Journal of Chromatography B

Volume 1216, 1 February 2023

An LC-MS/MS method for simultaneous

analysis of up to six monoamines from brain
tissues
Sejal Davla,Edward Daly, Jenn Nedow, Ari Gritsas, Laura Curran, Lorne
Taylor, Donald J. van Meyel

Mestrando: Jackson Albernáz dos Santos

Orientadora: Dr. Luciana Grazziotin Rossato Grando
 TÓPICOS

1- INTRODUÇÃO

2-MATERIAIS E MÉTODOS

3-RESULTADOS E
DISCUSSÕES

SBL | Reimaginando a Assistência Médica 4- CONCLUSÃO

 Monoaminas biogênicas ( formadas pela descarboxilação enzimática de
1- INTRODUÇÃO aminoácidos naturais);
Encontrada no sistema nervoso de todos os animais, sendo neuromodeladores
para os processos fisiológicos e suas alterações podem acarretar patologias
neurológicas ( Parkinson, depressão e distúrbios do sono).
Uso de HPLC - compromete a análise pelo potencial de oxidação nas pequenas
quantidades;
LC- MS/MS- facilita pela ionização por electrospray, não requerendo extração
exaustiva;
cada método é limitado pois se concentra somente na dopamina e serotonina.
medida de cérebro de moscas-das-frutas(Drosophila melanogast e
camundongos.
 um novo método LC-MS/MS multiplexado que incorpora o uso de
2- MATERIAIS E MÉTODOS
um Espectrômetro de Massa Triplo Quadrupolo (QQQ) para a
medição simultânea.
dopamina, serotonina, octopamina, tiramina, melatonina e N-
acetilserotonina;
as amostras do cérebro (da mosca) e do camundongo foram
dissecados com solução de fosfato (gelada para não desnaturar) e
após centrifugadas. Após separação de material foram congelados à
-80°C.
foram realizadas soluções reservas para comparação durante as
análises;
spectrômetro de massa quadrupolo triplo Thermo-Scientific Quantiva™ (QQQ) que incorporava uma fonte de ionização por
eletrospray aquecida (HESI), um sistema UHPLC Thermo Scientific UltiMate™ 3000 (incluindo amostrador automático
UltiMate™ 3000 RS).
 fonte: cequimica.com.br/produto/coluna-hplc-zorbax-eclipse-plus-c18/

o tempo de aquisição foi de 12,1 min e o tempo total da execução em torno de 14 min

rodado primeiro o padrão e observado nenhum pico de interferência.

3-RESULTADOS E DISCUSSÕES

ANÁLISE DE PADRÕES DE REFERÊNCIA SINTÉTICOS (DA, 5-HT, OA, TA, MT E NAS);

PADRÕES INTERNOS DEUTERADOS CORRESPONDENTES (- D4-DA, D4-5-HT, D3-OA, D4-TA

, D4-MT E D3-NAS.)

PADRÕES NÃO MARCADOS ERA ORIGINALMENTE DE 10 NG/ML PARA CADA ANALITO (100
PG NA COLUNA) E POSTERIORMENTE REDUZIDA PARA 5,0 NG/ML E 2,5 NG/ML PARA OS
PADRÕES MARCADOS;

OS ÍONS PRECURSORES ESCOLHIDOS PARA AS TRANSIÇÕES DE MASSA MRM

REPRESENTANDO DA E 5HT FORAM ([M−17] + ) ÍONS, ENQUANTO QUE PARA OA FOI ([M−18]
+ ), QUE EVITAM MASSAS ISOBÁRICAS REPRESENTANDO O ([M + H] +) DE QUALQUER
ANALITO.

TRANSIÇÕES DE MASSA OTIMIZADAS E ENERGIAS DE COLISÃO PARA DA (TRANSIÇÃO DA

RELAÇÃO MASSA-CARGA ( M / Z ) 137 → 91), 5-HT ( M / Z 160 → 115), OA ( M / Z 136 → 91), TA ( M
/ Z 138 → 121), MT ( M / Z233 → 174) E NAS ( M / Z 219 → 160);
 Figura 2 . Traços representativos para análise espectrométrica de massa de padrões de referência deuterados. SRM scan HESI-MS/MS cromatogramas de massa de
Fig. 1 . Traços representativos para análise espectrométrica de massa de padrões de referência. SRM scan HESI-MS/MS cromatogramas de massa de um
→ → → um padrão de referência (10 ng/mL) em solução, injeção de 10uL; (A) d3-OA, ( m / z 139 → →
93), (B) d4-DA ( m / z 141 →
95), (C) d4-TA ( m / z 142 125), (D) d4 -5-HT ( m /
padrão de referência (10 ng/mL) em solução, injeção de 10uL; (A) OA, ( m / z 136
160 → →
115), (E) NAS ( m / z 219 →
160) e (F) MT , ( m / z233
91), (B) DA ( m / z 137 91), (C) TA ( m / z 138 121), (D) 5-HT ( m / z
174). As estruturas químicas para cada uma das monoaminas alvo são mostradas à direita.
z 164 →118), (E) d3-NAS, ( m / z 222 → 160) e (F) d4-MT, ( m / z 237→ 178).
DETECÇÃO DE
MONOAMINAS
EM EXTRATOS
DE CÉREBROS
DE
DROSOPHILA

 (A) MEDIÇÃO HPLC-MS DE DA

(N = 8 LISADOS ​DE AMOSTRAS
INDEPENDENTES, CADA UM
DE 20 CÉREBROS
Quantificação DISSECADOS),
de (B) A PARTIR DE 200 ΜL DE
monoaminas EXTRATO DE AMOSTRA DO
CÓRTEX CEREBRAL DE
em extratos de CAMUNDONGO, TRÊS
INJEÇÕES INDEPENDENTES
cérebros de FORAM FEITAS PARA
MEDIÇÃO DE HPLC-MS DE
Drosophila e de CADA DA, 5-HT E TA.

camundongos. (C) A PARTIR DE DUAS

RÉPLICAS BIOLÓGICAS

(VERMELHO E AZUL), ONDE
CADA UMA COMPREENDIA
500 ΜL DE EXTRATO DE
AMOSTRA DO CÓRTEX
CEREBRAL DE CAMUNDONGO,
 O método é benéfico pela rapidez na detecção de monoaminas em
4- CONCLUSÃO tecidos cerebrais;
Os processos de cromatografia liquida e gasosa com detecção
eletrônica são eficientes, porém na cromatografia de fase reversa
( usada para separar compostos que possuem porções
hidrofóbicas e não possuem um caráter polar dominante) se tem
um método mais eficaz e com maior controle.
Para aminas altamente polares o grau de dificuldade é maior pois
elas ficam próximas da área de fuga do solvente ( distorção dos
picos).
Pode ser utilizado em outros tipos de monoaminas;