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8 DE OUTUBRO DE 2014

Antecedentes Científicos sobre o Prêmio Nobel de Química 2014

MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA SUPER-RESOLVIDA

A ROYAL SWEDISH ACADEMY OF SCIENCES tem como objetivo promover as ciências e fortalecer sua infuência na sociedade.

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Microscopia de fluorescência super-resolvida

A Real Academia Sueca de Ciências decidiu conceder a Eric Betzig, Stefan W. Hell e WE Moerner o Prêmio
Nobel de Química 2014 pelo desenvolvimento da microscopia de fluorescência de super-resolução.

1. Limite de difração de Abbe

No final do século XIX, Ernst Abbe (Abbe, 1873) e Lord Rayleigh (Rayleigh, 1896) formularam o que é
comumente conhecido como o “limite de difração” para microscopia.
Grosso modo, este limite afirma que é impossível resolver dois elementos de uma estrutura que estão mais
próximos um do outro do que cerca de metade do comprimento de onda (λ) no plano lateral (x,y) e ainda mais
distantes no plano longitudinal ( z). Em outras palavras, as distâncias mínimas ( δxmin, δymin) que, segundo o
critério de Abbe, podem ser resolvidas no plano lateral são aproximadas por

( δxmin , δymin ) =~ λ / 2

Outra consequência da mesma limitação de difração é que não é possível focalizar um feixe de laser em um

ponto de dimensão menor que cerca de λ/2 (Fig. 1).

Figura 1: (Huang et al., 2010, Cell, 143, 1047 – 57). A: (esquerda) Feixe de laser focalizado, (meio)
estrutura, (direita) resolvida (A) e não resolvida (B) características estruturais. B: da esquerda para a direita
célula de mamífero, célula de E. coli , mitocôndria, vírus influenza, ribossomo, GFP, timina.

No caso da microscopia de luz (óptica), que é, juntamente com a microscopia eletrônica, a ferramenta mais
importante para a imagem de estruturas biológicas, isso significa que dois objetos dentro de um

1 (15)
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distância entre 400/2=200 nm (azul distante) e 700/2=350 nm (vermelho distante) não pode ser resolvida.
Para microscopia eletrônica, para a qual o comprimento de onda é ordens de magnitude menor, isso não é
uma limitação real, mas esse método é muito difícil de usar em células vivas. A escala de comprimento do E.
coli é de cerca de 1.000 nm (1 µm), ou seja, maior, mas de magnitude semelhante ao limite de difração
(Fig. 1). Isso explica por que no passado foi difícil imaginar detalhes das estruturas internas das bactérias
vivas e, talvez, por que elas foram consideradas organismos “primitivos” com pouca estrutura interna. Uma
definição mais precisa do limite de Abbe pode ser baseada na função de espalhamento do ponto (PSF) da
microscopia de fluorescência. Ou seja, quando a fluorescência é emitida de uma fonte pontual, devido ao
limite de difração de Abbe ela será espalhada no espaço e aparecerá como uma função quase gaussiana no
plano da imagem de um microscópio. A transformada de Fourier de uma fonte pontual (funcional de Dirac) é
uniforme em todo o espectro de frequência, enquanto a transformada de Fourier do PSF diminui com o
aumento da frequência e se torna zero em uma frequência espacial, 1/ Δmin, nas direções x e y (Figura 2).

Figura 2: (Schermelleh et al., 2010, JCB vol. 190 no. 2 165-175). Esquerda: onda de frequência espacial
alta (verde) e baixa (azul). Direita: transformada de Fourier correspondente da PSF (a função de transferência
óptica OTF) da onda de frequência baixa (1) e alta (1/ Δmin) .

Como a transformada de Fourier da imagem de qualquer objeto é a transformada de Fourier do próprio

objeto multiplicada pela transformada de Fourier do PSF do microscópio, o comprimento Δmin define o limite
de resolução estrutural do microscópio (Schermelleh et al., 2010) . Usando este parâmetro para definir
objetivamente o limite de Abbe, está no plano lateral relacionado aos parâmetros fundamentais da microscopia
como:

(1)

Na microscopia de luz padrão, a resolução normalmente pior na direção axial (z-) é muitas vezes aproximada
pela expressão (Born e Wolf, 2002):

(2)

2 (15)
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Aqui, α é metade do ângulo de abertura sob o qual a fonte pontual é observada e n é o índice de refração do
meio de microscopia. Eq. 1 quantifica o limite de Abbe no plano lateral e grandes esforços têm sido feitos
para otimizar seus parâmetros.

2. Luta precoce com o limite de difração da microscopia óptica

As primeiras abordagens ao limite de Abbe são convenientemente categorizadas como métodos de campo distante (far-field) e de

campo próximo (near-field).

2.1 Campo distante. Melhorias na resolução foram feitas com microscopia confocal (Cremer e Cremer,
1978; Sheppard e Wilson, 1981; Brakenhoff et al., 1985)) e multifotônica (Zipfel et al., 2003; Hell e Stelzer,
2002). Ambos os métodos permitem uma supressão de plano de fundo eficaz
e têm sido importantes também para o estabelecimento da espectroscopia de
molécula única (vide infra). Uma melhoria considerável da resolução notoriamente ruim na direção axial foi
alcançada pela microscopia 4Pi (Hell e Stelzer, 2002; Hell, 2003) e I5M (Gustafsson et al., 1995), onde
duas lentes objetivas são usadas para criar uma imagem quase esférica. ponto focal em 3D. Outro método,
Microscopia de Iluminação Estruturada (SIM) comumente usa a interferência entre dois feixes para criar
um padrão senoidal na luz excitante (Heintzmann e Cremer, 1999; Gustafsson, 2000). Quando tal onda
senoidal interfere no objeto estudado, surgem padrões de luz nos quais detalhes espaciais abaixo do limite de
difração se tornam visíveis (padrões Moiré), permitindo uma melhoria do limite de Abbe confinado a um fator
de dois, desde que a intensidade de fluorescência emitida seja uma função linear da intensidade da luz
excitante. Todas essas abordagens de campo distante podem produzir uma resolução melhorada, por um fator
de dois, em relação ao limite Abbe no plano lateral, e podem proporcionar uma melhoria substancial na direção
axial, aumentando efetivamente o ângulo de abertura do instrumento com o ajuda de duas lentes objetivas.
Embora estendam o limite de resolução de Abbe, essas técnicas permanecem confinadas por suas prescrições.

2.2 Campo próximo. A Fluorescência de Reflexão Interna Total (TIRF) é um fenômeno amplamente
explorado em espectroscopia de fluorescência e microscopia (Ambrose, 1956; Axelrod, 1981).
A luz que é totalmente refletida em ângulos altamente inclinados em relação a uma interface vidro-
meio cria uma onda evanescente, que penetra cerca de 100 nm no meio e pode ser usada para excitar
moléculas fluorescentes no volume muito pequeno próximo à interface. Por este método de microscopia, a
resolução axial é muito melhorada em relação à microscopia padrão, mas sua aplicabilidade é estritamente
confinada a estudos próximos à superfície, enquanto o interior de células inteiras está fora de alcance.

A microscopia óptica de varredura de campo próximo (NSOM, SNOM) é uma técnica que, em princípio,
pode transcender o limite de Abbe indefinidamente. Ele opera sem uma lente objetiva e ilumina uma
superfície estudada a uma distância muito próxima com a luz que emana através de uma abertura estreita,
por exemplo, na extremidade de uma fibra de vidro de formato cônico. Por este método, a onda evanescente
foi limitada lateralmente e axialmente a 20 nm e, assim, transcendeu o limite de Abbe por uma ordem de
magnitude em todas as dimensões (Betzig e Trautmann, 1992). Em um tour de force técnico , o método foi
usado com sucesso para detectar fluoróforos únicos, tornando possível a microscopia de molécula única
(Betzig et al., 1993). Apesar destes sucessos, a implementação deste

3 (15)
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técnica permanece tecnicamente complicada e suas aplicações permaneceram limitadas a

estudos de superfície. O avanço científico e técnico na microscopia de fluorescência super-resolvida
veio na forma de técnicas de excitação de campo distante de dois tipos principais, como será descrito na
próxima seção.

3. Descoberta da microscopia de fluorescência super-resolvida Até

hoje, existem dois princípios de campo distante que levam à microscopia baseada em fluorescência
com uma resolução muito além do famoso limite de Abbe. O primeiro é aqui referido como “ conjunto super-resolvido
microscopia de fluoróforo” e o segundo como “microscopia de fluoróforo único super-resolvido ”.

O primeiro princípio foi originalmente concebido e implementado por depleção de emissão estimulada
(STED) de fluorescência de todas as moléculas em uma amostra, exceto aquelas em uma pequena região
do objeto estudado. Com emissão estimulada de saturação, a região “ativa” pode ser arbitrariamente menor
do que o tamanho limitado por difração. Ao escanear o ponto de luz definindo a região fluorescente através
do objeto estudado e monitorando a emissão de fluorescência continuamente, uma reconstrução
computadorizada do objeto pode ser obtida (Hell, 2000). O princípio também pode ser implementado por
Microscopia de Iluminação Estrutural Saturada (SSIM)
(Gustafsson, 2005). Esses métodos podem ser usados quando as regiões fluorescentes contêm conjuntos de
fluoróforos, bem como fluoróforos únicos e, portanto, são genericamente referidos como “ microscopia de
fluoróforo de conjunto super-resolvido”. Seu denominador comum é que a saturação dos picos de excitação no
SSIM e a saturação da emissão estimulada no STED criam frequências espaciais muito mais altas do que as
permitidas pelo limite de Abbe (Fig. 2). Sua descoberta teve duas fases distintas. A primeira diz respeito às
descrições teóricas dos métodos e a segunda à sua implementação experimental.
Fluoróforos são moléculas que absorvem fótons com energia de determinado espectro de excitação e re-emitem
fótons com energia em determinado espectro de emissão. A grosso modo são componentes de uma molécula
que faz com que ela seja fluorescente.
O segundo princípio é baseado no conhecimento a priori de que virtualmente todos os fótons de um objeto
detectado em um determinado momento vêm de fluoróforos únicos que estão separados uns dos outros por
distâncias maiores que o limite de Abbe (Eq. 1). Essa informação é então usada para estimar a posição dessas
fontes pontuais emissoras com uma precisão muito maior do que a permitida pelo limite de difração de Abbe.
O segundo princípio é aqui genericamente referido como “microscopia de fluoróforo único super-resolvido”. Sua
descoberta pode ser descrita como três etapas distintas. A primeira diz respeito à descoberta da espectroscopia
de fluoróforo único em meio denso, a segunda à descrição teórica do princípio e a terceira à sua implementação
experimental.

3.1 Microscopia fluorófora de conjunto super-resolvida: STED e sua progênie No início da década
de 1990, Stefan Hell mudou-se como pós-doutorando da Alemanha para a Universidade de Turku, na
Finlândia, para encontrar espaço e a possibilidade de desenvolver seu, na época, ideia controversa de que
não era apenas possível, mas também viável transcender o limite de difração de Abbe em microscopia de luz
de campo distante. Em dois artigos teóricos, ele demonstrou os princípios e delineou, em termos quantitativos,
as condições experimentais para o inovador conceito de microscopia Stimulated Emission Depletion (STED)
(Hell e Wichmann, 1994) e técnicas similares (Hell e Kroug, 1995). . De volta à Alemanha, ele finalmente
conseguiu montar um microscópio de fluorescência suficientemente sofisticado para fornecer a prova
experimental do princípio da microscopia STED (Klar et al., 2000). No STED, são usados dois feixes de laser.
Um baixo-

4 (15)
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feixe de laser de intensidade irradia os fluoróforos que definem a estrutura do objeto estudado.
Este feixe exibe uma ampla região focal conforme determinado pelo limite de difração de Abbe. Outro
feixe STED de alta intensidade, desviado para o vermelho em relação ao primeiro feixe, tem um mínimo
de intensidade zero na região focal e sua intensidade cresce em todas as direções a partir do foco. Ele
rapidamente traz fluoróforos que foram excitados pelo primeiro feixe, do estado vibracional fundamental do
primeiro estado singleto excitado, S1, para um estado de alta energia vibracional do estado fundamental
eletrônico, do qual eles se movem rapidamente para o estado vibracional fundamental. Fig. 3).

Figura 3: (Hell et al., Current Opinion in Neurobiology 2004, 14:599–609). (a) Excitação do estado fundamental
eletrônico S0 para S1 com luz verde e retorno a S0 com emissão de luz amarela ou por STED com luz
amarela. (b) Depleção de S1 com STED. (c) Esquerda: densidade de fluorescência amarela nas direções z e
x no plano focal sem STED. Meio: descrição do microscópio STED (superior) e (inferior) excitação verde sem
STED, STED vermelho de baixa intensidade e ponto de excitação verde e STED vermelho de alta intensidade
e ponto de excitação verde. Direita: mancha amarela de fluorescência com STED de alta intensidade.

Por esse arranjo, em conjunto com sequências de pulso ótimas para os feixes de excitação e STED, a
emissão de luz é desligada em todos os lugares, exceto em uma pequena parte da região focal limitada
pela difração. A última região encolhe indefinidamente com o aumento da intensidade do valor máximo, I0,
do feixe STED. A largura, ÿmin, da região efetivamente fluorescente está no plano lateral aproximado por
(Hell et al., 2004)

ÿ
ÿÿ (3)
min
ÿ ÿ (1 II /
2 npecado )
0 sentado

5 (15)
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Segue-se desta expressão que o limite de resolução devido ao critério de Abbe foi removido: a medida
de resolução ÿmin aproxima-se de zero à medida que I0 cresce indefinidamente. De fato, a região
iluminada se aproximará de um funcional de Dirac com I0 aumentando além do limite (Fig. 4).

Figura 4: (Hell et al., Current Opinion in Neurobiology 2004, 14:599–609). (a) Ilustração do princípio de
depleção de fluorescência. (b) Densidade de fluorescência (amarelo) em função da coordenada x no plano
focal nas intensidades STED (I(x), vermelho) com diferentes intensidades máximas (I0). A densidade de
fluorescência (amarelo) torna-se mais nítida com o aumento de I0.

Usando STED, o ponto focal normalmente limitado por difração pode ser feito infinitamente pequeno. É claro
que pode haver outros tipos de problemas, como foto-dano em tecidos biológicos, com feixes STED de alta
intensidade. É importante, no entanto, que esses obstáculos não sejam causados por um limite físico rígido e
possam, portanto, ser sucessivamente removidos, por exemplo, pela introdução de outros mecanismos de
depleção do estado fundamental que não a emissão estimulada, que não requerem uma intensidade tão alta
(Hell e Kroug, 1995). O resultado da primeira demonstração experimental de Hell do princípio STED (Klar et al.,
2000) é ilustrado na Fig. 5, mostrando como a notória má resolução axial é melhorada de cerca de 500 para
100 nm.

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Figura 5: (Klar et al., 2000, PNAS, 97, 8206-8210). (a) Diminuição não linear na intensidade de
fluorescência com o aumento da intensidade de STED, ISTED. Ilustração do ponto de intensidade de
fluorescência nas direções x e z na ausência (b) e presença (d) de STED. Distribuição de fluorescência
medida na direção z na ausência (preto) e presença (vermelho) de STED.

Cinco anos depois, M. Gustafsson demonstrou super-resolução com técnicas SSIM (Gustafsson,
2005). Seu trabalho foi encerrado prematuramente por sua morte trágica em 2011.

3.2 O árduo caminho para a detecção de fluoróforo único em meios densos

Embora a existência de moléculas e seus modos estocásticos de ação tenham sido reconhecidos
há muito tempo (Einstein 1905), a visão de que as reações químicas são partes de um continuum dinâmico
obedecendo a leis determinísticas tem sido notavelmente persistente.

Essa ilusão foi quebrada pela demonstração experimental de flutuações em torno do estado de
equilíbrio de um corante fluorescente ligado ao DNA (brometo de etídio). WW Webb, com seus
colaboradores E. Elson e D. Magde, desenvolveu a técnica de espectroscopia de correlação de
fluorescência (FCS) e pôde usar o teorema de flutuação-dissipação para estimar as constantes de
velocidade que governam a cinética da interação entre o corante fluorescente e o duplo DNA helicoidal em
condições ambientais (Magde et ai., 1972; 1974; Elson e Magde, 1974).
Na mesma época, R. Rigler e colaboradores sugeriram o uso de flutuações de intensidade de fluorescência
para obter conhecimento sobre movimentos moleculares rotacionais e tempos de vida de fluorescência
(Ehrenberg e Rigler, 1974).

Alguns anos depois, T. Hirschfeld usou polietilenoimina para marcar anticorpos (ÿ globulina) com um
grande número de fluoróforos (80-100 por molécula de proteína) (Hirschfeld, 1976). Ele então usou a
microscopia TIRF à temperatura ambiente para observar a difusão, bem como o movimento mecanicamente
acionado dos anticorpos multimarcados através de um pequeno volume iluminado por um laser de Ar.
Esses resultados, obtidos com microscopia de excitação de campo próximo e detecção de campo distante,

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definiu o início do longo e árduo caminho para alcançar a detecção de fluoróforos únicos em
meios densos.

A primeira observação de um único fluoróforo em meio denso foi feita no laboratório de WE

Moerner (Moerner e Kador, 1989). Eles mediram espectros de absorção das estruturas
estatísticas finas de transições ópticas não homogêneas de moléculas de pentaceno simples
em cristais de p terfenil à temperatura de hélio líquido (4 K). O resultado de Moerner foi
revolucionário, principalmente porque ele conseguiu detectar fluoróforos únicos por sua absorção
de fótons em vez de emissão. Seus resultados demonstraram que era realmente possível medir
fluoróforos únicos e, assim, inspiraram grandemente o campo de molécula única. No ano
seguinte, M. Orrit usou o mesmo sistema experimental de Moerner para medir a fluorescência
de fluoróforos individuais. Como esperado, a relação sinal-ruído aumentou bastante em relação
às observações baseadas em absorção (Orrit e Bernard, 1990). No mesmo ano, RA Keller e R.
Rigler com colaboradores detectaram fluoróforos únicos em meio líquido à temperatura ambiente
(Shera et al., 1990; Rigler e Widengren, 1990). Para suprimir a radiação de fundo, Rigler usou
microscopia confocal e Keller usou excitação pulsada em conjunto com detecção de fótons atrasada.
Em 1993, E. Betzig usou microscopia de varredura de campo próximo para estudar fluoróforos simples
em uma superfície seca ao ar com super resolução (Betzig e Chichester, 1993). Em 1994, RA Keller e
colaboradores (Ambrose et al., 1994), bem como S. Xie e colaboradores (Xie e Dunn, 1994) mediram
os tempos de vida do estado excitado de fluoróforos únicos e em um estudo influente no mesmo ano
S. Nie, D. Chiu e R. Zare demonstraram a detecção de difusão de fluoróforo único com microscopia
confocal (Nie et al., 1994). Em 1995, Yanagida documentou a detecção de moléculas únicas de ATP
marcadas com fluorescência interagindo com moléculas únicas de miosina com um microscópio TIRF;
outro marco na espectroscopia de molécula única (Funatsu et al., 1995).

Em resumo, esses resultados científicos abriram caminho tanto para a espectroscopia de molécula
única quanto para a microscopia de molécula única. Uma descoberta muito precoce de grande
impacto conceitual foi a demonstração experimental de flutuações em reações químicas, e a
aplicação da conexão flutuação-dissipação para determinar constantes de velocidade de reação como
realizado por Magde, Elson e Webb. Outro resultado muito precoce, antecipando o que estava por vir
nas próximas duas décadas, foi a demonstração de Hirschfeld com iluminação TIRF e detecção de
campo distante do movimento de moléculas de anticorpos individuais com vários marcadores de
fluorescência. Um avanço decisivo foi a primeira detecção de fluoróforos simples, realizada por Moerner
sob condições de temperatura crio. Este passo, mostrando que o aparentemente impossível se tornou
possível, abriu caminho para uma série de técnicas de molécula única em espectroscopia e microscopia.
Inspirou a detecção de fluorescência de fluoróforos únicos à temperatura crio no laboratório de Orrit e
tornou-se um ponto de referência para a detecção de fluoróforos únicos sob as condições biologicamente
importantes de temperatura ambiente e meio líquido realizadas nos laboratórios de Keller, Rigler e
Yanagida.

3.3 Microscopia de fluoróforo simples super-resolvido: PALM, STORM, PAINT e

seus descendentes

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fonte pontual de fótons. Conforme descrito na seção 1 acima, os fótons de uma fonte pontual atingirão o detector
do microscópio com densidade de probabilidade espacial determinada por sua função de espalhamento de ponto
(PSF) (Fig. 6).

Figura 6: (a) Intensidade de fluorescência pixelizada de um único fluoróforo nas direções xey do detector. (b)
Intensidade de fluorescência na direção x (barras azuis) ajustadas a uma distribuição Normal (linha vermelha, Eq.
4). (c). Densidade de probabilidade do centro (x=0) da distribuição Normal em (b).
O conhecimento de que existe um único emissor permite que a posição da fonte pontual seja estimada
com muito mais precisão (c) do que a largura do PSF (b).

Desprezando o fundo e a pixelização, a densidade de probabilidade, p(x,y), da detecção de fótons no plano

lateral é aproximadamente gaussiana (Thompson et al., 2012):
2
2 ÿ S ÿÿ ÿ
ÿx ÿÿ x ÿ
ÿ ÿ
S

( , isso
pxy ) ÿ 2ÿ 2 2ÿ 2 (4)

C é uma constante de normalização, µx e µy definem o centro lateral do PSF e ÿ é igual ao limite de difração
de Abbe na Eq. 1 acima. A partir do conhecimento de que a distribuição de fótons no detector se origina de uma
fonte pontual, o centro da função de espalhamento pontual pode ser estimado com um erro padrão, ÿmin, em
ambas as coordenadas x e y, dadas por (Bobroff, 1996; Webb, 2002):

ÿ 1 ÿ
ÿÿ ÿ (5)
min
NN 2 sen n ÿ

N é o número total de fótons registrados pelo detector, e vê-se que a resolução espacial do microscópio,
, é melhorado
tomada como sua capacidade de localizar uma fonte pontual, ÿmin do limite original de Abbe pelo fator 1/
ÿN. Isso significa que com 100 fótons detectados de uma única fonte pontual ÿmin é um fator de 10 menor que
o limite de Abbe e com números crescentes de fótons detectados não há limitação estrita de quanto a resolução
pode ser melhorada. Para isso, a estrutura de interesse deve ser tão escassamente marcada com fluoróforos
que sua separação seja maior que o limite de difração. Essa condição, no entanto, leva a outro problema. De
acordo com os teoremas de amostragem de H. Nyqvist (1928) e CE Shannon (1948) uma resolução espacial,
ÿmin, na reconstrução de uma estrutura requer que a estrutura seja

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amostrados uniformemente com uma frequência espacial superior a 2/ ÿmin. Esta condição, no entanto, está
em desacordo com a condição de que a distância do vizinho mais próximo entre os rótulos é maior que o limite
de difração de Abbe. Na verdade, o que é necessário é a dicotomia de uma distribuição muito esparsa de
rótulos de fluorescência para salvar a suposição de que todos eles são fontes pontuais separáveis em conjunto
com uma distribuição muito densa para cumprir os teoremas de amostragem de Nyqvist e Shannon. Uma
solução conceitual para esse dilema lógico foi fornecida pela primeira vez por Eric Betzig.

Apesar do sucesso do trabalho de Betzig em microscopia de fluorescência de campo próximo (por exemplo,
Betzig et al., 1992; 1993), estava ficando cada vez mais claro que o confinamento aos estudos de superfície e
a implementação complicada limitavam o uso desses métodos. Betzig decidiu deixar a ciência acadêmica, mas
continuou a pensar em microscopia de fluorescência super-resolvida. Ele finalmente percebeu uma nova maneira
de alcançar super-resolução sem as deficiências da microscopia de campo próximo (Betzig, 1995). A solução,
ele sugeriu, era determinar as posições de um grande número de fontes pontuais com propriedades espectrais
distinguíveis em duas etapas. Em uma primeira etapa, o PSF de cada classe espectral foi determinado
separadamente. Certificando-se de que cada classe espectral forma um conjunto esparso no espaço, seria
possível determinar as posições de seus membros com super-resolução estimando os centros de seus PSFs
com a precisão da Eq. 5. Considerando as posições de todas as classes juntas, uma imagem de super-resolução
de uma estrutura densamente amostrada pode ser obtida. Uma implementação particular desse método foi
posteriormente usada em experimentos por GJ Brakenhoff e colaboradores (van Oijen et al., 1998), mas ainda
faltava uma maneira ideal de realizar experimentalmente a visão de Betzig.

Dois anos após a proposta de Betzig, Moerner estudava as propriedades de emissão de luz de moléculas
únicas de mutantes da proteína verde fluorescente (GFP) obtida no laboratório de Roger Tsien. Os estudos
(Dickson et al., 1997) foram realizados à temperatura ambiente com a proteína embebida em gel aquoso
arejado. Inesperadamente, quando excitada a 488 nm, a proteína passou por vários ciclos de emissão de
fluorescência intermitente: as moléculas de GFP exibiram um comportamento “piscando”. Após vários ciclos de
piscadas, as moléculas entraram em um estado escuro estável. Surpreendentemente, a partir deste estado
escuro eles podem ser reativados por irradiação a 405 nm.
Esses resultados demonstraram pela primeira vez que era possível orientar opticamente proteínas
fluorescentes entre os estados ativo e inativo pelo uso sofisticado da fotoquímica inerente da proteína (Fig. 7).

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Figura 7: (Dickson et ai., 1997, Nature 388, 355-358). A GFP no estado A é excitada para A* e retorna para A
após a emissão de fótons. Quando I é alcançado de A, não há fluorescência até que I se mova espontaneamente
para A: piscando. Quando I se move para N, não há fluorescência até que N seja ativado para N* por excitação
de 405 nm e GFP retorne para A.

A demonstração de Moerner de piscar e fotoativação abriu o caminho para explorar um vasto espaço de
mutantes GFP para novas propriedades ópticas. J. Lippincott-Swartz projetou uma variante GFP com
propriedades impressionantes (Patterson e Lippincott-Schwartz, 2002). Este mutante é inicialmente opticamente
inativo. Ele pode, no entanto, ser ativado por irradiação a 413 nm e, em seguida, exibe fluorescência quando
excitado a 488 nm. Eventualmente, após intensa irradiação em 488 nm, o mutante é irreversivelmente inativado
pelo fotobranqueamento.

Quando Betzig retornou à ciência acadêmica após seu exílio pós-campo próximo na indústria privada, ele
aprendeu sobre o mutante de Lippincott-Schwartz e percebeu que poderia resolver o problema de encontrar
uma maneira ideal de combinar conjuntos esparsos de fluoróforos com espectros espectrais distintos.
propriedades para um conjunto total denso de fluoróforos. A solução simples seria ativar um subconjunto
aleatório muito pequeno e, portanto, esparso de moléculas mutantes de GFP em uma estrutura biológica por
irradiação de baixo nível a 413 nm. A irradiação subsequente em 488 nm seria então usada para determinar as
posições dos membros do subconjunto esparso em super-resolução, de acordo com a Eq. 5 acima.
Quando o primeiro subconjunto foi irreversivelmente inativado por branqueamento, um segundo pequeno
subconjunto pode ser ativado e as posições de seus membros determinadas em alta resolução, e assim por
diante até que todos os subconjuntos tenham sido amostrados e usados para determinar a estrutura sob
condições autênticas de super-resolução. Isso cumpriu tanto a condição de apenas um subconjunto esparso
sendo observado de cada vez quanto a condição de amostragem espacial de alta frequência (densa) para
cumprir os teoremas de Nyqvist e Shannon, conforme ilustrado na Fig. 8.

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Figura 8: (a) Amostragem espacial de baixa frequência, (b) Amostragem tendenciosa, (c) Amostragem uniforme, (d)
Sobreamostragem.

Em colaboração com Lippincott-Schwarz e HF Hess, Betzig (Betzig et al., 2006) expressou fusões de uma GFP fotoactivável
(PA-GF Kaede), semelhante à descrita acima (Patterson e Lippincott-Schwartz, 2002) e uma transmembrana lisossomal
proteína (CD63) para obter a estrutura super-resolvida de uma seção fina de um lisossomo de mamífero fixo (Fig. 9).

Figura 9: (Betzig et al., Science, 2006, 313, 1642-1645). Distribuição da proteína do lisossomo marcada com GFP (CD63)
sem (A) e com (B) PALM. Caixa grande em B em maior ampliação (C).
Pequena caixa em B em maior aumento (D). Observe que a barra de escala em D está próxima do limite de Abbe.

Eles chamaram seu método de PALM (microscopia de localização fotoativada). Mais tarde, no mesmo ano, X. Zhuang e
colaboradores (Rust et al., 2006) e ST Hess e colaboradores (Hess, 2006) publicaram estudos de microscopia de
fluorescência super-resolvida com base em princípios semelhantes e os nomearam STORM (Stochastic Optical
Reconstruction Microscopy), e fPALM (fluorescência-PALM), respectivamente. Além disso, o grupo de RM Hochstrasser
publicou ainda

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outra estratégia para alcançar a super-resolução (Sharonov e Hochstrasser, 2006). Ele aproveita as
mudanças nos parâmetros de fluorescência (mudança no espectro de emissão) de um marcador de fluorescência
(Vermelho do Nilo) induzido após sua ligação a um alvo intracelular (membrana hidrofóbica).
O método foi denominado PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography).
Desde então, muitos esquemas para controlar as concentrações de fluoróforos ativos foram desenvolvidos
(Thompson et al., 2012).

4. Após a descoberta
A história da microscopia de fluorescência super-resolvida é curta. O conjunto-fluoróforo
A microscopia STED foi implementada no ano de 2000 e os métodos baseados em fluoróforo único no ano de
2006. Apesar disso, as técnicas em rápido desenvolvimento (por exemplo, Sahl e Moerner, 2013) de microscopia
de fluorescência super-resolvida já são aplicadas em larga escala nas principais áreas das ciências biológicas,
como biologia celular, microbiologia e neurobiologia (eg Huang et al., 2010). Neste ponto, há todas as razões
para prever que esse desenvolvimento, já produzindo uma série de resultados novos e anteriormente
inalcançáveis, irá acelerar nas próximas décadas. Espera-se que esse desenvolvimento revolucione a biologia e
a medicina, não menos importante, permitindo descrições quantitativas realistas em resolução em nanoescala da
dinâmica dos processos biológicos moleculares complexos e multidimensionais que definem os fenótipos de
todas as formas de vida.

Måns Ehrenberg
Professor de Biologia Molecular, Universidade de Uppsala
Membro do Comitê Nobel de Química

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