UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Março de 2022
 ASPECTOS DA BIOLOGIA REPRODUTIVA,
CITOGENÉTICA E GENÔMICA POPULACIONAL DE
Carpotroche brasiliensis (RADDI)

Discente Elizabete N. S. Gusmão

Orientadora: dra. Fernanda A. Gaiotto
Co-orientador: dr. Cláusio A. F. de Melo

Ilhéus - BA
Março - 2022
Introdução

A Mata Atlântica - um hotspot de biodiversidade do planeta.

Esteve conectada em diferentes períodos da história a outros biomas.

Habitat de mais de 20,000 espécies de plantas e mais de 13,000 espécies de

vertebrados.
Introdução

Provê serviços ecossistêmicos importantes - água, geração de energia,

segurança alimentar, regulação do clima e etc.

Redução de cobertura e fragmentação ameaçam a Mata Atlântica

Introdução
Entre os anos de 1970 a 2000 perda de cobertura de quase dois terços da Mata
Atlântica no Paraguai.

No Brasil a perda de floresta também tem sido intensa.

Entre os anos de 1976 a 1996 houve um intenso processo de desmatamento e

fragmentação da Mata Atlântica no estado do Rio de Janeiro.

Introdução
O estudo de Wagner et al. (2020) - mapeamento da floresta da região da Mata
Atlântica São Paulo.

Com base na diferença da cobertura florestal de 1962 e de 2017.

Resultados: 5% da área estudada - áreas de regeneração recente -10% da

floresta passa por intensa perturbação antrópica.

cemaden.gov.br
Perda de carbono repercute nas mudanças
climáticas

Mudanças climáticas - composição da paisagem

O estudo de Wilson et al. (2021) (abordagem de modelagem + dados
paleoecológicos)

Respostas de plantas da Mata Atlântica do sul do país

frente às mudanças climáticas
 Foram listados mais de 1,000 espécies de plantas nativas a
mais de 300 espécies de animais de ameaçados de extinção.

A degradação reduz a diversidade funcional - leva

a homogeneização biótica
Uso não sustentável da terra (conversão de novas
áreas em pastagens, superexploração).

As espécies nativas são mais suscetíveis (epífitas

e árvores).

Redução de exemplares - fluxo gênico e

comprometendo a diversidade genética
 Uso da terra para a agricultura

Alternativas mais sustentáveis

Sistemas agroflorestais - forma de uso mais sustentável

Crescimento contínuo
 Sistema agroflorestal - conceito
Fragmento de floresta

Fragmento de floresta

Cultura agrícola de interesse

Agrofloresta - menos hostil que a monocultura
Entre fragmentos de florestas - benefícios para a cultura de interesse

GENES

GENES
 Fonte de renda para pequenos
produtores

Papel socioconômico das

agroflorestas Sustentabilidade ambiental
Agricultura voltada para fins
não alimentares

Suporte à segurança alimentar

e fonte medicinal
 Diversidade genética

Variação genética entre indivíduos de uma dada população, entre

populações

Pode ser mensurada pelo parâmetro de heterozigosidade e

identificação de variação alélica por loco

Crescimento contínuo
 Heterozigosidade

Heterozigosidade observada Heterozigosidade esperada

EHW - ausência de forças seletivas as frequências

gênicas e genotípicas permanecem constantes
Heterozigotos (frequência reflete a diversidade genética)
Identificação de variação por
Riqueza alélica
loco
 Diversidade genética - qual a sua
importância?

Peça chave da evolução

Base da adaptação e resiliência de espécies frente a adversidades

Crescimento contínuo

Nas angiospermas a diversidade está vinculada à eficiente

dispersão de pólen e de sementes
Paisagens perturbadas - perda de conectividade
 Perda de fluxo gênico - aumento de
cruzamentos entre aparentados

Perda de heterozigotos na população

Menor fitness

Crescimento contínuo
A subdivisão populacional muda as frequências
alélicas entre populações

Estatísticas F de Wright
Mede o desvio de panmixia intrapopulacional

Mede o desvio de panmixia de todas as populações

Mensura endogamia interpopulacional

 Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs)

SNPs são variações nas sequências do genoma que

ocorrem
em nível de um único nucleotídeo

Surgem a partir de mutações pontuais -

transições/transversões

Crescimento contínuo
 Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs)

Bialélicos

Co-dominantes

Amplamente distribuídos ao longo do genoma

Crescimento contínuo
 Novas ferramentas computacionais, barateamento de
sequenciamento e as técnicas de redução de genoma.

Identificação e genotipagem
de SNPs de forma mais rápida, confiável e com baixo
custo.

Crescimento contínuo

 Captura de sequências - é um tipo de

enriquecimento de alvo

Sonda hibridizam em
regiões específicas da fita simples de DNA ou RNA

Crescimento contínuo
 Carpotroche brasiliensis Família Achariaceae
(Raddi) (Malpighiales)

Nome popular: sapucainha

Folhas decíduas, simples e
alternadas

Folhas de C. brasiliensis Imagem:

Bittencourt (2017)
Frutos com casca rígida,
polpa carnosa e grandes
sementes

Fruto de C. brasiliensis Imagem:

Bittencourt (2017)
Fonte de alimento de algumas espécies de animais

Cuniculus paca Gênero Darsyprocta

 Semente rica em óleo

Óleo de sapucainha é rico em ácidos graxos: ácido chaulmúlgrico, hidnocárpico e

górlico

Uso medicinal se deve à presença desses compostos

Anti-inflamatórias, antinociceptivas e antiparasitárias

Medicamento à base do óleo de
sapucainha. Imagem: Oliveira et
Cosmético à base do óleo de
al. (2009)
sapucainha. Imagem:
https://www.natura.com.br/
Derivados presentes no óleo de sapucainha apresentam atividade antiproliferativa
contras as células tumorais Osório et al. (2020).
 Importância socioeconômica da espécie

A espécie é utilizada em sistema agroflorestal

Comercialização de suas sementes

 Objetivo

Analisar aspectos citogenéticos, reprodutivos e

caracterizar a diversidade genética de C. brasiliensis
Capítulo I

Knowing the unknown: pollen viability, stigma receptivity, and karyotype of

Carpotroche
brasiliensis Raddi (Achareaceae)

Elizabete Neta dos Santos Gusmão, Cláusio Antônio Ferreira de Melo, Fernanda Amato
Gaiotto

Forest Research
 Capítulo I

Objetivo:

Caracterizar a biologia reprodutiva de C. brasiliensis por meio da análise da morfologia,

viabilidade e germinação do pólen, receptividade do estigma e analisar o número de
cromossomos e nível de ploidia da espécie.

Material e métodos

Sementes germinadas e flores foram coletadas em Camamu-Maraú - BA.

Sementes foram coletadas entre março e dezembro de 2018.

Flores foram coletadas em setembro de 2018 (três tempos).

Material e métodos

Ao menos 15 flores por indivíduo.

Flores acondicionadas em papel / isopor com uma camada de papel absorvente úmido na
parte inferior.
Material e métodos
Histoquímica

Teste de amido - lugol

Teste de lipídio - Sudan Black (saturado a 95%)

Alexander (1980) - viabilidade (pólen viável/vermelho e inviável/verde ou incolor)

1,000 grãos de pólen (3 repetições)

Material e Métodos

Teste de germinação in vitro

Método da gota pendente (meio de germinação pH 6,5)

Incubação em câmara úmida 26 ± 1 °C por 14 h no escuro

500 grãos de pólen por amostra - viável (tubo polínico =ou> que o dobro do seu diâmetro)

O delineamento experimental inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 3 x 4

Teste de Kruskal-Wallis (intervalo de confiança de 95%)

Material e Métodos

Estrutura do grão de pólen

Os grãos de pólen foram coletados (flores em antese), colocados em stubs, armazenados

sílica gel por 2h e metalizados em ouro paládio por 2h

25 grãos de pólen medidos por amostra (3 repetições)

Classificação morfológica de acordo com Punt et al. (2007)

Material e Métodos

Receptividade do estigma e razão pólen/óvulo (P/O)

Peróxido de hidrogênio - benzidina (Dafne 1992) - receptivo a solução apresenta bolhas

e a superfície do estigma cora em azul escuro.

Razão P/O = grãos de pólen por antera x anteras por flores / número de óvulos por flores
Cruden (1977)

Material e Métodos

Análise citogenética

Sementes germinadas foram limpas com água destilada e coletadas raízes de 2 a 3 cm de

comprimento.

Pré-tratamento com 8-hidroxiquinoleína (8HQ) por 2h a temperatura ambiente e

armazenadas por 24 horas a 4 ºC.

Fixação das células - Carnoy 3:1 por 24 horas e lavadas 2 vezes por 5 minutos.

Material e Métodos

Análise citogenética

Celulase-pectinase (20:1) e mantidas em câmara úmida 37 ºC por 1h.

Lavadas, submetidas a ácido acético (45%) e coradas com Giemsa por 20 minutos.

Coloração com fluorocromos (Schweizer 1980)

 Resultados e discussão

Diclamídeas, dialissépalas, dialipétalas. Flor estaminada polistêmone, com anteras

rimosas, basifixas (67 a 98). Flor pistilada com 7 a 8 estigmas captados, estiletes
terminais, estames vestigiais, gineceu é gamocarpelar, placentação parietal e ovário
hipógino.

Flor de C. brasiliensis. A- flor estaminada; B- flor pistilada; C - flor hermafrodita

 Resultados e discussão

As estruturas florais das flores pistiladas e estaminadas de C. brasiliensis observadas

foram semelhantes às relatadas por Santos et al. (2016), diferindo apenas quanto ao
número de pétalas e presença de estames vestigiais

Placentação parietal é uma característica compartilhada entre as famílias do clado

parietal
 Resultados e discussão

Análise histoquímica do pólen de C. brasiliensis. (A) Teste com solução de Lugol

mostrando positivo para amido; (B) Teste do Sudan Black mostrando positivo para
lipídios
 Resultados e discussão

A tonalidade próxima ao vermelho foi observada em espécies da ordem Zingiberales

O amido encontrado pode ser uma reserva ou um componente estrutural .

O pólen amiláceo - uma característica compartilhada pelo clado parietal

 Resultados e discussão

Os lipídios podem estar relacionados ao processo de desenvolvimento do pólen para

formação da exina (camada externa)

Elemento de proteção, reserva, estrutura e reprodução (interação estigma-pólen)

 Resultados e discussão

Análise histoquímica e teste de germinação in vitro de grãos de pólen de C. brasiliensis.

A- teste de viabilidade com solução Alexander (seta mostrando um grão de pólen
inviável); B- Teste de germinação in vitro

 Resultados e discussão

A alta viabilidade dos grãos de pólen (92%) sugere que há um processo regular de
meiose

A alta viabilidade dos grãos de pólen indica não só a boa qualidade do pólen, mas
também o potencial para um maior rendimento de sementes por fruto

A alta viabilidade é um fator positivo para programas de melhoramento e conservação

 Resultados e discussão

Em nosso estudo, a viabilidade detectada a partir do teste histoquímico foi maior do que
a observada no teste de germinação in vitro (observado em outros estudos)

Teste histoquímico avalia a integridade das estruturas e presença/ ausência de

substâncias

Teste de germinação avalia aspectos fisiológico

 Resultados e discussão

A B C

Microscopia de varredura do grão de pólen de C. brasiliensis. A) vista polar mostra o grão

de pólen 3-colporado, âmbito triangular; forma subesferoidal a prolata; B) vista equatorial
(seta mostra opérculo reticulado; C- visão equatorial (seta mostra endoabertura lalongada)
(bar=20 μm).
 Resultados e discussão

As características morfológicas observadas nos grãos de pólen de C. brasiliensis

corroboram com outros resultados relacionados a espécies de Achariaceae e algumas
espécies de Violaceae

A forma subesferoidal a prolata é uma característica predominante em Malpighiales

A endoabertura lalongada parece ser uma sinapomorfia compartilhada pelo clado

parietal, com possíveis reversões dentro do grupo Violaceae-Passifloraceae-Salix
 Resultados e discussão

Teste de receptividade do estigma de flores pistiladas de C. brasiliensis. A) Formação de

bolhas indicando a receptividade estigmática; B) Estigmas corados em azul escuro após
teste com peróxido de hidrogênio e benzidina.

Razão pólen/óvulo: 2,050 ± 654.62

 Resultados e discussão
A receptividade estigmática indica disponibilidade para receber o pólen

A receptividade estigmática também em pré-antese. Resultado semelhante observado

em espécies de Euphorbiaceae

O estigma de C. brasiliensis apresentou receptividade por pelo menos 10 horas após a

antese

De acordo com a relação P / O e o tamanho do pólen, hipotetizamos que a polinização

de C. brasiliensis ocorre via insetos
Resultados e discussão

(A) Coloração convencional (Giemsa 3%) em cromossomos metafásicos de

C. brasiliensis (68 cromossomos); (B) Bandamento específico de base de
fluorocromos (CMA e DAPI) em cromossomos de C. brasiliensis (blocos
sugerem dois pares de cromossomos satélites, sinalizando o padrão diploide)
Bar = 20 µm.
 Resultados e discussão

Ausência de informações sobre o número cromossômico básico ou diploide de muitas

espécies impedem certas inferências

Algumas espécies da família Achariaceae (12 a 46 cromossomos)

O alto número de cromossomos em C. brasiliensis e seu pequeno tamanho dificultam a

análise morfológica.
 Capítulo II

Population genomics reveals similar diversity between agroforestry and natural forest
for the wild tropical tree Carpotroche brasiliensis Raddi (Achareaceae)

Elizabete Neta dos Santos Gusmão, Flora Bittencourt, Matias Kirst,, Leandro G. Neves ,
Taruhim Miranda Cardoso Quadros, Carlos Magno Moreira Sales, Fabienne Micheli,
Alessandro Souza Santos, Bárbara S. F. Müller, Fernanda Amato Gaiotto

Canadian Journal of Forest Research

 Capítulo II

Objetivo

Estimar a diversidade genética de árvores de C. brasiliensis amostradas em agrofloresta e

floresta natural da Mata Atlântica, investigar as diferenças em termos de diversidade
genômica entre esses ambientes

Material e métodos

92 árvores adultas de C. brasiliensis foram amostradas aleatoriamente em 11 locais na

Mata Atlântica, nos municípios de Camamu-Marau, BA

Diferentes tecidos foram coletados para a extração de RNA (folhas, raízes, botões florais,
frutos e sementes)

DNA foi extraído de folhas

Material e métodos

11 locais - distância : 180 m

a 9,47 km

7 agroflorestas (AS)

4 fragmentos de floresta
(NR)

Mapa mostrando a localização das populações amostradas de C. brasiliensis no sul da Bahia,

Brasil.

Material e métodos

Preparação e sequenciamento da biblioteca de cDNA

RNA extraído com kit RNAqueous

24 bibliotecas de cDNA foram sequenciadas em Illumina MiSeq 2x250

Remoção de adaptadores foi realizada com Trimmomatic 0.32 (Bolger et al. 2014)

Trinity (Grabherr et al, 2011) TopHat 2.0.13 (Trapnell et al. 2009) foram utilizados para a
montagem de novo
Material e métodos

Preparação e sequenciamento da biblioteca de cDNA

Alinhamento realizado com o Mosaik (Lee et al. 2014)

O mapeamento foi realizado o banco de dados de Arabidopsis thaliana

Material e métodos

Desenho das sondas

21 mil sequências enviadas para a Rapid Genomics

72 unigenes - relacionados ao dimorfismo sexual.

Um total de 1, 532 sondas (a partir dos 72 unigenes) e 20, 933 sequências que bateram com
o banco de dados de A. thaliana

Resultado - 20,000 sondas (1,532 +18,468)

Material e métodos
Material e métodos

SNP calling

Após SNP calling foram obtidos 36,812 SNPs.

Filtragens - 8,346 SNPs foram usados neste estudo.

Material e métodos

Teste de Mantel
 Resultados e discussão

Parâmetros de diversidade genética para populações de C. brasiliensis em sistemas

agroflorestal e remanescentes naturais na Mata Atlântica do Sul da Bahia-Brasil. AS -
Sistema Agroflorestal; NR - Remanescente natural
Resultados e discussão

Os parâmetros de diversidade analisados indicam que a diversidade genética foi mantida em

níveis semelhantes nas duas áreas - natureza sustentável da agrofloresta

Nossos resultados corroboram com outros estudos que avaliaram a natureza sustentável da
agrofloresta.

Agrofloresta pode mimetizar o ambiente da floresta natural.

Resultados e discussão

Manter proporções de diversidade genética similares

A diversidade genética de uma população está relacionada ao fitness

Os valores do coeficiente de endogamia indicam que os indivíduos não são relacionados e

fluxo gênico tem contribuído para manutenção da conectividade genética
Resultados e discussão

O baixo coeficiente de endogamia é possivelmente resultado da perda de homozigotos

devido à não adaptação ao ambiente local

Os baixos valores de endogamia podem também estar relacionados ao tipo de mating

A conectividade estrutural tem sido suportada pelas agroflorestas - corredores que favorecem
o movimento de pólen e sementes
Resultados e discussão

O fluxo gênico em angiospermas ocorre pelo movimento de sementes e pólen - frugívoros

contribuem para dispersão

Movimento de sementes gera uma diversidade de fontes maternas nos locais de deposição o
que influenciará na diversidade e estrutura genética das mudas

A espécie possui frutos com características de anacrônicos

Resultados e discussão

Hipotetizamos que o dispersor primário da espécie foi algum animal da megafauna extinta

A queda dos frutos estabelece as sementes abaixo da planta-mãe e a atividade dos agentes
dispersores favorece o movimento das sementes

Comportamento dos dispersores de C. brasiliensis

 Resultados e discussão

Heatmap mostrando diferenciação genética entre as 11 populações de C. brasiliensis do

sistema agroflorestal e remanescentes
 Resultados e discussão

Análise da estrutura genética no Structure resultou em dois clusters. K = 2 foi o resultado

mais provável de acordo com o delta K. Cada cor representa um componente genético e é
composto por todas as amostras oriundas das populações
 Resultados e discussão

Análise de componentes
principais (PCA) mostra
padrãos de dois pools gênicos.
Cada um dos clusters
apresenta amostras dos dois
sítios.
Resultados e discussão

A baixa diferenciação genética indica o fluxo gênico contínuo tem ocorrido mesmo em
ambiente antropizado.

O teste de Mantel não mostrou nenhuma relação entre as distâncias físicas dos locais
amostrados e os valores de FST

A separação das áreas AS7, NR1 e NR2 das demais se deva a essas diferentes origens, além
de estar sob a influência de outros fatores
 Conclusões Gerais

A espécie é predominantemente dioica, todavia, há ocorrência de indivíduos monoicos.

Os grãos de pólen da espécie são ricos em amido e em lipídios apresentando altas taxas de
germinação, o que indica um processo regular de meiose na espécie.

Quanto a morfologia, os grãos de pólen de C. brasiliensis apresentam características comuns

àquelas observadas em outras espécies da ordem Malpighiales
 Conclusões Gerais

A receptividade estigmática da espécie foi observada da pré-antese até 10 horas após a

antese e no que se refere à razão pólen/óvulo, os resultados indicaram que a espécie é
xenógama obrigatória.

Diante dos valores da razão pólen/óvulo, hipotetizamos que a polinização seja realizada
principalmente por insetos.

A espécie apresenta 2n= 68 cromossomos e os blocos CMA3+/DAPI- sugerem dois pares de

cromossomos satélites, sinalizando um padrão diploide.
 Conclusões Gerais

Árvores de C. brasiliensis em áreas de agrofloresta apresentaram níveis de diversidade

genética semelhantes aos observados em áreas de remanescentes de Mata Atlântica.

O que indica que quando se prioriza a manutenção ou plantio de árvores nativas, os

sistemas agroflorestais podem mimetizar o ambiente da floresta.

Os achados do presente estudo são básicos e fundamentais para futuras investigações

genéticas em C. brasiliensis bem como para programas de melhoramento e conservação.
Agradecimentos:
Referências

APG IV. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and
families of flowering plants. APG IV. Botanical Journal of Linnean Society, v. 181, p.1–20, 2016.

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Bhattacharya, A.; Mandal, S. Pollination, pollen germination and stigma receptivity in

Moringa oleifera Lamk. Grana, [s. l.], v. 43, n. 1, p. 48–56, 2004.

Brenig, B.; Brem, G. Direct cloning of sequence tagged microsatellite sites by DNA affinity
chromatography. Nucleic Acids Research, v. 19, p. 5441, 1991.
Referências

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Saitou, N.; Nei, M.. The Neighbor-joining Method : A New Method for Reconstructing Phylogenetic
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Osorio, L. S.; Ionta, M.; Demuner, A. J.; de Sousa, B. L.; Ferraz, G. O.; Varejão, E. V. V.; Ferreira-
Silva, G. A.; Pilau, E. J.; Silva, E.; dos Santos, M. H. Synthesis of 1,2,3-Triazole Derivatives of
Hydnocarpic Acid Isolated from Carpotroche brasiliensis Seed Oil and Evaluation of
Antiproliferative Activity. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 31, 2500 –2510, 2020.