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2 - Ciclo do Ácido Cítrico e Fosforilação Oxidativa

Bioquímica II (Universidade de Lisboa)

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Ciclo do Ácido Cítrico e Fosforilação Oxidativa

Para a maioria das células eucarióticas e muitas bactérias,
que vivem em condições aeróbias e oxidam os
combustíveis orgânicos a CO2, O2, e a água, a glicólise é
apenas a primeira etapa para a oxidação completa da
glicose. Em vez de ser reduzido a lactato, etanol ou algum
outro produto de fermentação, o piruvato é oxidado a
água e CO2 Respiração Celular.
A respiração celular decorre em 3 fases distintas:
Moléculas combustíveis orgânicas glicose, ácidos
gordos e alguns aminoácidos são oxidados para
produzirem fragmentos de dois carbonos na forma do
grupo acetil da acetil-CoA.
Os grupos acetil entrem no no ciclo do ácido cítrico,
que os oxida enzimaticamente a CO2. A energia libertada é
conservada nos transportadores de eletrões reduzidos
NADH e FADH2.
Estas coenzimas reduzidas são oxidadas, doando
protões e eletrões. Os eletrões são transferidos ao O2 - o
aceitador final de protões por meio de uma cadeia de
moléculas transportadoras de eletrões cadeia
respiratória.
No curso da transferência de eletrões, a grande
quantidade de energia libertada é conservada na forma de
ATP por fosforilação oxidativa.

Produção da Acetil-CoA:
Aqui o foco será em como o piruvato, derivado da glicose e de outros açúcares pela glicólise, é oxidado a
acetil-CoA e CO2 pelo complexo da piruvato-desidrogenase (PDH, de pyruvate dehydrogenase), um grupo de
enzimas múltiplas cópias de três enzimas localizado nas mitocôndrias de células eucarióticas e no citosol
de bactérias.
O piruvato é oxidado a acetil-CoA e CO2
A reação geral catalisada pelo complexo da piruvato-desidrogenase é uma descarboxilação oxidativa, um
processo de oxidação irreversível no qual o grupo carboxil é removido do piruvato na forma de uma
molécula de CO2, e os dois carbonos remanescentes são convertidos ao grupo acetil da acetil-CoA. O NADH
formado nessa reação doa um ião hidreto (:H2) à cadeia respiratória, que transferirá os dois eletrões ao
oxigénio (ou a um aceitador alternativo em microrganismos anaeróbios, como sulfato).

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O complexo da piruvato-desidrogenase requer cinco coenzimas

• Pirofosfato de tiamina (TPP);

• Dinucleotídeo de flavina-adenina (FAD);
• Coenzima A;
• Dinucleotídeo de nicotidamina-adenina (NAD);
• Lipoato.
O complexo da piruvato-desidrogenase consiste em três enzimas distintas
O complexo da PDH contém três enzimas, cada uma presente em múltiplas cópias:

• Piruvato-desidrogenase (ligada ao cofator TPP) Cataliza a primeira descarboxilação produzindo

hidroxietil-TPP e, então, a oxidação do grupo hidroxietil a um grupo acetil;
• -hidrolipoil-transacetilase (covalentemente ligada ao grupo lipoil) Cataliza a transferência do
grupo acetil para a coenzima A, formando acetil-COA;
• -hidrolipoil-desidrogenase (com os cofatores FAD e NAD) - catalisa a regeneração da forma
dissulfeto (oxidada) do lipoato.

Reações do ciclo do ácido cítrico

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Fase 1 Formacao do citrato. Primeira reação do ciclo é a condensação de acetil-CoA e oxaloacetato para a
formação do citrato, catalisada pela citrato-sintase. Nesta reação, o carbono do metil do grupo acetil é unido
ao grupo carbonil (C-2) do oxaloacetato. Citroil-CoA é o intermediário transitoriamente formado no sítio ativo
da enzima. Esse intermediário é rapidamente hidrolisado em CoA livre e citrato, que são libertados do sítio
ativo. A hidrólise desse intermediário tioéster de alta energia
torna a reação direta altamente exergónica. A grande e
negativa variação de energia livre padrão da reação da
citrato-sintase é fundamental para o funcionamento do ciclo,
pois, a concentração de oxaloacetato normalmente é muito
baixa. A CoA libertada nessa reação é reciclada para participar
da descarboxilação oxidativa de outra molécula de piruvato
pelo complexo PDH.

Fase 2 Formacao de isocitrato via cis-aconitato. A enzima

aconitase (mais formalmente, aconitato-hidratase)
catalisa a transformação reversível do citrato a isocitrato,
pela formação intermediária do ácido tricarboxílico cis-
aconitato, o qual normalmente não se dissocia do sítio
ativo. Aconitase pode promover a adição reversível de
H2O à ligação dupla do cis-aconitato ligado à enzima de
duas maneiras diferentes, uma levando a citrato e a outra
a isocitrato.

Fase 3 - Oxidacao do isocitrato a a-cetoglutarato e

CO2. Na próxima etapa, a isocitrato-desidrogenase
catalisa a descarboxilação oxidativa do citrato
para formar a-cetoglutarato. O Mn2+ presente no
sítio ativo interage com o grupo carbonil do
oxalosuccinato intermediário, que é formado
transitoriamente, mas só deixa o sítio ativo
quando a descarboxilação o converte em a-
cetoglutarato. O Mn21 também estabiliza o enol
formado transitoriamente por descarboxilação.
Fase 4 - Oxidação do a-cetoglutarato a succinil-CoA e
CO2. Outra descarboxilação oxidativa, na qual o a-
cetoglutarato é convertido a succinil-CoA e CO2 pela
ação do complexo da a-cetoglutarato-desidrogenase;
NAD1 é o aceptor de elétrons e CoA é o transportador
do grupo succinil. A energia da oxidação do a-
cetoglutarato é conservada pela formação da ligação
tioéster da succinil-CoA.

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Fase 5 - Conversao de succinil-CoA a succinato. A succinil-

CoA, como a acetil-CoA, tem uma ligação tioéster com uma
G -
36 kJ/mol). Na próxima etapa do ciclo do ácido cítrico, a
energia liberada pelo rompimento dessa ligação é utilizada
para impelir a síntese de uma ligação fosfoanidrido no GTP
ATP G de apenas -2,9 kJ/mol. A enzima que
catalisa essa reação reversível é chamada de succinil-CoA-
sintetase ou succinato-tiocinase; ambos os nomes indicam
a participação de um nucleosídeo trifosfatado na reação.

Fase 6 - Oxidação do succinato a fumarato. O succinato

formado a partir da succinil-CoA é oxidado a fumarato
pela flavoproteína succinato-desidrogenase.

Fase 7 - Hidratação do fumarato a malato. A hidratação

reversível do fumarato a L-malato é catalisada pela
fumarase (formalmente, fumarato-hidratase).

Fase 8 - Oxidação do malato a oxaloacetato. Na última reação do

ciclo do ácido cítrico, a L-malato-desidrogenase ligada ao NAD
catalisa a oxidação de L-malato a oxaloacetato.

Produtos de uma rodada do ciclo do ácido cítrico A

cada rodada do ciclo do ácido cítrico, três moléculas
de NADH, uma de FADH2, uma de GTP (ATP) e duas
de CO2 são liberadas em reações de
descarboxilação oxidativa. Aqui, e em algumas das
figuras seguintes, todas as reações do ciclo estão
representadas como se elas ocorressem em apenas
uma direção, lembre-se, entretanto, que a maioria
das reações são reversíveis

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Precursores biossintéticos produzidos por um ciclo

do ácido cítrico incompleto em bactérias anaeróbias.
Estes organismos anaeróbios carecem de a-
cetoglutarato-desidrogenase e, portanto, não
podem efetuar o ciclo do ácido cítrico completo. a-
Cetoglutarato e succinil- -CoA são precursores em
diversas vias biossintéticas.

Um ciclo produz 3 NADHs, 1 FADH2, 1 GTP

e 2 CO2.

O Ciclo do ácido cítrico fornece importantes intermediários biossintéticos.

• Nos organismos aeróbicos, o ciclo

do ácido cítrico participa quer no
catabolismo quer no anabolismo
Via anfibólica;
• Além do seu papel no catabolismo
oxidativo de carboidratos, lípidos e
aminoácidos o ciclo fornece
precursores para muitas vias
biossintéticas
• Conforme os intermediários do
ciclo do ácido cítrico são
removidos para servirem como
precursores na biossíntese, eles
são repostos por reações
anapleróticas. Mantém as concentrações dos intermediários relativamente constantes.

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Regulação do fluxo dos metabólitos a partir

Regulação do Ciclo do ácido cítrico
do complexo da PDH durante o ciclo do ácido
cítrico em mamíferos. O complexo da PDH é
alostéricamente inibido quando as razões
[ATP]/[ADP], [NADH]/[NAD+] e [acetil-
CoA]/[CoA] estão elevadas, indicando um
estado metabólico com energia suficiente.
Quando estas razões decrescem, o resultado
é a ativação alostérica da oxidação do
piruvato. A velocidade do fluxo pelo ciclo do
ácido cítrico pode ser limitada pela
disponibilidade dos substratos da citrato-
sintase, oxaloacetato e acetil-CoA, ou de
NAD+, o qual é exaurido pela conversão a
NADH, retardando as três etapas de oxidação
dependentes de NAD. A inibição por
retroalimentação por succinil-CoA, citrato e
ATP também diminui a velocidade do ciclo
pela inibição de etapas iniciais. No tecido
muscular, o Ca2+ estimula a contração e, como
mostrado aqui, estimula o metabolismo
gerador de energia para repor o ATP
consumido durante a contração.

Fosforilação Oxidativa
A fosforilação oxidativa e a fotoforforilação são semelhantes em 3 aspetos:

• Ambos envolvem o fluxo de eletrões através de transportadores de membrana;

• A energia livre disponível pelo fluxo de eletrões é utilizada para o transporte de protões através de
uma membrana impermeável aos mesmos, conservando assim esta energia livre sob a forma de um
potencial eletroquímico transmembranar;

• O fluxo transmembranar de protões contra o seu gradiente de concentração mediado por proteínas
específicas fornece a energia livre para a produção de ATP catalisada pelo sistema enzimático ATP
sintase que acopla o fluxo de protões com a fosforilação do ADP.

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A membrana externa é porosa, tornando-a permeável a

pequenas moléculas e iões, mas não a proteínas.
As cristas da membrana interna fornecem uma grande
área de superfície. É impermeável à maioria das
pequenas moléculas e iões incluindo H+. Contém:

• Transportadores de eletrões da cadeia

respiratória (complexos I-IV);
• ADP-ATP-translocase;
• ATP-sintase (FoF1);
• Outros transportadores de membrana.
A matriz contém:

• Complexo da piruvato-desidrogenase;
• Enzimas do ciclo do ácido cítrico;
• Enzimas da -oxidação de ácidos gordos;
• Enzimas de oxidação de aminoácidos.;
• DNA, ribossomas;
• Muitas outras enzimas;
• ATP, ADP, Pi, Mg2+, Ca2+, K+;
• Muitos intermediários metabólicos solúveis.

A fosforilação oxidativa começa com a entrada de eletrões na cadeia de carregadores de eletrões, chamada
de cadeia respiratória A maioria desses eletrões surge da atividade da ação das desidrogenases, que
coletam eletrões das vias catabólicas e canalizam estes para aceitadores universais de eletrões
(nucleotideos de nicotinamida - NAD+ ou NADP*- ou nucleotideos de flavina - FMN ou FAD) .

• As desidrogenases dependentes de NAD+ removem 2 átomos de hidrogénio dos seus substratos: um

é transferido como ião hidreto (:H+) ao NAD+ e outro é libertado como H+ no meio.
• O NADH transporta os eletrões das reações catabólicas até ao seu ponto de entrada na cadeia
respiratória complexo NADH-desidrogenase.
• O NADPH geralmente fornece eletrões para as reações anabólicas.
• Tanto o NADH como o NADPH não atravessam a membrana interna da mitocôndria, sendo os
eletrões transportados indiretamente.
• Nas desidrogenases dependentes de FMN ou FAD (flavoproteínas), a flavina aceita um eletrão
(transformando-se na forma semiquinona) ou dois transformando-se em FADH2 ou FMNH2.
Os eletrões passam através de uma série de transportadores de membrana, que são proteínas integrais de
membrana com grupos prostéticos capazes de aceitar e doar um ou dois eletrões.

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Além do NAD+ e flavoproteínas, existem 3 outros tipos de

transportadores de eletrões na cadeia respiratória:

Ubiquinona uma quinona hidrofóbica, também chamada coenzima Q,

é uma benzoquinona solúvel em lípidos com uma longa cadeia lateral
isoprenoide. A redução completa da ubiquinona requer dois eletrões e
dois protões e ocorre em duas etapas por meio do intermediário, o
radical sequinona.

Citocromos:
Proteínas com absorção
caracteristicamente forte de luz
visível, devido aos seus grupos
prostéticos heme contendo ferro.
Há 3 classes de citocromos: a, b e c.
Os cofatores deme dos citocromos a
e b são fortemente, mas não
covalentemente, ligados às suas
proteínas associadas; os citicromos c
são covalentemente ligados por
meio de resíduos Cys.

Em proteínas ferro-enxofre, o ferro está ausente no heme, mas encontra-se em associação com átomos de
enxofre inorgânico, ou com átomos de enxofre dos resíduos de Cys na proteína, ou com ambos.

Complexos multienzimáticos da cadeia respiratória

Complexo I (NADH: ubiquinona-oxidorredutase) NADH à ubiquinona. Cataliza 2 processos simultâneos e
acoplados:

• Transferência exergónica para a ubiquinona de um ião hidreto: NADH + H+ + Q NAD+ + QH2;

• Transferência endergónica de 4 protões da matriz para o espaço intermembranar.
Complexo II (succinato-desidrogenase) Succinato a ubiquinona. A succinato-desidrogenase é a única
enzima que se encontra no ciclo do ácido cítrico. Os eletrões movem-se do succinato para o FAD e,
posteriormente para a ubiquinona.
Complexo III (Complexo de citocromo bc1 ou Ubiquinona: citocromo c-oxidorredutase) Ubiquinona para
citocromo c. é um dímero de monómeros idênticos, sendo um com 11 subunidades diferentes. É composto
por citocromo b e os seus dois hemes, proteína ferro-sulfurico com os seus centros 2Fe-2S e citocromo c
com o seu heme. Acopla a transferência de eletrões do ubiquinol (QH2) para o citocromo c com o transporte
vetorial de protões da matriz para o espaço intermembranar.
Complexo IV (citocromo-oxidase) citocromo c para O2. Carrega eletrões do citocromo c para o oxigénio
molecular, reduzindo-o a H20. A transferencia de eletrões começa quando 2 moléculas de citocromo c

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reduzido cedem, cada uma, um eletrão para o centro binuclear Cu-A. A partir daqui os eletrões passam
através dos hemes para o centro Fe-Cu. O oxigénio liga-se ao heme a3 e é reduzido até um derivado do
peróxido. 2 eletrões convertem o oxigénio em água.

A membrana mitocondrial interna separa dois meios

com concentrações de iões H+ diferentes. Esta
separação resulta numa diferença de concentração
química ( pH) e na distribuição de cargas ( ) através
da membrana. O efeito resultante é a força proto-
motriz ( G).

Modelo quimiosmótico
A corrente de eletrões é
acompanhada pela transferencia
de protões através da membrana,
produzindo um gradiente químico
e um gradiente elétrico.
A membrana interna da
mitocondria é impermeável aos
protões e estes reentram
passivamente na matriz a partir de poros específicos na ATP-sintase.
A força que move os protões de volta para a matriz provém da energia da síntese de ATP. Este modelo
explica a dependência da transferencia de elerões na síntese de ATP.

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Regulação da fosforilação oxidativa

As concentrações relativas de ATP e ADP controlam

não somente as taxas de transferência de elétrons e
a fosforilação oxidativa, mas também as velocidades
do ciclo do ácido cítrico, da oxidação do piruvato e da
glicólise. Sempre que o consumo de ATP aumenta, as
velocidades da cadeia transportadora de eletrões e da
fosforilação oxidativa aumentam. Simultaneamente, a
velocidade de oxidação do piruvato pelo ciclo do
ácido cítrico aumenta, elevando o fluxo de eletrões
na cadeia respiratória. Esses eventos podem, por sua
vez, evocar um aumento na velocidade da glicólise,
aumentando a velocidade de formação de piruvato.
Quando a conversão de ADP em TP reduz a
concentração de ADP, o controle pelo aceitador
diminui a transferência de eletrões e, assim, a
fosforilação oxidativa. A glicólise e o ciclo do ácido
cítrico também têm sua velocidade reduzida, porque
o ATP é um inibidor alostérico da enzima glicolítica
fosfofrutocinase-1 e da piruvato-desidrogenase.
fosfofrutocinase-1 também é inibida por citrato, o
primeiro intermediário do ciclo do ácido cítrico.
Quando o
acumula dentro das mitocôndrias, sendo então
transportado para o citosol. Quando tanto as
concentrações de ATP quanto de citrato aumentam,
eles produzem um efeito alostérico conjunto da
fosfofrutocinase-1, que é maior do que a soma dos
seus efeitos individuais, reduzindo a glicólise.

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