Introdução à LC/MS

Introdução

n LC provém a separação, em fase líquida, de

misturas complexas, porém dificilmente fornece a
identificação positiva de componentes
individuais.
n MS é uma técnica que auxilia na elucidação
estrutural de compostos em fase gasosa, porém
dificilmente é apropriado para a análise de
misturas.
n LC opera em fase líquida enquanto que MS opera
em fase gasosa, sob alto vácuo.
Introdução

n O uso de uma interface é necessário para ter

compostos seqüencialmente separados em LC e
introduzidos para análise no MS.

n  U mbom sistema LC/MS pode fornecer

informações quali e quantitativas, geralmente
com diminutas quantidades de material.
Cromatografia Líquida
Espectrometria de Massas
Misturas em MS
Combinando LC com MS
Aquisição dos Dados

Velocidade de varredura
Aquisição dos Dados

Número de espectros por pico

Melhorando os Resultados

Obter a maior eficiência possível

Melhorando os Resultados

Apresentação de cromatograma de
íon selecionado
Melhorando os Resultados

Monitoramento de íon selecionado (SIM)

Sumário

n O interfaceamento de LC com MS resulta em um

instrumento poderoso de LC/MS que pode ser
usado para análises de misturas complexas,
originada de fontes mais variadas.

n Aplicações de interesse nas áreas de meio

ambiente, arqueologia, medicina e forense, além
de química e bioquímica.
 Cromatografia Líquida
Acoplada à Espectrometria
de Massas —LC/MS

n  Espectrometria de Massas

n  Interfaces
n  Analisadores de Massas
I. Espectrometria de Massas (MS)

n  A espectrometria de massas é uma técnica

analítica instrumental utilizada para a análise, em
fase gasosa, de átomos ou moléculas de uma
amostra que são ionizados e separados de
acordo com a razão massa/carga quando
submetidos a condições específicas de um
campo elétrico e/ou magnético.
I. Espectrometria de Massas (MS)

n  A determinação da massa molecular;

n  A caracterização estrutural;
n  O estudo da reatividade em fase gasosa;
n  A análise qualitativa e quantitativa dos
componentes de uma mistura complexa;
n  A estrutura de compostos inorgânicos, orgânicos
e biológicos;
n  A estrutura e composição de superfície sólida;
n  A razão isotópica de átomos na amostra.
II. O Espectrômetro de Massas

n  Processo de ionização e/ou fragmentação

n  Separação dos íons
n  Detecção e análise

Amostra

Sistema de
Fonte Analisador
introdução Detector
de íons de massas
de amostra

Sistema Proc. de
de vácuo dados
Etil benzeno: MM = 106 Da

C6H5CH2CH3 + e- → C6H5CH2CH3• + + 2e-

Informações do Espectro de
Massas

n  Separação dos íons pela razão massa/carga

n  Pico do íon molecular

n  Pico do íon base (100%)

n  Padrão de fragmentação

n  Razão isotópica

III. Fontes (Processos) de
Ionização
Tipo Nome e Sigla
Básico
Fase Gasosa Impacto Eletrônico (EI)
Ionização Química (CI)
Ionização de Campo (FI)
Dessorção Dessorção de Campo (FD)
Ionização electrospray (ESI)
Ionização/dessorção à laser
assistido por matriz
(MALD/I)
Bombardeamento de átomos
rápidos (FAB)
Ionização termospray (TS)
Agente Ionizante
elétrons energéticos
íons gasosos
eletrodo alta voltagem
eletrodo alta voltagem
alto campo elétrico
feixe de laser
feixe átomos
acelerados
alta temperatura
Impacto Eletrônico ou Ionização
por Eletrons

n  A amostra passa por uma “cortina” de elétrons

acelerados por um campo de 70 eV

E = 70 eV ≈ 7 × 103 kJ mol-1

n  Energia de ligação típica ≈ 200 - 600 kJ mol-1

Fragmentação
Impacto Eletrônico
Ionização por Elétron

J  Alta produção de íons - boa sensibilidade

J  Fragmentação auxilia na identificação

K  Requer amostra volátil

L  Pico íon molecular nem sempre é evidente

⇒  Uso de Ionização Química (CI):

⇒  produção de íon molecular e a

fragmentação é mais amena
Reprodutibilidade de fragmentação
Ionização à Pressão Atmosférica (API)

n  Ionização Electrospray (ESI)

n  Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI)

Vantagens API

n  Informação sobre a massa molecular (MM) dos

compostos, inclusive grandes biopolímeros.
n  Sensível; MM obtida com concentrações baixas de
analitos.
n  A técnica é compatível com moléculas voláteis, não
voláteis, polares e apolares.
n  Excelente para confirmação de compostos
conhecidos.
Ionização por Electrospray (ESI)

n  Ionização à pressão atmosférica e temperatura

ambiente
n  Aplicação de campo elétrico de vários kV
promove a ionização das gotículas do spray
n  Um contra fluxo de gás secante reduz o tamanho
das gotículas até o seu colapso eletrostático
n  Produção de íons com elevado número cargas
Interface ESI
Processo de Ionização
Aplicações do ESI

q  Análise de compostos polares e com elevada massa

Molecular. Por Exemplo: Saponinas
H3C CH3

OH
CH3 CH3

OH O
O H3C

HO O
O H3C
H OH

O H
O
HO
H
O O
O OH

H OH
H
O
 1445.2
1395.1 1434.1
0 447.5 1230.1
691.9 727.6 769.8 882.0
896.0 909.4 1187.7
sep1124Fs 8 463.5
(0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23)) 1470.0
Scan ES-
0 1350.1
100 4.20e5
sep16rFs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) 1349.6 1351.2 Scan ES-
1314.1 1391.9 2.21e5

Monitoramento da composição de frações

100 1272.2
1308.1 1352.2
1271.6
1271.9 1394.0
% 1230.1 1272.9 1356.1 1392.0
1395.1 1434.1
1230.1
1230.8
% 447.5463.5 691.9 727.6 769.8 882.0
896.0 909.4 1187.7
1188.0 1398.0 1470.0

obtidas de extratos de Sapindus saponaria

499.7 520.7 966.1 1002.1 1436.0 1488.1
0 603.9 749.4 881.9 923.9 1041.8 1146.0
sep16rFs
0 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) Scan ES-
100
sep1162Fs 13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49)) 1272.2 1314.1 2.21e5
Scan ES-
966.1 1271.6 1356.1 1.81e5
100 1230.1 1272.9 1392.0
924.0 965.6 966.5 1230.8
% 1188.0 1398.0
924.6966.1967.1 1436.0 1488.1
% 499.7 520.7 603.9 749.4 881.9 923.9 1002.1 1146.0
749.5 1041.8
863.6 881.9 1008.0 1042.2
0 603.4 750.5
471.4 836.9 1141.0 1338.7 1407.4
sep1162Fs
0 13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49)) Scan ES-
966.1 1.81e5
sepFreu2026Fs
100 10 (0.494) Cm (7:13) Scan ES-
924.0 965.6 966.5
924.0 3.90e5
100
924.6 967.1
923.6 924.5
% 749.5
863.6 881.9 965.7 1008.0 1042.2
% 603.4 750.5 882.0
471.4 836.9 1141.0 1338.7 1407.4
503.5 863.9 883.1 945.0 967.6 1019.9 1041.8
0 455.3 603.3 749.6 1097.3 1154.6 1265.3 1298.9 1468.4
665.4
sepFreu2026Fs
0 10 (0.494) Cm (7:13) Scan ES-
sepha1149Fs 28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8)) 924.0 3.90e5
Scan ES-
100
923.6924.1
924.5 3.46e5
100
sep1112Fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9)) Scan ES-
966.1
965.7 1288.0
%
100 882.0 2.24e5
945.1 966.6 1246.2
% 503.5 863.9 883.1 945.0 967.6 1041.8 1097.3 1154.6 1203.8 1265.3
455.3 603.3 665.4
749.6
864.0 882.0
1019.9 1246.91298.9
1289.0 1330.0
1468.4
1004.1 1037.9 1080.0 1204.5
0
% 749.4 1386.8 1407.4
440.7471.8 1162.1 1247.8 1290.0 1330.6
sepha1149Fs
0 411.3 28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8)) 1205.7 Scan ES-
m/z
605.5 645.3 689.7 1387.9
100400 450473.4500 528.6550 600 650 700 745.9
750 800 850 900924.1950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 14001402.1 14501445.23.46e5
0 966.1
sep1124Fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23)) Scan ES-
945.1 966.6 1350.1
%
100 4.20e5
864.0 882.0 1349.6 1351.2
1004.1 1037.9 1080.0 1386.8 1407.4
1391.9
440.7471.8 749.4 1308.1 1352.2
0 1394.0
% 1271.9 1434.1 m/z
1395.11450
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 12001230.1
1250 1300 1350 1400
447.5
463.5 691.9 727.6 769.8 882.0
896.0 909.4 1187.7
1470.0
0
sep16rFs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) Scan ES-
sep1112Fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9)) Scan ES-
100 1272.2 1314.1
1288.0
2.21e5
100 2.24e5
1271.6
1246.2 1356.1
1230.1
1203.8 1272.9 1392.0
1246.9 1289.0 1330.0
% 1204.5 1230.8
1188.0 1398.0
% 1290.0 1330.6
499.7 749.4 881.9 923.9
966.1 1002.1 1146.0 1205.7 1247.8
1162.1 1436.0 1488.1
411.3 473.4 520.7
528.6
603.9
605.5 645.3 689.7 745.9 1041.8 1387.9 1402.1
0 1445.2
0
sep1162Fs 13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49)) Scan ES-
sep1124Fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23)) 966.1 Scan ES-
1.81e5
100 1350.1 4.20e5
100 924.0 965.6 966.5 1349.6 1351.2
Figura
%
18: Conjunto de espectro de massas 924.6 das
967.1 frações eluídas com MeOH/H O (1:1). 1308.1 1352.2
1391.9 2
1394.0
749.5
Debaixo
%
447.5 471.4
para cima:
603.4 fração 12,750.5
691.9 727.6 769.8
24, 49 e 62.
863.6 881.9
836.9 896.0 909.4
1008.0 1042.2
1141.0
1187.7
1271.9
1230.1
1338.7
1395.1 1434.1
1407.4
463.5 882.0 1470.0
0
0
sepFreu2026Fs 10 (0.494) Cm (7:13) Scan ES-
sep16rFs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) 924.0 Scan ES-
100 3.90e5
100 1272.2 1314.1 2.21e5
923.6 924.5
1271.6 1356.1
1230.1 1272.9 1392.0
% 882.0 965.7 1230.8
%
Ionização Química à Pressão
Atmosférica (APCI)

n  Bastante similar a ESI

n  Indicado para obtenção de MM de compostos

conhecidos (confirmação de síntese de biblioteca
combinatória), porém indução de fragmentação
também é possível
n  Compatível com grande faixa de fluxos de fase
móvel
n  Robusto para desenvolvimento de método
Interface APCI
Principais Diferenças entre
APCI e ESI

n  Mecanismo de Ionização:

n  Enquanto ESI tem voltagem aplicada à ponta

do spray, APCI apresenta um nebulizador
aquecido e pneumaticamente assistido. A
voltagem (~3 kV) é aplicada a uma agulha de
metal na saída do spray.
n  A descarga Corona ioniza as moléculas do
solvente que por sua vez ionizam os analitos
por transferência de prótons formando [M+H]+
ou [M-H]-
Principais Diferenças entre
APCI e ESI

n  Razão de Fluxo:

n  APCI tolera fluxos na ordem de 0,2 a 2,0 mL/

min, enquanto que ESI opera no máximo até
1,0 mL/min.
n  ESI é melhor indicado para fluxos tão baixos
quanto 5 µL/min, compatível com
acoplamentos capilares (µLC ou CZE).
Principais Diferenças entre
APCI e ESI
n  Fragmentação:

n  Devido ao uso de aquecimento, APCI pode

produzir alguma fragmentação, enquanto que
ESI pode até formar alguns íons pseudo-
moleculares.
n  APCI não produz cargas múltiplas, portanto
não é adequado para compostos de alta MM.
n  Sensibilidade:

n  Sem ser uma regra, APCI tende a render

melhor sensibilidade para solutos menos
polares.
Dessorção/Ionização à Laser
Assistida com Matriz (MALD/I)

n  Processo de ionização branda.

n  Apropriado para biomoléculas de elevado peso

molecular.

n  Pulso de laser incide sobre uma amostra co-

cristalizada com uma matriz apropriada -
derivados de ácidos benzóicos.

n  Análise proteômica.

Dessorção/Ionização à Laser
Assistida com Matriz (MALD/I)
Espectro MALD/I
IV. Analisadores de Massas

n  Setor magnético (B)

n  Duplo foco (EB ou B2)

n  Quadrupolo (Q)

n  Tempo de vôo (TOF)

n  Captura de íons (MSn)

n  Ciclotron de íons (ICR)

 Resolução em MS
Nome Fórmula Nominal Exata Média
Methyl C19H38O2 298 298.2872 298.5114
Stearate
Ubiquitin C378H630N105O118S 8556 8560.6254 8565.873

m
RS =
Δm
RS = 4000 ⇒ 400,0 e 400,1 (40,00 e (40,01)
Resolução em MS
Resolução em MS

A resolução necessária depende da aplicação

Analisador tipo Setor Magnético

2 2
m Bre
=
z 2V
Analisador Quadrupolar (Q)

n  Analisador de varredura

n  Normalmente é mais barato e robusto que setor

magnético

n  Conjunto de 4 pólos de sinais opostos, que

alternam sinais de radiofreqüência entre pares,
permitindo que apenas um íon atinja o detetor de
cada vez
Analisador Quadrupolar (Q)
Analisador Quadrupolar (Q)
Analisador Quadrupolar (Q)
Analisador Quadrupolar (Q)
Experimentos de MS/MS com triplo quadrupolo
Analisador Quadrupolar (Q)
Tempo de Vôo (TOF)

n  Íons são produzidos em pulsos e injetados no

tubo de deslocamento
Tempo de Vôo (TOF)
Tempo de Vôo (TOF)

n  Separação dos íons é temporal e depende da

energia cinética dos fragmentos

t f = d = d (1 2)V ⋅ m
v z

m
= 1,9 ×V t 2 d 2
z
 Analisador Trap Iônico (ion trap)

n  Compacto & robusto

n  Funcionamento similar ao

quadrupolo
n  Capacidade de efetuar MS
tandem temporal
Analisador Trap Iônico (ion trap)