BMM 5777 Culturas celulares e suas aplicaes

em Microbiologia



P3a - Contagem de clulas em cmara de Neubauer

1. Colocar a lamnula sobre a rea de marcada na cmara de contagem. Usar lamnulas
especiais que fornecem a profundidade correta da cmara de contagem. No usar
lamnulas comuns.

2. Homogeneizar bem a suspenso celular e transferir com esterilidade 0,1 ml para um
pequeno tubo de ensaio.

3. Adicionar 0,3 ml de corante azul de tripano 0,2% ao tubo, obtendo assim uma diluio
1/4.

4. Misturar os contedos e retirar uma alquota de 0,5 ml com a pipeta.

5. Encostando a ponta da pipeta na borda da lamnula, preencher cuidadosamente a
cmara de contagem. O lquido deve preencher apenas um lado da cmara e no
deve chegar aos canais de cada lado da rea de contagem (Fig. 1).

6. Deixar as clulas sedimentarem por 2 min.

7. Focalizar a rea demarcada da cmara de contagem com a objetiva de menor
aumento (Fig.2). Nas reas 1, 2, 3 e 4, o volume com a lamnula colocada
corresponde a 0,1 mm
3
.

8. Contar as clulas nas 4 reas de um lado da cmara de contagem, seguindo o
esquema da Fig. 2 e dividir o valor por 4 para obter a mdia.

9. Como a suspenso foi inicialmente diluda a 1/4, o nmero de clulas contadas ser
igual mdia multiplicada pelo fator de diluio, no caso 4.

10. Para obter o nmero de clulas/ml, multiplicar corrigir o valor obtido por 10.000, pois:
1 ml =1 cc
1 cc =10 x 10 x 10 mm =1.000 mm
3
.Na cmara de Neubauer obtemos o nmero de celular por 0,1 mm
3
, ento
devemos multiplicar por 10, portanto 10 x 1.000 =10.000
11. Assim temos:
n
o
total de clulas
n
o
de clulas/ml = x fator de diluio x 10.000
n
o
de quadrantes contados

Critrios para a contagem (Fig. 3):
enumerar clulas com ncleo bem visvel;
contar clulas isoladas como 1 clula (a);
contar grumos constitudos por clulas facilmente distinguveis por seus ncleos e
citoplasmas como grupos de clulas isoladas e contar cada clula (b);
grumos, cujas clulas so difceis de serem distinguidas umas das outras, devem ser
contados como um nico grupo (c).





Fig. 1 Fig. 2
1 2
3
4



Sentido da contagem Grumos de clulas

Fig. 3 Fig. 4


Clculo do n
o
de clulas desejadas


n
o
de clulas/ml da suspenso original
x volume original = volume final
concentrao de clulas desejada/ml