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Capítulo 5
Cultivo celular
Emanuele Amorim Alves
Anna Christina Rosa Guimarães
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Frasco de vidro com volume variado utilizado no armazenamento de produtos biológicos.
Cultivo Celular | 221
Fonte: Fotos cedidas pelo Setor de Cultura de Células do Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Saúde (INCQS), Fiocruz.
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3.2.2. Congelamento
Na natureza é muito comum que os indivíduos se adaptem cada vez
mais ao meio ambiente por meio de mutações genéticas. Esse procedimento
evolutivo descrito por Darwin ocorre em todos os seres vivos e não seria
diferente pensar que também ocorreria em células cultivadas.
A partir do momento em que uma célula se encontra em uma cultura
primária ocorrem adaptações para o seu estabelecimento como uma linhagem.
Células em cultura por longos períodos acabam perdendo suas caracte-
rísticas fenotípicas, pois após várias divisões, há grande probabilidade de ocor-
rerem alterações demasiadas em seu DNA.
Manter células congeladas significa atrasar, em anos, quaisquer altera-
ções que poderiam ocorrer quando em cultura. Tais alterações são dispensáveis
para os laboratórios de cultura de células e os grandes bancos mundiais forne-
cedores de linhagens.
As células em cultura geralmente são congeladas em nitrogênio líquido
em uma temperatura de -196ºC. Nessa temperatura, todas as reações bioquí-
micas nas células ficam paralisadas impedindo qualquer alteração na cultura
criopreservada.
O procedimento mais utilizado no congelamento celular é o lento.
Nesse processo há diminuição da temperatura, vagarosamente acarretando a
solidificação da água que se encontra no meio de cultura. Isso aumenta a
concentração de soluto fora da célula e faz com que a água saia através do
processo de osmose. A saída da água da célula faz com que ela murche.
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Assim, à medida que a água sai, ela se congela no exterior, deixando a célula
desidratada. Nesse processo, a água do meio externo é congelada formando
cristais que podem se reorganizar no exterior da célula. A formação de cristais
e reorganização dentro da célula leva ao rompimento da membrana celular,
matando as células. Isso é impedido com o processo lento de congelamento.
Q1+Q2+Q3+Q4
X104 X faror de diluição=n° de células / mL
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Para não ocorrer a contagem de uma célula mais de uma vez, deve-se fazer
uma marcação em forma de “L” nos quadrados, para que, ao aparecerem células
em cima das linhas, se contem somente as que estiverem sobre a marcação.
Para a análise de viabilidade celular utiliza-se o corante azul de Trypan,
que não atravessa membranas íntegras. Assim, células vivas não permitem a
passagem do corante e, logo, não adquirem nenhuma coloração. Como as
células mortas têm suas membranas danificadas, ocorre o fluxo de corante para
o interior da célula fornecendo uma coloração azul.
Entre os métodos de contagem indireta mais utilizados estão o teste de
brometo 3 - [4,5-dimetil-tiazol - 2-il] - 2,5 - difenil-tetrazólio (MTT) e o
ensaio de coloração por Coomassie Brillant Blue R-250 (CBBR – 250).
A coloração por CCBR-250 se baseia na capacidade do corante de
corar proteínas celulares. Assim, faz-se uma curva padrão com concentrações
celulares conhecidas e também as leituras das amostras de cultura. Para isso,
deve-se corar a cultura e depois eluir a solução corante, sendo lida em
espectrofotômetro.
O ensaio do MTT se baseia na redução do MTT, um sal tetrazólico,
pela desidrogenase mitocondrial de células viáveis para formar como produto o
azul de Formazan. O ensaio mede a respiração celular, que é proporcional à
quantidade de Formazan produzida, e ao número de células viáveis em cultura.
A vantagem desse método é a contagem somente do número das células
viáveis, o que não ocorre com o método de CBBR – 250.
3.4.1. Cariotipagem
proteínas (necessárias
aminoácidos vitaminas sais outros em meios sem soro
quimicamente definidos)
5.2. Virologia
Na virologia, a cultura de células é muito utilizada para a obtenção viral.
Como os vírus necessitam de hospedeiros, é na cultura de células que é
possível cultivá-los.
A cultura de células permite o isolamento do vírus para avaliar o seu
efeito em determinados tipos celulares, além de verificar quais células são
suscetíveis a determinados vírus.