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Imunoensaios Cap 5
Imunoensaios Cap 5
Testes Laboratoriais
Aplicados Imunologia Clnica
Ana Lgia Bender
Carlos Alberto von Mhlen
TESTES SOROLGICOS OU
IMUNOENSAIOS
Os imunoensaios so tcnicas para a deteco ou
quanticao de antgenos ou anticorpos, podendo
utilizar reagentes marcados ou no marcados. Os
ensaios com reagentes no marcados possuem sensibilidade de deteco menor, pois necessrio que se
forme grande quantidade de imunocomplexos para
que se processe a visualizao do fenmeno.
A imunoqumica disponibiliza mtodos simples, rpidos e sensveis aplicveis s anlises na
rotina laboratorial. Os mtodos imunoqumicos
normalmente no requerem equipamentos caros e
preservam as caractersticas do material biolgico.
A utilizao de sistemas de marcao de reagentes
torna possvel a amplicao do sinal nal e deteco atravs de instrumentos (fotometria, uorimetria
ou luminometria), elevando a sensibilidade ordem
de atomol ou zeptomol (10-19 /10-21 ).
Nas ltimas dcadas os imunoensaios se tornaram a tecnologia padro em medicina laboratorial.
Houve grande desenvolvimento na tecnologia de
produo de anticorpos e antgenos empregados,
bem como dos analisadores automatizados. Esses
avanos tecnolgicos agregaram baixa variabilidade
inter e intra-ensaios (CV = coeciente de variao)
e rapidez na realizao dos testes.
Apesar do aumento nos processos automatizados
nos laboratrios clnicos, a interveno humana
REAES DE PRECIPITAO
As reaes de precipitao envolvem a combinao de antgeno solvel com anticorpo solvel para
produzir complexos insolveis que so visveis. As
tcnicas de precipitao comearam a ser utilizadas
h aproximadamente 100 anos por Rudolf Kraus em
Viena e em 1905 Bechhold apresentou seus experimentos sobre a precipitao em gis.
Heidelberger e Kendall em 1935 descreveram a
curva parablica que mostra a quantidade de precipitado (imunocomplexos Ag-Ac) quando adicionada
quantidade crescente de antgeno a uma quantidade
constante de anticorpo (Fig. 5.1). A reao entre o
antgeno e o anticorpo reversvel e obedece a uma
constante de associao (Ka). Dentre vrios fatores
fsico-qumicos e imunolgicos que interferem na
reao, as concentraes relativas do antgeno e do
anticorpo um dos mais importantes. Quando as
quantidades de antgeno e anticorpo so equivalentes
(zona de equivalncia) h a formao mxima de
precipitado, decrescendo medida em que um dos
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Fig. 5.1 Curva de formao de imunocomplexo em funo da quantidade de antgeno adicionada. (Fonte:http://www.uoguelph.ca/mbnet/323IMMUN/C2_AGAB.)
Fig. 5.2 Prova de precipitao simples demonstrando presena de crioglobulinas no soro direita, em paciente com infeco pelo vrus da hepatite C.
Fig. 5.3 Reaes de imunodifuso radial simples e dupla. (Fonte: http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/C2_AGAB.)
TCNICAS ENVOLVENDO
SEPARAO ELETROFORTICA
Nestas tcnicas ocorre a migrao de partculas
carregadas em um solvente condutor sob a inuncia
Imunoeletroforese
Combina a eletroforese em gel, seguida da
imunodifuso e precipitao das protenas. um
procedimento em duas etapas que primeiro envolve
a separao eletrofortica das protenas, seguida de
imunodifuso de cada componente, a partir do seu
centro de difuso, contra o anti-soro especco, formando uma linha ou arco de precipitao na regio
de equivalncia. Assim, a caracterizao de uma
substncia feita a partir de suas propriedades eletroforticas (mobilidades diferentes devido a cargas
eltricas diferentes), coecientes de difuso e propriedades imunolgicas (especicidade). O sistema
de imunodifuso que se obtm aproxima-se de uma
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Imunofixao
A imunoxao deve ser realizada quando um
pico ou banda encontrada na eletroforese de protenas sricas ou quando h suspeita de gamopatia
monoclonal. A imunoxao combina a eletroforese
e a imunoprecipitao. um procedimento em dois
estgios: primeiro a amostra aplicada em seis posies diferentes do gel de agarose e as protenas so
separadas por eletroforese de acordo com a carga.
Aps, soros monoespeccos para IgG, IgA, IgM,
cadeia kappa e cadeia lambda impregnados numa
ta de papel ou acetato de celulose so colocados
individualmente sobre cada posio, seguidos da
aplicao de soluo xadora de protenas. Se o
antgeno complementar estiver presente em propores adequadas na amostra, os complexos formados
precipitam e so xados no gel, o que permite sua
identificao com o auxlio de um corante (Fig.
5.5). O teste utilizado na deteco precoce de
gamopatias monoclonais, na interveno teraputica em casos novos e na recorrncia de mieloma.
e, a seguir, cada campo foi analisado com o anti-soro respectivo (anti-IgG, antiIgA, anti-IgM, anti-kappa e anti-lambda). Notamos neste paciente a presena
de protena M monoclonal em IgM-kappa. (Figura cedida pelo Laboratrio de
Patologia Clnica do Hospital So Lucas da PUC-RS).
TCNICAS ENVOLVENDO
A DISPERSO DA LUZ
Nefelometria
Uma caracterstica importante das solues coloidais a sua pronunciada disperso da luz. Quando
um feixe de luz incidente atravessa um meio contendo
partculas, estas interferem com a passagem da luz,
fazendo com que seja dispersa em todas as direes.
Este fenmeno, conhecido como efeito Tyndall, no
altera o comprimento de onda da luz incidente e
independente do tipo de partcula (Fig. 5.6).
Os ensaios nefelomtricos se baseiam no princpio de que um imunocomplexo em soluo dispersa
luz em vrios ngulos em relao luz incidente.
Um nefelmetro utiliza uma fonte de luz de alta
intensidade que incide em uma cubeta contendo os
imunorreagentes.
A quantidade e a natureza da disperso dependem
da forma e do tamanho das partculas, da concentrao, do comprimento de onda e do ndice de refrao
do meio. A nefelometria totalmente automatizada,
de realizao fcil, rpida e precisa, principalmente
se forem utilizados nefelmetros que subtraiam
rudos, como os causados por lipemia ou hemlise,
e que garantam leitura na regio de excesso de anticorpo. Medidas acuradas s podem ser feitas nesta
regio porque onde existe relao linear entre a
concentrao da substncia e a densidade tica.
Dentre as aplicaes mais comuns temos as determinaes de protenas especcas como alfa-1-antitripsina, alfa-1-glicoprotena-cida, alfa-2-antiplasmina,
IgG, IgA, IgM, C3, C4, apolipoprotenas, beta-2microglobulina, anti-estreptolisina O, protena C
reativa ultrassensvel e fator reumatide.
Turbidimetria
Este teste est sujeito s mesmas condies dos
sistemas nefelomtricos. O sinal de deteco a
absorbncia e no a intensidade de luz dispersa (Fig.
5.6). No necessita de aparelhagem especial. As
reaes podem ser medidas em espectrofotmetros
simples utilizados em bioqumica. Pode ser utilizada
para medidas quantitativas de drogas ou biomarcadores no soro, plasma ou urina.
REAES DE AGLUTINAO
A ligao cruzada com produo de agregados
ocorre quando um anticorpo reage com um antgeno
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Coaglutinao
Nos testes de coaglutinao estaloccica, cepas
de Staphylococcus aureus mortos e intactos so
usadas para visualisao. A parede celular desses
ENSAIOS LTICOS
Ensaio de Neutralizao
semelhante reao de xao do complemento, mas aplicvel somente em certas situaes
patognicas onde o anticorpo a ser medido dirigido
contra uma hemolisina (toxina bacteriana capaz de
lisar diretamente os eritrcitos). Nestas situaes, a
hemolisina e os eritrcitos reagentes so adicionados e, se o anticorpo hemolisina est presente, a
lise dos eritrcitos no ocorrer. A quanticao
realizada pela diluio seriada da amostra
antgenos em tecidos biolgicos (material de bipsias, vrus, bactrias, clulas etc.), raramente
quantitativa. Essa tcnica muito utilizada para a
pesquisa de vrus respiratrios (inuenza, parainuenza, vrus sincicial respiratrio e adenovrus).
Fig. 5.8 - Testes fluorescentes heterogneos: em (a) imunofluorescncia direta (IFD), em (b) imunofluorescncia indireta (IFI) com anticorpo antiisotipo e em (c),
IFI com protena A marcada com substncia fluorescente. (Fonte: http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/C2_AGAB)
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Citometria de Fluxo
a aplicao das tcnicas de imunouorescnica
na identicao de determinadas clulas em suspenso, ou seja, na identicao de antgenos em clulas
vivas. Quando uma suspenso de clulas marcadas
colocada em um separador de clulas ativado por
uorescncia (FACS), o aparelho determina a intensidade da uorescncia de cada clula. As clulas
so separadas conforme sua emisso uorescente
caracterstica. Esta tcnica permite, alm da anlise
fenotpica e funcional de subpopulaes celulares, o
isolamento de diferentes populaes celulares com
distintos antgenos de superfcie corados por diferentes anticorpos uorescentes (Fig. 5.11).
A citometria de uxo ferramenta diagnstica
e prognstica na avaliao de doenas malignas e
benignas, transplante de rgos e tecidos, imunodecincias primrias e adquiridas. Exemplos da
Ensaio desenvolvido recentemente que combina a citometria de uxo com microesferas. Vrias
destas microesferas so produzidas por diferentes
empresas. Um destes sistemas consiste de 100 diferentes tipos de microesferas produzidas de forma
uniforme, com propores e nveis de uorescncia
do vermelho e laranja (detectado em um equipamento FACScan) distintas. Cada microesfera forma
a base de um ensaio individual, eis que apresenta
endereo espectral especco, usando a uorescncia
verde para analisar os resultados (FL1). Assim, um
primeiro feixe de laser l qual a esfera especca
que est passando pelo detector, e o segundo feixe
l a reao em sua superfcie. Este sistema facilita
o desenvolvimento de ensaios multiplexados, que
simultaneamente medem diferentes analitos em um
pequeno volume de amostra (Fig. 5.12). Eles so
rpidos, no requerem lavagem para separao da
fase livre daquela ligada e podem ser realizados em
menos de 2 horas.
ENSAIOS DE IMUNOHISTOQUMICA
Imunoperoxidase
um ensaio semelhante imunouorescncia
indireta em que a presena de anticorpo identi-
Fig. 5.11 - Esquema de separao de populao de clulas expressando ou no antgenos A e B marcados, identificados por anticorpo marcado com molcula
fluorescente. Aps anlise computadorizada as populaes celulares so representadas graficamente em funo da fluorescncia emitida aps marcao. (Fonte:
http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/C2_AGAB).
Fig. 5.12 - Representao esquemtica dos reagentes utilizados no ensaio de citometria de fluxo baseado em partculas Multiplex. As linhas azuis representam a
luz excitatria incidente, as linhas das demais cores, os padres de emisso.
Imunocitoqumica
Envolve a avaliao microscpica computadorizada aps ensaio de imunouorescncia ou imunohistoqumica em material de bipsia. H aumento
na especicidade com a remoo da subjetividade
do observador, podendo ser realizada a avaliao
quantitativa atravs da anlise de cor, intensidade e
concentrao.
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Radioimunoensaio
Os testes radioativos utilizam um reagente
marcado, antgeno ou anticorpo, para quanticar
o antgeno ou o anticorpo da amostra. O composto
desconhecido pode ser determinado pela medida da
radioatividade emitida. O termo radioimunoensaio
(RIE) utilizado usualmente quando o componente
marcado o antgeno e ensaio imunorradiomtrico
(IRMA) quando o componente marcado o anticorpo. O radioistopo mais utilizado o iodo-125. A
sensibilidade do mtodo da ordem de nanogramas
ou picogramas.
Radioallergosorbent Test
o nome dado para o mtodo in vitro que detecta
anticorpos IgE (ou IgG) alergeno-especcos. Uma
matriz de carboidratos (chamada sorbent) revestida
de alergeno, podendo ser detectados utilizando antianticorpo marcado com um radioistopo.
ENSAIOS LUMINESCENTES
Ensaios Quimioluminescentes
So baseados na emisso de luz produzida em
algumas reaes qumicas de oxidao, aqui incluidos agentes quimioluminescentes derivados biologicamente. A emisso de luz pode ser detectada ou
medida utilizando-se luminmetros com tubos fotomultiplicadores, diodo de silicone em estado slido
ou lme fotogrco como detector. As reaes de
Eletroquimioluminescncia
A eletroquimioluminescncia, tambm chamada
de quimioluminescncia eletrogerada, envolve reaes de transferncia de um eltron na superfcie
de um eletrodo com gerao de composto instvel
(excitado) que emite um fton de luz (Fig. 5.13).
Ocorre como uma reao de oxidao-reduo em
ciclo. O sistema mais utilizado envolve a aplicao
de voltagem em um eletrodo na presena de um luminforo eletroquimioluminescente como o rutnio
Ru(bpy)32+ em presena da tripropilamina (TPA).
A eletroquimioluminescncia encontra aplicao
em imunoensaios e anlise de DNA. Este sistema
utilizado para a dosagem de hormnios, marcadores
tumorais, marcadores cardacos e deteco de anticorpos em algumas doenas infecciosas.
Enzimaimunoensaio
o termo genrico para um grande nmero de
testes que permitem ensaios quali- e quantitativos,
para a deteco tanto de antgenos quanto de anticorpos. Estes testes usam o produto da mudana de
cor da interao da enzima com o seu substrato para
medir a reao entre o antgeno e o anticorpo.
Fig. 5.13 - Esquema da reao de eletroquimioluminescncia. A micropartcula magntica (fase slida) suporta a estrutura do imunoensaio, em que o marcador
a molcula de rutnio. O marcador participa de uma reao de oxidao-reduo com a tripropilamina (TPA). (Fonte: Roche do Brasil Diviso Diagnstica.)
Fig. 5.14 - Esquemas dos testes enzimticos heterogneos do tipo indireto (a), sanduche (b) e captura (c). (Fonte: http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/
C2_AGAB.)
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[G]TCNICAS DE
IMUNOELETROTRANSFERNCIA
Western Blotting
um procedimento em que as protenas so
separadas pelo tamanho por eletroforese e, aps
IMUNIDADE CELULAR E
FUNES FAGOCTICAS
Fig. 5.15 - Western Blot de soros de crianas com diagnstico de lupus eritematoso sistmico juvenil. Em 1, soro controle negativo, em 2 e 3, soros controle positivos,
conforme indicado. Entre 4 e 17, fitas com reaes individuais de auto-anticorpos. Perceber a presena de auto-anticorpos contra proteina P ribossomal (rRNP) em
4 a 7, bem como a grande variedade de bandas representativas da presena de mais de um auto-anticorpo nos casos juvenis de lupus. Em 18, soro reagindo com o
antgeno NOR-90 (human upstream binding factor), proveniente de criana com fenmeno de Raynaud.
Imunofenotipagem.
Passos na investigao da funo fagoctica.
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trombocitopenia auto-imune, doenas linfoproliferativas, hemoglobinopatias e anormalidades cromossmicas, como por exemplo a sndrome de DiGeorge
e a sndrome de Down. Doenas auto-imunes como
a doena mista do tecido conjuntivo, o lpus eritematoso sistmico, o diabetes tipo 1, a esclerose
amiotrca lateral, a esclerose mltipla e a miastenia
gravis podem estar associadas a alteraes imunes
celulares.
CD45/CD14
Controles isotipo imunoglobulinas de rato
CD3/CD25 (Receptor de interleucina 2 IL-2-R)
CD3/HLA-DR
Valores de Referncia
CD2
75% a 92%
CD3
63% a 84%
A funo imune diferencial realizada por citometria de uxo, em que os linfcitos T so separados
pela expresso do seu receptor CD3. Este receptor
essencial para a ativao da populao de clulas T.
Linfcitos B so identicados pela sua imunoglobulina de superfcie (detectada por anticorpos monoclonais como anti-CD19 e anti-CD20). A expresso
de molculas do MHC de classe II tambm pode
CD69 e CD3
0% a 2%
CD25 2 CD2
0% a 5%
CD71 e CD2
0% a 8%
HLA-DR e CD3q
1% a 9%
59% a 84%
0% a 10%
Produo de Citocinas
O estudo dos mecanismos imunolgicos de desenvolvimento de auto-imunidade, alergias, doenas
hematolgicas e imunodeficincias impossvel
sem uma avaliao quali-quantitativa da produo
de citocinas. Em um nmero de doenas do sistema
imune, a quanticao de citocinas no soro e no
meio de clulas sangneas estimuladas essencial
para determinar o estgio imunopatogentico do
desenvolvimento de uma doena, para escolher a
imunoterapia adequada e estimar a eccia da imunocorreo especca.
Conseqentemente, o desenvolvimento de novos
mtodos para estimar o nvel de citocinas em meio
siolgico ou meio de cultura de clulas importante no somente na pesquisa, mas tambm na prtica
mdica.
Existem kits comerciais disponveis para a
dosagem de citocinas atravs de metodologia imunoenzimtica (ELISA), radioimunoensaio (RIA),
quimioluminescncia (CLIA) ou eletroquimioluminescncia (ECLIA). Atualmente, esto disponveis em laboratrios de referncia a dosagem das
seguintes citocinas: IL-1, receptor antagonista de
IL-1, IL-2, receptor solvel de IL-2, IL-3, IL-4, IL-
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Ensaios de Citotoxicidade
A atividade citotxica de linfcitos T, clulas
matadoras naturais (NK) e clulas matadoras ativadas por citocinas usualmente testada atravs
de ensaios radioativos, que detectam a liberao de
contedos citoplasmticos aps a desintegrao da
clula-alvo agonizante. Em contraste a esta avaliao indireta da citotoxicidade, foi descrito um ensaio
de uorescncia baseado na anlise direta qualiquantitativa por citometria de uxo de dano celular
a um nico nvel celular. Nesta tcnica, clulas-alvo
so coradas com PKH-26, corante lipoflico que se
integra membrana celular e permite a distino
entre clula-alvo e clula efetora. Aps 3 horas
de incubao in vitro, uma outra colorao com
anexina V-FITC (ann-FITC) e iodeto de propdio
(PI) permite a discriminao entre clulas vivas,
em apoptose ou necrticas. A anlise de dados
realizada primeiramente nas clulas-alvo PKH-26
positivas, seguida da anlise das subpopulaes annFITC e PI positivas. O percentual de citotoxicidade
na populao de clulas PKH-26 calculado pela
subtrao de clulas-alvo ann-FITC ou PI positivas
no-especcas, medida em controles apropriados
sem a clula efetora.
A colorao da membrana da clula-alvo como
clulas de melanoma primrio ou blastos leucmicos
revelou impregnao alta e estvel do PKH-26, sem
alterar a viabilidade ou imunogenicidade das clulas.
Usando linfcitos T citotxicos antgeno-especcos,
foi demonstrado que a tcnica com citometria de uxo sensvel e se correlaciona com o ensaio padro
de liberao do cromo 51, sendo o novo ensaio mais
simples e altamente reprodutvel.
Similarmente, a protena fluorescente verde
enriquecida (enhanced green fluorescent protein
EGFP) foi utilizada para avaliar a citotoxicidade
de clulas matadoras naturais (NK) sobre clulas de
eritroleucemia humana (linhagem K562) por citometria de uxo. Esta nova tcnica para avaliao de
citotoxicidade de clulas NK mostrou forte associao tcnica padro que utiliza marcao radioativa
Procedimentos Laboratoriais
Isolamento de Neutrfilos e Moncitos
Este procedimento realizado para o isolamento
de moncitos e neutrlos que sero usados nos
ensaios de quimiotaxia e atividade microbicida.
Princpio: Amostra de sangue total heparinizado submetida a gradiente de densidade em
Ficoll/Hypaque sob centrifugao. As clulas
mononucleares (linfcitos e moncitos) situam-se
na interface plasma/Ficoll-Hypaque. Estas clulas
mononucleares so cuidadosamente aspiradas. O
plasma e o Ficoll/Hypaque remanescentes so aspirados, permanecendo no tubo as clulas vermelhas
e polimorfonucleares. As clulas mononucleares
so depositadas em frascos cobertos com gelatina,
seguindo a aderncia dos moncitos. As clulas
mononucleares que no cam aderidas (linfcitos)
so cuidadosamente decantadas. Posteriormente,
os moncitos sero soltos da gelatina atravs de
aspirao.
Os eritrcitos e polimorfonucleares so ressuspensos e adicionado Dextran 500 a 1%. Aps
centrifugao, as clulas vermelhas sedimentam e
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Desta forma, obtm-se clulas mono e polimorfonucleares separadas para serem utilizadas nos testes
especcos.
Ensaio de Quimiotaxia
Princpio: A migrao de moncitos e neutrlos
em resposta a um estmulo quimiottico especco
o primeiro passo crucial na seqncia de eventos
principais da resposta inamatria aguda e crnica.
Receptores de superfcie celular para vrias funes
de estmulo so expressos na membrana celular.
Estes eventos resultam na migrao dirigida de fagcitos ao local da inamao.
Este ensaio mede a migrao radial de moncitos ou neutrlos na agarose, em resposta a um
gradiente quimiottico criado pela difuso de um
quimioatraente na agarose. Aps permitir a migrao
direta em direo ao quimioatraente e a migrao
randmica na direo oposta do quimioatraente
aplicado, os moncitos ou neutrlos so xados e
corados com Giemsa. Aps secagem, a distncia da
migrao e a orientao randmica da migrao dos
fagcitos corados e xados determinada por microprojeo (40 ). A rede de migrao determinada
por subtrao da distncia randmica de migrao
(em centmetros) da migrao direta em direo
ao quimioatraente. Os valores dos pacientes so
Imunofenotipagem
Moncitos/macrfagos e neutr los tm um
importante papel nos mecanismos de defesa imune
inata e na regulao da resposta imune adaptativa
celular e humoral. Estes mecanismos efetores
so mediados atravs de importantes molculas
de adeso e receptores celulares na membrana
citoplasmtica dos fagcitos. Os receptores para
a poro Fc da imunoglobulina IgG (CD16,
FcRIII; CD32, FcRII; CD64, FcRI), bem como os
receptores para os componentes do complemento
(CD11b, receptor C3bi) tm um papel crucial na
ligao de antgenos imunocomplexados superfcie das clulas fagocticas, assim auxiliando o
processo fagoctico e a eliminao dos patgenos.
Alm disso, a expresso de molculas de adeso
na superfcie das clulas, tais como o CD18, essencial para a migrao dos fagcitos aos locais da
inamao. Estes mesmos receptores encontrados
em moncitos/macrfagos servem para realizar
a internalizao dos antgenos, o que contribui
para o processamento e posterior apresentao s
clulas T imunorregulatrias.
Pacientes com deficincias nos receptores de
membrana (CD11b, CD16, CD18) esto predispos-
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DOSAGEM DE CITOCINAS
INTRACELULARES
As citocinas so polipeptdeos secretados por
uma variedade de clulas em resposta a vrios estmulos, mediando efeitos autcrinos, parcrinos e
endcrinos, que so pleiotrpicos e redundantes.
As citocinas imunologicamente relevantes so
principalmente aquelas formadas por clulas imunes (monocinas e linfocinas) e/ou inuenciam a sua
funo.
O estudo dos mecanismos imunolgicos do desenvolvimento de doenas auto-imunes, alrgicas,
hematolgicas e imunodecincias impossvel sem
uma estimativa quali e quantitativa da produo de
citocinas. Em inmeras doenas do sistema imune, a
quanticao de citocinas no sangue e em meios de
cultura de clulas sangneas estimuladas essencial
para determinar o estgio imunopatogentico do
desenvolvimento da doena, a escolha da imunoterapia apropriada, bem como estimar a eccia da
imunocorreo especca.
A princpio, as citocinas so detectveis em trs
nveis:
1. Pelo uso da reao em cadeia da polimerase
(PCR), a expresso do RNA mensageiro dos
genes das citocinas pode ser detectada e, com
novas tcnicas, at mesmo quanticada.
2. Atravs de bioensaios e enzimaimunoensaios podemos estimar a sntese de protenas. A deteco
da produo intracelular de citocinas pode ser
avaliada atravs de tcnica imunocitolgica ou
imunoistolgica.
3. Deteco da formao de citocinas pela anlise
dos produtos da atividade das citocinas.
Sennikov e cols., citados abaixo, descreveram
um mtodo empregando eletroquimioluminescncia (ECLIA) desenvolvido pela IGEN (EUA) para
a dosagem de interleucinas (IL-1, IL-4 e IL-10
e IFN) sricas e em meios de cultivo de clulas
mononucleares. Outros imunoensaios enzimticos
e quimioluminescentes tambm esto disponveis
no mercado para a dosagem srica e em meios de
cultivo de citocinas e seus receptores solveis.
A demonstrao da sntese de citocinas habitualmente requer o isolamento de clulas. Esta
abordagem permite a disseco dos mecanismos
moleculares e celulares reguladores da resposta imune, mas tem limitaes para aplicaes em grande
escala, como monitoramento imune em pesquisas
clnicas para avaliao de novas vacinas ou agentes
imunoteraputicos. Para evitar os problemas relacionados com o uso de clulas puricadas, culturas
de sangue total foram desenvolvidas especialmente
para o estudo da rede de citocinas humanas em nvel
de protena ou gene. A medida de citocinas via RNA
mensageiro (mRNA) de clulas mononucleares em
sangue perifrico foi descrita por Stordeur e cols.3
por PCR, sendo muito sensvel e atrativa, principalmente quando a metodologia PCR real time
utilizada.
A citometria de uxo tambm tem sido empregada na avaliao da imunidade celular. O mapeamento
de eptopo por citometria de uxo uma abordagem
muito moderna que no somente identica os eptopos das clulas T, mas simultaneamente permite
a anlise detalhada da resposta das subpopulaes
das clulas T, incluindo a linhagem e expresso de
marcadores de ativao, dentre outros. O sistema
mais freqentemente utilizado baseado na identicao de citocinas intracelulares em clulas T
ativadas, seguindo estimulao com peptdeos ou
pools de peptdeos. Um ensaio mais recentemente
desenvolvido analisa a proliferao de clulas T
medindo a diminuio na colorao do ster de succimidil-carboxiuorescena diacetato (CFDA-SE)
em clulas proliferadas5.
O fascnio do uso da citometria de uxo para o
mapeamento de eptopos consiste na grande versatilidade deste sistema no que diz respeito ao nmero
de parmetros que podem ser obtidos em uma nica
medida, isto : marcador de linhagem celular, marcador de ativao na superfcie e internamente clula.
Hoffmeister e cols., citados abaixo, descreveram um
sistema baseado na deteco da produo rpida de
citocinas em clulas T ativadas em curto prazo (to
curto quanto 6 horas) ensaio ex vivo. Neste sistema, alm da rapidez, a resposta CD4 e CD8 pode
ser medida no mesmo ensaio e no mesmo tubo de
teste. O uso da colorao com o CFDA-SE simples
e rpido. A intensidade de colorao desta protena
perdida em aumentos regulares, medida que h
passagem ao prximo estgio de diviso celular. O
CFDA-SE um corante no-txico, uorescenarelacionado, que capaz de penetrar na clula com
o auxlio de suas duas cadeias acetato laterais. Uma
vez dentro da clula, o grupo acetato removido
pelas esterases intracelulares e a carboxiuorescena resultante sai em uma velocidade muito lenta,
seguindo a ligao covalente das aminas livres das
protenas citoplasmticas, formando ligaes amino
muito estveis.
A disponibilidade de tcnicas ecientes capazes
de avaliar a imunidade celular tm disponibilizado
LEITURA RECOMENDADA
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6. Panoskaltsis N, Reid CD, Knight SC. Quantication and cytokine production of circulating lymphoid and myeloid cells
in acute myelogenous leukaemia. Leukemia, 17(4):716-30,
2003.
7. Brown V, Warke TJ, Shields MD, Ennis M. T cell cytokine
proles in childhood asthma. Thorax, 58(4): 311-16, 2003.
8. Laufer S, Greim C, Bertsche T An in-vitro screening assay for
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a useful tool for the development of new antiarthritic and disease modifying drugs. Osteoarthritis and Cartilage, 10: 961-7,
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