionria
picos muito rpidos
injete amostra
picos muito prximos
ainda no separa
Utilizar Fase Normal
picos muito lentos
Adicione pequenas quantidades
de modificadores orgnicos
fortes
Ajuste pH para os compostos
parcialmente inicos; fora
inica
Ajuste Temperatura
Altere o modificador
fator reteno : k = tR / tM
fator separao: = k2 / k1 = tR2 / tR1
REAES PS-COLUNAS
Para a deteco de alguns componentes, principalmente a baixas concentraes, preciso
transform-los em derivados que apresentem maior sensibilidade para um determinado
detector.
Isso necessrio quando o componente:
No bomcromforo
No bomfluorforo
No eletroquimicamenteativo
Nestes casos efetua-se reaes especficas, formando derivados que possam apresentar
algumas das seguintes propriedades:
Alta constante de equilbrio de formao
Rpida velocidade de formao
EspectroUV-VIS de alta sensibilidade
Fluorescncia
Eletroquimicamenteativos
REAES PS-COLUNAS
EXEMPLO: HERBICIDA GLIFOSATO
Caracterstica original: ummaucromforo e um maufluorforo
Reao ps coluna: reao com hipoclorito e o-ftalaldedo (OPA) e mercaptoetanol
(MERC)
Glifosato Glicina Isoindol
Deteco: fluorimetricamente do isoindol (excitao a 230-240 nm, emisso a 420-450nm)
OCl
-
OCl
-
MERC
bomba
injetor
50C
coluna
bomba
OCl
-
bomba
OPA / MERC
reactor reactor
fluormetro
registrador
108
REAES PS-COLUNAS
EXEMPLO: BARBITRICOS
caractersticaoriginal: baixa absorbncia no UV
reao ps coluna: elevao de pH a um sistema alcalino (em sistemas alcalinos, a
absorbncia mxima de barbitricos se desloca para comprimentos de onda mais altos,
porm, nessa condio, a FM dissolve a slica da FE, assim, o problema resolvido
elevando-se pH somenteaps a coluna.)
deteco: UV a 240 nm
PICOS COM CAUDA EM HPLC COM FASE REVERSA
Picos com cauda em fase reversa continua sendo um problema em cromatografia.
Particularmente na separao de compostos bsicos e portanto um problema constante na
anlise de produtos farmacuticos.
Picos com cauda causam inmeros problemas, incluindo baixa resoluo, sensibilidade
reduzida , preciso e quantificao inadequada.
A figura 1 ilustra como a resoluo e sensibilidade da amostra afetada por picos com
cauda.
A figura 2 ilustra como a exatido e preciso de uma anlise pode sofrer devido a inabilidade
dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.
CAUSAS DE CAUDA NO PICO AO CORRETIVA
SOLVENTE DA AMOSTRA MAIS FORTE QUE A FASE
MVEL
DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MVEL OU
REDUZA A FORA DO SOLVENTE
EXCESSO DE MASSA DE AMOSTRA
REDUZA A MASSA DE AMOSTRA INJ ETADA
TABELA 2 INDICA A QUANTIDADE RECOMENDADA
DE AMOSTRA A SER INJ ETADA PARA DIFERENTES
COLUNAS.
INTERAO DE SILANOL COM AMINAS
REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3
AUMENTE A FORA INICA DA FASE MVEL,
25mM A 50mM RECOMENDADO ADICIONE UMA
AMINA COMPETITIVA NA FASE MVEL 10mM DE
TEA SUFICIENTE.
SELECIONE FASE ESTACIONRIA COM MENOR
ATIVIDADE DE SILANOL.- FIG.6
ADSORO DE CIDOS NA slica
AUMENTE A CONC. DE SAL NA FASE MVEL.
25mM A 50mM E USUALMENTE SUFICIENTE.
REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3.
ADICIONE UM CIDO ORGNICO COMPETITIVO.
1% DE ACIDO ACTICO OU 0.1% DE TFA
USUALMENTE SUFICIENTE.
VAZIOS NA COLUNA
SUBSTITUA A COLUNA.
TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS
RARAMENTE VALE A PENA.
ANLISE DE COMPOSTOS BSICOS
Problemas com a forma do pico de compostos bsicos so normalmente comuns.
Mas h vrios passos simples que podem melhorar significativamente a forma do
pico de bases:
1- Selecione uma coluna base-slica desativada.
2- Usar fase mvel com baixo ph.
3 Aumento da concentrao de sais na fase mvel.
4 Selecione uma coluna heavily endcapped.
5 Adicione uma base competitiva.
ANLISE DE COMPOSTOS CIDOS
1 Adicione um cido orgnico competitivo.
Adicionou-se 1% de cido actico fase mvel para minimizar as interaes
soluto-silanol, pela ao de um cido competidor.
Os resultados foram notveis, com o pico de ibuprofen eluindo perfeitamente
gaussiano fator cauda 1.0.
2- Substituindo o cido actico por 0.1% de cido trifluoractico tfa.
A concentrao relativamente alta de cido actico resulta em rudo da linha de
base. Usando tfa 0.1% como modificador aquoso resulta numa fase mvel mais
transparente, menos rudo, e o pico de ibuprofen ainda elui com uma banda
simtrica, fator cauda 1.09.
Em pH 3, a fase mvel est tamponada, porm a capacidade tamponante
baixa. aumento da concentrao para 10 20mm melhorar a reprodutibilidade
cromatogrfica por mais tempo, alm de melhorar ainda mais a forma do pico.
HPLC FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
Tempo de reteno no reprodutvel
um problema comum quando se usa fase
mvel altamente aquosa.
Na separao de compostos muito
polares, solveis em gua no
incomum usar fm com menos de 10% de
modificador orgnico(metanol ,
acetonitrila, etc.) Para conseguir
reteno suficiente.
Entretanto, nestas condies a
reprodutibilidade ruim.
Com o tempo, os picos eluiro com
tempo de reteno cada vez menores e a
resoluo piora.
A figura mostra cromatogramas de
anlise de vitaminas em coluna ymc ods-
fm:5meoh 95% 0.1M KH2PO4
f:1ml/min
Vitamina C vitamina B1 vitamina B6 -
nicotinamida
COLAPSO DE FASE ESTACIONRIA
A mudana do tempo de reteno causada pelo fenmeno denominado colapso de fase
de fases alqulicas hidrofbicas c18 ou c8 em condies de fase mvel altamente aquosas.
A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilica interagir com
solutos diminui e o tempo de reteno decresce.
H tambm evidncia que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosa dos poros da
FE, reduzindo a rea superficial acessvel para os solutos e portanto reduzindo os tempos
de reteno.
Em condies normais a fase alqulica est extendida na FM e solvente e molculas da
amostra tem total acesso a fe.
Quando se usa Fm altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo de reteno
afetado.
COLAPSO DE FASE ESTACIONRIA
A figura mostra cromatogramas em coluna c8 base
desativada;
Aps deixar por 10 min. em FM 100% aquosa o tempo
de reteno de amoxicilina diminuiu de 5 min.
Indicando colapso da fase;
Purgando a coluna com solvente orgnico a fase
alquilica novamente extendida e o tempo de
reteno restaurado.
HPLC REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
COLUNAS QUE NO EXIBEM PROBLEMAS COM COLAPSO DE FASE
Alguns fabricantes resolveram o problema
usando silanos polares com fase ligada ou
usando endcapping hidrofilico.
Ambos tem o mesmo efeito de manter a fase
alquilica(C18 ou C8) extendida, mesmo MBOS
quando se usa fase mvel 100% aquosa.
Colunas: AquaSep, HydroBond AQ,
HydroBond PS, ProntoSIl AQ, Zorbax SB AQ
CROMATOGRAFIA POR INTERAO INICA
ION PAIR CHROMATOGRAPHY
A anlise de compostos com carga tem sido obtida por supresso de ion (ajuste
cuidadoso do pH da fase mvel para resultar em analito no ionizvel.
Determinao do pH timo da fase mvel em supresso de ion frequentemente
requer trabalho extensivo no desenvolvimento do mtodo.
Para amostras contendo mais de um componente ionizvel, o mtodo
frequentemente nao adequado.
As limitaes da supresso de ion, conduziu ao desenvolvimento de uma
metodologia mais adequada para a separao de componentes ionizados:
cromatografia por interao inica ion pair chromatography.
A tcnica envolve a adio de composto inico na fase mvel para promover a
formao de pares de ions (ion pairs) com analitos carregados. Estes reagentes so
constituidos de uma cadeia alqulica com terminal ionizvel.
Quando usado com colunas hidrofbicas Fase Reversa , os reagentes ion par podem
ser usados para aumentar seletivamente a reteno de analitos carregados.
126
QUANDO UMA FASE MVEL DEVE SER TAMPONADA?
Em HPLC com fase reversa, a reteno dos analitos est relacionada com sua
hidrofobicidade. Quanto mais hidrofbico o analito, mais ele ser retido.
Quando um analito ionizado, ele torna -se menos hidrofbico e portanto sua reteno
diminui.
cidos perdem um proton e tornam-se ionizados quando o ph aumenta.
Bases ganham um proton e tornam-se ionizados quando o ph decresce.
Portanto, nas separaes contendo cidos e/ou bases utilizando fase reversa, necessrio
controlar o ph da faxe mvel, usando um tampo apropriado para se obter resultados
reprodutveis.
FASES MVEIS TAMPONADAS PARA HPLC COM FASE REVERSA
128
A figura 2 mostra que metilamfetamina totalmente protonada em pH menor que 3 e sua reteno
no afetada por pequena mudana no pH da fase mvel. J a pH 7, prximo de seu pKa, uma
mudana de apenas 0.2 unidades de pH desloca a reteno de quase 9% .
ANLISE QUALITATIVA
A anlise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificao dos analitos de
interesse.
Existemdois casos a seremconsiderados para anlise qualitativa comHPLC:
Anlise Qualitativa emControle de qualidade
Anlise Qualitativa emidentificaes no rotineiras
ANLISE QUALITATIVA
Anlise Qualitativa em Controle de qualidade
normalmente efetuada atravs da comparao do tempo de reteno ou
reteno relativa dos analitos de interesse comesses parmetros de padres. Tais
anlises so realizadas commetodologias j estabelecidas.
fundamental o controle e monitoramento das condies analticas para evitar
concluses errneas.
Anlise qualitativa em identificaes no rotineiras
Neste caso importante conhecer o mximo da histria da amostra e utilizar
detectores que auxiliama identificao da estrutura do composto, como detector
de espectrometriade massa.
ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS POR NORMALIZAO
Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e so
detectveis
Existemdois procedimentos:
Normalizao de rea (% em rea)
Normalizao utilizando-se a rea corrigida
ANLISE QUANTITATIVA
Normalizao de rea (% em rea)
A
i
= rea do composto i
Ai = somatria das reas de todos componentes
Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a sua
concentrao e que mesma concentrao de diferentes compostos resulte em
reas iguais (o que dificilmente ocorre).
100 % x
A
A
i
i
i
ANLISE QUANTITATIVA
Normalizao com rea corrigida
Ai = rea do composto i
F
i
= fator de resposta do componente i
A
i
F
i
= somatria das reas de todos componentes multiplicadas pelos respectivos
fatores de resposta
necessrio conhecer todos os componentes da amostra para determinao dos
fatores de resposta de cada componente
100 % x
xF A
xF A
i i
i i
i
ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS ABSOLUTOS
Utiliza-semtodos absolutos quando:
O objetivo da anlise quantificar um ou alguns dos componentes da
amostra.
Ao utilizar detectores especficos ou seletivos que detectam somente os
componentes de interesse
Existncia de compostos na amostra que no so eludos nas condies de
anliseou no so detectados e que no haja interesse de quantific-los.
Quantificaode componentes embaixa concentrao.
Existemdois procedimentos:
Padronizao externa
Padronizao interna
ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS ABSOLUTOS - Padronizao externa
1. Determina-se a curva de calibrao de cada componente atravs da anlise de misturas padres
injetando-se umdeterminado volume.
2. Posteriormente, injeta-se o mesmo volume da amostra e obtem-se a concentrao do analito atravs da
urva dec calibrao.
Nesta tcnica, se o volume injetado no for exatamente o mesmo ou se houver alterao de algum
parmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variao da intensidade
de luz do UV-VIS ou alterao na FM, as reas dos picos podero ser maiores ou menores daquelas
obtidas na calibrao e consequentemente os resultados sero incorretos.
A
i
C
i
ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS ABSOLUTOS - Padronizao interna
Para minimizar os problemas da padronizao externa, a amostra e a mistura padro so
modificadas pela adio de um composto considerado como padro interno. O padro
interno deve ter as seguintes caractersticas:
1. No estar presente na amostra original, ser estvel e no reativa.
2. Picoseparado dos componentes da amostra
3. Eluir prximo dos componentes de interesse
4. Detecosemelhantedos picos de interesse
5. Concentraoque produza rea similar aos picos analisados
6. Pureza elevada ou conhecida (possveis impurezas no devem eluir com os
picos de interesse).
ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS ABSOLUTOS - Padronizao interna
1. Determina-se a curva de calibrao de cada componente atravs da anlise de misturas
padres contendo o padro interno. Nessa curva de calibrao utiliza-se a relao entre rea
do componentei e rea do padro interno emfuno das relaes de suas concentraes.
2. Posteriormente, injeta-se a amostra contendo padro interno (preferencialmente na
mesma concentrao utilizada na calibrao) e obtem-se a concentrao do analito atravs
da curva de calibrao.
A
i
/ Ap
i
C
i
/ Cp
i
Se o volume de amostra injetado for
diferente do utilizado na calibrao, ou se
algum parmetro analtico for alterado
resultando em reas diferentes daquelas
esperadas nas condies de calibrao, a
relao de rea entre analito e padro
interno no ser afetada.
UHPLC ULTRA HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPY
A tecnica utiliza particulas menores que 2m o que fornece colunas com maior
eficincia( maior nmero de pratos) e consequentemente melhor separao, desde
que os analitos tenham coeficiente de partio diferentes.
Normalmente utiliza-se colunas com 1.7m o que acarreta maior presso no
sistema, sendo necessrio utilizar equipamento configurado para isso.
O sistema necessita de baixo volume morto, bomba para trabalhar com presses
maiores que HPLC convencional, detectores de baixo volume da cela.
Em analises rpidas, o detector precisa permitir velocidade de amostragem na faixa
de 50milisegundos ou invez de 400 na HPLC convencional e constante de tempo de
0.05 seg.
SISTEMAS UHPLC E FASES ESTACIONARIAS
Waters Corporation Acquity UPLC System 6 FE BEH/slica
Thermo Scientific Accela High Speed LC 3 FE Hypersil Gold
Agilent 1200 Series 8 FE Eclipse, Extend e Stablebond
Restek(colunas) Pinnacle DB 1.9m
Grace/ Alltech - colunas
V ERIFICAO DE EQUIVALNCIA DE COLUNAS HPLC
Dois grupos projeto USP e projeto Snyder/Dolan, utilizando parmetros para caracterizar colunas
HPLC, com a finalidade de avaliar a equivalencia entre elas.
PROJ ETO USP Grupo de trabalho: Agilent, NIST,Phenomenex, Supelco,ThermoHypersil-
Keystone, Waters
Parmetros avaliados:
Hidrofobicidade
Quelao de metais
Atividade do grupo silanol
Seletividade
Densidade de ligaes
Projeto Snyder/Dolan Grupo de trabalho Impurezas PQRI informao obtida emWyeth, Eli Lilly,
FDA-laboratorio de Rockville, 3M, Laboratorio de Snyder/Dolan - 8 compostos/ 2 amostras
Parmetros avaliados:
Hidrofobicidade
Seletividade
Acidez pontes de H
Basicidade pontes de H
Capacidade de troca inica
Site: www.usp.org/USPNF/columns.html
DESENVOLVIMENTO DE MTODO HPLC COM AUXILIO DE COMPUTADOR
Varios softwares foram desenvolvidos com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento
de mtodo de anlise por HPLC.
So softwares caros, mas o investimento permite uma economia para as Empresas,
pois cada mtodo desenvolvido em pouco tempo.
Dependendo da experincia em cromatografia e da complexidade da amostra, um
mtodo desenvolvido manualmente(mtodo convencional), pode levar um ms ou
mais.
Com um desses programas eletronicos, o mtodo pode ser desenvolvido em
algumas horas ou poucos dias.
ALGUNS PROGRAMAS BEM CONHECIDOS E DOCUMENTADOS:
DRY-LAB 2000 PLUS(Rheodyne) www.molnar-institut.com/www.rheodyne.com
CHROMSWORD AUTO - (Hitachi Agilent Iris) www.chromsword-auto.com
ACD LABS METHOD DEVELOPMENT SOFTWARE www.acdlabs.com
POPLC- Phase Optimized Liquid Chromatography BISCHOFF
CHROMATOGRAPHY www.poplc.def
REFERNCIAS PARA CONSULTA
HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis George Lunn Norman Schmulf
Wiley Interscience 1997 (1632 pag.) ISBN 0471181765
HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals George Lunn Wiley
2005 (717 pag.) ISBN 9780471669418
HPLC for Pharmaceutical Scientists Yuri Kazakevich Rosario Lobrutto Wiley
J an 2007(1104 pag.) ISBN 9780471681625
HPLC Made to Measure Stravos Kromidas Wiley 2006 ISBN 352731377X
Validation Chromatographic Methods A Practical Guide David M. Bliesner Wiley
2006 (304 pag.) ISBN 9780471741473
HPLC Practical and Industrial Applications J oel Swadesh
Modern HPLC for practicing scientists Michael W.Dong Wiley Interscience 2006
HPLC A practical users guide Marvin C. McMaster J ohn Wiley & Sons - 2007
REFERNCIAS PARA CONSULTA
Fundamentos da Cromatografia a lquido de alto desempenho REMOLO CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1a
Ed.
Bulletin 781, How to protect your HPLC Column and prolong its life,
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Bulletin 826, HPLC Troubleshouting guide,
Bulletin 788, Guidelines for formulating mobile phases for various reversed phase HPLC Columns,
Bulletin 844, Post Columns reactions enhance detections sensitivity and selectivity in HPLC analysis,
Bulletin 879, CG and HPLC Phases and packings for US Pharmacopoeia methods,
The Reporter, Optimizing HPLC Separations,
Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, nmero 3, junho 1998, Validao de mtodos cromatogrficos,
pg. 12
FONTES DE INTERNET
www.chem.agilent.com
www.alltech.web
www.dionex.com
www.esind.com
www.gls.co.jp
www.hamiltoncompany.com
www.macherey-nagel.com
www.mac-mod.com
www.merck.de
www.microlc.com
www.microsolvtech.com/
www.phenomenex.com
www.instruments.perkinelmer.com
www.polymerlabs.com
www.restekcorp.com/h
www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco
www.thermo.com
www.tosoh.com/
www.varianinc.com
www.vydac.com/
www.waters.com
www.zirchrom.com/
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O Centro de Educao Profissional (CEP) uma Empresa voltada para a Educao
Continuada e Profissionalizante atravs de: Cursos de Extenso Presenciais;
Cursos a Distncia (EAD); Cursos In-Company;Programas Especiais e Especializaes;
Assessoria e Consultoria Customizada;
Dentro das di versas reas que o CEP atua, destacam-se: Instrumentao e Desenvol vimento Analtico,
Controle de Qual idade, Garantia da Quali dade, Assuntos Regul atri os, Pesqui sa e Desenvol vimento,
Microbiologia e Habilidades Gerenciais.
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Professor Ayrton: ayrtonargenton@hotmail.com
Av. Ibirapuera 2907, Ed. Comercial State, Conj. 1709, Moema - SP - SP - TEL/ FAX: 11 50539755
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