INTRODUO

1. INTRODUO 1.1 MIOGLOBINA E HEMOGLOBINA

A Mioglobina (Mb) e a Hemoglobina (Hb) so hemeprotenas e fazem parte da famlia das protenas globulares. Estas protenas so caracterizadas por terem a cadeia polipeptdica enrolada de forma esfrica ou globular possuindo vrios tipos de estruturas secundrias. Outro aspecto importante que caracteriza as protenas globulares, o posicionamento das cadeias aminoacdicas laterais, que se reflecte na estrutura e estabilidade das interaces hidrfobas. A maior parte dos seus grupos laterais hidrfobos est localizada no interior das molculas, ficando distantes da exposio gua, e grande parte dos grupos laterais hidrfilos (polares) fica superfcie das molculas (Nelson e Cox, 2004). As hemeprotenas so constitudas por um grupo prosttico, o heme e por uma parte proteica, a globina. So responsveis por diversos tipos de actividade cataltica e desempenham vrias funes nos sistemas biolgicos. Apresentam um mximo de absoro a 400-440 nm (banda de Sort), caractersticos das porfirinas (Alface, 1997 e Ozaki et al., 2000). A Mb e a Hb consideradas hemeprotenas respiratrias so responsveis pelo transporte de oxignio molecular e possuem uma sequncia aminoacdica semelhante entre si. Neste trabalho foram utilizadas a Mioglobina de corao de cavalo (Mb c) e a Hemoglobina humana (Hb A).

1.1.1 Grupo Heme

O grupo prosttico heme confere a estas protenas uma cor caracterstica, e constitudo por uma parte orgnica e um tomo de ferro, no estado ferroso [Fe(II)].
Grupo Heme

Mioglobina

Subunidade da Hemoglobina

Figura 1.1 Grupo heme na mioglobina e na subunidade da hemoglobina.

(Adaptado de Nelson e Cox, 2004)

INTRODUO

O heme consiste numa estrutura tetrapirrlica, na qual os quatro anis pirrlicos se encontram ligados por pontes de metano tendo periferia 4 radicais metilo, 2 radicais vinilo e 2 radicais proprionilo em arranjos diferentes, dos quais a protoporfirina IX um dos ismeros. O Fe(II) encontra-se no centro da protoporfirina IX coordenado por 4 ligaes ao azoto de cada anel pirrlico (Stryer, 1988).

Figura 1.2 Representaes da estrutura do grupo prosttico heme (Fe-protoporfirina IX).

(Adaptado de Nelson e Cox, 2004)

A sua frmula molecular C34H32FeN4O4 e tem uma massa molecular de 616,487 g/mol. Este grupo essencialmente plano, ligeiramente dobrado. A 5 e a 6 ligao coordenadas do Fe(II) esto estabelecidas com dois ligandos adicionais, localizados acima e abaixo do plano do heme. A 5 ligao est ligada ao azoto imidazlico do resduo de histidina (His) proximal (F8 ou 8 resduo da sexta hlice ou F nomenclatura de Perutz) da cadea polipeptdica. A 6 ligao coordenada est livre no estado no oxidado ou Desoxi, e ocupada pelo oxignio no estado oxigenado ou Oxi, que se situa entre o Fe(II) e o grupo imidazol da His distal (E7) (Stryer, 1988, Zubay et al., 1995 e Lehninger et al., 1993).

Fe

His F8

O2

Figura 1.3 Representaes do heme, que permitem observar que a 5 posio de coordenao do Fe(II), est associado a um aminocidos (resduo de His F8) da cadeia polipeptdica e a 6 posio permite a associao ao oxignio molecular (estado oxigenado ou Oxi). (Adaptado de Nelson e Cox, 2004)

O tomo de ferro pode estar no estado de oxidao ferroso (II) ou no frrico (III), e as formas correspondentes quer da mioglobina quer da hemoglobina so denominadas, respectivamente, ferro- e ferri- (ou meta-). Somente os que se encontram no estado de oxidao (II), podem ligar-se ao oxignio (Stryer, 1988).

INTRODUO

1.1.2 Mioglobina - Estrutura e Funes

A mioglobina uma protena extremamente compacta, que se encontra nas clulas dos msculos dos animais vertebrados, tendo como funo principal armazenar e facilitar o transporte de oxignio nos msculos. O prefixo Mio (Myo) deriva da palavra grega que significa msculo, sendo muitas vezes abreviada por Mb. Esta protena encontra-se no msculo cardaco e msculo esqueltico dos mamferos e aumenta a solubilidade efectiva do oxignio no msculo, actuando como um reservatrio de oxignio e facilitando a difuso de O2 dos capilares sanguneos at aos mitocndria (Evans e Brayer, 1988 e Roncone et al., 2004). particularmente abundante nos mamferos aquticos, como as baleias, os golfinhos e as focas, cujos msculos apresentam uma cor acastanhada devido grande presena desta protena, permitindo que permaneam submersos por longos perodos, j que quando a disponibilidade de oxignio limitada, a oximioglobina liberta o oxignio necessrio contraco muscular facilitando a difuso do oxignio no msculo cardaco (Stryer, 1988, Anderson, 1999 e Nelson e Cox, 2004). Esta hemeprotena teve uma grande importncia no conhecimento da estrutura das protenas. Em 1957 aps longos anos de trabalho, Jonh C. Kendrew e a sua equipa, em Inglaterra, conseguiram visualizar pela primeira vez a estrutura tridimensional de uma protena a da mioglobina, atravs de uma tcnica bastante complexa de difraco de raios-X. Deste modo, foi possvel a construo do modelo tridimensional da mioglobina de esperma de baleia. Esta descoberta permitiu a Jonh Kendrew partilhar com Max Perutz, o prmio Nobel da Qumica em 1962 (Kendrew, 1962, Anderson, 1999 e Garry et al., 2003).

Figura 1.4 Estrutura tridimensional da mioglobina, de esperma de baleia - disponvel na PDB com o cdigo 1MBN, citada pela primeira vez por Kendrew et al. (1958) e posteriormente por Watson (1969).

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A mioglobina constituda por uma nica cadeia polipetdica com 153 aminocidos, dos quais 121 em hlices, e combinada com um grupo heme. A molcula constituda por aproximadamente 1200 tomos (excluindo os de hidrognio), apresentam-se como um esferide achatado de dimenses aproximadas 453525 . constituda por oito troos de hlices ligados uns aos outros. As hlices so designadas a partir da extremidade terminal N pelas letras A a H. No possui pontes de dissulfureto ou grupos livres SH (Stryer, 1988 e Nelson e Cox, 2004).

(a)

(b)

Figura 1.5 Modelos da estrutura terciria da mioglobina. (a) Salientando o grupo heme a vermelho (Adaptado de Ordway e Garry, 2004); (b) Representao com a identificao das cadeias hlice , de A a H. (http://kinemage.biochem.duke.edu/gallery/2Dindex.php)

A sua estrutura primria, secundria e terciria conhecida para um elevado nmero de espcies, sendo muito semelhantes entre si. de salientar que esta protena no possui estrutura quaternria, e o seu contedo em histidina (His) e lisina (Lys) relativamente elevado (Anderson, 1999). O seu interior e exterior esto bem definidos. O interior constitudo basicamente por resduos aminoacdicos no polares, como leucina (Leu), valina (Val), metionina (Met) e fenilalanina (Phe). Os resduos polares como cido asprtico (Asp), cido glutmico (Glu), Lys e arginina (Arg), esto ausentes do interior da protena. De facto, apenas os dois resduos de His, que participam na ligao do oxignio ao grupo heme, so os nicos resduos polares existentes no seu interior. Quanto ao exterior, constitudo por resduos aminoacidcos polares e no polares (Stryer, 1988 e Campbell, 1999). De um modo geral, no interior esto inseridos predominantemente os aminocidos de carcter hidrfobo e sua superfcie, os de carcter hidrfilo, tornando a molcula solvel em gua (Nelson e Cox, 2004).

INTRODUO

O grupo heme fica incorporado numa concavidade interior hidrfoba da molcula proteica, no entanto as suas cadeias laterais de proprionato muito polares, dispemse superfcie da protena. Assim, a um valor de pH fisiolgico, estes grupos carboxlicos esto ionizados (Takano, 1977). A capacidade da Mb se ligar ao oxignio, depende da presena do heme. Na mioglobina oxigenada, uma molcula de oxignio ocupa a 6 posio do tomo de ferro. Na Mb o grupo heme muito menos susceptvel oxidao, porque duas molculas de mioglobina no se conseguem associar para formar um complexo heme-O2-heme. A formao deste complexo est estereoqumicamente impedida pela His E7 e por outros resduos circundantes da 6 posio de coordenao (Goto et al., 1990). A Mb apresenta trs conformaes fisiolgicas muito semelhantes, variando apenas na 6 posio de coordenao do tomo de ferro do grupo prosttico: desoximioglobina (vazio), oximioglobia (ligao com O2) e ferrimioglobina (ligao com H2O). O tomo de Fe(II) do grupo heme, quando exposto ao oxignio oxidado de um modo irreversvel a Fe(III). A parte proteica da Mb impede essa oxidao e torna possvel a ligao reversvel do O2 ao heme. A oxigenao leva a mudana de colorao da molcula de Mb. No modelo estrutural da Mb desnaturada, a ferrimioglobina oxida e perde o grupo heme, transformando-se em apomioglobina. O grupo heme dissocia-se da protena apenas a pH muito baixo. No entanto, quando este grupo de novo adicionado apomioglobina desnaturada, esta recupera a sua conformao activa. A informao estrutural primria, implcita na apomioglobina, assim suficiente para determinar as estruturas secundria e terciria (Postnikova et al., 1991 e Henry, 1993). Outras molculas que tambm se podem coordenar com o tomo de ferro do heme, so as de monxido de carbono, dixido de carbono, xido ntrico e ies cianeto. A afinidade por estas molculas (com excepo do CO2) bastante maior do que pelo o oxignio, sendo responsvel pela asfixia e envenenamento dos animais. Estudos recentes revelaram tambm a importncia da Mb como moduladora das funes cardacas. Sendo produzida nos cardiomicitos (clulas do msculo cardaco) e nas fibras oxidativas dos msculos esquelticos, estes estudos colocam a Mb como uma hemeprotena multifuncional (Figura 1.6) que participa em diversas funes fisiolgicas, nomeadamente como mediadora do transporte do oxignio, como participante na regulao da biodisponibilidade do xido ntrico nos

INTRODUO

cardiomicitos e sua inactivao e, como j foi referido, como reservatrio de O2 (Garry et al., 2003 e Ordway e Garry, 2004).

Figura 1.6 Possveis funes da Mb. (Adaptado de Garry et al., 2003)

1.1.3 Hemoglobina - Estrutura e Funes

A hemoglobina a principal protena solvel que se encontra presente nos eritrcitos do sangue de diversos organismos (representa cerca de 75% da protena total do sangue), e cuja capacidade de ligao a gases conhecida. responsvel pelo transporte do oxignio, dos pulmes at aos tecidos e parte do dixido de carbono no sentido inverso. A versatilidade da hemoglobina reside na capacidade para se ligar e desligar facilmente ao O2, conforme varie a presso deste gs nos tecidos (Stryer, 1988 e Perutz, 1962). O nome hemoglobina deriva do grego haima (sangue) e do latim globus (bola). As caractersticas viscosas, assim como cor vermelha do sangue, tm sido dos aspectos mais notrios deste fludo desde que o homem existe. A explicao de que a cor vermelha do sangue resultaria da constituio e da conformao tetramrica prpria de cada molcula de hemoglobina, foi adquirindo receptividade ao longo dos anos. Ao combinar-se com o oxignio, esta estrutura metaloproteica adquiria uma cor vermelha mais clara, escurecendo quando passava ao estado desoxigenado. Sequencialmente, foi estabelecido que a organizao qumica e a respectiva ressonncia electrnica, que resulta de numerosas ligaes duplas do anel de protoporfirina (em cada um dos quatro grupos heme de cada molcula de hemoglobina), est na origem daquela colorao e, tambm, da capacidade de fluorescncia das porfirinas numa estreita banda do espectro de luz visvel.

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A molcula de hemoglobina dos vertebrados um tetrmero, constitudo por quatro cadeias polipeptdicas, duas e duas . As cadeias possuem 141 aminocidos e as cadeias 146 aminocidos, sendo muito semelhantes da mioglobina. Cada cadeia polipeptdica contm um grupo heme, ligado covalentemente, e um centro de ligao ao oxignio. As quatro unidades polipeptdicas esto ligadas entre si por ligaes no covalentes, ou seja, ligaes fracas (Stryer, 1988 e Campbell, 1999).

(a) (b) Figura 1.7 (a) Estrutura tridimensional da hemoglobina humana. Esta protena formada por quatro cadeias polipeptdicas, duas cadeias (representadas a amarelo) e duas cadeias (representadas a cinzento). Cada cadeia polipeptdica contm um grupo prosttico heme (representado a vermelho). Estruturalmente, os quatro monmeros ligam-se dispondo dmeros, que formam o tetrmero da hemoglobina. (Adaptado de Lodish et. al, 2004) (b) Imagem tridimensional da ligao distal de uma subunidade da hemoglobina, demonstrando a incorporao do heme na protena.
(http://www.sdsc.edu/IOTW/week26/iotw.html)

Figura 1.9 Arquitectura molecular do tretrmero da hemoglobina.

(http://www.sdsc.edu/IOTW/week26/iotw.html)

O tomo de ferro de cada grupo prosttico heme, est ligado a uma cadeia lateral de histidina (cadeia est ligada a His63 e a cadeia His58), que coloca o grupo heme na ligao central da bolsa do heme, na posio E7. A estrutura tridimensional de alta resoluo da hemoglobina humana e da hemoglobina de cavalo (oxigenada), foi pela primeira vez apresentada por Max F. Perutz e seus colegas, por cristalografia de protenas por difraco de raios-X. Esta descoberta concedeu-lhe o prmio Nobel da Qumica em 1962, juntamente com J.

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C. Kendrew, como j foi anteriormente referido. ainda de salientar que as estruturas tridimensionais da hemoglobina de corao de cavalo e da hemoglobina humana adulta so muito semelhantes (Perutz, 1962). A hemoglobina A, hemoglobina humana principal dos adultos (Hb A), como j foi mencionado, constituda por quatro cadeias polipeptdicas (1, 2, 1, 2). Uma outra hemoglobina dos adultos (cerca de 3-5% da hemoglobina total) a hemoglobina A2, na qual as cadeias so substitudas por cadeias . Assim, a composio da hemoglobina A 2 2 e da hemoglobina A2 2 2 (Alface, 1997). Apenas cerca de 18% dos resduos de aminocidos so idnticos na mioglobina e nas subunidades e da hemoglobina, possuindo no entanto, estruturas tercirias similares (Zubay et al., 1995). As subunidades e da hemoglobina tm o mesmo plano estrutural da mioglobina. Contudo, surgem novas propriedades de profunda importncia biolgica, quando diferentes subunidades se juntam para formar um tetrmero. A hemoglobina portanto, uma molcula muito mais complexa e susceptvel do que a mioglobina. Para executar a sua funo fisiolgica, a hemoglobina deve capturar o oxignio to eficiente quanto possvel, e libert-lo facilmente nos outros tecidos. In vivo, a hemoglobina pode apresentar duas estruturas quaternrias distintas. Uma a estrutura T (Tensa), caracterstica da forma desoxiHb (no ligada), e tem baixa afinidade ao oxignio; a outra a estrutura R (Relaxada), caracterstica da forma oxiHb (4 molculas de oxignio ligadas) e tem alta afinidade ao oxignio. Nos eritrcitos, as hemoglobinas encontram-se num equilbrio das duas formas. A concentrao de formas parcialmente ligadas baixa (Stryer, 1988 e Zubay et al. 1995). As estruturas da hemoglobina em diferentes estados de ligao tm sido intensivamente estudadas, em parte pela sua importncia na medicina e na fisiologia. As comparaes entre as estruturas da oxiHb e da desoxiHb mostram mudanas na estrutura terciria das subunidades individuais e na estrutura quaternria, ou seja, na geometria relativa das subunidades e nas interaces nas interfaces (Stryer, 1988). A Hb pode-se ligar a outros gases para alm do O2. A ligao da Hb ao CO, muito semelhante que ocorre com o O2, mas possui uma estabilidade de ligao de cerca de 200 vezes superior. A dissociao deste gs muito difcil, o que explica a sua toxicidade. A Hb ligada ao CO designada por carboxi-hemoglobina. O anidrido carbnico, pode tambm combinar-se com a Hb, obtendo-se a carboxihemoglobina, mas os grupos heme, no intervm, visto que a fixao de CO2 se d ao nvel dos grupos bsicos da parte proteica da Hb.

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Cerca de 1 a 2% da Hb encontrada no sangue humano so meta-hemoglobinas. Esta forma produto da oxidao do Fe(II) a Fe(III), de forma que o heme oxidado a hematina. A metaHb pode ser obtida de diversas formas, como por exemplo, devido auto-oxidao da oxiHb, consequncia da sua baixa estabilidade em soluo (Lehninger et al., 1993 e Alface, 1997).

1.1.4 Pseudoactividade de Peroxidase da Mioglobina e da Hemoglobina

A Mb e a Hb, sendo hemeprotenas partilham muitas semelhanas qumicas, fsicas e espectroscpicas com os centros activos das peroxidases. Ambas apresentam pseudoactividade de peroxidase, e tm vindo a ser objecto de interesse de vrios investigadores, uma vez que so um bom modelo para o estudo da actividade cataltica de peroxidase de vrias hemeprotenas, pois possuem um tamanho molecular relativamente pequeno quando comparado com a maior parte das protenas, apresentam o mesmo grupo prosttico heme (centro redox e electroactivo da protena), e porque podem reagir in vivo com o H2O2 produzido nas clulas em vrios processos metablicos. No entanto, a Mb tem sido a mais utilizada em estudos de actividade cataltica (Wan et al. 1998, Khan et al., 1998 e Hu, 2001). Em 1900, R. Kobert demonstrou pela primeira vez que a Hb reagia facilmente com o H2O2. Cerca de vinte anos mais tarde, H. Wu (1923) referiu a actividade de peroxidase da Hb. No entanto, a reaco da Mb com o H2O2, apenas foi demonstrada em 1952, atravs do trabalho desenvolvido por P. George e D.H. Irvine. A capacidade da Mb catalisar a oxidao de substratos na presena de perxidos, foi descrita pelo trabalho de D. Keilin e E.F. Hartree em 1955 (Wan et al., 1998). As peroxidases catalisam a oxidao de uma variedade de substratos orgnicos e inorgnicos na presena de hidroperxidos (ROOH), na maioria das vezes H2O2. O mecanismo mais comum para um ciclo cataltico da peroxidase, habitualmente representado pela seguinte sequncia de reaces (Wan et al., 1998 e Dunford, 1998):
E + H2O2 k1 composto I + H2O k2 k3 composto II + AH E + AH composto I + AH2 composto II + AH2

Neste ciclo cataltico, o tomo de Fe(III) presente no heme da peroxidase livre (E), oxidado pelo H2O2, dando origem a um composto intermedirio do tipo radical catio do anel da protoporfirina da protena que contm Fe(IV), designado por composto I. Esta reaco consiste numa oxidao-reduo com dois electres, em que o H2O2 reduzido a H2O e a protena oxidada. Uma oxidao d-se no tomo de Fe originando o composto I intermedirio oxiferril (Fe4+=O). Por sua vez, este
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INTRODUO

composto oxida um substrato orgnico originando um radical (AH). O composto I submetido a uma segunda oxidao (pelo segundo electro) formando-se o composto II, constitudo por um centro oxiferril coordenado com um anel da protoporfirina (dianinico). Finalmente, o composto II, reduzido ao estado frrico inicial com a concomitante oxidao do substrato (com um electro). Aps este ciclo, a protena regenerada sua forma inicial e o mecanismo pode iniciar-se de novo, como esperado num processo cataltico. A carga global da protena estvel e do composto I +1, enquanto que a do composto II neutra (Dawson, 1988, Wan et al., 1998, Witting et al., 2002 e Roncone et al., 2004). O esquema de reaco que estas enzimas seguem, pode ser simplificado da seguinte forma:
Enzima Estvel

Figura 1.9 Esquema de reaco das hemeperoxidases na presena de H2O2 e um substrato orgnico. (Adaptado de Dawson, 1988)

semelhana do ciclo cataltico das peroxidases, tambm na reaco da Mb e da Hb com H2O2, h a formao de um derivado da protena, semelhante ao composto I, que capaz de oxidar uma larga gama de substratos redutores como o fenol e aminas aromticas. A actividade especfica da Mb e da Hb na catlise destas reaces, partida menor do que a da peroxidase e dependente do pH do meio reaccional e/ou do estado de oxidao do tomo de ferro do heme (Wan et al., 1998, Witting et al., 2002 e Gabbianelli et al., 2004). Embora a qumica de coordenao da Mb seja semelhante das peroxidases (His proximal do heme e a His distal), a reaco do perxido de hidrognio com a Mb parece ser cintica e mecanisticamente diferentes. Segundo alguns autores, a reaco da peroxidase com H2O2, envolve clivagem heteroltica da ligao O-O do H2O2, atravs de um mecanismo push-pull, enquanto que o mecanismo de reaco da Mb com o H2O2 muito mais complexo e ainda pouco conhecido (Khan et al., 1998 e Hersleth et al., 2002).

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INTRODUO

A Mb no estado de metamioglobina (metaMb) a forma sob a qual esta protena apresenta comportamento cataltico semelhante ao das peroxidases (Roncone et al., 2004). Este mecanismo cataltico, como j foi referido, continua ser investigado por vrios autores, no entanto Carlsen et al. (2003) apresentaram um esquema semelhante ao das peroxidases e verificaram que este influenciado pelo pH do meio reaccional.
H2O + A

H2O2 MbFe (III)

H+ + HA

H2O

MbFe (IV) = 0 Composto II

MbFe (IV) = 0 Composto I

HA

Figura 1.10

Esquema do ciclo cataltico de peroxidase da Mb, sendo HA um substrato orgnico.

(Adaptado de Carlsen et al., 2003)

Na Figura 1.10, a reaco 1 representa a reaco da MbFe(III), metaMb nativa, com o H2O2 que origina o composto intermedirio MbFe(IV)=0, anlogo ao composto I. uma reaco lenta e independente do pH. A reaco 2, reaco de oxidao do HA pelo MbFe(IV)=0, uma reaco rpida, desta forma a actividade do composto I determinada atravs da reaco 1. Atravs da reaco 3, reaco de oxidao do substrato pelo composto II, (MbFe(IV)=0, pode-se verificar que a actividade cataltica da Mb aumenta com a diminuio do valor de pH. Esta reaco de segunda ordem, a valores de pH elevados e baixos. A protonao do composto (MbFe(IV)=0 evidencia uma forma mais reactiva, em que o anel imidazlico da His distal fica protonado, o que pode facilitar o acesso ao tomo de Fe, alargando a estruturas das pontes de hidrognio (Carlsen et al., 2003 e Khan et al., 1998) . A ligao do substrato protena na zona da bolsa do heme, controlada por alguns resduos aromticos a existentes. Ao comparar as estruturas 3D, obtidas por difraco de raios-X, da Mb e da peroxidase, observaram-se diferenas na disposio destes resduos aminoacdicos. A peroxidase contm dois resduos bastante importantes na bolsa do heme, His e Arg, o que facilita o referido mecanismo push-pull No caso da Mb e da Hb, estas no possuem Arg na zona distal do heme (Tabela 1.1), mas a His distal crucial para as suas propriedades de ligao e tem sido sugerido que participa na formao do radical da protena formado na reaco com H2O2 (Khan et al., 1998, Ozaki et al., 2000 e Roncone et al., 2004).

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Na formao do composto I, pensa-se que a His distal actua como um catalisador cido-base. O facto da His distal estar prximo do Fe do heme facilita a formao do composto I e a reactividade da Mb com o H2O2 consequentemente mais baixa do que a da peroxidase. A estrutura 3D obtida por difraco de raios-X da peroxidase, sugere que a carga positiva conservada na Arg pode tambm ajudar a heterlise do proxido, e estudos de NMR mostraram que a que fenilalanina (Phe) da zona distal est envolvida na ligao aos substratos aromticos (Ozaki et al., 2000). A rede de pontes de hidrognio que envolve estes resduos que delimitam a zona do heme, tambm crucial para a eficincia da actividade de peroxidase e a sua esteroespecificidade (Witting et al., 2002).
Tabela 1.1 Comparao da sequncia distal de algumas hemeprotenas. (Adaptado de Khan et al., 1988) PROTENA Mioglobina Hemoglobin Hemoglobin Peroxidase de rbano-silvestre Citocromo-c peroxidase SEQUNCIA Asp Gln Lys Arg Arg Leu Val Val Leu Leu Lys Lys Lys His Ala Lys Ala Ala Phe Trp His His His His His Gly Gly Gly Asp Thr Ala Lys Lys Cys Ser Thr Lys Lys Asp Gly Val68 Val62 Val67 Cys46 Thr56

A mutao da His distal na Mb tem sido estudada por vrios investigadores semelhana do que j foi realizado para a peroxidase de rbano silvestre e Cyt c, originando uma diminuio da actividade cataltica destas hemeprotenas, o que torna evidente a importncia deste resduo como uma pea chave na catlise destas reaces, uma vez que a remoo deste altera o seu comportamento cataltico (Khan et al., 1998). Alguns autores, tm atribudo a ocorrncia do radical da protena nestas reaces, nos resduos de tirosina (Tyr) nas posies 103 e 146 e/ou de triptofano (Trp) 14. Segundo Witting et al. (2002) a Tyr103 desempenha tambm um papel muito importante na orientao do substrato, assim como influencia a velocidade de degradao do H2O2. A Hb semelhana da Mb, reage com o H2O2 gerando um composto intermedirio altamente reactivo, ferrilhemoglobina, que por sua vez oxida um substrato orgnico. A metaHb (Fe(III)Hb), apresenta tambm maior pseudoactividade de peroxidase, do que a forma Fe(II)Hb (oxiHb ou desoxiHb), o que levou a Gabbianelli et al. (2004) sugerirem que a presena de um substrato orgnico pode inibir a transio do estado R T na metaHb. Estes investigadores verificaram que a permanncia do estado R pode impedir as alteraes estruturais, induzidas pela diminuio de pH, diminuio esta que pode afectar as interaces da molcula de substrato com a zona do heme.

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Existem tambm vrios estudos que descrevem o aumento da pseudoactividade de peroxidase intrnseca destas protenas, atravs de alteraes qumicas do grupo prosttico e de substituies de resduos aminoacdicos da zona do heme atravs de mutagenese convensional e dirigida (Wan et al., 1998, Witting et al., 2002 e Roncone et al., 2004). Redaelli et al. (2002) e Roncone et al. (2004 e 2005) obtiveram variantes de Mb de esperma de baleia T67R, T67K e T67R/S92D que foram mutadas de modo a possurem 2 resduos cruciais no aumento da actividade de peroxidase da Mb, isto , a Arg distal e o Asp proximal. A Arg distal favorece a clivagem heteroltica da ligao O-O da ligao do perxido ao grupo heme, atendendo a que a ltima ligao do hidrognio ao grupo imidazol da His proximal aumenta a sua intensidade como dador ao tomo de Fe do heme. Estas mutaes foram de facto criadas para aumentar a actividade de peroxidase da Mb para substratos fenlicos, sem alteraes perceptveis da estrutura global da protena (Battistuzzi et al., 2007). Segundo Battistuzzi et al. (2007) o par redox Fe3+/Fe2+ do Fe do grupo heme, no parece estar envolvido no mecanismo cataltico da Mb, uma vez que o aumento da actividade de peroxidade da Mb atravs das mutaes T67R, T67K e T67R/S92D exercem uma pequena influncia no potencial de reduo da Mb. No entanto, segundo estes autores, esta reactividade redox do Fe parece estar relacionada com o favorecimento na orientao do substrato no interior da cavidade distal do heme. Outro exemplo destes estudos, foi desenvolvido por Wan et al. (1998), cujo objectivo foi sintetizar um gene codificado de Mb c e utiliz-lo para a produo de Mb nativa em Escherichia coli. Com a disponibilidade deste sistema de produo, foram aplicados vrios ciclos de mutagenese convensional para desenvolver variantes de Mb de modo a melhorar a actividade de peroxidase. Atravs deste processo, foram identificados quatro variantes de Mb que apresentaram cerca de 25 vezes mais actividade de peroxidase e que conservaram as outras propriedades funcionais da protena. Atravs da Figura 1.11, pode-se observar o centro activo da Mb c nativa, e a localizao dos resduos substitudos por Wan et al. (1998).

Figura 1.11 Centro activo da Mb c. Os resduos de His proximal (His 93) e distal (His 64) esto representados por baixo e por cima do plano do heme, respectivamente. (Adaptado de Wan et al., 1998)

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INTRODUO

A compreenso das funes destes aminocidos presentes no centro activo destas protenas, pode levar ao desenvolvimento da engenharia molecular de protenas optimizando a sua actividade cataltica, tornando-as competitivas para aplicaes comerciais (Witting et al., 2002). As peroxidases hemticas constituem uma das classes de enzimas mais estudadas, uma vez que a sua estrutura, funo e propriedades cinticas, possibilitam inmeras aplicaes (utilizao como sondas enzimticas para antignios, anticorpos e oligonucletidos e em outros reagentes biolgicos, como por exemplo, em ensaios de diagnstico clnicos e bioqumicos). Podem ser tambm utilizadas no tratamento de efluentes, lamas e solos contaminados com compostos fenlicos, aminas aromticas, compostos orgnicos clorados e metais pesados, onde estas enzimas podem actuar, na presena do H2O2, convertendo estes compostos em outros menos txicos ou noutra forma molecular mais facilmente removvel. No entanto, o elevado custo e a disponibilidade limitada destas enzimas dificultam a sua utilizao em bioremediao (Sinclair et al., 1996 e Witting et al., 2002). Por estas razes, a produo de peroxidases recombinantes funcionais e a concepo de novas peroxidases optimizadas so objectivos a atingir por vrios investigadores. As semelhanas da zona do heme da Mb e da Hb, partilhadas com outras hemeprotenas, como as peroxidases e o Cyt c, impulsionam a sua utilizao na engenharia de novas metaloprotenas e na sua mutao de modo a promover a aumento da sua actividade cataltica (Roncone et al., 2004). Devido s suas propriedades catalticas a Mb e a Hb, podem ser utilizadas como protenas mimetizadoras das peroxidases. Esta propriedade cataltica faz com que sejam usadas na deteco de H2O2 em alimentos (carne e peixe), produtos farmacuticos, em ensaios clnicos e kits de diagnstico na deteco de sangue em fluidos biolgicos e como bioelementos para o reconhecimento de substncias txicas (xido ntrico e cido tricloroactico) em biossensores. Esta capacidade parece ser tambm bastante importante na degradao oxidativa dos compostos lipdicos em sistemas biolgicos e em alimentos (Hu, 2001, Kristinsson, 2002, Roncone et al., 2004 e Zhou et al., 2005). A Hb apresenta propriedades peroxidativas (actividade de remoo do H2O2) o que pode ser bastante importante para o tempo de vida celular. A actividade de peroxidase das duas subunidades da Hb ( e ) menor do que o a do tetrmero intacto, e a oxidao do heme foi detectada em como est relacionada com a diminuio da sua actividade (Gabbianelli et al., 1998, Fedeli et al., 2001 e Gabbianelli et al., 2004). A actividade cataltica intrnseca destas protenas, tambm bastante importante in vivo. Por exemplo, os substratos fenlicos podem ser eficientemente nitrados nos

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INTRODUO

anis aromticos, atravs da reaco cataltica de peroxidase na presena de H2O2; esta reaco bastante importante in vivo, devido nitrao da tirosina (Tyr) que origina 3-nitrotirosina. Este composto est associado a uma vasta gama de doenas, uma vez que o nitrito o produto principal do metabolismo do monxido de azoto (Roncone et al., 2004). O facto destas protenas poderem reagir in vivo com o H2O2, gerado nas clulas em vrios processo metablicos, pode produzir formas de valncia superiores s das protenas, que esto relacionados com vrios processos patolgicos (Khan et al., 1998). O H2O2 um composto reactivo envolvido na propagao de leses celulares durante vrios estados patolgicos. A concentrao de H2O2 no plasma normal humano 4 a 5 M, que aumenta sob condies inflamatrias, e a sua toxicidade aumenta tambm com a presena de Hb. Esta potencial toxicidade est associada reaco da hemoglobina com o H2O2, que pode ser encontrada nos glbulos vermelhos e no meio extracelular quando a hemoglobina libertada dos glbulos vermelhos deteriorados. A reaco do H2O2 com a Fe(II)Hb e com Fe(III)Hb resulta na formao de ferrilHb e oxoferrilhemoglobina (oxoferrilHb), respectivamente. Estes compostos radicais da protena so oxidantes muito fortes, considerados responsveis pela danificao de clulas e tecidos (Nagababu e Rifkind, 2000). Assim, esta reaco bastante importante, uma vez que interfere no tempo de vida dos glbulos vermelhos, na medida em que estes esto constantemente expostos a espcies reactivas de oxignio, que provocam leses e o envelhecimento dos eritrcitos (Gabbianelli et al., 2004). Outro exemplo da importncia desta reaco consiste no facto de que o composto radical da protena formado na reaco da Mb com o H2O2, parece ser a chave determinante nas leses provenientes da isquemia cardaca (Roncone et al., 2004). A presena de Mb no sistema circulatrio pode provocar leses no msculo cardaco, que por sua vez podem induzir a enfarte do miocrdio. Esta situao pode ser facilmente atingida, uma vez que mesmo uma pequena leso nas clulas musculares resulta numa substancial e rpido aumento da concentrao da Mb no plasma sanguneo (Zheng, et al., 2005). Devido ao papel fundamental que estas protenas desempenham na vida animal, a sua deteco de extrema importncia, levando investigao e evoluo de vrios mtodos. Recentemente, Zheng, et al. (2005) desenvolveram um mtodo espectrofotomtrico baseado na actividade de peroxidase da Mb na oxidao de o-fenilenodiamina (OPDA) na presena de H2O2. Assim, naturalmente estas hemeprotenas continuam a ser intensivamente alvo de inmeros estudos por parte de vrios investigadores.

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INTRODUO

1.2

CALIXARENOS BREVE DESCRIO E SUAS APLICAES

Os calixarenos so macromolculas que constituem uma classe de oligmeros cclicos sintticos, compostos por unidades fenlicas unidas por pontes de metileno. Possuem cavidades intramoleculares em forma de cesto, que possibilitam o desenvolvimento de interaces com espcies moleculares, inicas e macromolculas, podendo formar complexos de incluso (Gutsche, 1995, McMahon et al., 2003 e Barata, 2004).
R2 R R3

R1

coroa inferior

O R4

n O O O R' R6 R5

Figura 1.12 Estrutura geral dos calix[n]arenos.

A nomenclatura sistemtica destes compostos vulgarmente designada pelo termo calix[n]arenos com a indicao dos respectivos substituintes, onde n indica o nmero de unidades arlicas (eg. p-tert-butilcalix[4]areno designa o composto 5,11,17,23-tetra-tert-butil-25,26,27,28-tetrahidroxicalix[4]areno) (Barata, 2004). Estes compostos tiveram origem no final do sculo XIX com Adolf von Baeyer, mas apenas foram identificados h cerca de 50 anos, por Alois Zinke e seus colaboradores. David Gutsche, nos anos 70, chamou a estes compostos calixarenos, uma vez que se assemelham a um tipo de vaso grego designado por calix crater. Gutsche demonstrou que, com um controlo adequado das condies reaccionais, era possvel a obteno de compostos puros com diferentes tamanhos de anis e com um bom rendimento. A metodologia sinttica mais utilizada na obteno de calix[n]arenos, consiste na condensao de fenis p-substitudos com formaldedo em meio bsico. Das suas propriedades fsicas as que mais se destacam so os elevados pontos de fuso, a insolubilidade em gua e a solubilidade em apenas alguns solventes orgnicos, assim como a extrema acidez. O seu comportamento conformacional, sem dvida a propriedade esterioqumica mais estudada, uma vez que cada calix[n]areno possui vrios ismeros conformacionais (Gutsche, 1995 e Barata, 2004). A estrutura dos calixarenos permite que estes compostos possam sofrer vrios tipos de reaces, como a funcionalizao das coroas superior e inferior, tornando-as
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INTRODUO

teis plataformas moleculares para a obteno de derivados com diversas funcionalidades adequadas a uma aplicao particular (McMahon et al., 2003 e Barata, 2004). Por exemplo, a introduo de determinados grupos funcionais nas suas coroas, aliada variedade de tamanhos e arquitectura das suas cavidades, permite a estes compostos a incluso de uma molcula hspede ou a criao de afinidade especfica com uma molcula alvo (Oshima et al., 2002). Estas propriedades como hospedeiro tm sido exploradas em diversos contextos, desde a catlise ao reconhecimento molecular. A sntese de materiais polimricos, lineares e entrecruzados, associados a unidades de calixarenos uma das reas de crescente interesse na qumica destes compostos. Assim, das vrias linhas de investigao e respectivas aplicaes destes compostos, podem-se destacar (Gutsche, 1995, Oshima, 2002, Barata, 2004 e Ludwing, 2005):

sntese e caracterizao de calix[n]arenos possuindo funcionalidades diversas na sua coroa inferior e superior (destacando-se n=4,6,8); utilizao como catalisadores de transferncia de fase; extraco de diversos poluentes presentes em matrizes aquosas (eg. compostos fenlicos e compostos agroqumicos); estudos de capacidade e selectividade extractiva de metais pesados e de transio, presentes em matrizes aquosas; suportes polimricos associados a unidades de calixarenos, com diversas aplicabilidades: membranas para sensores de espcies qumicas e bioqumicas, substratos para a construo de membranas selectivas de transporte de ies, fase estacionria em cromatografia (eg. resina de troca inica), adsorventes em qumica analtica; monitorizao biomdica (eg. inibidores de vrus); extraco de nucletidos). biomolculas (eg. protenas e enzimas, aminocidos,

Desta forma, os calixarenos so tambm compostos muito atractivos para aplicaes industriais. Com efeito, nos dias de hoje existem mais de 300 patentes registadas descrevendo aplicaes de molculas baseadas nestes compostos.

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INTRODUO

1.3

EXTRACO LQUIDO-LQUIDO

1.3.1 Tcnicas Utilizadas na Separao de Biomolculas Os processos de separao em biotecnologia so definidos consoante a natureza do produto e das suas aplicaes. A extraco lquido-lquido uma tcnica utilizada para separar substncias activas aps remoo dos constituintes celulares. Nestes processos ocorre transferncia entre duas fases lquidas imiscveis atravs de uma interface. A fase aquosa que contm o bioproduto misturada com o solvente extractante at que se atinja o equilbrio. A velocidade de transferncia de massa entre as duas fases depende das propriedades fsicas destas, da sua concentrao, da rea da interface e do grau de agitao. A extraco lquido-lquido um mtodo de separao muito verstil com uma vasta aplicao em vrias reas, das quais se destacam o sistema de partio bifsica aquosa (ATPS), o sistema de partio por afinidade e o sistema de micelas invertidas. O sistema de partio bifsica aquosa um dos processos mais utilizados na separao e purificao de biomolculas, que se baseia na capacidade exibida por solues de dois polmeros hidrfilos (ou de um polmero e de um sal), de se separarem em duas fases aquosas sempre que certas concentraes mnimas sejam excedidas. As duas fases aquosas assim formadas, diferem na sua composio sendo cada uma delas rica num dos constituintes do sistema, isto , os dois polmeros (ou o polmero e o sal) concentram-se em fases distintas. Estas fases apresentam teores em gua habitualmente superiores a 80%, podendo em alguns casos atingir valores superiores a 95%. Por este facto, os sistemas bifsicos aquosos apresentam ambientes suaves para molculas e para partculas biolgicas. Podem tambm ser utilizados numa vasta gama de separaes, podendo algumas delas serem executadas em apenas alguns segundos e envolvem tenses interfaciais bastante reduzidas. Na separao de protenas, os sistemas de duas fases aquosas mais utilizados so formados por dois polmeros, polietilenoglicol (PEG)/dextrano e PEG/fosfato de potssio. Estes ltimos constituem uma alternativa particularmente interessante para operaes escala piloto ou industrial, j que o sal mais barato do que o dextrano purificado. No entanto, esta tcnica de separao habitualmente utilizada apenas como passo inicial de purificao, na extraco de contaminantes, sendo aplicadas tcnicas de alta resoluo nos passos de purificao seguintes (Walter e Johansson, 1986, Huddleston et al., 1991 e Kubek, 1994). A partio de um produto num sistema de duas fases aquosas descrita atravs do coeficiente de partio (K), que determinado pela razo entre as concentraes do bioprotudo nas fases superior e inferior. Relativamente s propriedades do bioproduto a separar, que interferem na partio, podem destacar-se: o seu tamanho

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INTRODUO

ou rea superficial, a carga, hidrofobicidade, conformao, quiralidade e a presena de receptores para ligandos bioespecficos. O facto da partio depender de um elevado nmero de factores, na sua maioria independentes, torna externamente difcil a previso terica do coeficiente de partio de um determinado bioproduto, exigindo um trabalho experimental exaustivo (Aires-Barros e Cabral, 2003). Outro mtodo que pode ser utilizado de modo a aumentar a selectividade da extraco lquido-lquido aplicado a bioprodutos a utilizao de um sistema de partio por afinidade. Este sistema consiste numa extraco selectiva por afinidade aplicada essencialmente a sistemas PEG/dextrano, onde ligado um inibidor ao PEG e a protena extrada selectivamente para a fase superior do sistema. A partio por afinidade apresenta certas vantagens, como o aumento da capacidade de ligao do ligando, estabilizao dos bioprodutos pelos polmeros, ausncia de adsoro no-especfica e a recuperao quantitativa e reutilizao do polmeroligando (Hustedt et al., 1985 e Aires-Barros e Cabral, 2003). Os sistemas clssicos de extraco lquido-lquido que utilizam soluo aquosa e solventes orgnicos no so habitualmente os mais adequados para separar biomolculas, como as protenas, devido sua baixa estabilidade em solventes orgnicos. No entanto, nas ltimas dcadas tem-se estudado e desenvolvido sistemas, que desempenham um papel importante e estratgico nestes processos de separao. Desde os anos 80, que se estuda a separao, purificao e recuperao de protenas por extraco lquido-lquido, atravs de micelas invertidas (Ono e Goto, 1998 e Oshima et al., 2005). Os sistemas de micelas invertidas constituem casos particulares de microemulses, em que a fase aquosa no macroscopicamente distinguvel da fase orgnica (fase contnua). Estes sistemas reaccionais consistem em casos particulares de microemulses, formadas por agregados de molculas de agentes tensioactivos na presena de solventes apolares e de pequenas quantidades de gua. As molculas dos tensioactivos so compostas por uma cauda apolar (hidrfoba) e um grupo polar (hidrfilo), agrupando-se de modo a que as caudas hidrfobas fiquem em contacto com o solvente apolar e os grupos polares fiquem na direco do interior do agregado, formando um ncleo interior aquoso. Assim, estes sistemas permitem a solubilizao de biocatalisadores no ncleo aquoso e a partio de substratos e/ou produtos entre o ncleo aquoso e o solvente orgnico, dependendo da sua hidrofobicidade (Aires-Barros, 2002). Nestes processos a protena transferida de uma soluo aquosa para o ncleo interior aquoso das micelas invertidas, atravs das interaces entre o agente tensioactivo (ou surfactante) e a protena. Na maioria dos casos a extraco da

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INTRODUO

protena ocorre atravs das interaces electrostticas entre as cabeas polares carregadas do surfactante e os grupos com carga oposta das protenas. As interaces hidrofbicas podem ser o factor dominante. At aos dias de hoje, existem vrios estudos e publicaes sobre a extraco de diversas protenas utilizando diferentes tcnicas de micelas invertidas. No entanto, um dos problemas deste sistema o baixo factor de separao, j que a protena transferida para as micelas invertidas apenas atravs de simples interaces electrostticas, o que torna a separao de uma mistura de protenas com peso molecular e ponto isoelctrico semelhantes, bastante difcil. Alguns investigadores, j conseguiram extrair selectivamente protenas atravs destes sistemas, modificando quimicamente e incorporando um ligando com afinidade protena alvo, distinguindo-a deste modo, das protenas contaminantes (Ono e Goto, 1998 e Oshima et al., 2005).

1.3.2 Separao e Purificao de Protenas com Calixarenos

Como, j foi referido os calix[n]arenos tm sido extensivamente estudados como plataformas de construo de novos compostos hospedeiros, adquirindo funes especficas. No entanto, o desenvolvimento de derivados destes compostos como ferramentas de reconhecimento ou de modificao de biopolmeros continua, um pouco limitado devido ao facto da sua estrutura macrocclica ser difcil de se correlacionar com as grandes estruturas moleculares dos biopolmeros. Recentemente, a aplicao de calix[n]arenos como ferramenta de reconhecimento de biomacromoleculas, como as protenas, tornou-se uma rea de estudo de crescente interesse e importncia (Ludwig, 2005 e Perret et al., 2006). Oshima, Goto e Furusaki (2002), verificaram pela primeira vez, que o cido carboxlico derivado do p-tert-octilcalix[6]areno (Figura 1.13) apresentava uma elevada capacidade de extraco de protenas.

O O

3 O O

O O HO OH HO OH

Figura 1.13 Estrutura do cido carboxlico derivado do p-tert-octilcalix[6]areno.

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INTRODUO

Esta equipa testou calix[4,6,8]arenos e verificou que as cavidades largas dos cidos carboxlicos derivados do p-tert-octilcalix[6]areno (tOct[6]CH2COOH) e do p-tertoctilcalix[8]areno (tOct[8]CH2COOH), demonstraram uma capacidade de extraco elevada e semelhante entre si. No entanto, a simetria dos grupos carboxlicos ordenados do tOct[6]CH2COOH esterioquimicamente favorvel, assegurando uma forte interaco com grupos amino protonados (NH3+). Deste modo, espera-se que este composto hospedeiro tenha vastas aplicaes como ferramenta para o reconhecimento de vrias biomolculas que suportam grupos amino (Oshima et al., 2002). Evidenciaram que o tOct[6]CH2COOH apresenta uma elevada capacidade de extraco de protenas que possuem um nmero considervel de resduos de lisina. Para tal, utilizaram Citocromo c (protena catinica) em soluo aquosa, cujos grupos amino protonados sua superfcie interactuam com as molculas de t Oct[6]CH2COOH (dissolvido em solvente orgnico), formando um complexo entre as molculas do cido carboxlico derivado do calix[6]areno e os grupo RNH3+ dos resduos catinicos. A complexao compensa as propriedades inicas da superfcie do Cyt c e proporciona uma hidrofobicidade suficiente para que a protena seja transferida para a fase orgnica, resultando na sua extraco. Assim, uma vez que a extraco baseada na complexao entre o calix[6]areno e os grupos amino protonados, o tOct[6]CH2COOH revela selectividade pelas protenas ricas em resduos de Lys sua superfcie (Oshima et al., 2002 e Oshima et al., 2005). Os trs resduos aminoacdicos catinicos presentes na superfcie desta protena, Arg, Lys e His, podem participar nas interaces electrostticas formadas com o calix[6]areno. No entanto, Oshima et al. verificaram ainda, que o tOct[6]CH2COOH demonstra uma extraco selectiva para as protenas ricas em Lys, uma vez que conseguiram transferir para a fase orgnica apenas Cyt c, que se encontrava numa mistura de Cyt c e lisozima. Esta selectividade baseada no nmero de molculas de calix[6]areno que complexa com os grupos amino da superfcie das protenas. O Cyt c e a lisozima so protenas com peso molecular e pontos isolectricos (pI) muito semelhantes, mas diferem no nmero de resduos de Lys, j que o Cyt c tem 19 resduos de Lys e a lisozima apenas 6, e no nmero de resduos de Arg, 2 e 11, respectivamente. Com base nestes resultados, a extraco do Cyt c com tOct[6]CH2COOH, pode ser expressa atravs da seguinte equao: nH6R + (-NH3+)n-protena = (H5RNH3+)n-protena + nH+ (n<20)

em que, H6R e (-NH3+)n-protena, representam o tOct[6]CH2COOH e o Cyt c respectivamente.

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INTRODUO

Atravs da Fig. 1.14, pode-se observar esquematicamente, como se processa a extraco das protenas por este mtodo.
Protena rica em LYS

(1)

NH3+

(2)

NH3+

NH3+

Protena rica em LYS

Protena pobre em LYS

Protena pobre em LYS

Protena rica em LYS

Figura 1.14 Ilustrao geral da separao de protenas utilizando o cido carboxlico derivado do p-tert-octilcalix[6]areno. (Adaptado de Oshima et al., 2005)

Ainda pela figura anterior, pode-se verificar na etapa (2), que aps a extraco com o t Oct[6]CH2COOH, Oshima et al. (2002 e 2005) avanaram na recuperao do Cyt c para uma nova soluo aquosa cida (pH inferior a 2) contendo petan-1-ol. Estudos mais recentes, Shimojo et al. (2007) demonstraram que introduzindo um solvente orgnico polar (butan-1-ol; Log P =0,88) na fase aquosa reduz a interaco entre a o t Oct[6]CH2COOH e o Cyt c, promovendo uma maior recuperao da protena, da fase orgnica para a fase aquosa fresca. Estes investigadores obtiveram uma recuperao significativa com solues aquosas extractantes cidas (pH <2,5) com 30% (v/v%) de butan-1-ol. Alguns destes mesmos investigadores estudaram tambm a extraco de aminocidos com vrios calixarenos, em solventes orgnicos alifticos. Demonstraram que o tOct[6]CH2COOH foi o calix[n]areno com maior capacidade de extraco para os aminocidos, e que a extraco devida s interaces electrostticas que ocorrem entre os grupos amino do aminocido e os tomos de oxignio do calixareno. Posteriormente verificaram tambm que os factores que influenciam estas extraces parecem ser a estrutura cclica e o tamanho da cavidade interior destas biomolculas, assim como os grupos funcionais carboxlicos e o tamanho das cadeias alquil. A hidrofobicidade e as propriedades inicas das molculas hspedes tambm afectam a eficincia da extraco (Nakashima et al., 2002 e Oshima et al., 2004). O recente aparecimento de novos suportes polimricos associados a unidades de calixarenos rene as vantagens e caractersticas que cada monmero introduz no polmero final. De certa forma parece que a insero de calixarenos num sistema macromolecular como uma cadeia polimrica potencia as propriedades intrnsecas do macrociclo. A sntese destes calixarenos covalentemente ligados a suportes polimricos tem recebido grande ateno, devido ao seu contributo para o desenvolvimento de vrios mtodos analticos e de separao (Barata, 2004).
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INTRODUO

Com base neste conceito, no decorrer do presente trabalho foi utilizado um polmero contento unidades de calix[6]areno (Resina PC6) nos mtodos de purificao da Hb A. A PC6 utilizada, foi sintetizada a partir de unidades monomricas do derivado cido de p-tert-butilcalix[6]areno ligadas directamente a resinas do tipo Merrifield, atravs da sua coroa inferior, de modo a que a cavidade hidrofbica do macrociclo esteja mais disponvel para interaces com espcies moleculares (Barata, 2004). A estrutura do p-tert-butilcalix[6]areno, assemelha-se a um cone truncado, com seis grupos OH fenlicos de um mesmo lado, interagindo atravs de ligaes de hidrognio intramoleculares. Quando ocorre a desprotonao do p-tertbutilcalix[6]areno, o fenolato estabilizado por ligaes de hidrognio, o que estabiliza o anio e aumenta as constantes de acidez, tornado-o cerca de 106 vezes mais cido que os fenis correspondente. Esta propriedade permite a todos os calixarenos actuarem como cidos de Brnsted em relao a aminas (Nachtigall et al., 2004). As resinas do tipo Merrifield, so resinas comerciais caracterizadas quimicamente como poliestirenoclorometilado/divinilbenzeno. So constitudas por dois monmeros altamente hidrofbicos, divinilbenzeno que responsvel pelo entrecruzamento e estireno como componente polimrico principal.

Cl

Cl

CH2Cl

Cl

Cl

Cl n

Figura 1.15 Estrutura molecular tipo de uma resina Merrifield e respectiva simbologia. (Adaptado de Barata, 2004)

A resina PC6 possui propriedades extractivas comprovadas, apresentando como principal vantagem a sua capacidade de regenerao e reutilizao, resultante da sua estrutura entrecruzada.

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INTRODUO

1.4

BIOCATLISE EM SOLVENTES ORGNICOS

Oshima e seus colaboradores (2002) verificaram que a molcula de Cyt c complexada com o tOct[6]CH2COOH e solubilizada em clorofrmio, mantinha actividade enzimtica de peroxidase. Nas ltimas dcadas, observou-se que a utilizao exclusiva de gua como solvente de meios de biotransformao restringia a gama de aplicaes da biocatlise, bem como limitava a produtividade de diversos processos, nomeadamente os que envolviam substratos hidrfobos. No entanto, a constatao de que muitas enzimas operam in vivo em ambientes ricos em lpidos hidrfobos, permitiu concluir que estes meios predominantemente no-aquosos so igualmente adequados expresso de actividade biocataltica. A convergncia destes dois aspectos levou introduo no meio reaccional, de solventes orgnicos, fluidos supercrticos, fases gasosas ou fases slidas, os quais se atribuiu a designao de meios no-convencionais (AiresBarros, 2002). Os meios no-convencionais para biocatlise podem ser solventes orgnicos, fluidos supercrticos, sistemas de fases slidas, lquidas e gasosas sem solventes orgnicos, e mais recentemente fluidos inicos. Os solventes orgnicos so os meios no-convencionais mais utilizados na biocatlise. A utilizao destes solventes em biocatlise apresenta diversas vantagens, quando comparados com os sistemas aquosos convencionais. Destas vantagens podem-se destacar: a solubilizao de compostos no-polares (substratos e produtos), a reduo de efeitos inibitrios/txicos de substratos e/ou produtos, o deslocamento do equilbrio qumico a favor da sntese em detrimento da hidrlise (eg. sntese de steres, pptidos e lactonas), o deslocamento do equilbrio da reaco atravs do controlo da actividade da gua (eg. hidrlise de anidridos de cidos e polimerizao de quinonas), a possibilidade destas reaces ocorrerem a temperaturas muito mais elevadas, a fcil recuperao do produto a partir de solventes de baixo ponto de ebulio, a reduo da inibio pelo substrato e/ou produto e a eliminao de contaminaes microbianas. Quanto s principais desvantagens associadas utilizao de solventes orgnicos, podem-se salientar: toxicidade do solvente orgnico para as enzimas, o aumento das limitaes difusionais transferncia de massa de substratos e/ou produtos e necessidade de instalaes apropriadas para o manuseamento e para a recuperao de solventes (Zaks e Klibanov, 1985, Carrea e Riva, 2000 e AiresBarros, 2002).

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INTRODUO

1.4.1 Seleco do Solvente Orgnico

A seleco do solvente orgnico mais adequado a um determinado sistema biocataltico deve obedecer a determinados critrios fsico-qumicos, de segurana, logsticos, econmicos e biolgicos. Relativamente aos critrios fsico-qumicos, os factores mais importantes so a capacidade de extraco (coeficiente de partio) e solubilizao de substratos e/ou produtos pelo solvente orgnico. O solvente deve ser qumica e termicamente estvel, no deve formar emulses em meio aquoso, deve apresentar uma viscosidade reduzida e no pode ser degradado pelo biocatalisador. Em termos de segurana, no deve ser inflamvel nem deve apresentar toxicidade ambiental nem ser prejudicial para a sade. Do ponto de vista logstico, a sua disponibilidade deve ser elevada e a sua reciclagem deve ser vivel. Quanto ao aspecto econmico, o seu custo deve ser o mais baixo possvel. O critrio biolgico, o aspecto mais restritivo, uma vez que engloba a toxicidade do solvente orgnico para o biocatalisador. A toxicidade do solvente orgnico para o biocatalisador pode ser atribuda a dois processos: toxicidade molecular e a toxicidade de fase. A toxicidade molecular devida presena de solvente orgnico dissolvido na fase aquosa, pode causar inibio enzimtica, desnaturao de protenas e alterao do DNA. O mtodo mais usual para a previso da toxicidade molecular de um solvente orgnico, atravs do logaritmo de coeficiente de partio do solvente tendo como referncia um sistema de duas fases de octanol/gua (Log P = [Soluto]octanol/[Soluto]gua). O Log P designado por parmetro de Hansch, e estabelece uma correlao directa entre a actividade e a hidrofobicidade dos solventes. O valor de Log P de um determinado solvente pode ser determinado experimentalmente ou calculado pelo mtodo das constantes hidrfobas fragmentadas de Rekker. Laane et al., estabeleceram uma correlao directa entre a actividade cataltica e a hidrofobicidade dos solventes, traduzida por uma curva sigmoidal (Fig. 1.16) (Vermu e Tramper, 1995, Adlercreutz, 2000, Carrea e Riva, 2000 e Aires-Barros, 2002).
Actividade cataltica (u.a.) 100 80 60 40 20 0 0 2 4 Log P 6 8 10

Figura 1.16 Actividade cataltica (u.a. unidades arbitrrias) em funo de Log P.

(Adaptado de Vermu e Tramper, 1995)

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INTRODUO

Na tabela seguinte apresentam-se os valores de Log P, para os solventes orgnicos mais utilizados.
Tabela 1.2 Valores de Log P dos solventes orgnicos mais comuns. (Adaptado de Laane SOLVENTE Dimetil sulfxido (DMSO) Dioxano N, N dimetilformamida (DMF) Metanol Acetonitrilo Etanol Acetona Acetato de metilo Propanol Tetrahidrofurano (THF) Acetato de etilo Butanol ter dietlico Diclorometano Hexanona Pentanol Fenol Acetato de butilo Hexanol Log P -1,30 -1,10 -1,00 -0,76 -0,33 -0,24 -0,23 0,16 0,28 0,49 0,68 0,80 0,85 0,93 1,30 1,30 1,50 1,70 1,80 SOLVENTE cido benzico ter dipropilco Clorofrmio Benzeno Heptanol Tolueno ter dibutlico Tetracloreto de metano Pentano Xileno Ciclohexano Hexano Octano Ftalato de dibutilo Dodecanol Dodecano Tetradecano Hexadecano Ftalato de dioctilo
et al., 1987)

Log P 1,90 1,90 2,00 2,00 2,40 2,50 2,90 3,00 3,00 3,10 3,20 3,50 4,50 5,00 5,00 6,60 7,60 8,80 9,60

Solventes cujo Log P inferior a 2 so considerados txicos, havendo distoro da camada de gua ou camada de hidratao que permanece volta do biocatalisador. Os solventes que apresentam valores de Log P superiores a 4 so considerados biocompatveis, mantendo-se a camada de hidratao do biocatalisador intacta. Para valores de Log P entre 2 e 4, os resultados so um pouco imprevisveis. Quanto toxicidade de fase, esta est associada ao contacto directo entre o biocatalisador e o solvente orgnico. Esta aco txica mais notria com solventes orgnicos hidrfobos, devido sua baixa partio para o filme aquoso que rodeia o biocatalisador. Este factor faz com que a possibilidade de se atingir um valor de concentrao crtica do solvente na membrana celular, a partir da qual observada esta aco txica, seja reduzida. Este tipo de toxicidade pode ser minimizada utilizando uma rea interfacial menor, uma agitao mais suave ou diminuindo a razo volumtrica das fases orgnica/aquosa, de forma a reduzir os fenmenos de emulso e agregao. A imobilizao do biocatalisador e o design de biocatalisadores mais resistentes a
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solventes orgnicos, so tambm boas possibilidades para a reduo da toxicidade de fase (Adlercreutz, 2000 e Aires-Barros, 2002). Foi ento j comprovado, que a actividade das enzimas baixa em solventes relativamente hidrfilos, ou seja, solventes com Log P < 2, moderada em solventes com 2 < Log P < 4, e elevada em solventes relativamente hidrfobos, cujo Log P > 4 (Gao et al., 2005).

1.4.2 Sistemas de Biocatalisadores que Utilizam Solventes Orgnicos

Os sistemas de biocatlise com solventes orgnicos podem ser classificados consoante a natureza da mistura: (I) mistura homognea de meio aquoso e solventes orgnicos miscveis com gua; (II) mistura de duas fases lquidas orgnico-aquosas; (III) biocatalisadores dissolvidos em solventes orgnicos: micelas invertidas e enzimas modificadas covalentemente; (IV) biocatalisadores ressuspensos em solventes orgnicos com baixos teores de gua: enzimas liofilizadas ou biocalisadores imobilizados na ausncia de fase aquosa (Vermu e Tramper, 1995, Carrea e Riva, 2000 e Aires-Barros, 2002).
(a)
B B B B B B B B

(b)

(e)

(f)

(c)

(d)

(g)

(h)

Fase orgnica Fase aquosa

Biocatalisador imobilizado

B Biocatalisador solvel

Figura 1.17 Sistemas biocatalticos englobando solventes orgnicos: (a) sistemas de duas fases lquidas orgnico-aquosas; (b) sistemas de duas fases lquidas orgnico-aquosas; (c) e (d) biocatalisador imobilizado num suporte poroso, num sistema bifsico; (e) biocatalisador microencapsulado numa micela invertida; (f) biocatalisador modificado com PEG e dissolvido em meio orgnico; (g) biocatalisador imobilizado e ressuspenso em meio orgnico; (h) biocatalisador liofilizado ou na forma de cristais, ressuspenso em meio orgnico. (Adaptado de Aires-Barros, 2002)

O sistema que engloba uma mistura homognea de meio aquoso e solventes orgnicos miscveis com gua (I), consiste na adio de um solvente como o

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metanol, etanol ou DMF ao meio reaccional, de modo a aumentar a solubilidade de um substrato hidrfobo em meio aquoso. No entanto, a polaridade elevada destes solventes, cujos valores de Log P so inferiores a 2, atribui toxicidade para o biocatalisador, aumentando este efeito com o aumento da concentrao de solvente. O sistema de duas fases lquidas orgnico-aquosas (II), consiste num sistema bifsico com o biocatalisador e os compostos hidrfilos presentes na fase aquosa e os substratos e os produtos hidrfobos na fase orgnica (Figura 1.17 (a), (b), (c) e (d)). Tem como objectivo a melhoria da estabilidade do biocatalisador utilizando um solvente imiscvel com a gua, ou seja, um solvente com Log P superior a 4. Neste tipo de sistema necessrio garantir que a rea interfacial seja elevada, de modo a facilitar a transferncia de massa de substratos/produtos atravs da interface lquidolquido ou lquido-slido (no caso dos biocatalisadores imobilizados), atravs do controlo da velocidade de agitao e da razo volumtrica das fases aquosa e orgnica. Quanto aos sistemas que utilizam biocatalisadores dissolvidos em solventes orgnicos (III), so casos particulares dos sistemas bifsicos, em que apenas se observa macroscopicamente uma nica fase. Como exemplo destacam-se sistemas, so os sistemas de micelas invertidas (vide 1.3.1 e Figura 1.17 (e)) e a solubilizao dos biocatalisadores em solventes orgnicos modificados covalentemente atravs da adio de PEG (Figura 1.17 (f)). Por ltimo, os sistemas de biocatalisadores ressuspensos em solventes orgnicos (D) utilizam meios de reaco quase anidros, implicando a imobilizao das enzimas num suporte slido inerte ou a sua utilizao na forma liofilizada ou em cristais (Figura 1.17 (g) e (h)). Nestes sistemas a escolha do solvente um aspecto muito importante, uma vez que se estabelece uma competio entre o solvente e o biocatalisador para as molculas de gua. A utilizao de solventes hidrfilos pode levar remoo da camada de hidratao da molcula do biocatalisador, originando alteraes estruturais que podem provocar perda de actividade cataltica (Vermu e Tramper, 1995, Adlercreutz, 2000 e Aires-Barros, 2002).

1.4.3 Propriedades dos Biocatalisadores em Solventes Orgnicos A compreenso dos factores que afectam as propriedades dos biocatalisadores em solventes orgnicos, nomeadamente a actividade enzimtica, estabilidade, estrutura e selectividade, encontra-se hoje em dia quase comparvel com o nvel de conhecimento da biocatlise em meio aquoso.

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A actividade enzimtica em meio orgnico influenciada por diversos factores, como a actividade da gua, solvatao do substrato/produto, o pH, a forma da enzima e a natureza do solvente. A actividade enzimtica mais elevada em solventes hidrfobos do que em solventes hidrfilos. Como j foi referido, Laane et al. (1987) estabeleceu uma correlao directa entre a actividade e a hidrofobicidade dos solventes, expressa por Log P. Estes autores atribuem estes resultados s diferenas de capacidade que os solventes apresentam para deformar a camada de gua (camada de hidratao) que permanece volta do biocatalisador. Efectivamente o efeito do solvente orgnico numa enzima est relacionado com a interaco da camada de hidratao que se mantm ligada a esta. Mesmo num meio no-convencional essencialmente formado por uma fase orgnica, a quantidade de gua do sistema tem uma elevada influncia na actividade cataltica. Na presena de baixos teores de gua, de um modo geral, a actividade enzimtica reduzida. Com o aumento da camada de hidratao, h tambm um aumento da actividade cataltica, devido aco lubrificante da gua que provoca uma maior flexibilidade interna do biocatalisador (Carrea e Riva, 2000 e Gupta e Roy, 2004). De acordo com os estudos de Zaks e Klibanov (1985), as enzimas mantm a sua actividade cataltica at um mnimo de teor de gua de 0,02%. Em solventes orgnicos, onde no existe gua como lubrificante molecular as enzimas esto com uma conformao rgida. De facto, esta rigidez conformacional previne a desnaturao dos biocatalisadores e consequentemente a sua inactivao. Este fenmeno responsvel pela memria molecular das enzimas em solventes orgnicos, onde a actividade enzimtica e a selectividade so afectadas. As enzimas em solventes orgnicos memorizam a sua histria, porque esto cineticamente presas na sua conformao inicial (Zaks e Klibanov, 1985 e Ke e Klibanov, 1998). Da mesma forma, a elevada estabilidade trmica dos biocatalisadores em solventes orgnicos, especialmente nos hidrfobos e com baixos teores de gua, confere rigidez conformacional e ausncia de reaces covalentes na vizinhana, provocando termoinactivao irreversvel em gua (Carrea e Riva, 2000). Quanto ao pH, este factor bastante importante, j que o valor utilizado no prtratamento da enzima, ou seja, a correcta protonao das cadeias laterais dos resduos aminoacdicos em meio aquoso, permite alcanar uma elevada actividade enzimtica em fase orgnica. A enzima memoriza a forma inica correspondente ao valor de pH do ltimo meio aquoso a que foi exposta, sendo este fenmeno habitualmente designado por memria de pH. A actividade enzimtica correspondente a este pH mantida em meio orgnico, sem modificao dos

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solventes. Deste modo, a actividade enzimtica em solventes orgnicos vai tambm ser dependente do pH (Zaks e Klibanov, 1985 e Gupta e Roy, 2004). Assim, atravs do mtodo de extraco lquido-lquido com calixarenos, a actividade enzimtica da protena extrada para a fase orgnica, vai tambm depender do pH da fase aquosa utilizada na operao de extraco (Oshima et al., 2002). Os estudos cinticos demonstraram que as enzimas em solventes orgnicos seguem os modelos convencionais, como o de Michaelis-Menten. No entanto, relativamente aos parmetros cinticos, Vmax, Km e kcat/Km, as enzimas podem apresentar valores bastante diferentes de solvente para solvente, e tambm quando comparados com os obtidos em meio aquoso, para a mesma enzima e mesmo substrato. As protenas so praticamente insolveis na maioria dos solventes orgnicos, e quando se dissolvem perdem a sua conformao nativa. No entanto, e na ausncia de um outro tratamento especial, as enzimas esto presentes em solventes orgnicos numa suspenso bifsica slido-lquido. Isto simplifica a separao entre o catalisador e o produto, assim como a reutilizao da enzima (Vermu e Tramper, 1995, Carrea e Riva, 2000 e Gupta e Roy, 2004).

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