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28 1.I~uIg.n .~u.n 1~:~u:I:.

u~uI - u 2 - u:~u:u~z~u: 2UUI


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Lca1r1z oTacTa dc 11na
1:J~:::n uuuIn - 1~jn:Inu~uI u~
1.Ig.n ~IuIn: - Uu.:~::.unu~ u~ 1:n:.I.n
uI.un6uu:
A cngcnLarIa gcnctIca c a
bIotccnoIogIa modcrna
A tocnologia uo DNA rocomlinanto
possililita a oltonao uo organismos
com caractorsticas novas ou nao oncon-
trauas na naturoza, o guo pormito uma
nova altornativa para o molhoramonto
gontico uo ospcios uo valor
liotocnolgico. Dosso mouo, clulas uo
lactrias, lovouuras o mosmo oucariontos
suporioros como plantas pouom sor pro-
gramauas com gonos oxgonos, alrinuo
a porspoctiva uo prouuao nostos orga-
nismos uo polipoptuoos uo intorosso,
como o intorloron, o hormonio uo cros-
cimonto, a insulina ontro outros. A utili-
zaao uo microrganismos
ongonhoirauos`, capazos uo sintotizar
protonas om granuo guantiuauo, apro-
sonta, sol o ponto uo vista oconomico,
uma vantagom consiuorvol om rolaao
aos procossos clssicos uo prouuao.
A oxtraao uo protonas oucariticas,
como a insulina, roguor granuos guanti-
uauos uo matria-prima tpncroas suno
o lovino), guo nom sompro ostao uispo-
nvois o sao, goralmonto, uo olovauo
custo. lsso torna o procosso oxtrativo
caua voz mais onoroso. Nosso contoxto,
o omprogo uo tcnicas mais oliciontos,
como a uo DNA rocomlinanto, alriu
novas porspoctivas uo prouuao.
1ac1c ncTT11u
O u.n~I~: u~II.Iu: um grupo uo
uoonas causauas pola uolicincia na
socroao ou na aao uo hormonio pan-
crotico insulina, o guo prouuz prolun-
uas anormaliuauos no motalolismo. H
uuas classos principais uo u.n~I~:: o
juvonil o o auulto. No
primoiro, a uoona
comoa couo, tornan-
uo-so sovora o, no
ultimo, lonto para
so uosonvolvor, mo-
uorauo o,
lroguontomonto, nao
roconhociuo.
Os sintomas ca-
ractorsticos uo u.n-
~I~: sao souo oxcos-
siva o lroguonto mic-
ao, lovanuo
injostao uo granuos
volumos uo gua. Es-
sas altoraos sao uo-
viuas oxcroao uo
granuos guantiuauos
uo glicoso na urina
tglicosuria). O gran-
uo volumo uo urina
no u.n~I~: rolloto a
nocossiuauo uo rim
uo oxcrotar uma cor-
ta guantiuauo uo
gua junto com a glicoso, pois a capaciua-
uo uo rim uo concontrar os solutos na urina
tom um limito mximo. Outro sintoma o
nvol ua glicoso sangunoa o como a
rosposta ingostao ua glicoso. Quanuo a
concontraao ua glicoso no sanguo signi-
licativamonto alta chamaua uo
hiporglicomia.
O pH uo plasma sangunoo uo possoas
sovoramonto uialticas lroguontomonto
monor guo o valor normal ,4, conuiao
osta chamaua uo aciuoso. causaua pola
suporprouuao uo ciuos motallicos o o
pH uo sanguo pouo cair a 6,8 ou alaixo, o
lovar a losos irroparvois nos tociuos, o
morto. Esso aumonto ua aciuoz um
inuicativo uo altoraos prolunuas no la-
lano ciuo-laso uo organismo. A aciuoz
aumontaua uoviuo oxtonsa lormaao uo
corpos cotonicos no lgauo o sua lilora-
ao no sanguo. Como os tociuos nao con-
soguom utilizar a glicoso sangunoa, o
lgauo tonta componsar ossa uolicincia
aumontanuo a utilizaao uos ciuos graxos
como comlustvol, mas isso provoca a
suporprouuao uo corpos cotonicos, alm
ua capaciuauo uos tociuos om oxiu-los. A
ativiuauo uo glicoguinaso ost uiminuua
no u.n~I~: j guo a insulina guo ostimula
a liossntoso uossa onzima. Como conso-
guncia, lorma-so pouco glicognio. Como
os carloiuratos nao ostao sonuo utilizauos,
as protonas uo organismo sao usauas
como comlustvois. Os aminociuos so-
lrom porua uos sous grupos amino o os
acotociuos lormauos pouom solror oxiua-
ao om uixiuo uo carlono o gua, om
parto pola via uo ciclo uo ciuo ctrico.
A auministraao uo insulina para corri-
gir a uolicincia onucrina o a auministra-
ao uo licarlonato uo suio para corrigir a
porua, tanto uo suio como ua capaciuauo
uo tampao licarlonato, pouom trazor toua
a gumica uo organismo uo volta para um
lalano guaso normal uontro uo 12 a 24
horas. Para soguir o curso uo tal tratamonto,
as uosagons uo glicoso, pH o CO
2
sangu-
FIgura 1: Estrutura ua insulina humana: pr-insulina
tcauoias B, C o A) o insulina tcauoias B o A). Sotas
protas inuicam o ponto uo clivagom para a rotiraua ua
cauoia C ua pr-insulina, originanuo a insulina ativa.
Cauoia B, om rosa, cauoia C, om azul, o cauoia A, om
amarolo
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noos sao roalizauas lro-
guontomonto. Dosso mouo,
o u.n~I~: juvonil roguor
torapia com insulina o um
cuiuauoso controlo, por
toua a viua, uo lalano
ontro a ingostao uo glicoso
o a uoso uo insulina injota-
ua tIohningor, 1984).
InsuIIna Lumana
A insulina humana
prouuziua nas clulas
pancroticas, localizauas
uontro uos conjuntos uo
clulas uo 100 a 200 m
conhociuos como llhotas
uo Iangorhans. Essas ostao
uisporsas polo pncroas uo
muitos vortolrauos supori-
oros, constituinuo corca uo
1` ua massa uo orgao tStoinor ~I nI,
1985). A insulina tom siuo isolaua uo
uma granuo variouauo uo ospcios uo
vortolrauos, sonuo guo, om touas olas, a
molcula composta uo uuas cauoias
polipoptuicas tA o B) ligauas por pontos
uissulluricas.
A insulina humana, como muitos
hormonios proticos, sintotizaua como
uma protona procursora maior, soguiua
uo uma clivagom protooltica, para gorar
o hormonio ativo tWang 8 Tsou, 1991).
Dosso mouo, a insulina prouuziua sol
a lorma uo um unico polipoptuoo, a pr-
pr-insulina, com uma cauoia uo 110
aminociuos. Os vinto o guatro primoi-
ros aminociuos lormam o poptuoo
sinal ou soguncia pr ua protona o tm
a lunao uo lacilitar a ontraua ua mosma
no rotculo onuoporiplasmtico. Duranto
osso procosso, o poptuoo sinal sopara-
uo ua protona, rosultanuo na lormaao
ua pr-insulina tligura 1). Essa molcula
rosultanto, na gual as cauoias A t21
aminociuos) o B t30 aminociuos) os-
tao ligauas polo poptuoo conoctanto C
t35 aminociuos), a procursora ua
insulina. Ela auguiro sua conlormaao
com a lormaao uo uuas pontos
uissulluricas o transportaua para o
aparolho uo Golgi, onuo vai sor ompaco-
taua om grnulos uo ostoguo. Duranto a
lormaao o maturaao uos grnulos
socrotrios, a pr-insulina clivaua por
onzimas protoolticas uo tipo ua tripsina,
rosultanuo na liloraao uo poptuoo C.
Dosso mouo, as uuas cauoias A o B ostao
ligauas ontro si por pontos uissulluricas,
tonuo uma outra ponto intorna na cauoia
A, lormanuo a molcula uo insulina
tligura 1) tStoinor ~I nI., 1985).
Construo do gcnc sIntctIco
para a InsuIIna Lumana
Dontro as vrias manoiras polas guais
um gono oucaritico pouo sor oltiuo
para a oxprossao om procariotos, a sn-
toso gumica oloroco as soguintos vanta-
gons: lornoco uirotamonto a soguncia
oxata uosoj aua, as soguncias
couilicauoras o nao couilicauoras po-
uom sor uosonhauas para a oxprossao
procaritica, stios uo rostriao pouom
sor romoviuos ou auicionauos, ntrons
rotirauos, nao h nocossiuauo ua otapa
uo isolamonto uo mRNA ou DNA
gonomico o pormito a altoraao uo gono
uo lorma mais simplos.
Dosso mouo, a construao uo gono
sinttico para a pr-insulina humana loi
iniciaua a partir ua soguncia uo
aminociuos uossa protona uoscrita por
Suros ~I nI t1980). ltilizanuo-so os
cuons gonticos proloronciais para
1:I~:.I.n I. tDo Boor 8 Katoloin,
1986) para a otimizaao ua oxprossao uo
gono nossa lactria, loi montauo um
gono couilicanuo a protona humana. A
ligura 2 mostra a comparaao ua so-
guncia uo lasos na laso uo loitura uo
cDNA ua pr-insulina humana tBoll ~I
nI., 199, Suros ~I nI, 1980) com o gono
sinttico montauo nosso tralalho. Esso
gono contm 18,6 ` uo lasos sulstitu-
uas, sonuo 16,2 `, na torcoira laso, 1,16
`, na sogunua laso, o 1,16 `, na primoi-
ra laso uos cuons. Nonhuma uas mo-
uilicaos loitas nos cuons altorou o
aminociuo uo corrosponuncia. Aps
anliso computacional, a prosona uo
soguncias ropotitivas, uirotas ou invor-
sas, maioros uo guo oito nuclootuoos
nao loi oncontraua, ovitanuo assim uma
possvol ostrutura socunuria local
inuosojaua nos mRNAs
transcritos a sorom prouu-
ziuos a partir uostos gonos,
o guo pouoria alotar sua
oxprossao.
Para lacilitar a
clonagom, osso gono sint-
tico para a pr-insulina
humana loi prouito con-
tonuo um stio para a
onzima uo rostriao 1 Rl
no incio uo gono, soguiuo
uo um cuon para
motionina tATG), ua ro-
giao couanto para a cauoia
B, cauoia C o cauoia A,
nosta oruom, uo cuon uo
trmino tTAA), o linalmon-
to, uo um stio para a onzima
uo rostriao 1nu Hl. Ou-
tros stios para onzimas uo
rostriao loram auiciona-
uos intornamonto no gono uo mouo a
lacilitar mouilicaos postorioros.
Aps a uoliniao ua ostrutura uo gono
sinttico, loi roalizaua a sua montagom
conlormo a ostratgia mostraua na ligura
3. Quatro oligonuclootuoos loram sintoti-
zauos para a cauoia B, guatro para a
cauoia C o uois para a cauoia A. Essos
oligos loram anolauos om paros para a
lormaao ua lita uupla uo DNA o loram
ligauos ontro si, om uuas otapas. Na
primoira, loram montauas as cauoias B o
C o, na sogunua, montauo o gono ua pr-
insulina, sonuo guo nosta oruom: cauoia
B, C o A. Esso gono loi clonauo om um
votor para a roalizaao uo soguonciamonto
uo DNA o a conlirmaao ua soguncia
nuclootuica corrota uo gono.
Construo dc um vctor dc
LIpcr-cxprcsso para 1. coT1
Nos ultimos anos, muitos votoros para
1 I. tm siuo construuos com uivorsas
linaliuauos, ontro ossas, a clonagom uo
cDNAs, uo lragmontos uo DNA amplilica-
uos por PCR, transcriao .u :.I: o para a
oxprossao o prouuao uo protonas
hotorlogas. Para caua linaliuauo, o votor
tor guo aprosontar uotorminauas caracto-
rsticas para otimizar sua utilizaao. Dosso
mouo, para a construao uo um sistoma
uo oxprossao uo protonas om 1 I., sois
olomontos lsicos sao nocossrios:
- uma rogiao nocossria para roplicaao
ostvol o controlo uo numoro uo cpias,
- um marcauor solotivo, como um
gono conlorinuo rosistncia a antilitico
para a hospouoira,
- um promotor para iniciaao ua trans-
criao o sou controlo,
- uma rogiao torminauora ua transcri-
ao,
FIgura 2: Comparaao ontro a soguncia nuclootuica uo
gono sinttico tEc gono) o uo cDNA para a pr-insulina
humana tHs cDNA). Protoin: soguncia protica ua pr-
insulina
30 1.I~uIg.n .~u.n 1~:~u:I:.u~uI - u 2 - u:~u:u~z~u: 2UUI
- um stio uo ligaao uo rilossomas
para a iniciaao ua trauuao om uma
trinca ATG apropriaua,
- o uma rogiao uo stios apropriauos
para onzimas uo rostriao, para utiliza-
ao nas clonagons uos gonos a sorom
oxprossos.
Soguinuo ossos roguisitos para a cons-
truao uo votor uo oxprossao pIVT8.5
tligura 4), utilizamos a origom uo
roplicaao uo plasmuoo plC8, o gono
uo rosistncia totraciclina uo plasmuoo
RP4, o promotor jI isolauo uo lago
Iamlua, a rogiao Shino Dalgarno sint-
tica uo lago T, torminauor uo transcri-
ao Rho-inuoponuonto sinttico, o uma
rogiao uo multiplos stios unicos para
onzimas uo rostriao tligura 4).
Para a rogiao uo roplicaao ostvol o
uo controlo uo numoro uo cpias uo
plasmuoo loi oscolhiua a origom uo
roplicaao uo plasmuoo plC8. Essa
origom uorivaua uo plasmuoo pVB1
tou ColE1) onuo mutaos o uoloos
loram introuuziuas uo mouo a aumontar
o numoro uo cpias uo plasmuoo uon-
tro ua clula. Essos plasmuoos pouom
ostar prosontos om mais uo 500 cpias
por clula.
O gono uo rosistncia totraciclina
loi oscolhiuo o utilizauo porguo osto
pormito guo, alm ua soloao uas lact-
rias rocomlinantos, o antilitico
totraciclina ostar constantomonto lazon-
uo prossao solotiva uuranto a lormonta-
ao. A rosistncia totraciclina consisto
uo uma protona guo lomloia o antili-
tico para lora ua clula, nao pormitinuo
sua atuaao na iniliao ua sntoso protica
no intorior ua lactria. lsso tom como
consoguncia, om uma lormontaao in-
uustrial, guo so utilizom monoros guan-
tiuauos uo antilitico, pois osto nao sor
inativauo pola lactria rosistonto o ostar
constantomonto prosonto na lormonta-
ao. Assim, a prouutiviuauo no lioroator
nao sor alotaua uoviuo ao acumulo uo
lactrias som plasmuoos. Esso lonomo-
no uo acumulo uo lactrias som
plasmuoos loi olsorvauo por muitos
posguisauoros o rosponsvol por uili-
culuauos no oscalonamonto roguoriuo
para a comorcializaao uo prouutos
rocomlinantos tKumar ~I nI, 1991).
Para a iniciaao ua transcriao loi
oscolhiuo o promotor pI uo lactorilago
Iamlua. Esto um promotor lorto o
rogulauo nogativamonto polo roprossor
couilicauo polo gono cl. A mutaao
cl
85
tornou o roprossor sonsvol tom-
poratura, luncional a 28
o
C o nao lunci-
onal a 42
o
C. Assim, a oxprossao uo
soguncias couantos sol o controlo uos-
sos promotoros o polo roprossor cl
85
pouo sor ativaua simplosmonto por uma
muuana na tomporatura ua cultura, o
guo, principalmonto om oscala inuustri-
al, simplilica o laratoia o procosso.
A partir uo um promotor o uo um
incio uo transcriao, a RNA polimoraso
transcrovo o RNA at o roconhocimonto
uo um stio uo torminaao, guo lunciona
como um sinal para o trmino ua trans-
criao. Dois tipos uilorontos uo
torminauoros sao oncontrauos:
torminauoros simplos ou Rho-inuopon-
uontos o torminauoros Rho-uoponuontos
tuoponuontos ua protona Rho). Os
torminauoros Rho-inuoponuontos pos-
suom uuas caractorsticas: uma ostrutura
om lorma uo grampo, goraua por
paroamonto ontro ropotios invortiuas,
contonuo uma rogiao rica om paros G-C
na laso uo grampo, soparauas por uma
curta uistncia, o outra, sulsoguonto ua
primoira, guo contm uma rogiao uo,
aproximauamonto, sois rosuuos uo
uriuina no linal ua uniuauo. Essos
torminauoros parocom tor alguma lun-
ao na protoao uo mRNA, pola sua
capaciuauo uo lormar uma ostrutura om
grampo, provavolmonto lornoconuo uma
larroira contra a aao uo uma oxonucloaso
3` tBravorman, 198), o nao uoponuom
uo um lator protico, proporcionanuo
uma olotiva linalizaao ua transcriao no
votor uo oxprossao.
A otapa mais limitanto na sntoso
protica a ligaao uos rilossomas s
molculas uo mRNA. Dosuo guo o nu-
moro uo rilosomas na clula oxcoua a
classo uo monsagoiros, uma manoira uo
aumontar a oxprossao uo um gono
clonauo aumontar o numoro uos trans-
critos corrosponuontos. Para tal, a ma-
noira mais simplos clonar o gono uo
intorosso om um plasmuoo com granuo
numoro uo cpias.
As uuas caractorsticas uos mRNAs
uo 1 I. , guo uotorminam onuo o gual
a olicincia uo procosso uo roconhoci-
FIgura 3: Estratgia utilizaua para a construao uos gonos para a pr-
insulina humana para a oxprossao na lactria 1 I.
FIgura 4: Vapa uo
votor uo oxprossao
pIVT8.5 contruuo
para a prouuao ua
pr-insulina humana
om 1 I..
Tot
R
: gono uo
rosistncia a
totraciclina, ori:
origom uo
roplicaao, VCS:
rogiao uo stios
unicos para onzimas
uo rostriao, pI:
promotor pI, SD:
soguncia Shino-
Dalgarno, o TT:
rogiao uo
torminaao uo
transcriao
1.I~uIg.n .~u.n 1~:~u:I:.u~uI - u 2 - u:~u:u~z~u: 2UUI 31
monto rilosoma-mRNA, sao o cuon uo
iniciaao, goralmonto AlG ou GlG, o a
rogiao Shino Dalgarno tSD), ou stio uo
ligaao uo rilossomas tRBS). Essa rogiao
complomontar ao linal 3` uo RNA
rilosomal 16S tShino 8 Dalgarno, 194,
Shultzalorgor ~I nI, 2001). O SD tom
tipicamonto uo trs a sois nuclootuoos
uo tamanho o ost localizauo guatro a
guinzo nuclootuoos antos uo cuon uo
iniciaao. Essa rogiao tom a lunao uo
guiar o rilossoma para o ponto uo incio
corroto tDroylus, 1988). Olins ~I nI. t1988)
uoscrovoram uma rogiao SD a montanto
uo gono 10 uo lactorilago T tg 10-I).
Esso gono couilica para a protona ua
capa, guo a protona mais sintotizaua
aps a inlocao uo lago T. Essa rogiao
SD possui um granuo potoncial para
otimizar a olicincia ua trauuao uo
gonos homlogos o hotorlogos clonauos
om 1 I..
Para lacilitar a clonagom uo gonos
para a oxprossao no votor, uma rogiao
apropriaua uo stios unicos para onzimas
uo rostriao loi auicionaua ontro a rogiao
promotora o o SD, o a rogiao torminauora
ua transcriao, onuo tomos o stio para a
onzima uo rostriao Nl contonuo o
cuon ATG uo incio uo trauuao tligura
4).
Produo da
pr-InsuIIna Lumana
Para a prouuao ua pr-insulina, o
gono sinttico ua pr-insulina loi
sulclonauo no votor uo oxprossao
pIVT8.5 o o plasmuoo rocomlinanto loi
uonominauo uo pPTA1. Esso plasmuoo
loi utilizauo para a translormaao ua
copa 1. I. N4830-1, pois ossa possui o
roprossor cl tormossonsvol.
A copa 1 I. N4830-1 translormaua
com o plasmuoo pPTA1, loi utilizaua
para a inuuao trmica ua Pr-insulina.
Como controlo, loi utilizauas cultura ua
copa contonuo o plasmuoo pIVT8.5
som o gono clonauo. As protonas
inuuziuas ostao mostrauas na ligura 5.
Vorilica-so a inuuao uo uma protona
uo, aproximauamonto, 10.000 ultons,
guo corrosponuo Pr-insulina na cultu-
ra uo rocomlinanto pPTA1. Essa proto-
na corrosponuo a 20` uas protonas
totais ua lactria. Nas amostras com o
plasmuoo pIVT8.5, nao olsorvamos
ossa protona inuuziua. Pouomos con-
cluir portanto, guo ocorrou uma hipor-
oxprossao ua Pr-insulina a partir uo
gono clonauo no plasmuoo pIVT8.5
construuo.
Vorilicou-so tamlm guo ocorrou
lormaao uo corpos uo inclusao ua pro-
tona rocomlinanto prouuziua, o guo
auxilia a protoao contra protoliso o
lacilita sua purilicaao. Elos sao lorma-
uos como agrogauos citoplasmticos guo
pouom sor purilicauos aps a liso ua
clula, contrilugaao o solulilizaao uas
protonas com, por oxomplo, uria ou
guaniuina.
A porspoctiva uo prouuao a partir
uossas lactrias rocomlinantos, oltiuas
nosso tralalho, nas conuios uo cultura
utilizauas, uo 1 g uo pr-insulina para
caua 1 litros uo cultura, com uma uon-
siuauo colular uo 10
9
clulas por ml.
ConsIdcracs IInaIs
Esso tralalho loi roalizauo uontro uo
Projoto Prouuao uo insulina humana
atravs uo procursoros rocomlinantos
om 1:I~:.I.n I.`, cooruonauo polo
Prol. Spartaco Astolli Filho, com linanci-
amonto ua Biolrs o PADCTFlNEP,
uontro uo Convnio lnBBiolrs. Esso
sistoma uo prouuao uo insulina ost
patontoauo nos Estauos lniuos tpaton-
tos nos. 6068993, 30052000, o
6281329B1, 28082001) o com pouiuo
uo patonto no lNPl, Brasil.
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FIgura 5: Anliso ua oxprossao
om uilorontos tompos uo inuuao
ua pr-insulina om 1 I.. Gol
uosnaturanto tSDS-PAGE) a 15`
uos lisauos proticos totais uas
culturas, contonuo o plasmuoo
pIVT8.5 o o plasmuoo pPTA1
tpIVT8.5 + gono ua pr-insulina)