UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUBÁ

INSTITUTO DE RECURSOS NATURAIS

EBP026 - SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS
Drª Profª Thais Suzane Milessi Esteves

ROMPIMENTO CELULAR

Itajubá, 08 de março de 2021.

 UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUBÁ
INSTITUTO DE RECURSOS NATURAIS
EBP026 - SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS
Drª Profª Thais Suzane Milessi Esteves

ROMPIMENTO CELULAR

Alunos:
Cornelio Ribeiro Garcia - 2017002837
Fabíola de Oliveira Ribeiro - 2017002532
Mirraylow Pegorete - 2017004457
Talita Silva Belo - 28135

Itajubá, 08 de março de 2021.

 1. INTRODUÇÃO
Vários produtos têm nas leveduras sua principal fonte de obtenção, uma vez que, proteínas e enzimas
derivadas de microrganismos unicelulares são uma interessante fonte alternativa de substituição à
proteínas tradicionais de alto custo. Sabendo que, leveduras geralmente encontram-se disponíveis em
grandes quantidades, estas podem se tornar uma importante fonte para produtos de maior valor
agregado. (KNOOR ​et al​., 1979). A levedura ​Saccharomyces por ser a uma espécie totalmente
aceitável como alimento para seres humanos destaca-se nesse sentido, sendo amplamente utilizada na
produção de etanol, produtos de panificação, assim como no processamento de bebidas alcóolicas.
(VALDUGA ​et al.​ , 2008).
Para obtenção de componentes celulares intactos, diferentes métodos são estudados a fim de avaliar a
forma que melhor se adequa ao rompimento celular. O rompimento celular constitui a primeira etapa
na separação dos produtos intracelulares e é, portanto, crucial no processo de ​“downstream”​, pois
qualquer dano causado ao produto, nesta fase, pode comprometer e invalidar todos os processos
subsequentes. Vale também ressaltar, que um alto rendimento no rompimento celular resulta em uma
maior flexibilidade nos tratamentos subsequentes necessários ao produto (KESHAWARZ ​et al​.,
1984). O mecanismo adotado no processo depende do tipo de microrganismo empregado e ocorre
após a etapa de separação e lavagem das células obtidas ao final do cultivo (PESSOA & KILIKIAN,
2005).
Os métodos de rompimento celular são divididos em métodos mecânicos como o moinho de bolas,
homogeneizador de alta pressão, prensa francesa e ultrassom e os não-mecânicos. Dentre os últimos
existem os métodos químicos, como ação de detergentes e solventes, e físicos, como congelamento e
choque osmótico (MONKS, 2012).
O rompimento celular com moinho de bolas ocorre a partir do choque de esferas com a biomassa, o
que promove transferência de energia e consequente rompimento das células. O tamanho das esferas,
a velocidade de agitação do moinho e a concentração celular, são alguns fatores que interferem neste
processo (TAMER ​et al.​, 1998). A eficiência do rompimento celular com moinho de bolas depende
de vários parâmetros, como tempo de residência, forças de cisalhamento, tipo de microrganismo,
concentração da suspensão celular e velocidade de agitação. A desvantagem deste método está no
fato de haver uma grande quantidade de interferentes, como por exemplo, geometria da câmara de
rompimento, da velocidade e do tipo de agitador, do tamanho das esferas, da quantidade de esferas,
do diâmetro das esferas, da concentração celular e da temperatura, na sua eficiência e a possibilidade
de cisão das cadeias poliméricas (CHISTI; MOOYOUNG, 1986; GARRIDO ​et al​., 1994).
Já o método de processamento via choque osmótico pode ser efetuado a partir de um tampão fosfato,
ou acetato, ou ainda com água destilada. A extração pode ser realizada apenas com adição desses
solventes, mas também associando os métodos químicos aos físicos, como congelamento/
descongelamento, maceração gral/pistilo, digestão, sonicação (ultrassom), homogeneização por
pressão (PATEL, et al. 2005; CHEN, et al. 2006; PATIL, et al. 2006; SUN, et al., 2006).
As amostras de levedura utilizadas neste experimento foram processadas pelo método mecânico de
moinho de bolas e pelo método físico de choque osmótico.

2. OBJETIVO

Este experimento teve como objetivo a avaliação e comparação dos protocolos para ruptura celular
por meio de choque osmótico e moinho de bolas da levedura ​Saccharomyces cerevisiae​.
 3. METODOLOGIA

3.1 Procedimento de Choque Osmótico

Para esse experimento, pesou-se um grama de levedura ​Sacharomyces cerevisae ​que foram
distribuídos em quatro tubos tipo falcon de 15 ml, e nestes diluídos em 5 ml de uma solução de
bicarbonato de sódio a 0,15M em cada tubo. A seguir são encaminhados ao banho termostático à
37ºC, retirados um por vez nos tempos de 5, 10, 15 e 30 min e transferidos para um banho de gelo
por aproximadamente 5 min. Em seguida os tubos são encaminhados para centrífuga à 3000 rpm por
5 min e o sobrenadante é retirado cuidadosamente em tubos eppendorf para medir a atividade
enzimática.

3.2 Procedimento do Moinho de Bolas

O preparo desse experimento é bastante similar ao anterior, que após serem preparados os quatro
tubos tipo falcon com com 1 grama de levedura e 5 ml de da solução de bicarbonato de sódio,
também é adicionado 5 gramas de esferas de vidro para cada tubo. A seguir os tubos são agitados
mecanicamente com um vortex, retirados também em tempos diferentes de 3, 5, 7 e 10 min, depois
centrifugados a 3000 rpm por 5 minutos e do sobrenadante formado deve ser retirado 0,5 ml, que será
diluído com mais 0,5 ml de água destilada e armazenado em tubos eppendorf.

3.3 Metodologia analítica

Para teste da efetividade dos métodos de rompimento celular aplicados, é feita uma análise de
atividade enzimática a partir da liberação da enzima invertase presente na levedura ​S. cerevisae
utilizada. Para isso é aplicado o método DNS.
Assim, em tubos com rosca, foram adicionados: 1 ml de solução tampão pH 4,5; 0,8 ml de água
destilada; 0,7 ml de solução de sacarose a 0,03M; e após agitados, foram adicionados 50 µL do
extrato enzimático contidos nos tubos de eppendorf obtidos nos procedimentos anteriores e deixados
para agir por aproximadamente 5 min. Em seguida foi adicionado 1 ml de solução de 3,5-DNS e os
tubos foram colocados em banho termostatizado à 100ºC durante 5 min. Para finalizar a reação, os
tubos foram transferidos para um banho de gelo, diluídos em 6,5 ml de água destilada e
encaminhados para leitura espectrofotométrica a 540 nm.
Desta forma será possível calcular a velocidade de formação de glicose e a atividade enzimática da
invertase, como parâmetros os dados da curva de calibração padrão da glicose disponível na Tabela 1
e os dados de absorbância obtidas. O resultado se dará em UI/ml, unidade de atividade da quantidade
da enzima em ml necessária para liberar 1 µmol de glicose por min.

Tabela 1​: Dados da curva padrão da Glicose.

Glicose [g/L] Absorbância

0,15 0,116
0,30 0,286
0,60 0,632
1,20 1,293
2,40 2,425
fonte: roteiro do experimento
 4. RESULTADO E DISCUSSÕES

Por meio da plotagem dos dados da curva padrão de glicose fornecidos no roteiro do experimento,
obteve-se o Gráfico 1, a seguir, que fornece a equação da curva padrão de glicose , pela qual é
possível determinar a concentração de açúcares redutores (ART) liberados pela ação da enzima
invertase.

Gráfico 1.​ Curva padrão de glicose​.

Fonte:Autoral

Através da equação obtida pelo gráfico, tem-se que:

ART = 0, 9728 * ABS + 0, 0055 (1)

4.1. Choque osmótico

A adição de bicarbonato de sódio ao extrato de levedura, atua como um tratamento alcalino de

rompimento celular. Essa mudança drástica na concentração do meio causa um choque osmótico
capaz de solubilizar componentes da membrana celular como fosfolipídios e proteínas. Após essa
extração, pode-se verificar a eficiência do método através da medida da atividade enzimática desses
extratos.

Para isso, foi realizada a leitura da absorbância à 540 nm de cada uma das 4 amostras conforme a
Tabela 1.
 Tabela 1​ ​-​ Resultado do rompimento por choque osmótico

Amostra Tempo de Absorbância

rompimento (min)

1 5 0,644

2 10 0,707

3 15 0,732

4 30 0,962
Fonte:Autoral

A partir da Tabela 1 e da Equação 1, foram obtidas as concentrações de açúcares redutores (ART)

liberados pela ação da enzima invertase, conforme a Tabela 2 e o Gráfico 1

Tabela 2 - ​Açúcar redutor liberados nos diferentes tempos de rompimento

Tempo de Absorbância ART (g/L)

rompimento (min)

5 0,644 0,632

10 0,707 0,693

15 0,732 0,718

30 0,962 0,941
Fonte: Autoral

Gráfico 1 -​ Concentração de açúcar redutor por tempo de ruptura

Fonte: Autoral
Como uma unidade de atividade enzimática (UI/mL) é definida como a quantidade de enzima
necessária para liberar 1 µmol de glicose por minuto por mL (µmol/min.mL), para defini-la primeiro
calculou-se a velocidade de formação de glicose (v) (Equação 2), que depende da concentração de
produto formado, nesse caso, a glicose, que é equivalente à concentração de açúcares redutores
liberados (ART).

Considerando o volume reacional total (VR) e o volume adicionado de enzimas (VE), obtém-se a
Equação 3, utilizada para calcular a atividade enzimática nos diferentes tempos de ruptura. Os
resultados foram explicitados na Tabela 3 e no Gráfico 2.

ART
v = Δt ​[g/L.min] (2)

Onde Δt é o tempo de reação da enzima extraída com o substrato, equivalente à 5 minutos.

VR
AT V = v × 1
M M GLICOSE × 10 3 × VE ​(3)
Onde a massa molecular (MM) de glicose é 180,16 g/mol, VR = 2,5 mL e VE = 50 µL.

Tabela 3​ ​-​ Atividade Enzimática

Tempo de ruptura ART (g/L) v (g/L.min) Atividade enzimática

(min) (UI/ml)

5 0,632 0,126 35,079

10 0,693 0,139 38,481

15 0,718 0,144 39,831

30 0,941 0,188 52,250

Fonte: Autoral

A seguir, encontra-se também a curva de atividade enzimática em relação ao tempo.

Gráfico 2 - ​Perfil de atividade enzimática

Fonte:Autoral
A partir do perfil comportamental da atividade enzimática ao longo do tempo nota-se um padrão
crescente conforme o aumento no tempo de exposição ao choque osmótico. Isso ocorre devido ao
aumento em concentração da enzima invertase, que é liberada da célula pelo choque osmótico.

A medida quantitativa da atividade enzimática é, portanto, uma ferramenta útil na determinação da

eficiência do rompimento celular, além de apresentar baixo custo.

Mediante a análise dos resultados obtidos, dentre os tempos observados, o intervalo de 30 minutos
apresenta o resultado mais satisfatório, porém deveria-se observar até haver uma estabilização da
atividade pelo tempo para se afirmar o tempo real gasto para atingir-se eficiência máxima.

​4.2. Moinho de bolas

De forma análoga ao choque osmótico, foi realizada a leitura espectrofotométrica a 540 nm

de cada uma das 4 amostras, como demonstrado na tabela 4.

Tabela 4 -​ Rompimento com moinho de bolas

Amostra Tempo de rompimento Absorbância

(min) (Amostra diluída 2x)

1 3 0,448

2 5 0,544

3 7 0,568

4 10 0,482
Fonte:Autoral

A partir dos dados da Tabela 4 e da Equação 1, foram obtidas as concentrações de açúcares redutores
(ART) liberados pela ação da invertase, conforme a Tabela 5 e Gráfico 3.

Tabela 5 - ​Açúcar redutor liberados nos diferentes tempos de rompimento

Tempo de Absorbância ART (g/L)

rompimento (min) (diluída 2x)

3 0,448 0,441

5 0,544 0,535

7 0,568 0,558

10 0,482 0,474
Fonte: Autoral
 ​Gráfico 3 - ​Concentração de glicose pelo tempo de ruptura da amostra diluída​.

Fonte: Autoral

A velocidade de reação (v) pode ser novamente calculada empregando-se a Equação 2 enquanto que
para a atividade enzimática deve-se ainda, multiplicar a Equação 3 pelo fator de diluição (2), como
mostrado abaixo:

VR
AT V = v × 1
M M GLICOSE × 10 3 × VE ×d ​ (3’)

Tabela 6​ ​-​ Atividade Enzimática

Tempo de ruptura ART (g/L) v (g/L.min) Atividade enzimática

(min) (UI/ml)

3 0,448 0,088 49,035

5 0,544 0,107 59,411

7 0,568 0,112 62,006

10 0,482 0,095 52,710

Fonte: Autoral

Com os valores da tabela 6, foi possível construir o seguinte gráfico de comportamento ao longo do
rompimento celular.
 Gráfico 4 - ​Perfil de atividade enzimática ao longo do tempo de rompimento celular.

Fonte: Autoral

Igualmente como no caso anterior , é possível observar a partir dos gráficos, que os valores de
concentração de açúcares redutores e de atividade enzimática aumentam ao longo do tempo de
rompimento celular, com exceção do último ponto, que corresponde ao tempo de 10 minutos, no qual
esses valores caem bruscamente. Uma possível explicação para esse comportamento é o aumento da
temperatura observada no tubo de ensaio, devido à alta tensão de cisalhamento ocasionada pelo
movimento das esferas de vidro.
 5. CONCLUSÃO

Ambos os métodos mostram bons resultados, no primeiro método, o Choque Osmótico, o

aumento do tempo em banho maria das amostras, fez com que os valores de concentração de
açúcares redutores e de atividade enzimática aumentassem ao longo do tempo, mas se faz necessário
realizar outras amostras em tempos superiores a 30 min até que se atingiria uma estabilização da
atividade ou que a mesma caísse para então conseguir afirmar o tempo real gasto para atingir-se a
eficiência máxima.
Mas esse método em nível industrial é inviável devido ao seu maior tempo para atingir a
eficiência máxima, logo uma possível solução para diminuir o tempo, seria aumentar o número de
leveduras, porém isso faria com que o preço do mesmo aumentasse.
Já o tempo de rompimento celular no método do Moinho de Bolas fez com que os valores
de concentração de açúcares redutores e de atividade enzimática também aumentasse ao longo do
tempo, porém no minuto 7, atingiu-se a eficiência máxima e logo em seguida, com o aumento do
tempo houve uma queda na atividade enzimática e consequentemente na concentração de açúcares
redutores, possivelmente ocasionada devido ao aumento de temperatura que leva à morte celular,
logo se houver um controle na temperatura do meio esse método poderia ser mantido por mais tempo.
Portanto pode-se concluir que o método mais efetivo é o Moinho de Bolas, pois esse foi o
que obteve maior rompimento celular e consequentemente maior atividade enzimática e em um
menor tempo se comparado ao método do Choque Osmótico.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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