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com

protocolo

Ativação induzida pelo frio do tecido adiposo marrom e

angiogênese adiposa em camundongos
Sharon Lim1,3, Jennifer Honek1,3, Yuan Xue1, Takahiro Seki1, Ziquan Cao2, Patrik Anderson1, Xiaojuan Yang1, Kayoko
Hosaka1& Yihai Cao1,2

1Departamento de Microbiologia, Tumor e Biologia Celular, Karolinska Institute, Estocolmo, Suécia.2Departamento de Medicina e Ciências da Saúde, Universidade de Linköping, Linköping,
Suécia.3Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho. A correspondência deve ser endereçada a YC ( yihai.cao@ki.se ).

Publicado on-line em 1º de março de 2012; doi:10.1038/nprot.2012.013

a exposição de humanos e roedores ao frio ativa a atividade termogênica no tecido adiposo marrom (Morcego). este protocolo descreve
um modelo de camundongo para estudar a ativação de Bat e angiogênese em tecidos adiposos por aclimatação ao frio. após uma
exposição de 1 semana a 4 ° C, camundongos c57Bl/6 adultos mostram uma transição óbvia de tecido adiposo branco subcutâneo (Wat)
para tecido adiposo marrom (BrIte). o fenótipo BrIte persiste após exposição contínua ao frio e, no final da semana 5, BrIte contém um
alto número de mitocôndrias positivas para a proteína 1 de desacoplamento, uma característica de Bat. Durante a transição de Wat
para BrIte, a densidade vascular é marcadamente aumentada devido à ativação da angiogênese. Em morcego, a exposição ao frio
estimula a termogênese, aumentando o conteúdo mitocondrial e a taxa metabólica.
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este protocolo oferece uma excelente oportunidade para estudar os mecanismos moleculares que controlam a massa adiposa.

Introdução
Em contraste com a maioria dos outros tecidos do corpo, o tecido adiposo
experimenta constantemente expansão e contração ao longo da vida adulta
devido a mudanças na demanda metabólica. A plasticidade de WAT e BAT
determina se um fenótipo individual é obeso ou magro. A obesidade e seus
distúrbios metabólicos relacionados, como diabetes, doenças cardiovasculares e
câncer, estão entre as principais causas de mortalidade em humanos adultos na
sociedade ocidental e na maioria das outras partes do mundo.1,2. Portanto, a
prevenção e o tratamento da obesidade tornaram-se uma prioridade para a
melhoria da saúde pública, envolvendo esforços conjuntos de pesquisas
científicas, empresas farmacêuticas e diversos órgãos governamentais. Apesar
dos tremendos esforços na pesquisa da adipogênese, falta uma abordagem
eficaz para a intervenção farmacêutica para a obesidade. Atualmente, os
métodos não farmacêuticos mais eficazes para combater a obesidade são a
restrição da ingestão de alimentos, a prevenção da absorção de nutrientes e o
aumento da atividade física.
Além da plasticidade dos tamanhos dos adipócitos, tanto o WAT quanto
o BAT sofrem alterações funcionais marcantes sob várias condições
fisiológicas e patológicas. Por exemplo, a caquexia do câncer pode ativar
vias metabólicas nos adipócitos WAT, levando à atrofia adiposa3. Sob
condições fisiológicas, a exposição de roedores, como camundongos
experimentais, ao frio aumenta as vias termogênicas sem tremor (NST)
dependentes da proteína-1 de desacoplamento (NST) no WAT subcutâneo
(sWAT) (um fenótipo BRITE) via ativação do sistema simpático4–7. Durante
essa transição, a angiogênese é ativada simultaneamente, resultando em
aumento da densidade vascular associada ao aumento dos níveis de
consumo de oxigênio.2,5. O tecido adiposo também é considerado o maior
órgão endócrino do corpo e produz inúmeros fatores de crescimento,
hormônios, citocinas e adipocinas, que atuam em vários tipos de células
não adiposas.1,2,8. Assim, alterações estruturais e funcionais do tecido
adiposo podem ter um amplo impacto em múltiplos sistemas do corpo.
Aqui descrevemos um modelo de camundongo para estudar alterações
estruturais e funcionais induzidas pelo frio em WAT e BAT. Este modelo permite o
estudo cinético da transição dos adipócitos sWAT para um fenótipo semelhante
ao BAT (um fenótipo BRITE) em associação com a ativação da angiogênese. As
alterações estruturais e funcionais dos adipócitos e células endoteliais
microvasculares podem ser facilmente detectadas usando
marcadores moleculares específicos para cada tipo de célula. Por exemplo, as
células BAT e BRITE expressam especificamente UCP-1 como um marcador para
definir essas células, e as células endoteliais são detectadas por CD31 ou outros
marcadores específicos. Nós e outros estudamos a transição do WAT para um
fenótipo semelhante ao BAT usando modelos genéticos de camundongos9–11. No
entanto, esses modelos genéticos geralmente são baseados na superexpressão
ou deleção de um gene específico em camundongos e, portanto, são menos
relevantes para estudos em humanos. Além disso, as manipulações genéticas de
uma via específica em adipócitos em camundongos podem levar a alterações da
expressão gênica ou função associada a esse sistema de sinalização e, portanto,
não refletem um sistema de sinalização comum que controla a transição.
Estudos recentes mostram que existe uma quantidade substancial de BAT em
humanos adultos e que a exposição de humanos adultos ao frio também pode
ativar o metabolismo em BAT12–15. Assim, nosso modelo BAT induzido pelo frio em
camundongos é clinicamente relevante para seres humanos. Como a
angiogênese é necessária para a expansão e metabolismo da massa tecidual, a
mudança angiogênica induzida pelo frio no tecido adiposo oferece uma
excelente oportunidade para estudar os mecanismos moleculares subjacentes ao
crescimento e funções dos microvasos. Este modelo de camundongo também
oferece uma oportunidade para estudar as opções terapêuticas de combinações
de drogas frias e potenciais que podem reduzir sinergicamente o peso corporal.
Vantagens e limitações
Principais vantagens:
• O procedimento é simples e o custo é baixo.
• Camundongos com diferentes origens genéticas e a maioria das linhagens
geneticamente modificadas, incluindo camundongos transgênicos e knockout,
podem ser estudados nesta condição.
• Durante a exposição ao frio, a administração de drogas, compostos
químicos ou moléculas de proteína pode ser alcançada, permitindo que
os pesquisadores estudem seu impacto nos sistemas adiposo e vascular.
• Os fenótipos BRITE e vascular induzidos pelo frio tornam-se óbvios após
apenas 1 semana de exposição a 4°C e persistem a longo prazo, desde
que os camundongos sejam mantidos no ambiente frio. O tempo de
rotatividade para experimentos é curto.
• Há pouca variação entre os indivíduos do mouse em cada
configuração experimental.

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 protocolo
Figura 1 |Dissecção post mortem de depósitos iWAT e iBAT e ativação induzida por baixa
uma b
temperatura em BAT. (uma) Etapas de incisão 1–5 para localizar o iWAT. Os números indicam a
sequência de incisão e as pontas de seta indicam a direção da incisão. As setas apontam para
4 5
4 5
os depósitos iWAT. (b) Etapas de incisão 1–5 para localizar o iBAT. Os números indicam a
1
sequência de incisão e as pontas de seta indicam a direção da incisão. As setas apontam para
os depósitos do iBAT. (c) Após uma exposição de 4 semanas a 4°C ou 30°C, os camundongos 1

C57BL/6 foram sacrificados e os depósitos adiposos foram dissecados. A coloração H&E de 2 3

iWAT e iBAT revelou a existência de uma alta densidade de organelas intracelulares e tamanhos
de adipócitos menores em iWAT e iBAT expostos a 4 °C em relação ao correspondente
2 3

tecidos adiposos expostos a 30 °C. (d) Medição quantitativa de tamanhos de adipócitos de iWAT
e iBAT expostos a 4 °C ou 30 °C. Todos os estudos em animais foram aprovados pelo comitê de
cuidados e uso de animais do Comitê de Ética em Animais Experimentais do Norte de
c 30°C 4°C d
Estocolmo.n=8 amostras por grupo. As barras de erro indicam sem
P<0. 01

iWAT
4

Média adipócito de diâmetro

por campo (×102µm)
3
Limitações:
• É necessária a instalação de instalações frias (4 °C) e quentes (30 °C) em uma 2

instalação de alojamento de animais. 1

30°C

30°C
• A obtenção de permissões éticas para experimentação pode ser

4°C

4°C
0

iBAT
iWAT iBAT
demorada.
• Em algumas linhagens de camundongos geneticamente modificados, os animais
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100µm

morrem antes de desenvolver depósitos adiposos em tamanho real. Assim, é difícil

realizar experimentos nesses camundongos.
Design experimental
Aclimatação ao frio.Camundongos machos ou fêmeas adultos devem ser
divididos em dois grupos para aclimatação a 30°C e 4°C. Para obter valores
estatisticamente significativos, um número suficiente de camundongos deve ser
inscrito em cada grupo. Normalmente, não menos de dez camundongos devem
ser incluídos em cada grupo. Vários camundongos extras no grupo de 4 ° C
devem ser incluídos se você estiver usando camundongos geneticamente
modificados, incluindo várias cepas transgênicas e nocautes, devido a respostas
imprevisíveis à aclimatação ao frio que podem levar à morte dos camundongos.
No entanto, se a medição das taxas metabólicas for planejada, pelo menos 14 a
20 camundongos devem ser usados em cada grupo. Isso é especialmente
crucial se não apenas o NST basal, mas também o NST induzido por
norepinefrina (NE) deve ser medido. É importante que a linhagem, idade e sexo
dos camundongos sejam idênticos em ambos os grupos e que um único
camundongo seja colocado em cada gaiola. Aconselhamos colocar vários pellets
de comida dentro das gaiolas para que os ratos tenham fácil acesso aos
alimentos. Antes da exposição a 4°C, os camundongos devem ser mantidos a
18°C por pelo menos 1 semana para adaptação. Caso contrário, a transferência
direta de camundongos da temperatura ambiente (RT, geralmente 22°C) para
4°C pode levar a uma alta taxa de mortalidade. Um segundo grupo de
camundongos pode ser transferido diretamente da RT para a temperatura
termoneutra de 30°C. Ambos os grupos de camundongos de 4 ° C e 30 ° C devem
ser expostos por um período de tempo igual para obter dados experimentais
comparáveis. Para ativação de BAT e conversão de WAT-BRITE, os camundongos
normalmente precisam ser expostos a 4 ° C por 1 semana ou 4 a 5 semanas. No
entanto, a exposição prolongada ao frio pode aumentar ainda mais as alterações
fenotípicas. Para análise de expressão gênica, recomendamos que vários pontos
de tempo iniciais e tardios sejam considerados, pois a expressão de genes é
regulada diferencialmente ao longo do tempo. Para a detecção de
microvasculaturas adiposas, um fenótipo angiogênico óbvio pode ser
prontamente detectado após uma semana de exposição ao frio; isso se torna
mais robusto após 4 a 5 semanas de exposição.
Medição metabólica.No ponto final do experimento, alguns dos camundongos
devem ser considerados para medição de parâmetros metabólicos. Os
camundongos restantes devem ser usados para expressão gênica
análise de perfil, porque a injeção de NE em camundongos
para medição metabólica pode afetar a expressão gênica.
Para medir a taxa metabólica basal, os camundongos são
simplesmente
2
colocados em uma câmara metabólica2
na qual
o consumo de O, a temperatura corporal e a liberação de CO
são continuamente registrados por 24 h. Para medir o
metabolismo relacionado ao NST, os membros de um grupo
diferente de camundongos são anestesiados por injeção
intraperitoneal com pentobarbital; eles são então transferidos
imediatamente para uma câmara metabólica. A taxa
metabólica basal de cada camundongo deve ser registrada
por cerca de 30 min, seguida de injeção subcutânea com NE.
O metabolismo relacionado ao NST estimulado por NE deve
ser registrado por ~ 1 h.
Coleta de amostra de tecido.No ponto final dos experimentos, os
camundongos podem ser sacrificados pela exposição a uma dose
2
letal de
CO. No caso de coleta de amostras de sangue, a punção intracardíaca deve
ser realizada imediatamente para coletar ~800µl de sangue fresco de cada
rato. À medida que o plasma e o soro são preparados, devem ser usados
tubos revestidos sem heparina, heparina ou outros tubos revestidos com
anticoagulante. Vários depósitos adiposos podem ser cuidadosamente
coletados por excisão cirúrgica. Os tecidos adiposos dissecados de
diferentes grupos de camundongos devem ser fotografados para destacar
as diferenças de cor. Além disso, os depósitos adiposos devem ser pesados.
É importante incluir amostras de controle apropriadas do mesmo depósito
em cada grupo experimental. Após fotografar e pesar os tecidos, cada
depósito adiposo deve ser dividido igualmente em três porções. Uma
porção do tecido deve ser imediatamente congelada em nitrogênio líquido.
A outra porção deve ser transferida para um molde criogênico e coberta
com solução de Tissue-Tek; esses tecidos incorporados devem ser
colocados em gelo seco e armazenados a -80 °C até o uso. A terceira porção
do tecido deve ser fixada a 4°C com paraformaldeído (PFA) a 4% (p/vol) por
24 horas e então transferida para um novo tubo contendo um volume
suficiente de 1× PBS. Se necessário, os tecidos fixados podem ser divididos
em duas partes para coloração de montagem inteira/análise imuno-
histoquímica regular ou para inclusão em parafina.

protocolos da natureza|VOL.7 NO.3 | 2012 |607

 protocolo
Histologia.Amostras embebidas em parafina são adequadas para coloração
H&E, que pode revelar a morfologia e o tamanho dos adipócitos (Figura 1). Além
disso, a coloração H&E também detecta organelas finas intracelulares, como as
mitocôndrias. Amostras embebidas em parafina também podem ser usadas para
coloração imuno-histoquímica, incluindo detecção de vasos sanguíneos,
conteúdo mitocondrial e outros tipos de células, como células inflamatórias. Para
obter coloração específica e sinais positivos de alta qualidade,
Materiais
REAGENTES
• Ratos!CuidadoTodos os estudos em animais devem estar em conformidade com todos os
regulamentos de ética relevantes e devem ser revisados e aprovados por comitês
governamentais e institucionais de cuidados e uso de animais.-críticoÉ importante notar que
alguns modelos genéticos de camundongos são sensíveis à exposição ao frio, o que pode
levar a uma alta taxa de mortalidade.
• Acetona (Sigma-Aldrich, cat. nº 32201)
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• Anticorpo de cabra anti-rato IgG (H+ L) Alexa Fluor 555
(Invitrogen, cat. nº A-21434)
• Solução de desmascaramento de antígeno, à base de ácido cítrico (Vector
Laboratories, cat. nº H-3300)
• Intermediário de criomolde (Sakura Tissue-Tek, cat. nº 4566)
• Anticorpo Cy5 de cabra anti-coelho IgG (H+ L) (Invitrogen, cat. nº A-10523)
• DAPI (dilactato; Invitrogen, cat. nº D3571)
• Água destilada (dH O)
2 • Criostato de micrótomo (Histolab Products AB, cat. n.º HM500OM)
• Leite seco sem gordura (por exemplo, Semper)
• Gelo seco
• Solução de eosina Y (Sigma, cat. nº 318906)
• Etanol (99,7%; Solveco AB, cat. nº 200-578-6)
• Solução de hematoxilina, modificada por Harris (Sigma-Aldrich, cat. nº HHS16)
• Metanol (Sigma-Aldrich, cat. nº 32213)!CuidadoO metanol é tóxico quando
ingerido ou quando os fumos são inalados. O metanol deve ser mantido em
uma coifa química. Use roupas de proteção adequadas ao manuseá-lo.
• Esmalte
• Soro de cabra não imune (Vector Laboratories, cat. nº S-1000)
• Composto OCT Tissue-Tek (Sakura Tissue-Tek, cat. nº 4583)
• PBS (1×)
• PFA (Sigma-Aldrich, cat. nº 441244)!CuidadoÉ perigoso quando exposto à pele,
inalado ou ingerido. A preparação de 4% (p/vol) de PFA deve ser realizada em
uma capela química usando roupas de proteção apropriadas.
• Pentobarbital (Sigma-Aldrich, cat. nº P3393)
• Pertex (Produtos Histolab, cat. n.º 00801)
• Proteinase K (Invitrogen, cat. nº 25530-049)
• Policlonal de proibitina anti-rato de coelho (Abcam, cat. n.º ab28172)
• Anticorpo monoclonal CD31 anti-rato de rato (MEC13.3; BD Pharmingen, cat.
nº 553370)
• Éter octilfenil Triton X-100 Polioxietileno(10) (Acros Organics, cat. nº
215680010)!CuidadoPerigoso se ingerido. O manuseio deve ser realizado em
uma capela de exaustão química com roupas de proteção apropriadas.
• Base Trizma (Sigma, cat. n.º T4661-100G)
• Meio de montagem Vectashield (Vector Laboratories, cat. nº H-1000)
• Xileno (Produtos Histolab, cat. nº 02080)
procedimento
ativação induzida pelo frio do tecido adiposo-cronometragem2-8 semanas
1|Adaptação de camundongos (dia 1). Divida os ratos em pelo menos dois grupos, dependendo da demanda experimental. Cada
grupo deve consistir de pelo menos seis a oito camundongos, suficientes para análise estatística. Adaptar um grupo de camundongos
a 18 ° C por 1-3 semanas e outro grupo em RT (22 ° C).
!CuidadoTodos os estudos em animais devem ser revisados e aprovados por comitês governamentais e institucionais relevantes de cuidados e uso de animais. Um
experimento piloto com um número limitado de camundongos deve ser realizado se uma cepa de camundongo geneticamente modificada for usada. Em particular, a
deleção da superexpressão de genes metabolicamente relacionados pode causar uma alta taxa de mortalidade.
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é imperativo escolher anticorpos altamente específicos para coloração imuno-
histológica. Notavelmente, alguns anticorpos podem funcionar apenas em amostras
embebidas em parafina, enquanto outros anticorpos só podem ser usados para seções
congeladas. Recomendamos que um pesquisador habilidoso tente diferentes condições
antes de realizar um experimento em grande escala. Para imunocoloração de
montagem completa, amostras de tecido relativamente frescas devem ser usadas para
coloração e microscopia confocal deve estar disponível.
EQUIPAMENTO
• Sala mantida a 4 °C em uma instalação de animais adequada para manter camundongos
• Sala mantida a 30 °C em uma instalação de animais adequada para manter camundongos
• Adobe Photoshop CS3 ou versões posteriores (Adobe)
• Tubos cônicos de polipropileno de 50 ml BD Falcon (BD Biosciences, cat.
n.º 358206)
• Microscópio confocal (por exemplo, Nikon D-eclipse C1, Nikon)
• Software confocal (por exemplo, EZ-C1 3.9 Nikon digital eclipse, Nikon)
• Placas de cultura de células de seis poços Costar (Corning, cat. nº 3516)
• Placas de cultura de células de 96 poços Costar (Corning, cat. nº 3596)
• Forno de linha seca (VWR, cat. n.º DL53)
• Fórceps (AgnTho's, cat. nº 08-060-120)
• Calorímetro indireto (INCA, Somedic)
• Laminas de microscópio (VWR International, cat. n.º 631-0135)
• Parafina de micrótomo (Cellab, cat. nº Microm HM315)
• Agulha (BD Microlance, cat. nº 300800)
• Caneta PAP para imunocoloração (Sigma-Aldrich, cat. n.º Z672548)
• Tubos de coleta de plasma (BD Microtainer, cat. n.º 365975)
• Prancha de balanço (VWR International, cat. n.º 444-0341)
• Lâmina de bisturi (AgnTho's, cat. nº 02-040-010)
• Porta-lâminas de bisturi (AgnTho's, cat. n.º 02-030-030)
• Tubos de coleta de soro (BD Microtainer, cat. n.º 365968)
• Espátula/microcolher (VWR International, cat. n.º 231-1354)
• Lâminas de microscópio Superfrost Plus (Thermo Scientific, cat. n.º 4951plus)
• Seringa (BD Plastipak, cat. nº 300186)
• Temporizador (por exemplo, Fisher Scientific, cat. n.º FB70232))
• Frasco de coloração vertical com tampa de vidro (Electron Microscopy Sciences,
cat. n.º 70318-04)
• Banho-maria até 60 °C (por exemplo, Lauda Aqualine Al5)
• instrumento de ressonância magnética
• Tesouras
CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE
PFA (4%, p/vol)Para um volume final de 500 ml, adicione 20 g de pó de PFA a 1×
PBS. A 4°C, 4% (p/vol) de PFA pode ser armazenado por até 2 semanas.
PBST (PBS com Triton X-100 (0,3%, vol/vol))Para um volume final de 30 ml (0,3%
(vol/vol) Triton X-100), adicione 0,9 ml de Triton X-100 puro a 29,10 ml de 1× PBS.
Vortex e armazenar a solução a 4 ° C por vários meses. Tampão de bloqueio (3%, p/
vol)Adicione 3 g de leite em pó seco sem gordura a 100 ml de PBST para preparar 100
ml de tampão de bloqueio a 3% (p/vol). O tampão de bloqueio deve ser preparado
para cada experimento.
 protocolo
-passo críticoO tempo de adaptação varia entre diferentes linhagens de camundongos. Para camundongos C57BL/6 de tipo selvagem, por exemplo, a
aclimatação de 1 semana é suficiente. Algumas cepas, comoUcp1–/–camundongos, precisam ser adaptados a 18 ° C por 3 semanas. Um tempo de
adaptação mais curto pode causar a morte de camundongos durante a exposição subsequente ao frio. O seguinte protocolo é adequado para
camundongos do tipo selvagem; ajuste se estiver usando mouses com requisitos especiais. Durante a aclimatação a 18 ° C, os camundongos devem ser
preferencialmente mantidos em gaiolas individuais para evitar que fiquem próximos uns dos outros e mantenham-se aquecidos. Isso poderia interferir
com a ativação adequada do NST.
-passo críticoPara realizar a análise de ponto tardio, mantenha os camundongos a 30 ° C e 4 ° C, respectivamente, por 4 a 5 semanas.

2|Dia 7.Transfira os camundongos aclimatados a 22 ° C a 30 ° C e os camundongos aclimatados a 18 ° C a 4 ° C. Na temperatura termoneutra (30 ° C),
os camundongos têm sua atividade metabólica mais baixa, pois a temperatura ambiente permite que os camundongos mantenham sua temperatura
corporal ideal.
-passo críticoCada rato individual deve ser mantido em uma única gaiola. Verifique a condição dos camundongos diariamente para detectar possíveis
desconfortos para os animais como resultado da exposição ao frio.

3|Manter os camundongos a 30 ° C e 4 ° C, respectivamente, por 1-5 semanas. ?

solução de problemas

4|Medir a composição corporal dos ratos por ressonância magnética no final de 30 ° C e 4 ° C de exposição. Coloque os ratos de volta em
suas gaiolas após a medição.
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5|Se você deseja medir a taxa metabólica basal e o consumo de oxigênio usando um calorímetro indireto, siga a opção
A. Se você deseja medir o metabolismo relacionado ao NST estimulado por NE, siga a opção B. análise de matriz,
prossiga com a opção C para sacrificar os camundongos e coletar tecidos.
-passo críticoA medição da taxa metabólica basal, o consumo de oxigênio e o metabolismo relacionado ao NST estimulado por NE podem afetar a
expressão gênica dos tecidos e, portanto, os tecidos devem ser coletados imediatamente se for necessária a análise de matriz gênica.

(a) Medição da taxa metabólica basal e consumo de oxigênio com um calorímetro indireto-cronometragem1 dia
(i) Preparar calorímetros indiretos e equipar cada um com um temporizador que regula um ciclo de 12 horas de luz a 12 horas de escuridão de acordo com o
ritmo circadiano dos camundongos.
(ii) Abra os gases de calibração (15% e 20% de oxigênio) e suprimento de ar.
(iii) Ligue o sistema de refrigeração/regulação de temperatura e a câmara metabólica.
(iv) Certifique-se de que as configurações apropriadas funcionem de maneira ideal (temperatura e duração da medição)
para a medição no computador conectado aos calorímetros indiretos.
(v) Iniciar a calibração da câmara metabólica. A calibração é concluída quando uma linha de base estável é obtida, normalmente dentro de 20 a 30
minutos.
(vi) Durante a calibração, prepare uma única gaiola para cada rato. Equipe a gaiola com comida e água suficientes. Meça o peso
corporal e outros parâmetros de interesse, como a quantidade de comida fornecida para cada rato.
(vii) Quando uma linha de base de calibração estável for obtida e a temperatura desejada (por exemplo, 23 °C em uma concentração de
oxigênio de 21%) for atingida na câmara, feche os gases de calibração.
(viii) Coloque um rato na gaiola preparada e coloque a gaiola na câmara metabólica.
(ix) Feche a câmara e continue a medição.
(x) Terminar a medição após 24 h e sacrificar os camundongos conforme descrito na opção C.
-passo críticoPara garantir a reprodutibilidade dos resultados, recomendamos a medição por 24 h, pois há
diferenças na taxa metabólica entre os ciclos claro e escuro.
(B) Medição do metabolismo relacionado com nst estimulado por ne-cronometragem1 dia
(i) Abra os gases de calibração (15% e 20% de oxigênio) e o suprimento de ar.
(ii) Ligar o sistema de refrigeração/regulação de temperatura e os calorímetros indiretos.
(iii) Certifique-se de que as configurações apropriadas funcionem de maneira ideal (temperatura e duração da medição) para a medição no
computador conectado aos calorímetros indiretos. Comumente, uma temperatura de 33°C é usada para medir o metabolismo
relacionado ao NST induzido por NE.
(iv) Iniciar a calibração da câmara metabólica. A calibração é concluída quando uma linha de base estável é obtida, normalmente
após 20 a 30 min.
(v) Anestesiar os camundongos com pentobarbital (40-60 mg kg− 1) por injeção intraperitoneal. Certifique-se de que os ratos estão totalmente adormecidos.

-passo críticoÉ muito importante escolher a dose correta de pentobarbital. A janela efetiva é muito estreita e uma dose muito baixa pode
resultar em despertar prematuro, enquanto uma dose muito alta pode ser letal para camundongos.
?solução de problemas

protocolos da natureza|VOL.7 NO.3 | 2012 |609

 protocolo

(vi) Transferir cada rato para uma única câmara metabólica.

(vii) Medir a taxa metabólica básica por 30 min sem interrupção.
(viii) Abra a câmara metabólica e injete NE (1 mg kg−1) em cada mouse. Recomenda-se a injeção subcutânea dorsal.
(ix) Feche a câmara metabólica e continue a medição.
-passo críticoEvite abrir desnecessariamente a câmara metabólica durante a medição para evitar
perturbar os ratos dormindo.
(x) Medir a taxa metabólica até que a resposta NE diminua ou até que os camundongos comecem a acordar (normalmente cerca de 1 h após a
injeção de NE).
(xi) Prossiga com a opção C para sacrificar os camundongos e coletar os tecidos.
-passo críticoObserve que após a medição do metabolismo relacionado ao NST estimulado por NE, os níveis de expressão gênica podem ser
marcadamente alterados. Portanto, não recomendamos o uso de camundongos que sofreram estimulação NE para análise de expressão
gênica.
(c) necropsia e localização de depósitos adiposos-cronometragemvariável; depende do numero de ratos
(i) Eutanásia de cada camundongo por uma dose letal de narcose
2
CO, seguida de deslocamento cervical.
(ii) Dependendo de suas necessidades experimentais, colete amostras de sangue por punção intracardíaca. Se a coleta de amostras de
sangue não for necessária, prossiga para a Etapa 2C(iii). Para coletar sangue, posicione cada mouse com o abdômen voltado para cima e
faça uma incisão com uma tesoura em um ângulo de 30° do abdômen em direção ao pescoço. Corte cuidadosamente a caixa torácica,
perfure o coração com uma seringa de 23 G (1 ml) e remova suavemente o sangue com a seringa. Transfira o sangue para tubos de
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coleta de plasma ou soro, dependendo de seus projetos experimentais. É importante que uma quantidade suficiente de sangue
(geralmente não inferior a 500µl por camundongo) ser coletado de cada camundongo para realizar várias análises.
(iii)Localização e dissecção do WAT inguinal (iWAT).Posicione cada mouse com o abdômen voltado para cima (Fig. 1a, esquerda) e faça uma
incisão com uma tesoura a 30°ângulo no lado ventral do pescoço para o abdome inferior (Fig. 1a, à esquerda, Etapa 1). Levante a pele
com cuidado e faça quatro incisões em direção aos membros anteriores e posteriores (Fig. 1a, à esquerda, Etapas 2–5). Abra
cuidadosamente a pele cortada e prenda com agulhas. Disseque cuidadosamente o depósito iWAT (Fig. 1a, certo). ?solução de
problemas
(4)Localização e dissecção do BAT interescapular (iBAT). Posicione cada mouse com o lado dorsal voltado para cima (Fig. 1b, esquerda) e
faça uma incisão com uma tesoura a 30°ângulo do dorso para trás em direção ao pescoço (Fig. 1b, à esquerda, Etapa 1). Levante a
pele com cuidado e faça quatro incisões em direção aos membros anteriores e posteriores (Fig. 1b, à esquerda, Etapas 2–5). Abra
cuidadosamente a pele cortada e disseque o iBAT (Fig. 1b, certo). ?solução de problemas

(v) Se uma montagem inteira de tecido adiposo (Etapa 6, opção A) ou coloração H&E de tecidos adiposos embebidos em parafina (Etapa 6,
opção B) for desejada, transfira os depósitos adiposos para 4% recém-preparados (p/vol) PFA e manter os tecidos em
4% (p/vol) de PFA a 4°C durante 24 h. Se a coloração imuno-histoquímica de criossecções (Passo 6, opção C) for necessária, coloque
os tecidos adiposos em um molde plástico e adicione o composto OCT Tissue-Tek para incorporação.

coleta e fixação de tecido adiposo

6|Se desejar, execute uma montagem inteira de tecido adiposo (opção A), coloração H&E de tecidos adiposos embebidos em parafina
(opção B) ou imuno-histoquímica em criossecções adiposas (opção C).
(a) montagem inteira de tecido adiposo-cronometragem4 dias

(eu)Preparação de amostras de tecido adiposo (dia 1). Transfira e mergulhe 4% (p/vol) de tecidos adiposos de camundongo fixados em PFA em
placas de Petri preenchidas com 1× PBS. O volume do PBS deve ser suficiente para cobrir os tecidos.
-passo críticoPara obter os melhores resultados, os tecidos adiposos devem sempre ser obtidos como amostras frescas logo
após a dissecção e imersos na solução de trabalho (PBS ou PBST).
?solução de problemas
(ii) Para preparar fatias finas (tipicamente 5 mm × 5 mm), prenda os tecidos adiposos com fórceps e corte-os usando uma
lâmina de bisturi. Os cortes devem ser uniformes para produzir seções de igual espessura em toda a amostra de tecido.
Portanto, aplique uma leve pressão ao cortar o tecido com a lâmina do bisturi.
?solução de problemas
(iii) Transfira o tecido adiposo para uma placa de seis poços devidamente rotulada e lave-a com ~ 1,5 ml de 1× PBS por poço em temperatura ambiente
por 1 h em uma placa de balanço (o tecido adiposo deve ser coberto completamente com PBS). Nesta etapa, o PFA restante é removido do tecido.

(iv) Incubar as seções de tecido com Proteinase K (20µgml− 1em tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,4)) à temperatura ambiente durante 5 min para
digerir o tecido.
(v) Permeabilizar os tecidos adiposos com metanol a 100% à temperatura ambiente por 30 min. Devido à toxicidade do metanol, esta etapa deve ser
realizada em uma capela química.
(vi) Lave os tecidos adiposos três vezes com 1× PBS por 1 h em uma prancha de balanço.

610|VOL.7 NO.3 | 2012 |protocolos da natureza

 protocolo

(vii) Incubar o tecido adiposo com tampão de bloqueio a 3% (p/vol) por 12–24 h a 4 ° C em uma placa de balanço para bloquear sítios de ligação
inespecíficos.
(viii)Coloração de anticorpos primários (dia 2). Transfira o tecido para PBST e lave-o bem para remover o tampão de bloqueio. Em seguida,
incubar as seções de tecido com um ou vários anticorpos primários. Realize a incubação de anticorpos por 12–24 h a 4 °C em uma placa
de balanço. Se estiver usando o anticorpo monoclonal CD31 anti-rato de rato como anticorpo primário, dilua-o 1:200 em PBST. Adicione
um volume suficiente de solução de anticorpo para imergir todo o tecido.
(ix)Coloração de anticorpos secundários (dia 3). Lave as amostras de tecido com PBST por 1,5 h a 4 ° C em uma placa de balanço.
(x) Mergulhe as amostras de tecido com tampão de bloqueio de 3% (p/vol) por 1,5 h a 4 ° C em uma placa de balanço.
(xi) Preparar diluições de anticorpos secundários em tampão de bloqueio de 3% e incubar os tecidos adiposos com as soluções de anticorpos
diluídos por 2 h à temperatura ambiente em uma placa de balanço. Use, por exemplo, um anticorpo anti-rato de cabra conjugado com Alexa
Fluor 555 (diluído 1:400) como o anticorpo secundário.
(xii) Incubar as seções de tecido adiposo com tampão de bloqueio (diluição 1:1 com PBST) por 1 h à temperatura ambiente em uma placa de balanço.
(xiii) Lave os tecidos adiposos a 4 ° C com PBST durante a noite em uma placa de balanço.
(xiv)Montagem do tecido (dia 4). Transfira as amostras de tecido coradas para lâminas de vidro de microscópio e monte com uma ou duas
gotas de meio de montagem Vectashield por lâmina. Cubra o tecido com lamelas de microscópio. Examinar as lâminas diretamente
sob microscopia confocal ou armazenar as lâminas a 4 °C no escuro; usar em poucos dias.
-ponto de pausaSele as lamínulas com esmalte para evitar que os tecidos sequem; as lâminas podem ser armazenadas por até 4
semanas a - 20 °C.
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?solução de problemas
(xv)Imagem. Capture imagens 3D de tecidos adiposos corados de montagem inteira com um microscópio confocal usando um software
Nikon D-eclipse C1 e EZ-C1 3.90 (ou, alternativamente, qualquer microscópio confocal equivalente e sistema de imagem). Obtenha
imagens em ampliações de ×10, ×20, ×40 ou ×60 de 5µespessura m. Digitalize de oito a dez camadas (escolha a espessura e o número
de camadas de acordo com as informações desejadas que devem ser extraídas das imagens). Colete as imagens e analise-as de
forma quantitativa com o Adobe Photoshop.
?solução de problemas
(B) Coloração de H&e em depósitos adiposos embebidos em parafina-cronometragem1 dia
(eu)Preparação da seção de tecido (dia 1). Prepare seções de amostras de tecido adiposo embebidas em parafina usando um micrótomo
(espessura: 5µm para iWAT, 3µm para iBAT). Transferir as seções com uma pinça em um banho de água (~40 ° C). Colete as seções de
parafina usando uma lâmina de vidro Superfrost depois que a parafina ao redor do tecido estiver alisada. Seque as seções ao ar antes
de prosseguir para a próxima etapa.
?solução de problemas
(ii) Colocar as lâminas de tecido adiposo em um forno e incubar por 2 h a 60 ° C para remover o excesso de parafina. Deixe os slides esfriarem à temperatura
ambiente.
-ponto de pausaAs lâminas podem ser mantidas por 1 a 2 anos em temperatura ambiente em uma caixa de armazenamento.

(iii)Desparafinização.Transfira as lâminas para um frasco de coloração vertical. Desparafinizar as lâminas de tecido adiposo em Xylen duas vezes (5
min cada).
-passo críticoExecute a Etapa 6B(iii–xiii) usando um frasco de coloração vertical.
(4)Reidratação das lâminas de tecido. Reidratar as lâminas de tecido adiposo com etanol 99,7% (vol/vol) duas vezes (5 min cada).
(v) Reidratar as lâminas de tecido adiposo com etanol a 95% (vol/vol) duas vezes (5 min cada).
(vi) Reidratar as lâminas de tecido adiposo com etanol a 70% (vol/vol) duas vezes (5 min cada).
(vii) Lavar as lâminas de tecido adiposo com dHO
2
por 5 min.
(viii) Corar as lâminas de tecido adiposo com hematoxilina por 3 min.
(ix) Remova o excesso de hematoxilina em água corrente por 10 min.
(x) Corar as lâminas de tecido adiposo com eosina por 1-2 min.
(xi) Desidratar as lâminas de tecido adiposo com etanol a 95% (vol/vol) duas vezes (5 min cada).
(xii) Desidratar as lâminas de tecido adiposo com etanol 99,7% (vol/vol) duas vezes (5 min cada).
(xiii) Remova as lâminas de tecido adiposo do frasco de coloração vertical e deixe as lâminas secarem na bancada.
(xiv)Montagem. Adicione uma ou duas gotas de Pertex (dependendo do tamanho do tecido) nas seções de tecido adiposo coradas e
cubra-as com lamínulas de microscópio muito suavemente em ângulo; isso ajudará a evitar o aprisionamento de bolhas de ar.

-ponto de pausaAs lâminas de tecido adiposo coradas com H&E podem ser armazenadas em uma caixa de armazenamento por vários anos.

(xv)Imagem. Analise os tecidos adiposos corados com um microscópio de campo claro. Capture imagens em ampliações de ×10, ×20, ×40 ou
×60, dependendo das informações desejadas sobre as estruturas do tecido. Quantifique o tamanho dos adipócitos usando o Adobe
Photoshop ou software livre alternativo (ImageJ do NIH, disponível em http://rsbweb.nih.gov/ij/).

protocolos da natureza|VOL.7 NO.3 | 2012 |611

 protocolo

(c) Imuno-histoquímica em criossecções adiposas-cronometragem3 dias

(eu)Incorporação tecidual (dia 1). Coloque o composto OCT contendo o molde criogênico em gelo seco para congelar rapidamente a amostra.
Após o congelamento, o composto OCT solidifica.
-ponto de pausaAs amostras podem ser armazenadas em - 80 °C por 2 anos.
(ii)Corte de tecido. Antes de seccionar, ajuste o criostato do micrótomo para - 30 °C. Observe que o tempo necessário para atingir uma
diminuição de temperatura depende do equipamento.
-passo críticoPara o corte de tecidos adiposos, a temperatura de corte é -10°C mais baixa do que para outros tipos de tecidos. Essa
escolha da temperatura é necessária para garantir a integridade das estruturas teciduais.
?solução de problemas
(iii) Prepare seções de tecido de 15µm de espessura por lâmina. Coloque cuidadosamente as amostras de tecido em lâminas de microscópio
Superfrost Plus.
-passo críticoEm comparação com outros tecidos não adiposos, os cortes preparados a partir de tecidos adiposos são mais espessos;
isso garante a integridade das lâminas de tecido.
-ponto de pausaAs lâminas podem ser armazenadas a -80 °C por 2 anos.
(4)Coloração do tecido (dia 2). Adapte as lâminas de tecido à temperatura ambiente por ~30 min.

(v) Em um frasco de coloração vertical, fixe o tecido com acetona 100% por 10 min.
(vi) Lave as lâminas pelo menos três vezes em 1× PBS (5 min cada).
(vii) Use uma caneta hidrofóbica PAP para circundar as amostras de tecido para imunocoloração. Cercar os tecidos ajuda a minimizar a
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quantidade de reagente necessária. Sem tocar nas seções, remova cuidadosamente o excesso de água das lâminas usando um pedaço
de papel toalha (isso também é aplicado nas etapas subsequentes que exigem adição de soro de cabra ou anticorpos).
(viii) Para bloquear sítios de ligação de antígenos inespecíficos, incubar as lâminas com 1× PBS contendo 4% (vol/vol) de soro de cabra normal.
Durante este processo, as lâminas devem ser posicionadas horizontalmente em uma câmara de incubação umidificada.
(ix) Lave as lâminas pelo menos três vezes em 1× PBS (5 min cada).
(x) Diluir um ou vários anticorpos primários para as concentrações desejadas em PBS contendo 4% (vol/vol) soro de cabra e
incubar as lâminas de tecido com a solução de anticorpo durante a noite a 4 ° C na câmara de incubação umidificada. Por
exemplo, use Prohibitin anti-rato de coelho como anticorpo primário na diluição de 1:100.
(XI)Coloração do tecido (dia 3). Lave as lâminas pelo menos três vezes em 1× PBS (5 min cada).
(xii) Preparar diluições apropriadas em PBS contendo soro de cabra a 4% (vol/vol) para os anticorpos secundários correspondentes.
Por exemplo, use Cy5 anti-coelho de cabra em uma solução 1:400. Incubar as lâminas com a solução de anticorpo secundário
por 45 min em RT. Proteja os slides da luz.
(xiii) Lave as lâminas pelo menos três vezes em 1× PBS (5 min cada).
(xiv) Use uma toalha de papel para remover o excesso de PBS. Para montar as lâminas, adicione uma ou duas gotas de meio de montagem
Vectashield nos tecidos e cubra cuidadosamente as seções de tecido com lamelas de microscópio.
-ponto de pausaAs lâminas montadas podem ser mantidas a 4 °C no escuro se forem examinadas dentro de alguns dias. As lâminas podem ser
armazenadas por várias semanas a -20 °C.
(xv)Imagem. Analisar tecidos adiposos corados com um microscópio de fluorescência. Sinais positivos podem ser adquiridos usando um microscópio
fluorescente equipado com diferentes comprimentos de onda de excitação.
(xvi) Tire imagens em ampliações de ×10, ×20, ×40 ou ×60, dependendo da informação desejada sobre as estruturas do tecido. Quantifique
o tamanho dos adipócitos com o Adobe Photoshop.

?solução de problemas
O conselho de solução de problemas pode ser encontrado emtabela 1.

TABELA 1 |Tabela de solução de problemas.

degrau problema razao possivel solução

3 Alta taxa de mortalidade de Os camundongos foram adaptados em Aumente o número de camundongos em cada grupo;

camundongos no grupo 4°C grupos a 18°C adaptar camundongos em gaiolas individuais a 18 ° C

Um período de adaptação muito curto Prolongar a adaptação a 18 °C

a 18 ° C

Defeitos genéticos em algumas linhagens de Otimizar a condição de adaptação e

camundongos aumentar o número de animais;
mudar o fundo genético

(contínuo)

612|VOL.7 NO.3 | 2012 |protocolos da natureza

 protocolo

TABELA 1 |Tabela de solução de problemas (continuação).

degrau problema razao possivel solução

5B(v) Morte de camundongos após A quantidade de injeção de Pese cada rato com cuidado e calcule a
injeção de pentobarbital pentobarbital foi muito alta quantidade exata de pentobarbital necessária;
também considerar que certas cepas podem
exigir uma dosagem diferente de pentobarbital

5C(iii), 5C(iv) É difícil localizar diferentes depósitos Cepas geneticamente modificadas de Separe cuidadosamente os depósitos adiposos de outros
adiposos em camundongos camundongos e camundongos do tipo depósitos por dissecção hábil
transgênicos (por exemplo,FOXC2 e selvagem são fenotipicamente diferentes em

ob/ob); falta de depósitos adiposos depósitos adiposos

suficientes

Condições patológicas, como Corrija a condição patológica antes de

caquexia experimentos frios

6A(i) Perda de tecido adiposo Descarte acidental de tecidos Despeje tecidos adiposos em placas de Petri
adiposos durante a troca de durante a troca de tampão em vez de descartar a
tampões solução diretamente na pia
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6A(ii) Os tecidos adiposos são difíceis de Lâmina de bisturi sem corte Substitua novas lâminas ou tesouras com frequência

cortar em seções uniformes e finas para

toda a montagem

Posição incorreta da lâmina do Posicione a lâmina do bisturi perpendicularmente ao

bisturi tecido adiposo

6A(xiv) Autofluorescência de tecido Secagem do tecido adiposo devido ao Adicione meio de montagem Vectashield suficiente
adiposo corado meio de montagem Vectashield para cobrir o tecido adiposo antes de cobri-lo
insuficiente suavemente com lamínulas

6A (xv) Fundo fluorescente 4% (p/vol) PFA não é fresco Use PFA fresco a 4% (p/vol)
inespecífico

Bloqueio insuficiente de sítios de ligação Aumente o tempo de incubação com tampão de

não específicos bloqueio de 3% (p/vol)

6B(i) Secções de tecido adiposo Lâmina de criótomo sem corte Substitua por uma nova lâmina com frequência

embebidas em parafina danificadas

6C(ii) Seções de tecido adiposo Lâmina de criótomo sem corte Substitua por uma nova lâmina antes que surja o
embutidas em criomolde são problema
difíceis de cortar

- cronometragem

Etapas 1 a 5, transformação induzida pelo frio do tecido adiposo: 2 a 8 semanas

Etapa 5A, medição da taxa metabólica e consumo de oxigênio usando um calorímetro indireto: 1 d Etapa 5B,
medição do metabolismo relacionado ao NST estimulado por NE: 1 d
Etapa 5C, eutanásia de camundongos e localização post mortem de depósitos adiposos: variável; depende do número de camundongos, normalmente 20
a 30 minutos por camundongo
Etapa 6A (i-xiv), montagem inteira de tecido adiposo: 4 d
Etapa 6A(xv), imagem: variável; depende do número de amostras e disponibilidade de microscópios Etapa 6B (i-
xiv), coloração H&E em depósitos adiposos embebidos em parafina: 1 d
Etapa 6B(xv), imagem: variável; depende do número de amostras e disponibilidade de microscópios Etapa
6C(i–iii), preparação de seções de tecido: 1 d
Etapa 6C (iv-xiv), coloração de criossecções: 3 d
Etapa 6C(xv, xvi), imagem: variável; depende do número de amostras e disponibilidade de microscópios

protocolos da natureza|VOL.7 NO.3 | 2012 |613

 protocolo

uma30°C 4°C b Figura 2 |Aumento de mitocôndrias positivas para proibitina em adipócitos por exposição ao
frio. (uma) Após 4 semanas de exposição a 4°C ou a 30°C, os camundongos C57BL/6 foram
10
P<0,01 eutanasiados e os depósitos adiposos foram dissecados. As criosecções de iWAT e iBAT foram
iWAT

8 coradas com um anticorpo policlonal anti-rato proibitina de coelho (vermelho) e DAPI (azul).

Proibição+mitocôndria
por campo (×103µm2)
Tanto o iWAT quanto o iBAT expostos a 4 °C mostraram uma densidade aumentada de
6 mitocôndrias de proibitina (vermelho) em comparação com seus equivalentes a 30 °C. (b)
Quantificação de estruturas positivas para proibitinas de iWAT e iBAT expostas a 4 °C ou 30 °C.
4 P<0,01
Todos os estudos em animais foram aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais do

2 Comitê de Ética em Animais Experimentais do Norte de Estocolmo.n=8 amostras por grupo. As

30°C
iBAT

30°C
barras de erro indicam sem

4°C

4°C
0
50µm iWAT iBAT

resultados antecipados
Como a ativação BAT induzida pelo frio e a transição WAT-BAT são altamente reprodutíveis em cada camundongo individual, a variação entre
camundongos individuais deve ser mínima. É importante que o tecido adiposo do mesmo depósito seja utilizado para estudos comparativos. A
exposição de camundongos C57BL/6 a 4°C por 4 semanas gera exemplos altamente reprodutíveis de ativação de BAT (Fig. 1c,d). No iWAT
exposto a 4°C, o tamanho médio dos adipócitos é significativamente menor em relação ao grupo exposto a 30°C.
Além disso, os adipócitos no iWAT exposto a 4°C continham uma alta densidade de organelas intracelulares.Fig. 1c,d), que são confirmados
como mitocôndrias expressando proibitina (Figura 2). Ao contrário do iWAT, o tamanho médio dos adipócitos do iBAT não é significativamente
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reduzido em comparação com o grupo de 30 ° C (Fig. 1c,d). No entanto, o número intracelular de mitocôndrias de adipócitos BAT é
marcadamente aumentado a 4 ° C.Figs. 1e2). A coloração de CD31 de microvasos adiposos demonstrou que a densidade vascular foi
marcadamente aumentada em ambos iWAT e iBAT expostos a 4°C em relação aos seus depósitos correspondentes expostos a 30°C.Fig. 3a,b).
Esses resultados representam um exemplo da transição induzida pelo frio de sWAT para um fenótipo BRITE e a mudança para um fenótipo
angiogênico. Achados experimentais mais detalhados são descritos em outro lugar5,10. Como esperado, a exposição ao frio aumentou
significativamente a capacidade de NST em resposta à estimulação NE (Fig. 3c). Os dados apresentados emFigura 3c foram adotados e
modificados de nossa publicação anterior (ref. 5).

Figura 3 |Aumento da densidade vascular e termogênese uma30°C 4°C b c

sem tremores em resposta à exposição ao frio. (uma) Após
4 semanas de exposição a 4°C ou a 30°C, os camundongos 10 P<0,01 120
iWAT

C57BL/6 foram eutanasiados e os depósitos adiposos foram 4°C

CD31+área de embarcações por

8 100
dissecados. iWAT e iBAT frescos foram corados com um P<0,01 Vo2(ml mín.-1kg-1) 30°C
campo (×103µm2)

80
anticorpo monoclonal CD31 anti-rato de rato. Tanto o iWAT 6
60 NE
quanto o iBAT expostos a 4°C mostraram uma densidade 40
4
vascular aumentada em comparação com seus equivalentes 20
iBAT

2
30°C

30°C

a 30°C.
4°C

4°C

0
(b) Quantificação de microvasos positivos para 50µm 0 20 40 60 80
iWAT iBAT Tempo (min)
CD31 de iWAT e iBAT expostos a 4 °C ou 30 °C.
(c) Taxas metabólicas de 4°C– ou 30°C–expostos
grupos foram medidos para avaliação da termogênese sem tremores em resposta a NE. Os dados apresentados emcforam adotados e modificados de nossa publicação
anterior5. Todos os estudos em animais foram aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais do Comitê de Ética em Animais Experimentais do Norte de Estocolmo.n
=8 amostras de 4 camundongos em cada grupo. As barras de erro indicam sem

Observação: informações complementares estão disponíveis na versão HTML deste artigo.
AgradecimentosAgradecemos a B. Cannon e J. Nedergaard, da Universidade de
Estocolmo, por fornecerem a instalação animal para nossa pesquisa. O laboratório
do autor foi apoiado por bolsas de pesquisa do Conselho de Pesquisa Sueco,
Fundação Sueca do Câncer, Fundação Instituto Karolinska, Prêmio de Professor
Distinto do Instituto Karolinska, Fundação Torsten Soderbergs, Projeto Integrado da
União Europeia de Metoxia (projeto nº 222741) e a bolsa avançada do Conselho
Europeu de Investigação ANGIOFAT (projecto n.º 250021).
Publicado online em http://www.natureprotocols.com/.
Informações sobre reimpressões e permissões estão disponíveis online em http://www.nature.
com/reprints/index.html.
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doenças metabólicas.Nat. Rev. Drug Descov.9, 107-115 (2010).
3. Tisdale, MJ Cachexia em pacientes com câncer.Nat. Rev. Câncer2, 862-871 (2002).

Contribuições do autorYC desenhou o estudo. SL, JH, YX e 4. Petrovic, N.et ai.A ativação crônica do receptor ativado por proliferador de
TS realizou os experimentos. SL, JH, YX, TS e YC analisaram os dados. peroxissoma γ (PPAR-γ) de culturas de adipócitos brancos derivados do
SL, JH e YC escreveram o artigo. ZC, PA, XY e KH participaram do epidídimo revela uma população de adipócitos termogenicamente
desenvolvimento desses protocolos. competentes contendo UCP1 molecularmente distintos dos adipócitos
marrons clássicos.J. Biol. Química285, 7153-7164 (2010).
Interesses Financeiros ConcorrentesOs autores declaram não haver interesses financeiros 5. Xue, Y.et ai.Angiogênese independente de hipóxia em tecidos adiposos durante a
concorrentes. aclimatação ao frio.Célula Metab.9, 99-109 (2009).

614|VOL.7 NO.3 | 2012 |protocolos da natureza


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obesidade e abole a termogênese induzida pela dieta em camundongos isentos de
estresse térmico por viver em termoneutralidade.Célula Metab.9, 203-209 (2009).
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