/ jre1tee 1e lastllae ltmeae jer |NO|NN/Kl/ O|N|!lC/ 2AIGKEI= 8et|erle |reasealte jre1tt lastllae ltmeae Lca1r1z oTacTa dc 11na 1:J~:::n uuuIn - 1~jn:Inu~uI u~ 1.Ig.n ~IuIn: - Uu.:~::.unu~ u~ 1:n:.I.n uI.un6uu: A cngcnLarIa gcnctIca c a bIotccnoIogIa modcrna A tocnologia uo DNA rocomlinanto possililita a oltonao uo organismos com caractorsticas novas ou nao oncon- trauas na naturoza, o guo pormito uma nova altornativa para o molhoramonto gontico uo ospcios uo valor liotocnolgico. Dosso mouo, clulas uo lactrias, lovouuras o mosmo oucariontos suporioros como plantas pouom sor pro- gramauas com gonos oxgonos, alrinuo a porspoctiva uo prouuao nostos orga- nismos uo polipoptuoos uo intorosso, como o intorloron, o hormonio uo cros- cimonto, a insulina ontro outros. A utili- zaao uo microrganismos ongonhoirauos`, capazos uo sintotizar protonas om granuo guantiuauo, apro- sonta, sol o ponto uo vista oconomico, uma vantagom consiuorvol om rolaao aos procossos clssicos uo prouuao. A oxtraao uo protonas oucariticas, como a insulina, roguor granuos guanti- uauos uo matria-prima tpncroas suno o lovino), guo nom sompro ostao uispo- nvois o sao, goralmonto, uo olovauo custo. lsso torna o procosso oxtrativo caua voz mais onoroso. Nosso contoxto, o omprogo uo tcnicas mais oliciontos, como a uo DNA rocomlinanto, alriu novas porspoctivas uo prouuao. 1ac1c ncTT11u O u.n~I~: u~II.Iu: um grupo uo uoonas causauas pola uolicincia na socroao ou na aao uo hormonio pan- crotico insulina, o guo prouuz prolun- uas anormaliuauos no motalolismo. H uuas classos principais uo u.n~I~:: o juvonil o o auulto. No primoiro, a uoona comoa couo, tornan- uo-so sovora o, no ultimo, lonto para so uosonvolvor, mo- uorauo o, lroguontomonto, nao roconhociuo. Os sintomas ca- ractorsticos uo u.n- ~I~: sao souo oxcos- siva o lroguonto mic- ao, lovanuo injostao uo granuos volumos uo gua. Es- sas altoraos sao uo- viuas oxcroao uo granuos guantiuauos uo glicoso na urina tglicosuria). O gran- uo volumo uo urina no u.n~I~: rolloto a nocossiuauo uo rim uo oxcrotar uma cor- ta guantiuauo uo gua junto com a glicoso, pois a capaciua- uo uo rim uo concontrar os solutos na urina tom um limito mximo. Outro sintoma o nvol ua glicoso sangunoa o como a rosposta ingostao ua glicoso. Quanuo a concontraao ua glicoso no sanguo signi- licativamonto alta chamaua uo hiporglicomia. O pH uo plasma sangunoo uo possoas sovoramonto uialticas lroguontomonto monor guo o valor normal ,4, conuiao osta chamaua uo aciuoso. causaua pola suporprouuao uo ciuos motallicos o o pH uo sanguo pouo cair a 6,8 ou alaixo, o lovar a losos irroparvois nos tociuos, o morto. Esso aumonto ua aciuoz um inuicativo uo altoraos prolunuas no la- lano ciuo-laso uo organismo. A aciuoz aumontaua uoviuo oxtonsa lormaao uo corpos cotonicos no lgauo o sua lilora- ao no sanguo. Como os tociuos nao con- soguom utilizar a glicoso sangunoa, o lgauo tonta componsar ossa uolicincia aumontanuo a utilizaao uos ciuos graxos como comlustvol, mas isso provoca a suporprouuao uo corpos cotonicos, alm ua capaciuauo uos tociuos om oxiu-los. A ativiuauo uo glicoguinaso ost uiminuua no u.n~I~: j guo a insulina guo ostimula a liossntoso uossa onzima. Como conso- guncia, lorma-so pouco glicognio. Como os carloiuratos nao ostao sonuo utilizauos, as protonas uo organismo sao usauas como comlustvois. Os aminociuos so- lrom porua uos sous grupos amino o os acotociuos lormauos pouom solror oxiua- ao om uixiuo uo carlono o gua, om parto pola via uo ciclo uo ciuo ctrico. A auministraao uo insulina para corri- gir a uolicincia onucrina o a auministra- ao uo licarlonato uo suio para corrigir a porua, tanto uo suio como ua capaciuauo uo tampao licarlonato, pouom trazor toua a gumica uo organismo uo volta para um lalano guaso normal uontro uo 12 a 24 horas. Para soguir o curso uo tal tratamonto, as uosagons uo glicoso, pH o CO 2 sangu- FIgura 1: Estrutura ua insulina humana: pr-insulina tcauoias B, C o A) o insulina tcauoias B o A). Sotas protas inuicam o ponto uo clivagom para a rotiraua ua cauoia C ua pr-insulina, originanuo a insulina ativa. Cauoia B, om rosa, cauoia C, om azul, o cauoia A, om amarolo 1.I~uIg.n .~u.n 1~:~u:I:.u~uI - u 2 - u:~u:u~z~u: 2UUI 29 noos sao roalizauas lro- guontomonto. Dosso mouo, o u.n~I~: juvonil roguor torapia com insulina o um cuiuauoso controlo, por toua a viua, uo lalano ontro a ingostao uo glicoso o a uoso uo insulina injota- ua tIohningor, 1984). InsuIIna Lumana A insulina humana prouuziua nas clulas pancroticas, localizauas uontro uos conjuntos uo clulas uo 100 a 200 m conhociuos como llhotas uo Iangorhans. Essas ostao uisporsas polo pncroas uo muitos vortolrauos supori- oros, constituinuo corca uo 1` ua massa uo orgao tStoinor ~I nI, 1985). A insulina tom siuo isolaua uo uma granuo variouauo uo ospcios uo vortolrauos, sonuo guo, om touas olas, a molcula composta uo uuas cauoias polipoptuicas tA o B) ligauas por pontos uissulluricas. A insulina humana, como muitos hormonios proticos, sintotizaua como uma protona procursora maior, soguiua uo uma clivagom protooltica, para gorar o hormonio ativo tWang 8 Tsou, 1991). Dosso mouo, a insulina prouuziua sol a lorma uo um unico polipoptuoo, a pr- pr-insulina, com uma cauoia uo 110 aminociuos. Os vinto o guatro primoi- ros aminociuos lormam o poptuoo sinal ou soguncia pr ua protona o tm a lunao uo lacilitar a ontraua ua mosma no rotculo onuoporiplasmtico. Duranto osso procosso, o poptuoo sinal sopara- uo ua protona, rosultanuo na lormaao ua pr-insulina tligura 1). Essa molcula rosultanto, na gual as cauoias A t21 aminociuos) o B t30 aminociuos) os- tao ligauas polo poptuoo conoctanto C t35 aminociuos), a procursora ua insulina. Ela auguiro sua conlormaao com a lormaao uo uuas pontos uissulluricas o transportaua para o aparolho uo Golgi, onuo vai sor ompaco- taua om grnulos uo ostoguo. Duranto a lormaao o maturaao uos grnulos socrotrios, a pr-insulina clivaua por onzimas protoolticas uo tipo ua tripsina, rosultanuo na liloraao uo poptuoo C. Dosso mouo, as uuas cauoias A o B ostao ligauas ontro si por pontos uissulluricas, tonuo uma outra ponto intorna na cauoia A, lormanuo a molcula uo insulina tligura 1) tStoinor ~I nI., 1985). Construo do gcnc sIntctIco para a InsuIIna Lumana Dontro as vrias manoiras polas guais um gono oucaritico pouo sor oltiuo para a oxprossao om procariotos, a sn- toso gumica oloroco as soguintos vanta- gons: lornoco uirotamonto a soguncia oxata uosoj aua, as soguncias couilicauoras o nao couilicauoras po- uom sor uosonhauas para a oxprossao procaritica, stios uo rostriao pouom sor romoviuos ou auicionauos, ntrons rotirauos, nao h nocossiuauo ua otapa uo isolamonto uo mRNA ou DNA gonomico o pormito a altoraao uo gono uo lorma mais simplos. Dosso mouo, a construao uo gono sinttico para a pr-insulina humana loi iniciaua a partir ua soguncia uo aminociuos uossa protona uoscrita por Suros ~I nI t1980). ltilizanuo-so os cuons gonticos proloronciais para 1:I~:.I.n I. tDo Boor 8 Katoloin, 1986) para a otimizaao ua oxprossao uo gono nossa lactria, loi montauo um gono couilicanuo a protona humana. A ligura 2 mostra a comparaao ua so- guncia uo lasos na laso uo loitura uo cDNA ua pr-insulina humana tBoll ~I nI., 199, Suros ~I nI, 1980) com o gono sinttico montauo nosso tralalho. Esso gono contm 18,6 ` uo lasos sulstitu- uas, sonuo 16,2 `, na torcoira laso, 1,16 `, na sogunua laso, o 1,16 `, na primoi- ra laso uos cuons. Nonhuma uas mo- uilicaos loitas nos cuons altorou o aminociuo uo corrosponuncia. Aps anliso computacional, a prosona uo soguncias ropotitivas, uirotas ou invor- sas, maioros uo guo oito nuclootuoos nao loi oncontraua, ovitanuo assim uma possvol ostrutura socunuria local inuosojaua nos mRNAs transcritos a sorom prouu- ziuos a partir uostos gonos, o guo pouoria alotar sua oxprossao. Para lacilitar a clonagom, osso gono sint- tico para a pr-insulina humana loi prouito con- tonuo um stio para a onzima uo rostriao 1 Rl no incio uo gono, soguiuo uo um cuon para motionina tATG), ua ro- giao couanto para a cauoia B, cauoia C o cauoia A, nosta oruom, uo cuon uo trmino tTAA), o linalmon- to, uo um stio para a onzima uo rostriao 1nu Hl. Ou- tros stios para onzimas uo rostriao loram auiciona- uos intornamonto no gono uo mouo a lacilitar mouilicaos postorioros. Aps a uoliniao ua ostrutura uo gono sinttico, loi roalizaua a sua montagom conlormo a ostratgia mostraua na ligura 3. Quatro oligonuclootuoos loram sintoti- zauos para a cauoia B, guatro para a cauoia C o uois para a cauoia A. Essos oligos loram anolauos om paros para a lormaao ua lita uupla uo DNA o loram ligauos ontro si, om uuas otapas. Na primoira, loram montauas as cauoias B o C o, na sogunua, montauo o gono ua pr- insulina, sonuo guo nosta oruom: cauoia B, C o A. Esso gono loi clonauo om um votor para a roalizaao uo soguonciamonto uo DNA o a conlirmaao ua soguncia nuclootuica corrota uo gono. Construo dc um vctor dc LIpcr-cxprcsso para 1. coT1 Nos ultimos anos, muitos votoros para 1 I. tm siuo construuos com uivorsas linaliuauos, ontro ossas, a clonagom uo cDNAs, uo lragmontos uo DNA amplilica- uos por PCR, transcriao .u :.I: o para a oxprossao o prouuao uo protonas hotorlogas. Para caua linaliuauo, o votor tor guo aprosontar uotorminauas caracto- rsticas para otimizar sua utilizaao. Dosso mouo, para a construao uo um sistoma uo oxprossao uo protonas om 1 I., sois olomontos lsicos sao nocossrios: - uma rogiao nocossria para roplicaao ostvol o controlo uo numoro uo cpias, - um marcauor solotivo, como um gono conlorinuo rosistncia a antilitico para a hospouoira, - um promotor para iniciaao ua trans- criao o sou controlo, - uma rogiao torminauora ua transcri- ao, FIgura 2: Comparaao ontro a soguncia nuclootuica uo gono sinttico tEc gono) o uo cDNA para a pr-insulina humana tHs cDNA). Protoin: soguncia protica ua pr- insulina 30 1.I~uIg.n .~u.n 1~:~u:I:.u~uI - u 2 - u:~u:u~z~u: 2UUI - um stio uo ligaao uo rilossomas para a iniciaao ua trauuao om uma trinca ATG apropriaua, - o uma rogiao uo stios apropriauos para onzimas uo rostriao, para utiliza- ao nas clonagons uos gonos a sorom oxprossos. Soguinuo ossos roguisitos para a cons- truao uo votor uo oxprossao pIVT8.5 tligura 4), utilizamos a origom uo roplicaao uo plasmuoo plC8, o gono uo rosistncia totraciclina uo plasmuoo RP4, o promotor jI isolauo uo lago Iamlua, a rogiao Shino Dalgarno sint- tica uo lago T, torminauor uo transcri- ao Rho-inuoponuonto sinttico, o uma rogiao uo multiplos stios unicos para onzimas uo rostriao tligura 4). Para a rogiao uo roplicaao ostvol o uo controlo uo numoro uo cpias uo plasmuoo loi oscolhiua a origom uo roplicaao uo plasmuoo plC8. Essa origom uorivaua uo plasmuoo pVB1 tou ColE1) onuo mutaos o uoloos loram introuuziuas uo mouo a aumontar o numoro uo cpias uo plasmuoo uon- tro ua clula. Essos plasmuoos pouom ostar prosontos om mais uo 500 cpias por clula. O gono uo rosistncia totraciclina loi oscolhiuo o utilizauo porguo osto pormito guo, alm ua soloao uas lact- rias rocomlinantos, o antilitico totraciclina ostar constantomonto lazon- uo prossao solotiva uuranto a lormonta- ao. A rosistncia totraciclina consisto uo uma protona guo lomloia o antili- tico para lora ua clula, nao pormitinuo sua atuaao na iniliao ua sntoso protica no intorior ua lactria. lsso tom como consoguncia, om uma lormontaao in- uustrial, guo so utilizom monoros guan- tiuauos uo antilitico, pois osto nao sor inativauo pola lactria rosistonto o ostar constantomonto prosonto na lormonta- ao. Assim, a prouutiviuauo no lioroator nao sor alotaua uoviuo ao acumulo uo lactrias som plasmuoos. Esso lonomo- no uo acumulo uo lactrias som plasmuoos loi olsorvauo por muitos posguisauoros o rosponsvol por uili- culuauos no oscalonamonto roguoriuo para a comorcializaao uo prouutos rocomlinantos tKumar ~I nI, 1991). Para a iniciaao ua transcriao loi oscolhiuo o promotor pI uo lactorilago Iamlua. Esto um promotor lorto o rogulauo nogativamonto polo roprossor couilicauo polo gono cl. A mutaao cl 85 tornou o roprossor sonsvol tom- poratura, luncional a 28 o C o nao lunci- onal a 42 o C. Assim, a oxprossao uo soguncias couantos sol o controlo uos- sos promotoros o polo roprossor cl 85 pouo sor ativaua simplosmonto por uma muuana na tomporatura ua cultura, o guo, principalmonto om oscala inuustri- al, simplilica o laratoia o procosso. A partir uo um promotor o uo um incio uo transcriao, a RNA polimoraso transcrovo o RNA at o roconhocimonto uo um stio uo torminaao, guo lunciona como um sinal para o trmino ua trans- criao. Dois tipos uilorontos uo torminauoros sao oncontrauos: torminauoros simplos ou Rho-inuopon- uontos o torminauoros Rho-uoponuontos tuoponuontos ua protona Rho). Os torminauoros Rho-inuoponuontos pos- suom uuas caractorsticas: uma ostrutura om lorma uo grampo, goraua por paroamonto ontro ropotios invortiuas, contonuo uma rogiao rica om paros G-C na laso uo grampo, soparauas por uma curta uistncia, o outra, sulsoguonto ua primoira, guo contm uma rogiao uo, aproximauamonto, sois rosuuos uo uriuina no linal ua uniuauo. Essos torminauoros parocom tor alguma lun- ao na protoao uo mRNA, pola sua capaciuauo uo lormar uma ostrutura om grampo, provavolmonto lornoconuo uma larroira contra a aao uo uma oxonucloaso 3` tBravorman, 198), o nao uoponuom uo um lator protico, proporcionanuo uma olotiva linalizaao ua transcriao no votor uo oxprossao. A otapa mais limitanto na sntoso protica a ligaao uos rilossomas s molculas uo mRNA. Dosuo guo o nu- moro uo rilosomas na clula oxcoua a classo uo monsagoiros, uma manoira uo aumontar a oxprossao uo um gono clonauo aumontar o numoro uos trans- critos corrosponuontos. Para tal, a ma- noira mais simplos clonar o gono uo intorosso om um plasmuoo com granuo numoro uo cpias. As uuas caractorsticas uos mRNAs uo 1 I. , guo uotorminam onuo o gual a olicincia uo procosso uo roconhoci- FIgura 3: Estratgia utilizaua para a construao uos gonos para a pr- insulina humana para a oxprossao na lactria 1 I. FIgura 4: Vapa uo votor uo oxprossao pIVT8.5 contruuo para a prouuao ua pr-insulina humana om 1 I.. Tot R : gono uo rosistncia a totraciclina, ori: origom uo roplicaao, VCS: rogiao uo stios unicos para onzimas uo rostriao, pI: promotor pI, SD: soguncia Shino- Dalgarno, o TT: rogiao uo torminaao uo transcriao 1.I~uIg.n .~u.n 1~:~u:I:.u~uI - u 2 - u:~u:u~z~u: 2UUI 31 monto rilosoma-mRNA, sao o cuon uo iniciaao, goralmonto AlG ou GlG, o a rogiao Shino Dalgarno tSD), ou stio uo ligaao uo rilossomas tRBS). Essa rogiao complomontar ao linal 3` uo RNA rilosomal 16S tShino 8 Dalgarno, 194, Shultzalorgor ~I nI, 2001). O SD tom tipicamonto uo trs a sois nuclootuoos uo tamanho o ost localizauo guatro a guinzo nuclootuoos antos uo cuon uo iniciaao. Essa rogiao tom a lunao uo guiar o rilossoma para o ponto uo incio corroto tDroylus, 1988). Olins ~I nI. t1988) uoscrovoram uma rogiao SD a montanto uo gono 10 uo lactorilago T tg 10-I). Esso gono couilica para a protona ua capa, guo a protona mais sintotizaua aps a inlocao uo lago T. Essa rogiao SD possui um granuo potoncial para otimizar a olicincia ua trauuao uo gonos homlogos o hotorlogos clonauos om 1 I.. Para lacilitar a clonagom uo gonos para a oxprossao no votor, uma rogiao apropriaua uo stios unicos para onzimas uo rostriao loi auicionaua ontro a rogiao promotora o o SD, o a rogiao torminauora ua transcriao, onuo tomos o stio para a onzima uo rostriao Nl contonuo o cuon ATG uo incio uo trauuao tligura 4). Produo da pr-InsuIIna Lumana Para a prouuao ua pr-insulina, o gono sinttico ua pr-insulina loi sulclonauo no votor uo oxprossao pIVT8.5 o o plasmuoo rocomlinanto loi uonominauo uo pPTA1. Esso plasmuoo loi utilizauo para a translormaao ua copa 1. I. N4830-1, pois ossa possui o roprossor cl tormossonsvol. A copa 1 I. N4830-1 translormaua com o plasmuoo pPTA1, loi utilizaua para a inuuao trmica ua Pr-insulina. Como controlo, loi utilizauas cultura ua copa contonuo o plasmuoo pIVT8.5 som o gono clonauo. As protonas inuuziuas ostao mostrauas na ligura 5. Vorilica-so a inuuao uo uma protona uo, aproximauamonto, 10.000 ultons, guo corrosponuo Pr-insulina na cultu- ra uo rocomlinanto pPTA1. Essa proto- na corrosponuo a 20` uas protonas totais ua lactria. Nas amostras com o plasmuoo pIVT8.5, nao olsorvamos ossa protona inuuziua. Pouomos con- cluir portanto, guo ocorrou uma hipor- oxprossao ua Pr-insulina a partir uo gono clonauo no plasmuoo pIVT8.5 construuo. Vorilicou-so tamlm guo ocorrou lormaao uo corpos uo inclusao ua pro- tona rocomlinanto prouuziua, o guo auxilia a protoao contra protoliso o lacilita sua purilicaao. Elos sao lorma- uos como agrogauos citoplasmticos guo pouom sor purilicauos aps a liso ua clula, contrilugaao o solulilizaao uas protonas com, por oxomplo, uria ou guaniuina. A porspoctiva uo prouuao a partir uossas lactrias rocomlinantos, oltiuas nosso tralalho, nas conuios uo cultura utilizauas, uo 1 g uo pr-insulina para caua 1 litros uo cultura, com uma uon- siuauo colular uo 10 9 clulas por ml. ConsIdcracs IInaIs Esso tralalho loi roalizauo uontro uo Projoto Prouuao uo insulina humana atravs uo procursoros rocomlinantos om 1:I~:.I.n I.`, cooruonauo polo Prol. Spartaco Astolli Filho, com linanci- amonto ua Biolrs o PADCTFlNEP, uontro uo Convnio lnBBiolrs. Esso sistoma uo prouuao uo insulina ost patontoauo nos Estauos lniuos tpaton- tos nos. 6068993, 30052000, o 6281329B1, 28082001) o com pouiuo uo patonto no lNPl, Brasil. BIbIIograIIa Boll, G.l., Svain, W.F., Pictot, R., Coruoll, B., Tischor, E. 8 Goouman, H.V. 199. Nuclootiuo soguonco ol a cDNA clono oncouing human proproinsulin. NnIu:~, 282, 525-. Bravorman, G. 198. Dotorminants ol mossongor RNA stalility. ~II, 48: 5-6. Do Boor, H.A. 8 Kastoloin, R.A. 1986. 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