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PESQUISA ORIGINAL
publicado: 05 de julho de
2017 doi: 10.3389/fpls.2017.01153

O efeito do primer sinérgico do

ácido salicílico exógeno e H2O2 no
aumento da tolerância ao frio durante
a germinação de sementes de milho
(Zea mays L.)
Zhan Li1, Jungu Xu1 , Yue Gao1, Chun Wang1 , Genyuan Guo1 , Ying , Yutao Huang1 ,
Weimin Hu1, Luo1 Mohamed S. Sheteiwy1,2, Yajing Guan1 * e Jin Hu1
1
Seed Science Center, Institute of Crop Science, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou,
2
China, Departamento de Agronomia, Faculdade de Agricultura, Universidade de Mansoura, Mansoura, Egito

O estresse por frio é uma importante restrição para o estabelecimento de plântulas de milho no campo.
Para examinar o papel do ácido salicílico (SA) e peróxido de hidrogênio (H2O2) em resposta ao estresse
por frio, investigamos os efeitos do condicionamento de sementes com a combinação de SA, H2O2 e SA
+ H2O2 na resistência do milho sob estresse por frio (13ÿC) . O condicionamento com SA, H2O2 e
especialmente SA+H2O2 encurtou o tempo de germinação das sementes e melhorou o vigor das
Editado por:
Maren Muller, sementes e o crescimento das plântulas em comparação com os tratamentos com hidrocondicionamento
Universidade de Barcelona, Espanha e sem condicionamento sob baixa temperatura. Enquanto isso, o priming SA+H2O2 aumentou
Revisados pela: notavelmente o conteúdo endógeno de H2O2 e SA, as atividades de enzimas antioxidantes e os níveis
Alex Levine,
Universidade Hebraica de Jerusalém, Israel
de expressão de seus genes correspondentes ZmPAL, ZmSOD4, ZmAPX2, ZmCAT2 e ZmGR. A
Xuelu Wang, atividade da ÿ-amilase foi aumentada para mobilizar o amido para fornecer metabólitos como açúcar
Universidade Agrícola Huazhong,
solúvel e energia para a germinação de sementes sob estresse por frio. Além disso, a combinação
China

Zhong-Guang Li, SA+H2O2 regulou positivamente a expressão dos genes de biossíntese de ácido giberélico (GA)
Universidade Normal de Yunnan, China ZmGA20ox1 e ZmGA3ox2, e a expressão do gene de catabolismo GA ZmGA2ox1; enquanto promoveu
*Correspondência: a expressão dos genes de transdução de sinalização GA de ZmGID1 e ZmGID2 e diminuiu o nível do
Yajing Guan
vcguan@zju.edu.cn
gene inibidor de germinação de sementes ZmRGL2. O gene de catabolismo do ácido abscísico (ABA)
ZmCYP707A2 e as expressões dos receptores de resposta que codificam ZmCPK11 e ZmSnRK2.1 na
Seção de especialidades:
via de sinalização do ABA foram todos regulados positivamente. Esses resultados sugeriram fortemente
Este artigo foi submetido a

Plant Physiology ,
que o priming com SA e H2O2 promoveu sinergicamente o metabolismo de hormônios e a transdução de
uma seção da revista sinal, e melhorou o fornecimento de energia e as atividades de enzimas antioxidantes sob estresse por
Fronteiras na ciência das plantas
frio, que foram intimamente relevantes com o alívio da lesão por frio e a melhora da tolerância ao frio em
Recebido: 29 de julho de 2016
sementes de milho.
Aceito: 15 de junho de 2017
Publicado: 05 de julho de 2017

Citação:
Destaques:
Li Z, Xu J, Gao Y, Wang C, Guo G, Luo Y,
Huang Y, Hu W, Sheteiwy A germinação de sementes e o crescimento de plântulas foram significativamente melhorados sob
MS, Guan Y e Hu J ( 2017 ) Germinação
estresse por frio pelo condicionamento com a combinação SA+H2O2, que foi intimamente relevante com
de sementes de milho (Zea mays L.). Frente.
Planta Sci. 8:1153. a mudança de espécies reativas de oxigênio, metabólitos e fornecimento de energia, metabolismo e
regulação de hormônios.

Palavras-chave: milho, condicionamento de sementes, tolerância ao frio, ácido salicílico, H2O2, biossíntese de GA, catabolismo de ABA,
doi: 10.3389/fpls.2017.01153 enzimas antioxidantes

Fronteiras na Ciência Vegetal | www.frontiersin.org 1 julho de 2017 | Volume 8 | Artigo 1153

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Li et ai.
INTRODUÇÃO
O estresse por frio é um dos mais severos estresses abióticos que inibem
obviamente a germinação das sementes e o crescimento das plantas (Allen
e Ort, 2001). O milho, uma das culturas sensíveis ao estresse por frio (Hola
et al., 2007), muitas vezes encontra baixa temperatura quando semeado no
início da primavera, resultando na redução da emergência de sementes e
crescimento de plântulas (Farooq et al., 2008b; Guan et al., 2009; Imran et al., 2013).
Portanto, é necessário desenvolver novos métodos para aumentar a
tolerância ao frio de sementes de milho (Maslak et al., 2007).
O peróxido de hidrogênio (H2O2) na concentração adequada foi propício
para a quebra da dormência das sementes e o aprimoramento da germinação
(Müller et al., 2009; Lariguet et al., 2013). No entanto, o acúmulo excessivo
de H2O2 causou facilmente lesão celular (Mittler et al., 2004; Bailly et al.,
2008; Kumar et al., 2015). Sinal de H2O2 envolvido direta ou indiretamente
em muitas vias de sinalização de SA, GA, ABA e assim por diante (Durner e
Klessig, 1999; Diaz-Vivancos et al., 2013; Maarouf et al., 2015; Qi et al.,
2015) . Enzimas antioxidantes produzidas em plantas como superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbato peroxidase (APX) e glutationa
redutase (GR) contribuíram para o equilíbrio endógeno de H2O2 (Noctor e
Foyer, 1998; Slesak et al., 2007) . No entanto, existem poucos relatos sobre
a melhoria da resistência ao frio de sementes de milho através da aplicação
de H2O2 .
O ácido salicílico (SA) tem sido bem conhecido como uma molécula
sinalizadora na indução do sistema defensivo da planta a estresses bióticos
ou abióticos (Horvath et al., 2007; Rivas-San Vicente e Plasencia, 2011;
Dong et al., 2014). Sob baixa temperatura, o aumento da biossíntese de SA
endógena foi intimamente relevante com o aumento das atividades de
enzimas antioxidantes e crescimento de plântulas em sementes de milho
(Wang et al., 2013). Guan et ai. (2015) relataram que, como plântulas que
sofrem de estresse por frio (5ÿC), o peso seco de raízes e brotos e as
atividades de enzimas protetoras em sementes de milho de revestimento
tratadas com SA foram obviamente maiores do que aquelas não tratadas
com SA. Embora o SA tenha aumentado a tolerância ao frio do milho, e o
H2O2 possa promover a germinação de sementes, poucos relatos se
concentraram no efeito da combinação de SA e H2O2 no aumento da
tolerância ao frio do milho, e o mecanismo envolvido em seu efeito combinado
permaneceu completamente obscuro.
Durante a germinação de sementes de milho, a ÿ-amilase desempenhou
um papel importante na decomposição do amido em açúcar solúvel (Sun et
al., 2015). Além disso, a germinação de sementes foi geralmente inibida pela
alta concentração de ABA e promovida por AG em muitas espécies (Olszewski
et al., 2002; Yamauchi et al., 2004). O equilíbrio dinâmico da síntese e
catabolismo de ABA e GA foi crucial para a germinação de sementes (Footitt
et al., 2011), o NCED que codifica 9-cis-epoxicarotenoiddioxigenase era
conhecido como o gene chave na biossíntese de ABA, e CYP707A que
codifica ácido abscísico 8-hidroxilases como o gene essencial no catabolismo
do ABA (Footitt et al., 2011). Os genes mensageiros endógenos ABA CPK11
e SnRK2.1, respectivamente, que codificam proteína quinase dependente de
cálcio e proteína quinase não fermentativa relacionada à sacarose, foram
regulados positivamente sob estresses de seca, sal e frio (Mao et al., 2010;
Chen et al., 2012; Yang et al., 2014). O GA20ox (que codifica GA 20-oxidase)
e GA3ox (que codifica GA 3-oxidase) foram os principais genes durante a
biossíntese de AG bioativo.
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Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica
Em contraste, GA2ox que codifica GA 2-oxidase antagoniza poderia ativar
GAs para GAs inativos. As proteínas DELLA repressoras do crescimento
vegetal (DELLA) consistindo de GAI (insensível a GA), RGA (Repressor de
ga1-3) e RGL1-3 (RGA-like1-3) foram inibidores da via de sinal GA. Em que,
RGL2 foi considerado como o principal repressor da germinação de sementes
(Stamm et al., 2012). A ligação do GA com o GID (proteína anã insensível à
giberelina, um receptor de sinalização do GA) poderia desencadear a
degradação do RGL2, resultando em rápida germinação das sementes (Cao
et al., 2006).
Neste experimento, descobrimos que as sementes de milho germinaram
obviamente mais rápido após o priming combinado com SA+H2O2 em
comparação com o tratamento de priming com SA ou H2O2 sozinho.
Portanto, atividades de enzimas antioxidantes, atividades de ÿ-amilase e
expressão de genes correspondentes envolvidos no metabolismo e
transdução de sinal foram determinadas após o priming com a combinação
SA, H2O2 e SA+H2O2 para adquirir melhor entendimento sobre o potencial
mecanismo de priming SA+H2O2 em sementes de milho aumento da
tolerância ao frio.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Sementes de milho de Meiyu No.3 com 10,1% de teor de umidade foram
obtidas da HaiNan Lv Chuan Seed Co., LTD. SA e H2O2 foram adquiridos
de Shanghai Dingguo Biotech Co., Ltd., Shanghai, China.
Preparação de sementes
As sementes foram esterilizadas superficialmente com solução de NaClO
0,5% por 15 minutos e depois lavadas três vezes com água destilada
esterilizada para remover o resíduo de desinfetante. As sementes esterilizadas
foram preparadas com soluções de priming (1:5, p/v) a 20ÿC no escuro por
24 h, sem alterar a solução de priming durante o processo. Em seguida,
todas as sementes preparadas foram secas ao ar a 25ÿC por 48 h até seu
teor de umidade original. Neste estudo, quatro soluções de primer incluindo
água destilada (hidropriming), 0,5 mM de SA, 50 mM de H2O2 e 0,5 mM de
SA+50 mM de H2O2 foram realizadas.
Germinação de sementes e medição da qualidade de plântulas
Todas as sementes de milho preparadas foram germinadas em
toalhas enroladas umedecidas com água por 7 dias em câmaras de
crescimento sob estresse de frio (13ÿC), com densidade de fluxo de fóton
ativo fotossintético de 250 mmol m-2 ·s e uma fotoperíodo de 12 h claro (L):
12 h escuro (D) (Wang et ÿ1 al., 2013). Esses tratamentos foram, respectivamente,
indicados por HP+CS (hidrocondicionamento e
estresse por resfriamento), SA+CS (priming SA e estresse por resfriamento),
H2O2+CS ( priming H2O2 e estresse por resfriamento) e SA+H2O2+CS
(SA+H2O2 estresse de escorvamento e resfriamento). Foram utilizadas seis
repetições de 50 sementes cada para cada tratamento. As sementes
geminadas (radícula de 5 mm penetrada através do tegumento) foram
contadas diariamente por 7 dias, e então a energia de germinação (GE) e a
porcentagem de germinação (GP) foram calculadas no dia 4 e no dia 7,
respectivamente.
2 julho de 2017 | Volume 8 | Artigo 1153
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Li et ai. Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica

(ISTA, 2004). O índice de germinação (IG) foi medido como GI = 6 (Gt/Tt) (Hu de embriões para cada tratamento foram coletados em cada época de
et al., 2005). O tempo médio de germinação (TMG) foi calculado como MGT = amostragem.
6 (Gt × Tt)/6Gt, onde Gt é o número de novas sementes germinadas no tempo
Tt. Extração de RNA total e análise quantitativa de PCR em tempo
A altura da parte aérea e o comprimento da raiz foram medidos manualmente real (RT-qPCR) O RNA total foi isolado do embrião de semente
com uma régua. O peso seco (PS) das plântulas foi pesado diretamente após a
usando reagente Trizol (Huayueyang, Pequim, China) e transcrito reverso
secagem a 80ÿC por 24 h. As medições foram feitas em trinta mudas
usando um kit Rever Tra Ace qPCR RT (Toyobo, Osaka, Japão) seguindo as
selecionadas aleatoriamente por repetição. O índice de vigor (VI) foi determinado
instruções do fabricante. Os primers de RT-PCR específicos de genes foram
como VI = GI × DW (Hu et al., 2005).
projetados com base em suas sequências de cDNA (Tabela Suplementar S1).
Seis genes envolvidos em respostas ao estresse, ou seja, ZmSOD4, ZmAPX2,
ZmCAT2 e ZmGR. ZmAMY (gene ÿ-amilase) envolvido na germinação de
Medições de peróxido de hidrogênio, enzimas sementes. Seis genes envolvidos no sinal GA, ou seja, ZmGA20ox1, ZmGA3ox2,
antioxidantes, malondialdeído, ÿ-amilase e açúcar solúvel Durante a ZmGA2ox1, ZmGID1, ZmGID2 e ZmRGL2. Quatro genes envolvidos no sinal
ABA, ou seja, ZmNCED1, ZmCYP707A2, ZmCPK11 e ZmSnRK2.1.
germinação de sementes após a semeadura, 10 embriões de sementes
por replicação e 6 repetições para cada tratamento em cada tempo de
amostragem (0, 6, 24, 48 e 72 h após semeadura) foram coletados para
ZmPAL (codificando fenilalanina amônia-liase) envolvido na biossíntese de SA.
determinação dos parâmetros fisiológicos. O teor de H2O2 foi medido de acordo
O RT-qPCR foi realizado usando o sistema de detecção de PCR em tempo real
com o método de Doulis et al.
da Roche (Roche life science, Estados Unidos). Cada reação (20 µL) consistiu
em 10 µL de SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Chiga, Japão), 1 µL de
(1997). As atividades de SOD, POD, APX e CAT foram determinadas pelos
cDNA diluído e 0,1 µM de primers diretos e de reserva. As condições de
métodos descritos por Qiu et al. (2005).
ciclagem de PCR foram as seguintes: 95ÿC por 3 min, seguido de 40 ciclos de
A atividade de POD, APX e CAT foi, respectivamente, calculada como µmol de
ÿ1 95ÿC por 10 se 58ÿC por 45 s. O gene Actin do milho foi usado como controle
·FW e ·g
decomposição de ascorbato minÿ1 ·g decomposição minÿ1 µmol H2O2 como
foi definida
ÿ1 interno. A expressão gênica relativa foi calculada de acordo com Livak e
50% de inibição da reação fotoquímica
·FW; enquanto
de nitro-azul
umatetrazólio
unidade(NBT)
de atividade
e os SOD
resultados foram expressos em U · FW. A GR foi quantificada medindo a Schmittgen (2001).

diminuição da
-1
g
de absorbância a 340 nm devido à oxidação da nicotinamida
fosfato de adenina dinucleotídeo (NADPH), e a atividade de GR foi calculada Análise Estatística Os dados
ÿ1 foram analisados por análise de variância (ANOVA) utilizando o Statistical
como µmol de oxidação de NADPH minÿ1 ·g ·FW (Smith e Johnson,
teor1988).
de O
malondialdeído (MDA) foi medido usando o método de reação do ácido Analysis System (SAS) (versão 9.2) seguido de cálculo da Diferença Mínima

tiobarbitúrico (Gao et al., 2009). A atividade da ÿ-amilase foi realizada pelo Significativa (LSD, p < 0,05). Os dados percentuais foram transformados em

método colorimétrico do ácido 3,5-dinitrosalicílico (Li et al., 2009). O teor de arco-pecado antes da análise.

açúcar solúvel nas sementes foi medido pelo método colorimétrico de antronas
(Li e Li, 2013) com ligeira modificação.

RESULTADOS

O condicionamento de sementes aumentou a

Medições de SA endógenas O conteúdo de SA endógena
foi analisado usando HPLC de acordo com o método de Wang et al. (2013). velocidade de germinação de sementes e o crescimento de plântulas

Cada amostra foi moída em pó com nitrogênio líquido e então 0,5 g de pó foi
homogeneizado em 1 ml alíquota de 90% (v/v) de metanol.
Após centrifugação a 10.000 × g por 15 min, o sobrenadante foi seco por purga
de nitrogênio a 35ÿC. O resíduo foi dissolvido em 0,25 ml de TCA a 5% (p/v) e
a fase superior contendo SA foi concentrada por purga de nitrogênio a 35° C.
Além disso, o SA liberado foi extraído de uma fase aquosa inferior. O SA
coletado da fase superior e da fase inferior foram misturados e dissolvidos em
600 µl de fase móvel consistindo em tampão acetato de sódio 0,2 M (pH 5,5)
(90%) e metanol (10%), que foi então filtrado através de um Filtro de membrana
de 0,22 µm e analisado por HPLC (Waters 600, amostrador automático Waters
717, Waters, Milford, Estados Unidos) sob detecção de fluorescência (Waters
474). Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram 305 e 407 nm,
respectivamente. Seis repetições
sob estresse por frio Em comparação com NP + Cn, a germinação de
sementes foi inibida obviamente sob baixa temperatura, e nenhum dos
tratamentos de condicionamento atingiu a mesma velocidade de germinação e
crescimento de plântulas em comparação com NP + Cn (Figura 1 ). A
porcentagem de germinação de NP+Cn foi de 96% no terceiro dia, quando a de
NP+CS foi de 0%. Os tratamentos de condicionamento de sementes promoveram
significativamente a germinação de sementes sob estresse por frio em
comparação com NP+CS. Sementes tratadas com SA+H2O2+CS começaram a
germinar em 1 dia após a semeadura, enquanto as sementes tratadas com
SA+CS ou H2O2+CS começaram a germinar no segundo dia, enquanto as
sementes tratadas com HP+CS retardaram a germinação até o terceiro dia após
semeadura (Figura 1 e Figura complementar S2).
No terceiro dia, a porcentagem máxima de germinação (80,0%) foi registrada
em SA+H2O2 sob estresse por frio, assim como GE, GI, DW e VI, que também
foram significativamente

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Li et ai. Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica

FIGURA 1 | A preparação de sementes aumentou a velocidade de germinação das sementes sob estresse de frio (13ÿC). Barras verticais acima da média indicaram erro padrão de seis réplicas de 50
sementes cada para cada tratamento. Os valores foram média ± SE (n = 6). Diferentes letras minúsculas seguindo os valores indicaram diferença significativa (p < 0,05, LSD) entre
tratamentos. Outras explicações foram mostradas na Tabela 1.

TABELA 1 | A preparação de sementes aumentou a velocidade de germinação das sementes e o crescimento das plântulas sob estresse por frio (13ÿC).

Tratamentos GE (%) GI TMG (d) SH (cm) RL (cm) DW (g/10 plantas) VI

NP+Cnÿ 98,0 ± 0,3a 54,4 ± 0,2a 1,94 ± 0,02a 4,64 ± 0,12a 7,77 ± 0,09a 1,0102 ± 0,0225a 57,3 ± 1,01a

NP+CS 16,6 ± 0,3f 16,9 ± 0,2c 4,98 ± 0,02f 1,05 ± 0,09d 2,11 ± 0,11f 0,0320 ± 0,0009d 0,55 ± 0,02d

HP+CS 76,0 ± 1,0c 24,4 ± 0,1bc 3,99 ± 0,01e 1,08 ± 0,10d 3,24 ± 0,08e 0,0569 ± 0,0018c 1,36 ± 0,04cd

SA+CS 84,1 ± 0,3d 20,8 ± 0,5bc 3,57 ± 0,03d 1,10 ± 0,09d 4,24 ± 0,09d 0,0670 ± 0,0018c 1,40 ± 0,04cd

H2O2+CS 90,3 ± 0,3c 29,6 ± 0,2b 3,45 ± 0,04c 1,30 ± 0,10c 5,16 ± 0,10c 0,0597 ± 0,0011c 1,77 ± 0,03c

SA+H2O2+CS 92,6 ± 0,5b 49,5 ± 0,3a 2,55 ± 0,05a 1,51 ± 0,11b 6,05 ± 0,06b 0,0889 ± 0,0004b 4,40 ± 0,02b

ÿOs valores foram média ± SE (n = 6). Diferentes letras minúsculas seguindo os valores indicaram diferença significativa (p < 0,05, LSD) entre os tratamentos. O padrão de germinação
é de 5 mm de radícula penetrada através do tegumento da semente. GE, energia de germinação; IG, índice de germinação; MGT, tempo médio de germinação; SH, altura do rebento; RL, comprimento da raiz; DW,
o peso seco da plântula; VI, índice de vigor. NP+Cn, sem priming e sem estresse (25ÿC); NP+CS, sem priming e estresse por resfriamento (13ÿC); HP+CS, hidropriming (priming com água)
e estresse por resfriamento; SA+CS, iniciação com ácido salicílico 0,5 mM e estresse por resfriamento; H2O2+CS, priming de peróxido de hidrogênio 50 mM e estresse por resfriamento; SA+H2O2+CS, 0,5 mM
combinação de ácido salicílico e peróxido de hidrogênio 50 mM e estresse por resfriamento.

superior a outros tratamentos de priming (Tabela 1). Todos os priming tratamentos mostraram menos efeito sobre SH, em que H2O2
tratamentos possuíam RL mais longos do que NP+CS, nos quais e SA+H2O2 aumentam significativamente SH em comparação com NP+CS
SA+H2O2 teve o nível relativamente mais alto (6,05 cm). Preparação (Tabela 1).

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Li et ai. Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica

O condicionamento de sementes aumentou o teor de H2O2 conteúdo de NP+Cn diminuiu significativamente em 72 h em comparação
com NP+CS. Exceto por 24 e 72 h, o HP teve obviamente maior teor de
endógeno e diminuiu o teor de MDA sob estresse de frio
MDA do que os outros três tratamentos de priming. As sementes
A concentração de peróxido de hidrogênio aumentou
preparadas com SA apresentaram os menores níveis de MDA de 0 a 72
gradualmente em condições normais (NP+Cn) e foi significativamente
h, seguidas das sementes preparadas com SA+H2O2 e H2O2 sob refrigeração
maior do que NP+CS de 24 a 72 h após a semeadura (Figura 2A). O estresse.
teor de H2O2 em NP+CS manteve um nível baixo e estável e não
mostrou diferença visível durante a germinação das sementes (Figura
A preparação de sementes aumentou o conteúdo de SA endógeno
complementar S1A).
Em comparação com NP+CS, a concentração de H2O2 de H2O2+CS foi e a expressão de ZmPAL regulada positivamente sob estresse
significativamente maior em 0 e 48 h; enquanto SA+CS obviamente por resfriamento h após a semeadura. Sob estresse de frio, as
melhorou a concentração de H2O2 de 48 para 72 h. concentrações de SA tratadas por SA+CS, H2O2 +CS e SA+H2O2+CS
SA+H2O2+CS aumentou o nível de H2O2 em geral, mas não mostrou aumentaram rapidamente em comparação com NP+CS, que foram
diferença distinta com NP+CS e HP+CS de 6 a 72 h. significativamente maiores do que
Além disso, NP+Cn e NP+CS apresentaram níveis de MDA
relativamente mais altos durante a germinação de sementes do que
todos os tratamentos de priming (Figura 2B e Figura Suplementar S1B). O MDA

FIGURA 2 | O condicionamento das sementes aumentou o H2O2 endógeno (A) e diminuiu o teor de MDA (B) sob estresse por frio. Os embriões das sementes foram coletados, respectivamente,
às 0, 6, 24, 48 e 72 h após a semeadura, e foram utilizadas seis repetições para cada tratamento em cada época de amostragem. Diferentes letras minúsculas no topo das barras indicaram
diferenças significativas (p < 0,05, LSD) entre os tratamentos ao mesmo tempo. Barras de erro indicadas ± SE da média (n = 6). Para obter explicações adicionais, consulte a Tabela 1.

FIGURA 3 | O condicionamento de sementes aumentou os teores endógenos de SA (A) e aumentou a expressão de ZmPAL (B) sob estresse por frio. Os embriões das sementes foram coletados,
respectivamente, 0, 6, 24, 48 e 72 h após a semeadura, e foram utilizadas seis repetições para cada tratamento em cada época de amostragem. Diferentes letras minúsculas no topo das barras indicaram
diferenças significativas (p < 0,05, LSD) entre os tratamentos ao mesmo tempo. Barras de erro indicadas ± SE da média (n = 6). Para obter explicações adicionais, consulte a Tabela 1.

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FIGURA 4 | A preparação de sementes estimulou as atividades de enzimas antioxidantes, incluindo superóxido dismutase (A, SOD), ascorbato peroxidase (B, APX), catalase (C, CAT) e glutationa redutase
(D, GR) em resposta ao estresse de frio. Os embriões das sementes foram coletados, respectivamente, às 0, 6, 24, 48 e 72 h após a semeadura, e foram utilizadas seis repetições para cada tratamento em
cada época de amostragem. Diferentes letras minúsculas no topo das barras indicaram diferenças significativas (p < 0,05, LSD) entre os tratamentos ao mesmo tempo. Barras de erro indicadas ± SE da
média (n = 6). Para obter explicações adicionais, consulte a Tabela 1.

HP+CS. Todos os tratamentos de primer aumentaram os teores de SA em SA+H2O2 entre quatro tratamentos de priming sob refrigeração
de 0 a 72 h sob estresse por frio. estresse.

A expressão de ZmPAL de NP+Cn atingiu seu nível máximo 24 h

após a semeadura (160 vezes maior que NP+CS) (Figura 3B); enquanto Seed Priming aumentou a expressão de ZmSOD4,
a expressão de ZmPAL de NP+CS permaneceu em níveis relativamente
ZmAPX2, ZmCAT2 e ZmGR em resposta ao estresse
baixos durante 72 h após a semeadura. Sob estresse por frio, as
por resfriamento No final do condicionamento de sementes,
sementes de priming aumentaram significativamente a expressão de
SA+H2O2+CS, H2O2+CS e HP+CS aumentaram
ZmPAL em comparação com NP+CS e NP+Cn em 0 h, e também
aumentaram a expressão de ZmPAL em comparação com NP+CS em significativamente a expressão de ZmSOD4 em comparação com NP+Cn
24 h. A expressão de ZmPAL foi obviamente maior no caso da combinação e NP+CS, e o nível mais alto de ZmSOD4 foi registrado em SA+H2O2.
SA+H2O2 do que outros três tratamentos de priming de 6 a 48 h após a
semeadura.

Atividades de enzimas antioxidantes estimuladas pela

preparação de sementes em resposta ao estresse por frio
Todas as atividades de enzimas antioxidantes, incluindo SOD,
APX, CAT e GR de seis tratamentos, mostraram uma tendência
ascendente durante a germinação das sementes e atingiram níveis mais
altos em 72 h após a semeadura (Figura 4) . Essas quatro atividades
enzimáticas de NP+CS foram geralmente menores e tiveram diferenças
significativas em 72 h em comparação com as de NP+Cn. No geral, todos
os tratamentos de primer melhoraram as atividades de quatro enzimas
antioxidantes testadas em comparação com NP+CS, com algumas
exceções como HP+CS em 24 h em SOD e H2O2+CS em 72 h em GR.
Os níveis relativos mais altos de quatro enzimas antioxidantes foram
todos registrados
Em 48 h, a expressão de ZmSOD4 em sementes preparadas aumentou
rapidamente, e SA+H2O2 teve um nível de ZmSOD4 significativamente
maior do que outros tratamentos durante a germinação de sementes,
exceto 6 e 24 h.
As expressões de ZmCAT2 e ZmAPX2 em NP+Cn e NP+CS
permaneceram em níveis baixos durante a germinação das sementes
após a semeadura; no entanto, aumentos súbitos ocorreram em NP+Cn
em 24 h, que foram notavelmente maiores do que aqueles em NP+CS e
tratamentos priming (Figuras 5B,C). Todos os quatro tratamentos de
priming melhoraram a expressão de ZmCAT2 e ZmAPX2 em comparação
com NP+Cn e NP+CS em 0 h, dos quais SA+H2O2+CS mantiveram os
níveis mais elevados durante a embebição de sementes do que outros priming
tratamentos.

Fronteiras na Ciência Vegetal | www.frontiersin.org 6 julho de 2017 | Volume 8 | Artigo 1153

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Li et ai.
FIGURA 5 | A preparação de sementes aumentou a expressão de ZmSOD4 (A), ZmAPX2 (B), ZmCAT2 (C) e ZmGR (D) em resposta ao estresse por resfriamento. Os embriões das sementes
foram coletados, respectivamente, às 0, 6, 24, 48 e 72 h após a semeadura, e foram utilizadas seis repetições para cada tratamento em cada época de amostragem. Diferentes letras minúsculas no topo
das barras indicaram diferenças significativas (p < 0,05, LSD) entre os tratamentos ao mesmo tempo. Barras de erro indicadas ± SE da média (n = 6). Para obter explicações adicionais, consulte a Tabela 1.
A expressão de ZmGR de NP+Cn aumentou de 0 a 24 h após a semeadura,
e a maior expressão foi registrada em 24 h em NP+Cn que foi cerca de 14 vezes
maior que NP+CS (Figura 5D). No final do condicionamento de sementes, os
níveis de expressão de ZmGR foram significativamente regulados positivamente,
dos quais SA+H2O2 teve o nível de ZmGR mais alto (32 vezes maior que
NP+CS) entre os quatro tratamentos de condicionamento (Figura 5D, 0 h) .
Além disso, a expressão de ZmGR em SA+H2O2+CS foi visivelmente maior do
que em outros três tratamentos de priming de 0 a 24 h após a semeadura.
Seed Priming aumentou a atividade de ÿ-amilase e o teor de
açúcar solúvel e a expressão de ZmAMY regulada positivamente
sob estresse por frio CS e outros tratamentos de iniciação (Figura 6A).
No final do priming (0 h), as atividades de ÿ-amilase foram melhoradas
obviamente pelos tratamentos com primer em comparação com as sementes
sem primer, e as sementes tratadas com SA, H2O2 e SA+H2O2 apresentaram
níveis de ÿ-amilase mais altos do que as tratadas com HP.
A expressão de ZmAMY em NP+Cn foi aumentada gradualmente de 0 a 48
h, e o valor mais alto foi registrado em 48 h, que foi cerca de 90 vezes maior do
que em NP+CS (Figura 6B). A expressão de ZmAMY foi aumentada
significativamente no final dos tratamentos de iniciação (Figura 6B, 0 h), então
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Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica
diminuiu acentuadamente de 0 a 6 h. SA+H2O2 manteve a expressão de
ZmAMY acima de 100 vezes mais do que NP+CS de 0 a 48 h.
Após a semeadura por 72 h, a expressão de ZmAMY de todos os tratamentos
caiu para um nível baixo.
Além disso, o teor de açúcar solúvel de NP+Cn aumentou rapidamente para
um valor máximo em 48 h após a semeadura, e então acompanhado por um
leve declínio (Figura 6C). Exceto 24 h após a semeadura, os tratamentos de
priming obviamente melhoraram o teor de açúcar solúvel em sementes de milho
em comparação com NP+CS.
Durante a germinação das sementes, SA+H2O2+CS manteve um nível
relativamente mais alto do que outros tratamentos de priming, exceto 48 h
(Figura 6C).
Expressão de ZmNCED1, ZmCYP707A2, ZmSnRK2.1 e
ZmCPK11 sob estresse de frio regulada por iniciação de sementes
A expressão de ZmNCED1 de NP+Cn teve seu valor relativamente
mais alto em 48 h em comparação com outros tempos após a
semeadura (Figura 7A). Ao final do condicionamento (0 h), quatro tratamentos
de condicionamento aumentaram obviamente as expressões de ZmNCED1 do
que sementes não condicionadas, entre as quais o maior nível foi registrado em
HP. Durante a germinação de sementes de 0 a 6 h sob estresse por frio, a
expressão de ZmNCED1 em tratamentos de priming diminuiu rapidamente;
entretanto, de 24 a 72 h, SA, H2O2 e SA+H2O2 apresentaram tendência de
aumento gradual.
7 julho de 2017 | Volume 8 | Artigo 1153
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Li et ai.
FIGURA 6 | A preparação de sementes aumentou a atividade de ÿ-amilase (A) e o teor de
açúcar solúvel (C) e a expressão de ZmAMY regulada positivamente sob (B) estresse por frio.
Os embriões das sementes foram coletados, respectivamente, às 0, 6, 24, 48 e 72 h após a
semeadura, e foram utilizadas seis repetições para cada tratamento em cada época de
amostragem. Diferentes letras minúsculas no topo das barras indicaram diferenças
significativas (p < 0,05, LSD) entre os tratamentos na mesma época de semeadura. Barras de
erro indicadas ± SE da média (n = 6). Para obter explicações adicionais, consulte a Tabela 1.
As expressões de ZmCYP707A2 de tratamentos de iniciação foram reguladas
significativamente em 0 h em comparação com NP+Cn e NP+CS (Figura 7B), em
que SA+H2O2 regulou positivamente a expressão de ZmCYP707A2 em quase 16
vezes do que NP+CS.
No entanto, a expressão de ZmCYP707A2 diminuiu rapidamente e permaneceu
em níveis baixos durante o tempo após a semeadura em diferentes tratamentos.
As tendências de mudança das expressões de ZmSnRK2.1 e ZmCPK11 em
quatro tratamentos de priming foram semelhantes durante a germinação das
sementes (Figuras 7C,D). Às 6 h após a semeadura, atingiram
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Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica
seus níveis mais altos, e a expressão de ZmSnRK2.1 em SA+CS, H2O2+CS,
SA+H2O2+CS e HP+CS foram, respectivamente, 11 vezes, 10 vezes, 10 vezes e
6 vezes maiores que NP +CS; enquanto a expressão de ZmCPK11 foi,
respectivamente, 33 vezes, 50 vezes, 65 vezes e 22,5 vezes maior do que NP+CS.
Além disso, as expressões de ZmSnRK2.1 e ZmCPK11 em NP+Cn atingiram o
máximo em 24 h, que foi, respectivamente, 35 vezes e 58 vezes maior que NP+CS.
Seed Priming Expressão de ZmGA20ox1, ZmGA3ox2, ZmRGL2, ZmGID1
e ZmGID2 regulada para cima e expressão de ZmGA2ox1 regulada para
baixo sob estresse por frio Durante a germinação de sementes, os genes
ZmGA20ox1 e ZmGA3ox2 estiveram envolvidos na biossíntese de AG. A
expressão de ZmGA20ox1 de NP+Cn atingiu o nível mais alto em 24 h (cerca
de 11 vezes maior que NP+CS) e foi significativamente maior que NP+CS de 24 a
48 h (Figura 8A). No final dos tratamentos de priming (0 h), os níveis de expressão
de ZmGA20ox1 foram visivelmente regulados.
SA+H2O2+CS atingiu o nível de expressão mais alto de ZmGA20ox1 (cerca de 25
vezes maior que NP+CS) que foi distintamente maior que os tratamentos H2O2+CS,
SA+CS e HP+CS. Às 6 h após a semeadura, a expressão de ZmGA20ox1
permaneceu aumentando e atingiu níveis obviamente mais altos que foram,
respectivamente, 110 vezes em SA+H2O2+CS, 100 vezes em H2O2+CS, 90 vezes
em SA+CS e 70 vezes em HP+CS maiores que NP+CS, e então eles diminuíram
rapidamente.
A maior expressão de ZmGA3ox2 de NP+Cn foi registrada em 48 h, que foi
significativamente maior do que NP+CS e outros tratamentos (Figura 8B). Quatro
tratamentos de iniciação regularam positivamente a expressão de ZmGA3ox2 em
comparação com NP+CS. Sementes tratadas com SA, H2O2 e SA+H2O2
apresentaram teores mais elevados do que as tratadas com HP de 6 a 48 h sob
estresse por frio. E o valor significativamente mais alto foi registrado em
SA+H2O2+CS.
A expressão de ZmGA2ox1 em NP+Cn foi sempre significativamente menor
do que em NP+CS de 6 a 72 h (Figura 8C). Quatro tratamentos de priming
aumentaram a expressão de ZmGA2ox1 após o priming, que, no entanto, diminuiu
rapidamente no início da germinação das sementes e diminuiu significativamente
em comparação com NP+CS de 24 a 72 h.
SA+H2O2+CS teve o menor valor entre os quatro priming
tratamentos.
As expressões de ZmRGL2 em NP+Cn e NP+CS permaneceram em níveis
baixos após o priming (Figura 8D), o nível marcadamente mais alto foi mostrado
em 24 h em NP+Cn que foi cerca de 22 vezes maior do que NP+CS e outros
tratamentos. Os níveis de expressão de ZmRGL2 foram significativamente
regulados no final dos tratamentos de iniciação em comparação com NP+CS, mas
depois diminuíram rapidamente.
Os genes ZmGID1 e ZmGID2 são dois reguladores positivos para mediar as
vias de sinalização do GA. Os níveis máximos de expressão de ZmGID1 e ZmGID2
em NP+Cn foram observados em 48 h, que foram, respectivamente, cerca de 13
vezes e 3 vezes maiores que NP+CS (Figuras 8E,F). Após quatro tratamentos de
iniciação, as expressões de ZmGID1 e ZmGID2 foram significativamente reguladas
positivamente em comparação com NP+Cn e NP+CS em 0 e 6 h, respectivamente.
8 julho de 2017 | Volume 8 | Artigo 1153
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Li et ai. Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica

FIGURA 7 | A preparação de sementes regulou a expressão de ZmNCED1 (A), ZmCYP707A2 (B), ZmSnRK2.1 (C) e ZmCPK11 (D) sob estresse de resfriamento. Os embriões das sementes foram
coletados respectivamente às 0, 6, 24, 48 e 72 h após a semeadura, e foram utilizadas seis repetições para cada tratamento em cada época de amostragem. Diferentes letras minúsculas no topo das
barras indicaram diferenças significativas (p < 0,05, LSD) entre os tratamentos na mesma época de semeadura. Barras de erro indicadas ± SE da média (n = 6). Para obter explicações adicionais, consulte
a Tabela 1.

Sementes tratadas com SA+H2O2, H2O2 e SA apresentaram maiores os maiores valores de SH, RL, DW e VI. Obviamente, tratamentos de
valores de expressão de ZmGID1 e ZmGID2 do que aquelas tratadas priming são úteis (Elkoca et al., 2007; Pereira et al., 2009; Xu et al.,
por HP (em 48 e 6 h, respectivamente) e o maior valor foi registrado 2011), que podem ser usados para acelerar a germinação de sementes
em SA+H2O2 sob estresse por frio. de milho e melhorar a qualidade de plântulas sob estresse por frio.
Especialmente, SA e H2O2 tiveram efeito sinérgico no aumento da
germinação de sementes.
DISCUSSÃO A capacidade germinativa das sementes parecia estar ligada ao
acúmulo de H2O2 a um nível crítico (Hossain et al., 2015; Huang et
O resfriamento, um dos principais estresses abióticos, exerce severas al., 2017). E o conteúdo de H2O2 foi relacionado com o enfraquecimento
influências no crescimento e desenvolvimento da planta. No presente da capa do endosperma e alongamento do embrião durante a
estudo, 13ÿC foi aplicado como temperatura de resfriamento de acordo germinação de sementes de alface (Zhang Y. et al., 2014). Nossos
com o relato de Luo et al. (2015), e sob estresse por frio (NP+CS), a dados mostraram que NP+Cn acumulou mais conteúdo de H2O2 de
germinação do milho foi retardada em ÿ3 dias após a semeadura em 24 a 72 h do que NP+CS e outros tratamentos de priming; enquanto
comparação com a temperatura normal (NP+Cn) (Figura 1). quatro tipos de sementes de priming apresentaram níveis de H2O2
Foi consistente com os resultados concluídos por Farooq et al. (2008a) relativamente mais altos do que NP+CS de 48 a 72 h (Figura 2). No
que o tempo para emergência de 50% do milho híbrido foi cerca de entanto, o acúmulo excessivo de H2O2 levou facilmente a danos
1,5 dias menor em condições normais do que sob estresse por frio. oxidativos de lipídios de membrana, proteínas e ácidos nucleicos (Das e Roychoudh
Em comparação com o tempo de germinação de sementes não O conteúdo de MDA como índice de grau de dano oxidativo foi
condicionadas sob 13ÿC (NP+CS), as sementes preparadas com consequentemente analisado e os resultados mostraram que os
SA+H2O2 germinaram com 3 dias de antecedência, as sementes tratamentos de priming obviamente reduziram o acúmulo de MDA
preparadas com SA ou H2O2 germinaram com 2 dias de antecedência durante a germinação de sementes sob estresse por frio. Além disso,
e enquanto as sementes tratadas com HP germinaram com 1 dia de as concentrações de MDA em NP+CS e NP+Cn mantiveram níveis
antecedência (Figura 1 e Figura Suplementar S2). Embora a qualidade igualmente elevados de 0 a 24 h após a semeadura. No entanto, com
de plântulas de quatro tratamentos de condicionamento sob estresse o tempo de germinação prolongado, o teor de MDA em NP+Cn
por frio não tenha atingido o nível de NP+Cn, eles aumentaram diminuiu gradualmente, enquanto o de NP+CS aumentou
continuamente.
significativamente o RL e DW em relação ao NP+CS e entre os quais SA+H2O2 teve Foi sugerido que o acúmulo de H2O2 em sementes não condicionad

Fronteiras na Ciência Vegetal | www.frontiersin.org 9 julho de 2017 | Volume 8 | Artigo 1153

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Li et ai. Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica

FIGURA 8 | A preparação de sementes regulou a expressão de ZmGA20ox1 (A), ZmGA3ox2 (B), ZmRGL2 (D), ZmGID1 (E) e ZmGID2 (F) e a expressão de ZmGA2ox1 (C) regulada negativamente sob
estresse de resfriamento. Os embriões das sementes foram coletados respectivamente às 0, 6, 24, 48 e 72 h após a semeadura, e foram utilizadas seis repetições para cada tratamento em cada época de
amostragem. Diferentes letras minúsculas no topo das barras indicaram diferenças significativas (p < 0,05, LSD) entre os tratamentos ao mesmo tempo. Barras de erro indicadas ± SE da média (n = 6).
Para obter explicações adicionais, consulte a Tabela 1.

temperatura ou induzida por priming sob estresse por frio não causou dano
oxidativo ao embrião da semente. No entanto, NP+CS com o MDA cumulativo
sob baixa temperatura causaram facilmente uma influência prejudicial na
integridade da membrana celular (Allen e Ort, 2001). Curiosamente, sementes
com condicionamento sob estresse de frio apresentaram teor de MDA ainda
menor do que sementes não condicionadas sob temperatura normal, o que
pode ser devido à membrana e organela da semente após o condicionamento
ter sido reparado antecipadamente, no entanto, sementes não condicionadas
precisaram de tempo para se reparar durante a germinação das sementes.
Os tratamentos de primer melhoraram significativamente a concentração
endógena de SA durante a germinação de sementes sob estresse de frio, o
que pode ser intimamente relevante com a expressão de ZmPAL regulada
positivamente (Figura 3). Especialmente para a combinação SA+H2O2, sua
O conteúdo de SA e o nível de expressão de ZmPAL foram obviamente
maiores que os de SA ou H2O2. O aumento de H2O2 e SA como moléculas
sinalizadoras poderia facilmente induzir o sistema de defesa antioxidante na
planta (Mittler, 2002; Kang et al., 2003; Horvath et al., 2007). Comparando
com NP+CS, as atividades de enzimas antioxidantes e suas expressões de
genes relacionados à biossíntese aumentaram significativamente após os
tratamentos de primer (Figuras 4, 5). Luo et ai. (2011) também relataram
que o efeito benéfico do SA no alívio da lesão por frio pós-colheita da ameixa
'Qingnai' está intimamente relacionado ao aumento das atividades das
enzimas antioxidantes e à diminuição das concentrações de MDA. Portanto,
SA e H2O2 podem promover sinergicamente atividades de enzimas
antioxidantes para proteger o embrião de milho contra injúrias derivadas da
baixa temperatura.

Fronteiras na Ciência Vegetal | www.frontiersin.org 10 julho de 2017 | Volume 8 | Artigo 1153

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Li et ai. Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica

FIGURA 9 | Modelo proposto de priming por SA e H2O2 na melhoria da tolerância ao frio durante a germinação de sementes de milho (Zea mays L.). A ÿ-amilase foi aprimorada para decompor o
amido para fornecer metabolismo e energia para a germinação de sementes sob estresse por frio. Sementes de priming com SA e H2O2 regulam positivamente a biossíntese de GA e o catabolismo
de ABA e promovem a transdução de sinalização de GA. O conteúdo de SA e as atividades de enzimas antioxidantes aumentaram para aliviar o estresse por frio. As expressões ZmCPK11 e ZmSnRK2.1
foram reguladas positivamente para melhorar a tolerância ao estresse de frio. SA, ácido salicílico, H2O2, peróxido de hidrogênio.

Durante a germinação da semente, o amido na semente pode ser
decomposto pela ÿ-amilase em maltodextrina, sacarose, glicose, etc. .,
2015). A velocidade de germinação mais lenta de sementes de milho
embebidas a 10ÿC esteve intimamente relacionada à menor atividade
de ÿ-amilase em comparação com sementes tratadas a 25ÿC (Silva-
Neta et al., 2015). Neste estudo, NP+Cn começou a germinar 24 h
após a semeadura, acompanhado de evidente aumento da atividade
da ÿ-amilase e sua expressão do gene sintético ZmAMY. No entanto, o
estresse por frio reduziu a atividade da a-amilase e os açúcares solúveis
totais e as reservas das sementes não foram metabolizados durante as
primeiras 72 h após a semeadura, de modo que as sementes não
condicionadas (NP+CS) não germinaram durante esse período.
Portanto, o rápido aumento da atividade da ÿ-amilase e o aumento do
teor de açúcar solúvel podem ser parte das razões para a rápida
germinação das sementes após os tratamentos de primer. Vale ressaltar
que às 24 h após a semeadura, o teor de açúcar solúvel teve uma
diminuição repentina nas sementes condicionadas, o que pode ser
resultado do consumo de açúcares solúveis pelo metabolismo endógeno
ativado para preparação da germinação após o condicionamento. A
expressão de ZmAMY envolvendo a síntese de ÿ-amilase foi
significativamente aumentada nos tratamentos de priming, mesmo o
SA+H2O2 melhorou a expressão de ZmAMY 113 vezes mais do que
NP+CS. Ele indicou que os tratamentos de iniciação podem aumentar
a atividade da ÿ-amilase, embora regulando positivamente a expressão
de ZmAMY sob estresse por resfriamento. A germinação das sementes
era geralmente
acompanhado pelo aumento do catabolismo de ABA e biossíntese de
GA (Liu et al., 2014; Zhang H. et al., 2014). O mutante cyp707a2, que
codifica as 80-hidroxilases do ácido abscísico, acumulou muito mais
ABA e apresentou dormência mais forte do que o tipo selvagem (Zhang
H. et al., 2014). A superexpressão de feijão PvNCED1 resultou em
atraso na germinação de sementes e aumento do teor de ABA (Qin e
Zeevaart, 2002). Em nosso estudo, os níveis de expressão de
ZmNCED1 e ZmCYP707A2 aumentaram significativamente no final do
condicionamento das sementes e depois diminuíram rapidamente
durante a germinação das sementes, o que pode contribuir para a
menor concentração de ABA e germinação mais rápida em sementes
condicionadas do que sementes não condicionadas sob baixa
temperatura ( Figura 7). As expressões de ZmCPK11 e ZmSnRK2.1
envolvendo a via de sinal do ABA foram notadamente reguladas
positivamente pelo primer de sementes em comparação com NP+CS
sob estresse de frio. Foi consistente com os resultados relatados por
Mao et al. (2010) que aumentaram as resistências à seca, sal e frio
foram observadas em plantas com superexpressão de ZmCPK11 e ZmSnRK2.1.
GA é outro regulador chave da germinação de sementes em muitas
espécies. Um total de 136 AGs diferentes foram identificados em
plantas; no entanto, apenas alguns GAs são biologicamente ativos
(como GA1 e GA4) e o GA predominantemente ativo é geralmente
dependente da espécie (Olszewski et al., 2002; Yamauchi et al., 2004).
Sementes do mutante de deleção GA3ox não puderam germinar
mesmo em condições normais (Mitchum et al., 2006) e o nível de
transcrição de GA3ox2 aumentou 40 vezes em sementes com dormência quebrada

Fronteiras na Ciência Vegetal | www.frontiersin.org 11 julho de 2017 | Volume 8 | Artigo 1153

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Li et ai.
em comparação com os dormentes (Finch-Savage et al., 2007).
Considerando que a expressão de GA2ox1 manteve-se em um nível
obviamente mais alto em sementes altamente dormentes do que em sementes
não dormentes (Finch Savage et al., 2007). Após a iniciação de SA, H2O2 e
SA+H2O2 , os níveis de expressão de ZmGA20ox1 e ZmGA3ox2 envolvendo
a síntese de GA foram regulados positivamente e aqueles de ZmGA2ox1
envolvendo o catabolismo de GA foram significativamente regulados
Além disso,
negativamente durante a embebição de sementes de milho em condição de resfriamento
Além disso, a expressão de ZmRGL2 envolvendo a transdução de sinal GA
foi regulada positivamente no final do priming e, em seguida, regulada
negativamente durante a germinação. Foi consistente com o modelo que GA
melhorou a germinação estimulando o complexo SCF (SLY1) E3 ubiquitina
ligase para desencadear a ubiquitinação e destruição de RGL2 (Ariizumi e
Steber, 2007). A proteína RGL2 foi inferida como inibidora da germinação de
sementes (Lee et al., 2002). Ariizumi e Steber (2007) relataram que sementes
que não germinaram no mutante de biossíntese de AG gal1-3 poderiam ser
resgatadas por aplicação de AG exógeno ou por nocaute do gene DELLA
RGL2. ZmGID1 e ZmGID2 regulam positivamente a transdução de sinalização
GA.
A expressão de ZmGID1 foi aumentada significativamente em 0 e 48 h,
enquanto a de ZmGID2 foi aumentada significativamente em 6 h sob estresse
de frio neste estudo. Portanto, a transdução de sinal GA aprimorada pode ser
outra razão para a germinação de sementes mais rápida e melhor
estabelecimento de plântulas em sementes preparadas do que sementes não
preparadas sob refrigeração
estresse.
Além disso, é geralmente conhecido que o rompimento da radícula através
do tegumento da semente e a erupção do embrião são dois pontos-chave
durante a germinação das sementes (Dekkers et al., 2013). A radícula das
sementes de milho geralmente rompeu o tegumento após 24 h sob temperatura
normal e o embrião eclodiu após 48 h (Figura 1).
Correspondentemente, alterações fisiológicas e bioquímicas violentas
ocorreram geralmente durante 24 a 48 h, como metabolismo de GAs e ABA e
transdução de sinal, atividades de enzimas antioxidantes e atividades de ÿ-
amilase. Como a semente não preparada germinou a 13ÿC, a eclosão da
radícula atrasou até 96 h de embebição e a erupção do embrião ocorreu até 7
dias de germinação, portanto, as substâncias endógenas não sofreram
mudanças dramáticas durante 72 h. No entanto, o tempo de eclosão da
radícula sob baixa temperatura foi anterior a 24 h após sementes tratadas com
SA+H2O2, os tempos anteriores a 48 h após sementes tratadas com SA ou
H2O2; enquanto o tempo antecedeu 72 h após as sementes tratadas com HP.
Portanto, mudanças violentas do metabolismo endogenamente fisiológico
foram correspondentemente antecipadas no final do priming.
O vigor das sementes e o estabelecimento das plântulas sob estresse por
frio foram notavelmente melhorados na combinação SA+H2O2 nas sementes
de milho testadas. Pode sublinhar vários mecanismos possíveis (Figura 9).
(1) Alterações das espécies reativas de oxigênio: aumento do teor de H2O2 e
SA endógenos e aumento da atividade das enzimas antioxidantes após o
condicionamento das sementes; (2) metabolismo e fornecimento de energia:
o aumento da atividade da ÿ-amilase indicou rápida mobilização do amido nas
sementes, que forneceu metabólitos e
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Tolerância de resfriamento aprimorada de escorva sinérgica
energia para germinação de sementes e crescimento de plântulas sob estresse
por frio; (3) metabolismo e regulação de hormônios: genes de biossíntese de
GA ZmGA20ox1 e ZmGA3ox2 regulados positivamente, gene de catabolismo
de GA ZmGA2ox1 e gene de biossíntese de ABA ZmNCED1 regulado
negativamente. Enquanto isso, a expressão dos genes de transdução de
sinalização de GA ZmGID1 e ZmGID2 aumentou e o nível do gene inibidor de
germinação de sementes ZmRGL2 diminuiu após o condicionamento das sementes.
a expressão
(Figura 8) . dos receptores de resposta codificadores de
ZmCPK11 e ZmSnRK2.1 na via de sinalização do ABA foi regulada
positivamente.
CONCLUSÃO
A tolerância ao frio de sementes de milho pode ser significativamente
melhorada por SA+H2O2, que foi obviamente superior a SA ou H2O2. No
entanto, o efeito de SA+H2O2 na melhoria da resistência ao frio não foi a
simples adição de efeitos únicos de SA e H2O2. Definitivamente, indicou que,
com base nos dados fisiológicos e moleculares, SA e H2O2 podem mutuamente
induzir e manter a homeostase para exercer efeito sinérgico na resistência ao
frio de sementes de milho.
Além disso, as sinergias sublinhadas de SA e H2O2 sugeriram que havia
mecanismos diferentes na indução de resistência ao frio por SA ou H2O2; no
entanto, existiam efeitos de interação entre diferentes mecanismos fisiológicos
e moleculares sob estresse por frio, que ainda careciam de estudos mais
aprofundados.
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
Concebeu e desenhou os experimentos: ZL e YaG.
Realizou-se os experimentos: ZL, JX, WH e CW. Analisados os dados: ZL,
YuG, MS. Reagentes/materiais/ferramentas de análise que contribuíram: JH,
YL, YH, GG e WH. Escreveu o artigo: ZL e YaG.
AGRADECIMENTOS
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da
China (Nº 31371708, 31201279, 31671774), Fundação Provincial de Ciências
Naturais de Zhejiang (Nº LY15C130002, LZ14C130002), Fundos de Pesquisa
Fundamental para as Universidades Centrais (Nº 2015QNA6019) e Jiangsu
Centro de Inovação Colaborativa para Produção de Culturas Modernas, China.
MATERIAL SUPLEMENTAR
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: http://
journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2017.01153/full#supplementary-
material
12 julho de 2017 | Volume 8 | Artigo 1153
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Li et ai.
REFERÊNCIAS
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Declaração de Conflito de Interesses: Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na
ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como
um potencial conflito de interesses.
Copyright © 2017 Li, Xu, Gao, Wang, Guo, Luo, Huang, Hu, Sheteiwy, Guan e Hu. Este é um
artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License (CC
BY). O uso, distribuição ou reprodução em outros fóruns é permitido, desde que o(s) autor(es) ou
licenciante original sejam creditados e que a publicação original nesta revista seja citada, de
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