Módulo 3 - Engenharia metabólica

A engenharia metabólica é a modificação intencional do metabolismo celular para a

produção de compostos desejados, para diminuir custos, aumentar rendimentos, aumentar a
eficiência, usar matérias-primas renováveis para fornecer um processo mais ecológico do que
as abordagens químicas tradicionais.

Capítulo 3: Análise de Fluxo Metabólico (MFA)

MFA é uma técnica de modelação baseada em restrições que visa a quantificar os

fluxos metabólicos através de cada reação, ou seja, fluxome (v) com dim(v)=q, dado que um
conjunto suficiente de fluxos é medido (v b com dim(vb )=b ) . O sistema deve ser determinado,
ou seja, o número de equações ≥ número de incógnitas.

Restrições de MFA:

 Estequiometria de reações metabólicas, S;

Cálculo de todos os fluxos não medidos,
 Aproximação de estado pseudo-estacionário;
vu com dim(vu )=qb ( solução única)
 Irreversibilidade de reações metabólicas;
 b fluxos medidos, vb.

Modelação metabólica baseada em restrições

Modelação baseada em restrições (CBM): o objetivo do CBM é prever os fluxos

metabólicos de uma determinada rede metabólica em estado estacionário. Isso é obtido a
partir de um conjunto incompleto de equações, portanto, nenhuma solução única é obtida. Em
vez disso, um espaço de solução é obtido. O termo “baseado em restrições” decorre do fato de
que o conjunto incompleto de equações apresenta restrições que reduzem o tamanho do
espaço de solução final. Uma característica notável é que as equações cinéticas são evitadas
porque são consideradas não confiáveis.

Conjunto incompleto de restrições

 Estequiometria de reações metabólicas;

 Estado pseudo-estacionário; Sistema indeterminado
 Termodinâmica.

Rede metabólica de brinquedo

Considere a seguinte rede metabólica muito simples

com m=5 espécies intracelulares {A,B,C,D,E} e q=7
reações metabólicas com fluxos metabólicos v={v1,
v2, v3, v4, v5, v6, v7} das quais 4 são reações de
troca {v1, v4, v6, v7} com todas as reações sendo
irreversíveis, ou seja, vi≥0 para i=1,…,7.
Restrições básicas da rede de brinquedos:

 Estequiometria de reações metabólicas (matriz S):

 Hipótese de estado pseudo-estacionário: Metabólitos intracelulares não se acumulam

dentro da célula.
 O sistema é indeterminado porque o número de incógnitas (q=7) é maior que o número de
equações (m=5). Um número infinito de v soluções satisfaz a equação.

 Irreversibilidade das reações metabólicas (vj≥0): Um subconjunto de q reações

metabólicas são irreversíveis, consequentemente elas devem ter um valor de fluxo
positivo.

Espaço de solução em estado-estacionário

Equações centrais de MFA:

 Estequiometria de reações metabólicas; Nenhuma

 Aproximação de estado pseudo-estacionário; solução única
 Irreversibilidade de reações metabólicas.

{0=v >A0v
j

Este espaço de solução circunscreve todas as distribuições de fluxo

possíveis. As bordas do cone são todas as vias metabólicas possíveis
chamadas Modos de Fluxo Elementar (EMs).

Análise de Fluxo Metabólico (MFA):

 Conjunto suficiente de fluxos medidos (vb é

conhecido). A solução única O sistema é determinado v* é obtida.

Fluxos medidos: vb, Yb

A determinação dos valores de fluxo medidos, v b, requer experiências especialmente

projetadas. É relativamente fácil determinar os fluxos de troca medindo as concentrações
extracelulares. É mais complexo medir fluxos intracelulares usando marcação isotópica de
carbono. É também de extrema importância determinar os valores do fluxo experimental e
também a variância do erro, Yb.
Classificação de problemas

Em MFA, q é o número de todos os fluxos (dim(v)=q); b é o número de fluxos medidos

(dim(vb)=b); u = q – b é o número de fluxos desconhecidos (dim(vu)=u); m é o número de
equações linearmente independentes (m=rank(S)). Então o sistema é classificado como:

 Indeterminado (m < u): não há equações linearmente independentes suficientes para

calcular todas as taxas de vu; MFA é impossível.
 Determinado (m ≥ u): restrições linearmente independentes suficientes; MFA é
possível.
o Não redundante: m = u.
o Redundante: m > u.

MFA não redundante

Caso 1: MFA não redundante. O número de incógnitas corresponde exatamente ao número de

equações (u=m). O sistema é determinado e não redundante

Matriz quadrada não singular, Su:

Propagação do erro: o erro experimental em v b passa não filtrado para vu. Pode ou não
ser amplificado dependendo da estrutura de S.

MFA redundante com erro homogêneo

Caso 2: MFA redundante com erro homogêneo. Existem mais equações do que incógnitas (a
diferença é chamada de # de redundâncias). O sistema é assim determinado e redundante.
Fluxos desconhecidos são estimados por ajuste linear de mínimos quadrados.

Propagação do erro: o erro experimental em v b é atenuado em vu através de um filtro

de mínimos quadrados. Quanto maior o número de redundâncias, maior é a atenuação do
erro. Mas nenhuma informação sobre o erro é usada. Esta solução assume que o erro é
homogêneo.
Matriz de redundância, R: A matriz de redundância, R, resulta de uma transformação da
equação principal do MFA. É chamada de matriz de redundância porque R≠0 somente quando
o sistema é redundante.

Matriz de variância-covariância do erro estacionário, Y: Se a estequiometria assumida não

estiver correta e/ou os fluxos medidos tiverem erro, a restrição de estado estacionário não
será válida.

e = Rvb≠0(erro de estado estacionário, e, dim(e)=m)

Propagação do erro: o erro experimental em v b é

propagado para o erro em estado estacionário, e. Quanto
maior o # de redundâncias, maior é a atenuação do erro.

MFA redundante com erro heterogêneo

Caso 3: MFA redundante com erro heterogêneo. Existem mais equações do que incógnitas,
portanto, Su não é quadrado. O sistema é determinado e redundante. A matriz de variância-
covariância Yb é conhecida e heterogênea. Em seguida, os fluxos desconhecidos são estimados
por ajuste linear ponderado de mínimos quadrados.

Propagação do erro: o erro experimental em v b é atenuado em vu através de um filtro

de mínimos quadrados ponderado. Quanto maior o # de redundâncias, maior é a atenuação do
erro.

Índice de consistência, h: é utilizado para validar estatisticamente

a estimativa de fluxos desconhecidos, vu. Pode ser aplicado
apenas a sistemas redundantes.

 Erro (e): e = R.vb quando a bioquímica assumida está

correta e a medida vb é isenta do erro, então e=0.
 Índice de consistência (h): h segue uma distribuição X 2
(qui-quadrado) com graus de liberdade iguais ao número
 de redundâncias (m-u) com u o número de fluxos desconhecidos e m o número de
equações linearmente independentes.

MFA Restrito

Num problema prático pode haver restrições adicionais que não podem ser tratadas
pelos casos anteriores 1-3. Se as restrições são todas lineares, então métodos numéricos de
mínimos quadrados lineares podem ser aplicados para resolver MFA. MFA restrito minimiza
diretamente o índice de consistência, h.

Capítulo 4: Análise do balanço do fluxo (FBA)

FBA é uma técnica para calcular os fluxos metabólicos sob a hipótese de um objetivo
metabólico.

O sistema ainda é indeterminado (ou seja, não há equações suficientes para calcular
todas as incógnitas). Os cenários ótimos de fluxo podem, no entanto, ser calculados sob a
suposição de um objetivo metabólico. A solução do fluxo é hipotética e pode não coincidir com
a realidade.

Restrições FBA:

 Estequiometria de reações metabólicas;

Solução de fluxo hipotética que
 Aproximação de estado pseudo-
cumpre o objetivo metabólico.
estacionário;
 Termodinâmica de reações metabólicas;
 Outros.

FBA é o método de escolha para engenharia metabólica. Pode ser usado para projetar
“gene deletion knockouts”, a composição do meio de cultura ou ambos. As funções objetivo
metabólicas comuns usadas no FBA são:

 Maximização de biomassa ou crescimento celular: previsões de modelos consistentes

com dados experimentais para E. coli e H. pylori.
 Maximização da produção de ATP.
 Maximização da taxa de síntese de um determinado produto: Aplicado com sucesso a
cepas mutantes de E.coli.
  Minimizar a produção de ATP para determinar as condições de eficiência energética
metabólica ideal.
 Minimizar a absorção de nutrientes para avaliar as condições sob as quais uma célula
realizará as suas funções metabólicas enquanto consome a quantidade mínima de
nutrientes.

FBA da rede de brinquedos com m=5 metabólitos e q=7 reações. O sistema é

indeterminado, mas os fluxos v podem, no entanto, ser calculados sob a hipótese de uma
função objetivo.

Matematicamente , o FBA é classificado como um problema de otimização. FBA otimiza os

valores de q fluxos metabólicos, v, de modo que uma dada função objetivo, J, seja minimizada.
Como todas as equações envolvidas são lineares, o problema de otimização é classificado
como programação linear (PL).

Parsimonious FBA (pFBA): é uma variação de FBA que minimiza uma determinada função
objetivo desejada (exatamente a mesma que FBA padrão) e simultaneamente minimiza o valor
dos fluxos metabólicos (o termo). Evita soluções de fluxo, v, com valores de fluxo muito altos.

O pFBA é classificado matematicamente como Programação Quadrática (QP): a função

objetivo é quadrática, mas as restrições são lineares.

MOMA: Minimização do Ajuste Metabólico - é um caso especial de FBA para projetar

mutantes nocaute de genes. Implementa uma otimização quadrática para minimizar a
distância euclidiana entre fluxos do tipo selvagem, v WT, e fluxos mutantes knockout, vMUT. Os
fluxos do tipo selvagem, vWT, devem ser conhecidos a priori.

Capítulo 5: Análise de Controlo Metabólico (MCA)

MCA é uma técnica que quantifica como variáveis celulares, como fluxos e
concentrações de espécies, dependem de parâmetros de rede, como concentrações de
enzimas. MCA não assume estado estacionário (como em MFA e FBA) e requer um modelo
metabólico dinâmico. Aplica a análise de sensibilidade para calcular como as propriedades da
rede (por exemplo, concentração de enzimas) afetam as saídas críticas da rede (por exemplo,
fluxo ou concentração de um produto).

Entradas MCA – modelo Saídas MCA

metabólico dinâmico
Estequiometria de reações Coeficiente de
Análise de Sensibilidade elasticidade, Ecs
metabólicas, S
Cinética de reação, r Coeficiente de controlo de
fluxo, FCC
Condições iniciais, C(0) Coeficientes de controlo
de concentração, CCC

Modelo metabólico dinâmico

Considerando uma rede metabólica com m espécies e q reações dentro de um

compartimento perfeitamente misturado de tamanho V. A lista de reações é usada para
construir a matriz estequiométrica, S. EDOs são obtidas pelo balanceamento exato do material
sobre cada espécie bioquímica dentro do compartimento de tamanho V. Um sistema de m
EDOs é obtido da seguinte forma geral.
 As leis de velocidade de reação devem ser conhecidas num modelo dinâmico. Por
exemplo, a lei de velocidade modular que descreve uma reação genérica de vários substratos e
vários produtos em equilíbrio. Assumindo assim, um mecanismo de reação enzimática pelo
qual ns substratos, Si , e np produtos, Pj , ligam-se rapidamente e em ordem aleatória.

O valor da taxa de reação depende não apenas da quantidade de enzima, mas também
das concentrações das espécies e dos parâmetros cinéticos. O MCA é diferente do FBA, pois
leva em conta também o efeito das concentrações e parâmetros cinéticos.

k+, k− − constantes de rotatividade para frente e para trás; K mj - constante de dissociação das
espécies (a mesma interpretação modelo Michaelis-Menten); [E i]: concentração da enzima que
catalisa a reação, Ri.

Análise de sensibilidade local

O objetivo de uma análise de sensibilidade local é determinar o grau de mudança de

alguma propriedade do sistema (como um fluxo ou uma concentração) em resposta a uma
mudança numa outra propriedade (por exemplo, parâmetros, θ ou entradas, u). Local significa
que as sensibilidades podem mudar ao longo do tempo.

Exemplo: Sensibilidade local da concentração da espécie i, c i em relação ao parâmetro cinético

j, θj.

Saídas de Análise de Controle Metabólico (MCA)

A Análise de Controle Metabólico é um tipo especial de Análise de Sensibilidade para

identificar alvos para engenharia metabólica. MCA calcula diferentes tipos de sensibilidades
para explicar como o nível de enzimas afeta um determinado fluxo alvo ou uma determinada
concentração de espécies.
Exemplo: rede metabólica de brinquedos

Modelo dinâmico: equação de balanço de material sobre os metabólitos A,B,C,D,E no

compartimento intracelular perfeitamente misturado de tamanho V.

Rede metabólica de brinquedo: m=5 metabólitos com concentrações (A, B, C, D e E) e q=7

reações (v1,…,v7) com q=7 enzimas (e1,…e7) dentro do compartimento de tamanho V.

O alvo é o aumento do fluxo v4. O alvo é o aumento da concentração de C.

Ambiente e manipulação

 Meio de cultura para crescimento: O meio de cultura de crescimento é uma mistura

de compostos orgânicos e inorgânicos formulados numa forma sólida, líquida ou semi-
sólida projetada para suportar o crescimento de microrganismos ou células. Um meio
 de crescimento quimicamente definido (CD) para células animais normalmente
contém 60-90 compostos diferentes:
 Sistema tampão (por exemplo, vermelho de fenol para células animais); Sais
inorgânicos; Açúcares/Carbohidratos; Aminoácidos; Peptídeos e proteínas;
Ácidos gordos/lípidos; Vitaminas; Elementos (P, Na, K, Mg, Ca…).

Diferentes tipos de meio de cultura:

 SCM (soro contendo médio): Rico em nutrientes – Uso geral – mas altamente
variável: A suplementação com soros e outros componentes derivados de
animais têm sido a principal causa de rejeição de projetos e perdas
econômicas. É o tipo de meio com mais variabilidade.
 SFM (sem soro médio): Suplementação com hidrolisados/ peptonas derivadas
de plantas e fatores de crescimento recombinantes.
 MDL/PFM (meio quimicamente definido/meio sem proteína): No CDM a
identidade das moléculas e as concentrações das moléculas são conhecidas;
Além disso, o PFM não contém nenhuma proteína na sua composição. Todos
os ingredientes são bem definidos; variabilidade na qualidade altamente
reduzida. É o tipo de cultura mais específico.

Meio quimicamente definido (CDM): Adaptado ao processo, linha celular e produto.

- MDL/PFM: está a tornar-se o padrão na área dos biofármacos. A identidade e a concentração

de todos os componentes do meio são conhecidas.

 Vantagem: Ajuste fino ao processo, linhagem celular e até mesmo à molécula alvo;
Possibilidade de controlar a variabilidade.
 Limitação: Conhecimento aprofundado do papel fisiológico dos componentes dos
meios.

Otimização da composição do meio de cultura: A abordagem tradicional para otimizar o meio

de cultura é pelo desenho estatístico de experimentos (DoE) usando diferentes métodos
estatísticos. Normalmente, no estágio 1, uma pré-triagem de componentes críticos é realizada
pela Plakett Burman Design (PBD). Na etapa 2 a concentração dos componentes críticos é
otimizada pelo Central Composite Design (CCD).

Projeto Composto Central (CCD)

- Otimização de CM usando um modelo metabólico: A composição do meio de cultura (CM) e
a taxa de alimentação, F, podem ser calculadas a partir dos resultados da análise de equilíbrio
de fluxo (FBA). Os fluxos de interesse são os fluxos de troca, r exch. Valores de troca negativos
definem a taxa de fornecimento de nutrientes ao meio.

Hipótese: O fornecimento de nutrientes corresponde exatamente ao consumo de nutrientes

calculado pela FBA.

1ªAula TP

Redes bioquímicas: Uma rede é um sistema conexionista composto por nodos e arestas. O
número de arestas é tipicamente muito maior do que o número de nodos As propriedades da
rede são analisadas usando a teoria dos grafos.

 Graph: 1 nodo só se liga a 1 nodo;

 Hipergraph: combinação de 2 nodos – ligações mais complexas que envolvem mais do
que 1 nodo.

Redes metabólicas: compreende um conjunto de reações bioquímicas (catalisadas por

enzimas), bem como
transformações físicas (por
exemplo, transporte por
difusão) com a função de apoiar o metabolismo celular, ou seja, degradação de nutrientes para
geração de energia (catabolismo) e síntese de componentes celulares (anabolismo). Uma rede
metabólica é normalmente codificada como um hipergrafo.

Rede na escala genómica (GEMs): Uma rede em escala genómica é construída

sistematicamente, usando anotação genómica, conjuntos de dados 'omics' e conhecimento.
Todas as reações são asseguradas de serem balanceadas em massa e carga. GEMs fornecem a
melhor representação possível das capacidades metabólicas de um organismo no momento da
reconstrução (não necessariamente completa).

Matriz estequiométrica metabólica, S

Estequiometria de reações metabólicas: uma

lista de reações metabólicas balanceadas e com
os respetivos coeficientes de estequiometria é
um requisito básico na modelação metabólica e
engenharia metabólica. A lista de reações é
analisada em uma matriz estequiométrica da
seguinte forma:

Reações especiais

BIOMASSA: A reação de síntese de biomassa consiste em uma reação de polimerização de

moléculas intracelulares na entidade “biomassa”. A estequiometria desta reação é
estabelecida a partir da análise bioquímica dos constituintes celulares. Normalmente, uma
quantidade considerável de ATP é necessária para a síntese de uma unidade de biomassa. A
reação da biomassa é complexa e incerta. Um problema recorrente é que a composição da
biomassa muda moderadamente ao longo do tempo.

PRODUTO: A reação de síntese de biomassa consiste em uma reação de polimerização de

moléculas intracelulares na entidade “biomassa”. A estequiometria desta reação é
estabelecida a partir da análise bioquímica dos constituintes celulares.

Normalmente, uma quantidade considerável de ATP é necessária para a síntese de uma

unidade de biomassa. A reação da biomassa é complexa e incerta. Um problema recorrente é
que a composição da biomassa muda moderadamente ao longo do tempo.
Conectividade escala livre: Todos os organismos de todos os domínios da vida possuem um
tipo de conectividade sem escala nas suas redes, ou seja, a conectividade obedece à seguinte
lei de potência:

Propriedades-chave das redes bioquímicas:

 Tipo de conectividade escala livre: todas as redes bioquímicas parecem ser sem escala
ou aproximadamente sem escala, ou seja, a conectividade é heterogênea e obedece a
uma lei de potência P(k) α kϒ.
 Hubs: nodos que possuem graus de conectividade muito superiores à média. A grande
maioria dos nós tem baixo grau de conectividade e não são hubs.
 Robustez: devido à heterogeneidade das redes sem escala, interrupções de nós não
levam a uma grande perda de conectividade, portanto, não afeta muito a
funcionalidade geral. A perda dos “hubs” causa no entanto a quebra da rede em
clusters isolados e pode ser letal para as células.
 Modularidade: modularidade hierárquica, em que os módulos (sub-redes) são
constituídos por módulos menores e mais coesos, que por sua vez são constituídos por
módulos menores e mais coesos, etc.
 Motivos: as redes celulares contêm motivos de interação conservados, pequenos
subgrafos que possuem topologia bem definida, como autorregulação e loops feed-
forward.
 Comprimento do caminho curto : os comprimentos do caminho curto entre pares de
nós é um recurso que garante uma reação rápida e eficiente a perturbações (isso
também é conhecido como propriedade de mundo pequeno).
 Redundância de caminhos: a disponibilidade de múltiplos caminhos entre um par de
nodos é uma característica das redes bioquímicas que garante a robustez do sistema.