Localização imuno-histoquímica do fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) no

ovário e o efeito sinérgico do IGF-1 e FSH no desenvolvimento folicular in vitro e na

imunomarcação de receptores de LH

1. Introdução

A cultura folicular in vitro fornece uma ferramenta para novas descobertas sobre a
fisiologia e os mecanismos que regem o desenvolvimento folicular e a maturação de
oócitos [1]. Esses sistemas provaram ser bem-sucedidos na produção de oócitos de alta
qualidade e descendentes vivos de folículos murinos cultivados in vitro [2], mas o número
de embriões produzidos a partir de folículos pré-antrais cultivados in vitro a partir de
grandes espécies animais é muito baixo (suínos: [3]; búfalo: [4]; ovino: [5]; caprino: [6]).
Uma limitação importante é que a qualidade do oócito é significativamente impactada
pelo meio de cultura e condições [1]. Portanto, melhorias no sistema de cultura, como o
uso de componentes de mídia ideais, ajudariam a apoiar o desenvolvimento normal dos
folículos. Entre os fatores que regulam o desenvolvimento folicular ovariano, um papel-
chave é desempenhado pelo fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-1), que
pertence ao sistema IGF [7]. A expressão do mRNA de IGF-1 foi relatada nos ovários de
humanos [8], camundongos [9e11], bovinos [12,13], caprinos [14] e bubalina [15]. Em
espécies ovinas, o mRNA do IGF-1 foi localizado nas camadas granulosa e teca dos folículos
antrais [16,17], e também em oócitos e células granulosas dos folículos pré-antrais [18].
No entanto, a proteína do IGF-1 foi localizada nos folículos pré-antrais e antrais em
caprinos [19] e nos folículos pré-ovulatórios em bubalina [15]. As funções biológicas do
IGF-1 são mediadas pela associação com proteínas de ligação ao IGF (IGFBPs) e receptores
de tirosina quinase tipo I (IGF-IR) [20], que são expressos nas células da teca e granulosa
em bovinos [21]. Após a ligação ao seu receptor, duas vias de sinalização podem ser
ativadas:

Estudos in vitro demonstraram que a adição de IGF-1 ao meio de cultura de tecidos

ovarianos promoveu ativação folicular primordial (humano: [23]; caprino: [19, 24]; bovino:
[25]; ovino: [26]). Além disso, o IGF-1 reduziu a atresia folicular (suínos: [27]; bovinos: [28];
felinos: [29]; ovinos: [26]), aumentou o diâmetro folicular (suínos: [27]; rato: [30]; bovino:
[31]; ovino: [5]), estimulou a formação de antro (bovino: [32]), melhorou as taxas de
maturação dos oócitos [5], aumentou a proliferação de células da granulosa e a
esteroidogênese (camundongo: [33]; rato: [30]; bovinos: [34]). Esse fator de crescimento
também atuou sinergicamente com o FSH para melhorar o desenvolvimento folicular pré-
antral caprino e a produção de oócitos meioticamente competentes [35] e para aumentar
o diâmetro folicular em camundongos [36]. Além disso, O IGF-1 aumenta a expressão do
receptor de LH (LHR) nas células da granulosa de rato cultivadas na presença de FSH,
enquanto o IGF-1 sozinho não induz a expressão de mRNA do LHR [37]. Assim, é claro que
o IGF-1 é importante para o desenvolvimento folicular e existem variações dependentes da
espécie na expressão e ação do IGF-1. Portanto, imuno-histoquímica adicional para
detectar a proteína IGF1 e a cultura folicular in vitro pode ser usada para avaliar o efeito
do IGF-1 no crescimento folicular de ovinos [18]. Além disso, hipotetizamos que a
associação entre IGF-1 e FSH poderia modular a intensidade da imunocoloração da
proteína LHR após a cultura, mas a expressão da proteína LHR nos folículos antrais de
ovelhas antes ou após a cultura in vitro ainda não é conhecida. Os objetivos deste estudo
foram: (i) examinar a imunocoloração da proteína IGF-1 em ovários de ovinos,
 2. materiais e métodos

A menos que indicado, os meios, suplementos e produtos químicos utilizados neste estudo
foram adquiridos na Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).

2.1. Fonte dos ovários

Os ovários (n ¼ 100) foram coletados em um matadouro local de 50 ovelhas adultas de raça

mista (Ovis aries) (a raça não teve efeito significativo no crescimento folicular [38]). Desses
ovários, 16 ovários foram utilizados para análise imuno-histoquímica; 60 para cultura in vitro
de folículos secundários (30 ovários para cada experimento) e 24 para maturação in vitro.
Imediatamente após a morte, os ovários foram lavados uma vez em álcool a 70% (Dinamica,
São Paulo, Brasil) ~ seguidos por duas vezes em Meio Essencial Mínimo tamponado com HEPES
(MEM-HEPES) e suplementados com antibióticos (100 mg / mL de penicilina e 100 mg / mL de
estreptomicina). Posteriormente, os ovários foram transportados dentro de 1 h para o
laboratório em tubos contendo MEM-HEPES com antibióticos a 4 ° C [39].

2.2. Imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada de acordo com estudos anteriores [40]. Os ovários (n ¼ 16)
de quatro ovelhas foram coletados e fixados em formalina tamponada a 10% (Dinamica). Após
18 h de fixação, o tecido ovariano foi desidratado com concentrações crescentes de etanol
(Dinamica), clarificado em xileno (Dinamica) e embebido em parafina (Dinamica). Cortes (5 mm
de espessura) de cada bloco foram cortados usando um micrótomo (EasyPath, São Paulo,
Brasil) e montados em lâminas de vidro ~ Starfrost (Knittel, Braunschweig, Alemanha). As
lâminas foram incubadas em tampão de citrato (Dinamica) a 95 ° C em uma câmara de
cobertura (Biocare, Concord, EUA) por 40 minutos para recuperar a antigenicidade, e a
atividade endógena da peroxidase foi evitada por incubação com 3% de H2O2 (Dinamica) e
metila. etanol (QEEL, São Paulo, Brasil) por 10 min. Os locais de ligação não específicos foram
bloqueados usando soro normal de cabra a 1% (Biocare) e diluídos em solução salina
tamponada com fosfato (PBS; Sigma Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EUA).
Posteriormente, as seções foram incubadas em câmara umidificada por 60 minutos em
temperatura ambiente com coelho policlonal anti-IGF-1 (1:50; referência: (H-70) sc 9013,
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) anticorpos. Depois disso, as seções foram
incubadas por 20 min com polímero MACH4 Universal HRP (Biocare). A localização das
proteínas foi demonstrada com diaminobenzidina (DAB; Biocare) e as seções foram
contrastadas com hematoxilina (Vetec, São Paulo, Brasil) por 1 min. ~ Os controles negativos
(controle da reação) foram submetidos a todas as etapas, exceto a incubação do anticorpo
primário. Os folículos pré-antrais foram classificados conforme definido anteriormente [41],
em primordial (oócito cercado por uma única camada de células granulosa escamosa ou
escamosa e cuboidal), primário (oócito cercado por uma única camada de células granulosa
cuboidal), secundário (oócito cercado por duas ou mais camadas de células da granulosa
cuboidal) ou folículos antrais (presença de uma cavidade antral). Nos diferentes
compartimentos foliculares (células de ovócitos, granulosa e teca), a imunocoloração foi
classificada como ausente, fraca, moderada ou forte. As lâminas foram examinadas usando um
microscópio (Nikon, Tóquio, Japão) sob ampliação de 400. Nos diferentes compartimentos
foliculares (células de ovócitos, granulosa e teca), a imunocoloração foi classificada como
ausente, fraca, moderada ou forte. As lâminas foram examinadas usando um microscópio
(Nikon, Tóquio, Japão) sob ampliação de 400. Nos diferentes compartimentos foliculares
(células de ovócitos, granulosa e teca), a imunocoloração foi classificada como ausente, fraca,
moderada ou forte. As lâminas foram examinadas usando um microscópio (Nikon, Tóquio,
Japão) sob ampliação de 400.

2.3. Isolamento e seleção de ovinos folículos secundários

O isolamento, a seleção, a cultura e a avaliação folicular foram realizados de acordo com

Pessoa et al. [42] No laboratório, os tecidos adiposos e ligamentos circundantes foram
retirados dos ovários; grandes folículos antrais e corpos lúteos foram removidos. Cortes
corticais ovarianos (1 e 2 mm de espessura) foram cortados da superfície ovariana usando
uma lâmina cirúrgica em condições estéreis e subsequentemente colocados em meio de
retenção constituído por MEM-HEPES com antibióticos. Folículos secundários ovinos, com
aproximadamente 250e300 mm de diâmetro, sem cavidades antrais, foram visualizados
sob um estereomicroscópio (SMZ 645 Nikon, Tóquio, Japão) e isolados mecanicamente por
microdissecção usando agulhas de calibre 26 (26 G). Esses folículos foram então
transferidos para gotículas de 100 mL contendo meio de cultura básico para avaliação da
qualidade. Somente folículos que apresentaram as seguintes características foram
selecionados para cultura: uma membrana basal intacta, duas ou mais camadas de células
da granulosa e um oócito visível e saudável, redondo e localizado centralmente no folículo,
sem citoplasma escuro. Os folículos isolados foram reunidos e alocados aleatoriamente
aos tratamentos com aproximadamente 55 folículos por grupo. Após a seleção, os folículos
foram cultivados individualmente (um folículo por gota) em gotas de 100 mL de meio de
cultura sob óleo mineral em placas de Petri (60 15 mm, Corning, EUA). Todos os folículos
foram cultivados a 39 ° C sob 5% de CO2 por 18 dias. A cada dois dias, em todos os
tratamentos, 60 mL do meio de cultura foram substituídos por meio fresco em cada gota.
duas ou mais camadas de células da granulosa e um oócito visível e saudável, redondo e
localizado centralmente no folículo, sem citoplasma escuro. Os folículos isolados foram
reunidos e alocados aleatoriamente aos tratamentos com aproximadamente 55 folículos
por grupo. Após a seleção, os folículos foram cultivados individualmente (um folículo por
gota) em gotas de 100 mL de meio de cultura sob óleo mineral em placas de Petri (60 15
mm, Corning, EUA). Todos os folículos foram cultivados a 39 ° C sob 5% de CO2 por 18 dias.
A cada dois dias, em todos os tratamentos, 60 mL do meio de cultura foram substituídos
por meio fresco em cada gota. duas ou mais camadas de células da granulosa e um oócito
visível e saudável, redondo e localizado centralmente no folículo, sem citoplasma escuro.
Os folículos isolados foram reunidos e alocados aleatoriamente aos tratamentos com
aproximadamente 55 folículos por grupo. Após a seleção, os folículos foram cultivados
individualmente (um folículo por gota) em gotas de 100 mL de meio de cultura sob óleo
mineral em placas de Petri (60 15 mm, Corning, EUA). Todos os folículos foram cultivados a
39 ° C sob 5% de CO2 por 18 dias. A cada dois dias, em todos os tratamentos, 60 mL do
meio de cultura foram substituídos por meio fresco em cada gota. Os folículos isolados
foram reunidos e alocados aleatoriamente aos tratamentos com aproximadamente 55
folículos por grupo. Após a seleção, os folículos foram cultivados individualmente (um
folículo por gota) em gotas de 100 mL de meio de cultura sob óleo mineral em placas de
Petri (60 15 mm, Corning, EUA). Todos os folículos foram cultivados a 39 ° C sob 5% de CO2
por 18 dias. A cada dois dias, em todos os tratamentos, 60 mL do meio de cultura foram
substituídos por meio fresco em cada gota. Os folículos isolados foram reunidos e alocados
aleatoriamente aos tratamentos com aproximadamente 55 folículos por grupo. Após a
 seleção, os folículos foram cultivados individualmente (um folículo por gota) em gotas de
100 mL de meio de cultura sob óleo mineral em placas de Petri (60 15 mm, Corning, EUA).
Todos os folículos foram cultivados a 39 ° C sob 5% de CO2 por 18 dias. A cada dois dias,
em todos os tratamentos, 60 mL do meio de cultura foram substituídos por meio fresco
em cada gota.

2.4. Experiência 1:

Cultura in vitro de folículos secundários na presença ou ausência de IGF-1 O meio de controle

básico consistia em a-MEM + (pH 7,2e7,4) suplementado com 3,0 mg / mL de BSA, 10 ng / mL
de insulina, 2 mM de glutamina, 2 hipoxantina mM, 5,5 mg / mL de transferrina, 5,0 ng / mL de
selênio e 50 mg / mL de ácido ascórbico. No experimento 1, os folículos foram cultivados no
meio de controle (a-MEM +) ou no a-MEM + 62 APO Monte et al. / Theriogenology 129 (2019)
61e69 suplementado com diferentes concentrações de IGF-1 (10, 50 ou 100 ng / mL). As
concentrações de IGF-1 foram escolhidas com base em estudos anteriores [20,43]. Para esta
cultura, foram realizadas 5 repetições usando 30 ovários. Os aspectos morfológicos de todos
os folículos foram avaliados a cada 6 dias usando um micrômetro ocular pré-calibrado em um
estereomicroscópio (SMZ 645 Nikon) com ampliação de 100 x. Dois tipos de folículos foram
considerados folículos sobreviventes: (i) folículos intactos, caracterizados como translúcidos
com uma membrana basal intacta e cercados por células granulosas brilhantes e homogêneas;
e (ii) folículos extrudados, caracterizados por um folículo com membrana basal rompida e uma
oócito brilhante e intacto (sem sinais de contorno irregular, um oócito escurecido e / ou
células da granulosa) [42]. A atresia folicular foi reconhecida quando se observou um
escurecimento dos oócitos e células cumulus circundantes ou oócitos deformados. As
seguintes características foram analisadas nos folículos morfologicamente normais: (i)
formação da cavidade antral, definida como o surgimento de uma cavidade translúcida visível
dentro das camadas celulares da granulosa, (ii) o diâmetro dos folículos saudáveis, medidos a
partir da membrana basal, que incluiu duas medidas perpendiculares de cada folículo e (iii) a
taxa de crescimento diário, calculada como a variação do diâmetro durante o período de
cultura (18 dias). Após 18 dias de cultura, os folículos intactos foram cuidadosa e
mecanicamente abertos com agulhas 26 G sob um estereomicroscópio para recuperação de
oócitos. A porcentagem de oócitos totalmente crescidos, isto é, oócitos 110

2.5. Avaliação da viabilidade folicular após cultura

Para a marcação fluorescente viva / morta, após 18 dias de cultura, aproximadamente 20

folículos por tratamento foram colocados em gotículas de 100 mL de solução salina
tamponada com fosfato (PBS) com calceína-AM 4 mM e homodímero-etídio-etídio 2 mM
(Molecular Probes, Invitrogen , Karlsruhe, Alemanha), seguido de incubação a 39 ° C por 15
min. Posteriormente, os folículos foram lavados em PBS e examinados usando um microscópio
de fluorescência (Nikon E200, Tóquio, Japão), com uma ampliação de 400. Os sinais
fluorescentes emitidos de calceínaAM e etodium homodímero-1 foram coletados a 488 e 568
nm, respectivamente. Os folículos foram considerados vivos se o citoplasma foi marcado
positivamente com calceína-AM (verde) e morto se a cromatina celular foi marcada com etídio
homodímero-1 (vermelho) .mm,
 2.6. Experiência 2:

efeito da associação entre IGF-1 e FSH na cultura in vitro de folículos isolados No experimento
2, o meio de controle foi adicionado a-MEM + com 750 ng / mL de FSH (FSH humano
recombinante; Gonal-F®; MerkSerono SpA, Bari Itália). Aproximadamente 55 folículos
secundários por tratamento foram cultivados no meio de controle (a-MEM + + FSH) ou no
meio de controle suplementado com 10, 50 ou 100 ng / mL de IGF-1. A concentração de FSH
foi escolhida de acordo com um estudo recente realizado por nosso grupo com cultura
folicular secundária de ovinos (Barros et al. Dados não publicados). Para esta experiência,
foram realizadas 5 repetições usando 30 ovários. Conforme descrito para o experimento 1, a
cada 6 dias de cultura, os folículos foram avaliados quanto a aspectos morfológicos (folículos
sobreviventes, formação da cavidade antral, diâmetro do folículo, taxa de crescimento e
porcentagem de oócitos totalmente crescidos).

2.7. Análise histológica de folículos isolados cultivados

Para obter uma visão mais detalhada das estruturas foliculares após a cultura in vitro, os
folículos foram processados para exame histológico conforme descrito anteriormente [44],
com algumas modificações. Após 18 dias de cultura, folículos isolados de todos os tratamentos
foram fixados em paraformaldeído a 4% por 1 h. Depois disso, os folículos foram lavados duas
vezes em PBS. As amostras foram desidratadas por incubação com concentrações crescentes
de etanol (70 e 100%). Os folículos foram então embebidos em parafina e as seções seriais de
3 mm foram cortadas. As seções foram montadas, coradas com hematoxilina-eosina e
analisadas por microscopia óptica (400; Nikon). Para esta análise, os folículos foram
classificados como morfologicamente normais ou atréticos. Os folículos normais mostraram
oócitos intactos (sem núcleo picnótico ou retração citoplasmática) cercados por células da
granulosa organizadas. Inversamente,

2.8. Coloração imuno-histoquímica da proteína LHR em folículos antrais antes e depois

da cultura in vitro

Para verificar a hipótese de que a interação entre IGF-1 e FSH poderia aumentar a proteína
LHR, uma análise imuno-histoquímica foi realizada para abordar a imunocoloração da proteína
LHR em folículos antrais de tecido ovariano fresco e também em folículos isolados cultivados
por 18 dias no tratamento que mostrou a maior porcentagem de oócitos totalmente crescidos
(50 ng / mL de IGF-1 associado ao FSH). A imuno-histoquímica de tecidos frescos foi realizada
com os mesmos ovários utilizados para a imunocoloração de IGF-1. Os folículos isolados
cultivados foram fixados e processados para histologia. Posteriormente, a imuno-histoquímica
foi realizada como descrito acima usando anticorpo anti-LHR (1: 500; referência: (H-50), sc
25828 Santa Cruz Biotechnology).

2.9. Avaliação de marcadores de estresse oxidativo (níveis intracelulares de ROS e GSH) e

mitocôndrias metabolicamente ativas

Após a cultura, os oócitos dos folículos secundários ovinos isolados cultivados in vitro foram
recuperados e os níveis intracelulares de GSH, ROS e atividade mitocondrial foram medidos
como descrito anteriormente [40]. Resumidamente, 4-clorometil-6.8-difluoro-7-
hidroxicoumarina (CellTracker® Blue; CMF2HC; Invitrogen Corporation), 20, 70 - diacetato de
diclorodiidrofluoresceína (H2DCFDA; Invitrogen Corporation) e MitoTracker Red (MitoTracker®
Red, CMXRos, Molecular, Melbourne) , Victoria, Austrália) foram utilizados para detectar níveis
intracelulares de atividade de GSH, ROS e mitocondrial como fluorescência azul, verde e
vermelha, respectivamente. Aproximadamente 20 oócitos por tratamento foram incubados no
escuro por 30 min em PBS suplementado com 10 mM de CellTracker® Blue, 10 mM de
H2DCFDA e 100 MitoTracker® Red a 39 C. Depois disso, os oócitos foram lavados em PBS e a
fluorescência foi observada sob um microscópio de epifluorescência com filtros UV (370 nm
para GSH, 460 nm para ROS e 579e599 nm para mitocôndrias ativas). As intensidades de
fluorescência dos oócitos foram analisadas usando o método Im

2.10. Maturação de oócitos ovinos de folículos secundários cultivados in vitro

A maturação in vitro (MIV) foi realizada para confirmar que oócitos derivados de folículos pré-
antrais cultivados in vitro, cultivados em meio contendo 50 ng / mL de IGF-1 + FSH, foram
capazes de retomar a meiose. Para APO Monte et al. / Theriogenology 129 (2019) 61e69 63
isso, ovários ovinos adicionais (n ¼ 24) foram coletados, lavados e transportados para o
laboratório como descrito acima. Após 18 dias de cultura, todos os oócitos contidos em
folículos saudáveis foram cuidadosamente coletados com agulhas 26-G sob um
estereomicroscópio. Somente oócitos com 110 mm de diâmetro com citoplasma homogêneo e
cercados por pelo menos uma camada compacta de células cumulus foram selecionados para
MIV como descrito anteriormente [45,46]. Os complexos cumuluseoócitos (COCs) foram
transferidos para gotas de 100 mL de meio de maturação composto por TCM 199
suplementado com 10% de FCS, 1 mg / mL de FSH e 1 mg / mL de LH (hipófise ovina) em óleo e
incubados por 24 h sob 5% de CO2 [47]. Os oócitos foram incubados em gotas de PBS
contendo 10 mM Hoechst 33342 por 15 min à temperatura ambiente no escuro e visualizados
sob microscopia de fluorescência. A configuração da cromatina foi analisada através da
observação da vesícula germinativa intacta (GV), retomada meiótica (incluindo quebra da
vesícula germinativa [GVBD] ou metáfase I [MI]) ou maturação nuclear (metáfase II [MII]).

2.11. Avaliação da fragmentação do DNA pelo ensaio TUNEL

Para avaliação da fragmentação do DNA dos ovócitos após a IVM, os ovócitos foram
submetidos ao ensaio de marcação final da dUTP (TUNEL) mediada por transferência de
desoxinucleotidila (TUNEL), conforme descrito anteriormente [48]. Resumidamente, oócitos
saudáveis foram fixados em solução de paraformaldeído a 4% por 1 h à temperatura ambiente.
Em seguida, os oócitos (15 oócitos por tratamento) foram lavados três vezes em solução de
PBS / polivinilpirrolidona (PVP) e armazenados a 4 ° C em eppendorf com PBS / PVP até o início
do procedimento TUNEL. Depois disso, os oócitos foram incubados em gotículas de 100 mL de
solução permeabilizante (Triton X-100 a 0,1% [v / v] em 10 Mm PBS) por 3 h à temperatura
ambiente. Os controles positivos e negativos foram incubados em gotas de 100 mL contendo
RNase livre de DNase (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA) a 37 ° C por 1 h e lavadas
três vezes em gotas de PBS / PVP. O ensaio TUNEL foi preparado como indicado pelo
fabricante (Kit de detecção de células in situ, Fluoresceína: Boehringer Mannheim / Roche
Diagnostics Ltd., Indianapolis, EUA). Para este fim, 7,5 mL da enzima desoxinucleotidil
transferase terminal (TDT) e 67,5 mL da solução marcador de trifosfato de 2-desoxiuridina 5-
FITC foram feitos para obter 75 mL da mistura TUNEL para a reação. Os grupos experimentais e
o controle positivo foram incubados com 15 mL desta solução por 1 h a 37 ° C em uma câmara
úmida no escuro. O controle negativo foi incubado a 15 mL com a solução marcador. Os
oócitos foram lavados três vezes em gotas de PBS / PVP e incubados em PBS contendo 10 mM
Hoechst 33342 por 15 min à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, os oócitos foram
lavados em gotas de PBS / PVP e as lâminas foram preparadas para avaliação usando um
microscópio de epifluorescência (Nikon E200,

3. Resultados
3.1. Localização imuno-histoquímica do IGF-1 em folículos ovarianos de ovinos

A Fig. 1 e a Tabela 1 mostram o padrão de expressão de coloração imuno-histoquímica para

IGF-1 em ovários de ovinos. Oócitos de folículos primordiais, primários e secundários
apresentaram uma reação forte, moderada e fraca para a proteína IGF-1, respectivamente
(Fig. 1AeC), enquanto os ovócitos de folículos antrais mostraram uma reação moderada (Fig.
1D). A intensidade da imunocoloração foi forte nas células da granulosa dos folículos
secundários (Fig. 1C) e moderada nos folículos antrais (Fig. 1D). Não foi observada coloração
nas células teca ou estroma (Fig. 1D) nem nos controles negativos (Fig. 1E).

3.2. Experiência 1: Cultura in vitro de folículos secundários na presença ou ausência de

IGF-1

Os folículos secundários morfologicamente normais mostraram oócitos localizados

centralmente e células da granulosa normais, as quais foram encerradas por uma membrana
basal intacta (Fig. 2A). Já aos 6 dias de cultura, foi observada cavidade antral (Fig. 2B). Também
foram observados folículos com membrana basal rompida e oócitos intactos extrudidos (Fig.
2C) e folículos atréticos (Fig. 2D) após 18 dias de cultura. A porcentagem de folículos
morfologicamente normais (sobrevivência folicular) diminuiu significativamente do dia 0 ao dia
18 em todos os tratamentos, exceto no meio de controle que manteve (P> 0,05) a
sobrevivência folicular durante toda a cultura (Fig. 3). Após 18 dias, a porcentagem de folículos
normais foi semelhante (P> 0,05) entre todos os tratamentos (82,1%, 71,8%, 65% e 70% para o
meio controle, 10, 50 e 100 ng / mL de IGF-1, respectivamente) .

Fig. 1. Imunolocalização da proteína IGF-1 em folículos ovarianos de ovinos: folículo primordial (A), primário (B),
secundário (C), antral (D) e controle negativo (E). O: oócito; GC: células da granulosa; CT: células da teca. (400)
Barra de escala: 50 mm.
Fig. 2. Folículo morfologicamente normal no dia 0 (A), folículo antral após 6 dias de cultura em 50 ng / mL de IGF-1
(B), folículo extrudido a 100 ng / mL de IGF-1 (C), folículo atrético em 10 ng / mL de IGF-1 (D), folículo viável após
cultura em 50 ng / mL de IGF-1 (E) e folículo não viável cultivado em a-MEM (F) por 18 dias. GC: célula da granulosa;
O: oócito. A: antro. Barra de escala: 100 mm.

Fig. 3. Porcentagens de folículos morfologicamente normais cultivados em a-MEM + ou em diferentes concentrações

de IGF-1 (10; 50 ou 100 ng / mL). (a, b, c) Letras diferentes denotam diferenças significativas entre os períodos de
cultura no mesmo tratamento (P <0,05).
Fig. 4. Experiência 1: formação de antro (A) e diâmetro folicular (B) após cultura in vitro em a-MEM + ou em
diferentes concentrações de IGF-1 (10; 50 ou 100 ng / mL). (a, b, c) Letras diferentes indicam diferenças
significativas entre os períodos de cultura no mesmo tratamento (P <0,05); (A, B, C) Letras diferentes denotam
diferenças significativas entre os tratamentos no mesmo período (P <0,05).

o diâmetro foi observado após a cultura na presença de 10 ng / mL de IGF-1 (Fig. 4B). Além
disso, não houve diferença significativa (P> 0,05) nas taxas de crescimento diário entre os
tratamentos (1,5 mm, 2,1 mm, 2,1 mm e 2,0 mm para a-MEM +, 10, 50 e 100 ng / mL de IGF-1,
respectivamente) ou na taxa de oócitos 110 mm (71,8%, 66,7%, 62,5% e 65,0% para a-MEM +,
10, 50 e 100 ng / mL de IGF-1, respectivamente)

3.3. Experiência 2: efeito da associação entre IGF-1 e FSH na cultura in vitro de folículos
isolados

3.3.1 Morfologia folicular e desenvolvimento após cultura in vitro

A Fig. 5 mostra um folículo secundário normal antes da cultura (Fig. 5A), um folículo antral
após 6 dias de cultura em 50 ng / mL de IGF-1 + FSH (Fig. 5B), bem como um folículo com
membrana basal rompida e extrudido oócitos intactos (Fig. 5C) e folículo atrético (Fig. 5D) após
18 dias de cultura em a-MEM + + FSH. A sobrevivência folicular foi mantida em todos os
tratamentos ao longo da cultura e não houve diferença (P> 0,05) entre os tratamentos após 18
dias (98,3%, 96,4%, 98,3% e 96,4% dos folículos normais para o meio controle, 10 ng / mL IGF-
1 + FSH, 50 ng / mL de IGF-1 + FSH e 100 ng / mL de IGF1 + FSH, respectivamente). O exame
histológico confirmou que folículos normais foram encontrados após cultura in vitro (Fig.
5EeF). Semelhante ao experimento 1, já no dia 6 da cultura, a formação da cavidade antral foi
observada em todos os tratamentos (P <0,05; Fig. 6A).😉
Fig. 5. Folículo morfologicamente normal no dia 0 (A), folículo antral após 6 dias de cultura em 50 ng / mL de IGF-1 +
FSH (B), folículo extrudido a 100 ng / mL de IGF-1 + FSH (C) e folículo atrético cultivado por 18 dias em 10 ng / mL de
IGF-1 + FSH (D). Cortes histológicos mostrando folículos antrais normais após 18 dias de cultura em a-MEM + (E) ou
em 50 ng / mL de IGF-1 + FSH (F). O: oócito, GC: células da granulosa, A: antro. Barra de escala: 100 mm

Fig. 6. Experiência 2: formação de antro (A), diâmetro folicular (B) e porcentagens de oócitos totalmente crescidos
(C) após cultura in vitro em a-MEM + ou em diferentes concentrações de IGF1 (10; 50 ou 100 ng / mL) associado ao
FSH. (a, b, c) Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os períodos de cultura no mesmo tratamento
(P <0,05); (A, B, C) Letras diferentes denotam diferenças significativas entre os tratamentos no mesmo período (P
<0,05).
Fig. 6A). O diâmetro folicular aumentou significativamente em todos os tratamentos no dia 6
da cultura em comparação com o dia 0 (Fig. 6B). Entretanto, após 18 dias, não houve diferença
(P> 0,05) no diâmetro folicular (Fig. 6B) ou na taxa de crescimento diário entre os tratamentos
(9,9 mm, 6,1 mm, 8,1 mm e 9,1 mm para a-MEM + , 10, 50 e 100 ng / mL de IGF-1 + FSH,
respectivamente). Entretanto, é importante destacar que a interação entre 50 ng / mL de IGF-1
e FSH promoveu um aumento significativo na porcentagem de oócitos totalmente crescidos
em comparação com os outros tratamentos (52,5%, 44,6%, 71,7% e 56,4% para um -MEM +,
10, 50 e 100 ng / mL de IGF-1 + FSH, respectivamente; Fig. 6C).

3.3.3 Níveis intracelulares de ERO, GSH e atividade mitocondrial após cultura

No dia 18, os níveis de EROs de ovócitos eram mais altos (P <0,05) no meio contendo 100 ng /
mL de IGF-1 + FSH do que nos outros tratamentos (Fig. 8AeD e M). Além disso, os níveis de
GSH foram semelhantes (P <0,05) entre o meio de controle isolado ou adicionados com 50 ng /
mL de IGF-1 + FSH e mais altos (P <0,05) do que o meio contendo 10 ou 100 ng / mL de IGF-1 +
FSH (Fig. 8EeH e N). Além disso, a atividade mitocondrial foi semelhante (P <0,05) entre o meio
controle isolado ou suplementado com 10 ou 50 ng / mL de IGF

Fig. 7. Imunolocalização da proteína LHR em folículos antrais não cultivados de ovinos (AeB), controle negativo (C) e
folículo isolado cultivado na presença de IGF-1 (50 ng / mL) e FSH (750 ng / mL) (D) O: oócito; GC: células da
granulosa; CT: células da teca (400). Barra de escala: 50 mm.

Fig. 8. Detecção de níveis intracelulares de ERO, GSH e atividade mitocondrial em folículos cultivados em a-MEM +
(A, E, I), 10 ng / mL de IGF-1 (B, F, J), 50 ng / mL IGF-1 (C, G, K) ou 100 ng / mL de IGF-1 (D, H, L). Níveis intracelulares
de ERO (M), GSH (N) e mitocondrial ativo (O) em oócitos de diferentes grupos experimentais. (A, B, C) Dentro de
cada grupo (função ROS, GSH ou mitocondrial), barras com letras diferentes são significativamente diferentes (P
<0,05). Barras de escala: 50 mm.

1 + FSH (P> 0,05) e superior (P <0,05) a 100 ng / mL de IGF1 + FSH (Fig. 8I-L e O).

3.3.4 Configuração da cromatina e fragmentação do DNA após IVM

Após a avaliação da configuração da cromatina, alguns oócitos cultivados na interação entre 50

ng / mL de IGF-1 e FSH permaneceram no GV (20,83%; Fig. 9A). No entanto, a maioria (79,16%)
dos oócitos foi capaz de retomar a meiose (GVBD: 29,17% [Fig. 9B]; MI: 41,66% [Fig. 9C] e MII:
8,33% [Fig. 9D]). O ensaio TUNEL revelou a ausência (Fig. 10A e D) ou muito poucos oócitos
com fragmentação do DNA após IVM. Todos os oócitos apresentaram fragmentação do DNA
no controle positivo (Fig. 10B) e o controle negativo não mostrou coloração na análise TUNEL
(Fig. 10C). Tudo

Fig. 9. Imagens fotomicrográficas epifluorescentes de oócitos ovinos corados com Hoechst 33342 após IVM. Oócitos
obtidos de folículos cultivados em 50 ng / mL de IGF1 + FSH em GV (A), GVBD (B), MI (C) ou MII (D). Seta: cromatina
nuclear. Barras de escala: 50 mm.

Fig. 10. Fragmentação representativa do DNA de oócitos de ovelha após 18 dias de cultura. Folículo normal (A, D),
folículo com fragmentação do DNA (B, E) e controle positivo (C e F). Ocitos corados com TUNEL (A, B, C) e Hoechst
33342 (D, E, F). Barras de escala: 50 mm.
os oócitos mostraram cromatina corada com Hoechst 33342 em fluorescência azul (Fig. 10
DeF). Não foram encontradas diferenças significativas entre o meio de controle e 50 ng / mL de
IGF-1 + FSH (dados não mostrados).

4. Discussão

Este estudo demonstrou pela primeira vez a imunolocalização da proteína IGF-1 em ovários de
ovinos e os efeitos de IGF-1 isoladamente ou em associação com FSH no desenvolvimento in
vitro de folículos secundários isolados e imunocoloração de proteína LHR em folículos antrais.
Nas ovelhas, a proteína IGF-1 foi expressa em oócitos de todos os estágios do desenvolvimento
folicular (primordial, primário, secundário e antral) e nas células da granulosa de folículos
secundários e antrais. Anteriormente, o mRNA do IGF-1 havia sido localizado nos ovários de
outras espécies (humano: [8]; camundongo: [9e11]; bovino: [12,13]; caprino: [14]; bubalina:
[15] e IGF A proteína -1 foi expressa em folículos caprinos [14]) e bubalinos [15] ovarianos.
Além disso, o mRNA do IGF-1 foi expresso nas células granulosa e tecal dos folículos antrais
[16, 17] e em oócitos e células da granulosa de folículos pré-antrais [18] em ovinos. Vale
ressaltar que a expressão do IGF-1 é específica da espécie, sugerindo diferentes mecanismos
de ação. Portanto, a imunolocalização da proteína IGF-1 (Fig. 1) no desenvolvimento folicular
inicial apóia a hipótese de que ela possa estar envolvida na função ovariana em ovinos. Usando
esse conhecimento, avaliamos ainda os efeitos do IGF-1 na cultura in vitro de folículos
secundários ovinos. No entanto, o IGF-1 não influenciou a viabilidade folicular ou o
crescimento, como demonstrado pelos resultados do experimento 1 (Fig. 3 e 4). Da mesma
forma, após sete dias de cultura de tecido ovariano de cabra, a presença de 50 ou 100 ng / mL
de IGF1 não teve influência na taxa de sobrevivência folicular [24]. Mesmo assim, a adição de
10 ng / mL de IGF-1 ao meio de cultura (TCM199) de folículos secundários isolados de ovelhas
aumentou a formação e o crescimento do antro após a cultura de curto prazo [5]. Esses
resultados diferentes podem ser explicados pelas diferenças na mídia base usada (a-MEM x
TCM199). O conteúdo de alguns aminoácidos (arginina, glutamina, leucina e tirosina) é maior
no TCM-199 que no a-MEM [49]. Além disso, o TCM199 contém sulfato de adenina, um
precursor exógeno da adenosina, o que reduziria a isquemia e o estresse oxidativo nos
folículos ovarianos durante a cultura in vitro [50]. Embora não tenhamos avaliado a
imunocoloração por IGF-1 após a cultura, pode-se sugerir que a presença da proteína IGF-1 nas
células da granulosa dos folículos ovinos secundários e antrais pode ser suficiente para apoiar
a integridade folicular e o crescimento observado em nosso meio de controle (a-MEM + sem
IGF-1). Além disso, um estudo anterior com IGF-1 observou uma interdependência das vias de
sinalização da gonadotrofina e IGF-1 [51]. Em camundongos, o efeito do IGF-1 depende do
tamanho do folículo, pois promoveu o crescimento de folículos secundários iniciais (abaixo de
150 mm), enquanto o crescimento de folículos com diâmetro acima de 150 mm não foi
promovido [11]. O último estudo indicou que o crescimento de folículos acima de 150 mm
dependia principalmente de FSH e LH. De fato, o IGF-1 pode atuar sinergicamente com o FSH
para aumentar o crescimento folicular pré-antral e a produção de estradiol em camundongos
[29]. Portanto, hipotetizamos que a associação entre IGF-1 e FSH (experimento 2) poderia
melhorar o desenvolvimento in vitro de folículos secundários ovinos. Embora semelhante
entre os tratamentos, é importante notar que as taxas de folículos normais no experimento 2
(média de 97,5%) foram maiores que as observadas no experimento 1 (média de 68,7%), nas
quais o FSH não estava presente na mídia. Além disso, mais folículos antrais foram observados
no dia 6 da cultura no experimento 2 (54,7%) em comparação ao experimento 1 (18,8%).
Tomados em conjunto, esses achados demonstram a importância do FSH para a manutenção
da viabilidade folicular e formação de antro [47,52]. Comparado ao meio de controle com FSH,
a adição de 50 ng / mL de IGF-1 + FSH ao meio de cultura não resultou em nenhum efeito
aditivo na morfologia folicular ou na formação de antro nas espécies caprina [53] e bovina
[54], ou na viabilidade de folículos bovinos [ 55] Além disso, taxas semelhantes de folículos
normais foram observadas após sete dias de cultura de tecido ovariano de cabra no meio
controle e no meio contendo 100 ng / mL de IGF-1 combinado com FSH [56]. No entanto, tanto
o IGF-1 quanto o FSH a 50 ng / mL são aparentemente necessários para aumentar a
porcentagem de oócitos totalmente crescidos (70%) (Fig. 6C). Esses dados corroboram a
hipótese de que a associação entre IGF-1 e FSH tem um efeito sinérgico no desenvolvimento
de folículos e ovócitos em ovinos, o que também foi relatado em outros estudos in vitro. Por
exemplo, em espécies de caprinos, as porcentagens de oócitos totalmente crescidos após 18
dias de cultura também foram maiores nos folículos cultivados em IGF-1 (50 ou 100 ng / mL) +
FSH do que no grupo controle [35]. Além disso, o FSH atua sinergicamente com o IGF-1 para
aumentar a proliferação de células da granulosa bovina quando comparado ao IGF-1 sozinho,
sugerindo que o FSH aprimore a sensibilidade das células da granulosa ao efeito mitótico do
IGF-1 [57]. Portanto, sugerimos que a produção de esteróides e fatores de crescimento pelas
células da granulosa possa influenciar positivamente o desenvolvimento de oócitos no folículo
ovariano [58]. Outro achado importante do presente estudo é que, após a cultura in vitro em
meio contendo 50 ng / mL de IGF-1 + FSH, uma alta proporção de oócitos retomou a meiose
(79,16%) e 8,33% deles estavam maduros (metáfase II). Portanto, esses resultados apresentam
uma vantagem sobre os relatados por Luz et al. [59] em que folículos ovinos cultivados em
meio contendo IGF-1 possuíam 51,7% de oócitos totalmente crescidos, 60% de retomada da
meiose e nenhum dos oócitos atingiu o estágio da metáfase II. No entanto, acreditamos que
nossa taxa de retomada meiótica seria aumentada em um período prolongado de maturação
(36e40 h), conforme realizado em outros estudos [45,60]. O IGF-1 é capaz de sinergizar com
FSH, aumentando a expressão do mRNA de LHR nas células da granulosa de ratos de maneira
dependente da dose e do tempo [37]. Assim, analisamos ainda a imunocoloração da proteína
LHR em folículos antrais não cultivados (de tecido ovariano fresco) e nos folículos antrais
obtidos da cultura com a associação entre 50 ng / mL de IGF-1 e FSH. Para nosso
conhecimento, este é o primeiro estudo que demonstra a imunocoloração da proteína LHR em
células de oócitos, granulosa e teca dos folículos antrais, sugerindo que o LH pode ter um
papel fisiológico nos folículos de ovinos nesta fase. Curiosamente, de maneira semelhante às
nossas descobertas, a presença de mRNA para LHR também foi observada em oócitos de
camundongos e humanos de folículos antrais [61,62]. A expressão de LHR em oócitos pode
indicar um novo mecanismo de maturação de oócitos mediado por gonadotrofinas
diretamente [62]. O mRNA para LHR também era a Fig. 10. Fragmentação representativa do
DNA de oócitos de ovelha após 18 dias de cultura. Folículo normal (A, D), folículo com
fragmentação do DNA (B, E) e controle positivo (C e F). Ocitos corados com TUNEL (A, B, C) e
Hoechst 33342 (D, E, F). Barras de escala: 50 mm. APO Monte et al. / Theriogenology 129
(2019) 61e69 67 demonstrado em células ovarianas de folículos de rato [37], camundongo
[63], bovino [64,65], canino [66] e humano [67,68]. Neste estudo, é importante destacar que
foi observado um aumento da imunocoloração da proteína LHR em células de oócitos e
granulosa (de imunocoloração moderada a forte) após a cultura dos folículos em meio
contendo 50 ng / mL de IGF-1 e FSH. A expressão de LHR é um dos principais marcadores da
diferenciação induzida por FSH de células da granulosa, e esse processo também é modificado
por muitos fatores de crescimento [37]. Portanto, como sugerido por Hirakawa et al. [37],
podemos especular que o IGF-1 tem um efeito primário na expressão do receptor de FSH que
potencializa secundariamente a ação do FSH e resulta no aumento da imunocoloração da
proteína LHR nas células da granulosa. Outro estudo também demonstrou que o IGF-1
aumentou a expressão do mRNA de LHR nas células da granulosa de folículos antrais bovinos
pequenos e grandes [69]. Além disso, na presença de FSH, o IGF-1 também aumenta a síntese
de LHR nas células intersticiais de ratos [70] e nas células da granulosa [71] dos folículos
antrais. Nossos dados também podem indicar um papel fisiológico da LHR no processo de
maturação oocitária. Estudos futuros utilizando um ensaio quantitativo de proteínas, como
Western Blot, são necessários para elucidar completamente esses mecanismos e também
podem contribuir para o desenvolvimento de um meio de cultura ideal para as espécies
ovinas. Níveis semelhantes de ERO, GSH e mitocôndrias metabolicamente ativas foram
observados no meio de controle com FSH ou em meio contendo 50 ng / mL de IGF-1 e FSH.
Portanto, parece que esses achados podem ter contribuído para as mesmas taxas de
fragmentação do DNA observadas entre esses tratamentos. No entanto, 100 ng / mL de IGF-1
e FSH não foram adequados para o desenvolvimento de oócitos, porque essa combinação
aumentou os níveis de ERO e diminuiu a atividade de GSH e mitocondrial. Estes dados ilustram
os efeitos dependentes dos doses de IGF-1 na função ovariana. Em conclusão, a proteína IGF-1
está presente em todos os estágios do folículo ovariano em ovinos. Além disso, a associação
entre 50 ng / mL de IGF-1 e FSH tem um efeito sinérgico in vitro, aumentando a porcentagem
de oócitos totalmente crescidos e a imunocoloração da proteína LHR em oócitos e células da
granulosa de folículos antrais. Portanto, é provável que a ação sinérgica do IGF-1 com FSH seja
de importância fundamental para a manutenção de um nível crítico de LHR para a maturação
de oócitos no ovário de ovinos