MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIOGRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA NA DISFUNÇÃO VENTRICULAR APÓS O

INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO

MARINA SAMPAIO DE MENEZES CRUZ

Natal/RN
2021
 MARINA SAMPAIO DE MENEZES CRUZ

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA NA DISFUNÇÃO VENTRICULAR APÓS O

INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO

Tese apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em Ciências da
Saúde.

Orientador: Prof. Dr. André Ducati Luchessi.

Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Vivian Nogueira

Silbiger

Natal/RN
2021

i
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Cruz, Marina Sampaio de Menezes.

Análise da expressão gênica na disfunção ventricular após o
infarto agudo do miocárdio / Marina Sampaio de Menezes Cruz. -
2021.
54f.: il.

Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2021.
Orientador: André Ducati Luchessi.
Coorientadora: Vivian Nogueira Silbiger.

1. Insuficiência cardíaca - Tese. 2. Infarto agudo do

miocárdio - Tese. 3. Expressão gênica - Tese. 4. Marcadores -
Tese. I. Luchessi, André Ducati. II. Silbiger, Vivian Nogueira.
III. Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 616.12-008.46

Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263

ii
 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIOGRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde:

Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito

iii
 MARINA SAMPAIO DE MENEZES CRUZ

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA NA DISFUNÇÃO VENTRICULAR APÓS O

INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO

Aprovada em ___ / ___ / ___

Banca examinadora:

Presidente da Banca

Prof. Dr. André Ducati Luchessi

Membros da banca

Prof.ª Dr.ª Karine Cavalcanti Mauricio de Sena Evangelista - Departamento de

Nutrição / UFRN

Dr.ª Marcela Abbott Galvão Ururahy – Departamento de Análises Clínicas e

Toxicológicas / UFRN

Dr.ª Luciana Sacilotto – InCor / HCFMUSP

Prof. Dr. João Felipe Bezerra - Escola Técnica de Saúde / CCS / UFPB

iv
 DEDICATÓRIA

Ao meu pai, José Onilson de Menezes Cruz (in memoriam), em quem me inspiro
para trilhar essa jornada acadêmica. Você é saudade, amor e sabedoria em minha
vida.

À minha mãe, Tania Bezerra Sampaio, que sempre me mostrou a força e a

coragem que existiam dentro de mim e não contou esforços para me ver feliz.

Ao meu companheiro, Antônio Marques, que dividiu comigo os anseios e dilemas

da vida acadêmica e sempre soube respeitar minhas decisões.

Ao meu irmão, Ciro Sampaio, que sempre esteve presente “do jeitinho dele”.

À minha segunda mãe, Maria do Céu, que me mostrou amor na simplicidade.

À minhas meninas, Ciri e Laurinha, que me ensinaram uma nova forma de amar.

v
 AGRADECIMENTOS

Aos professores Dr. André Luchessi e Dr.ª Vivian Silbiger pela idealização deste
trabalho e por todas as orientações, que muitas vezes iluminaram com respostas um
caminho obscuro.

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da UFRN – ao coordenador

Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito e todos os funcionários da secretaria –
por toda a ajuda prestada para a realização desse estudo.

À CAPES e CNPq pelo apoio financeiro e bolsa de estudos para a realização dessa
pesquisa.

Aos profissionais do ambulatório da cardiologia do Hospital Universitário Onofre

Lopes, incluindo médicos, residentes e recepcionistas, em especial a Dr.ª Rosiane
Viana Zuza Diniz e o Dr. Julio Cesar Vieira de Sousa, pela disponibilidade e
contribuição para a execução deste estudo.

À toda família LBBM, em especial os amigos mais próximos (najs), Victor, Jéssica,
Isabelle, Nana e os agregados Iago, Karla e Ony, o meu sincero agradecimento por
todos os momentos de descontração, os sushis, os Mcs, bem como os momentos de
estudos. Sem vocês, eu não teria a força necessária para seguir e colher os frutos
desse caminho tempestuoso que muitas vezes é a pós-graduação.

Aos pacientes infartados que participaram deste estudo, na esperança de um futuro

melhor para todos.

À minha família de San Diego e meus hausemates, bem como o pessoal do

laboratório do Dr Eric Adler que me ensinaram muito sobre pesquisa, cultura e
amizade em um período de tantos desafios.

À todos aqueles de, direta ou indiretamente, colaboraram para a realização desta

pesquisa.
vi
EPÍGRAFE

#FORABOLSONARO

vii
 14

RESUMO
A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome progressiva caracterizada pela
incapacidade do coração bombear sangue suficiente para os demais tecidos, e sua
principal causa é o infarto agudo do miocárdio (IAM). Apesar dos avanços na
identificação de marcadores associados ao remodelamento do ventrículo esquerdo
(VE), o marcador ideal para uma detecção precoce e acurada da IC isquêmica ainda
não foi encontrado. Sendo assim, esse estudo tem como objetivo avaliar a expressão
de 13 genes previamente associados ao IAM em pacientes com disfunção ventricular
após o IAM comparando-os com aqueles que não tiveram complicações após o IAM.
Além disso, esse estudo buscou listar os miRNAs mais frequentemente citados na
literatura por estarem relacionados ao desenvolvimento da IC isquêmica e verificar
a influencia deles na expressão dos genes estudados. Os pacientes que sofreram
IAM prévio foram classificados em dois grupos: disfunção do VE [fração de ejeção
do VE (FEVE) ≤ 40%, n = 14] e função do VE normal (FEVE > 40%, n = 14). A
expressão de ALOX15, AREG, BCL2A1, BCL2L1, CA1, COX7B, ECHDC3, IL18R1,
IRS2, KCNE1, MMP9, MYL4 e TREML4 foram avaliados por RT-PCR. Apenas a
expressão de KCNE1 diminuiu no grupo FEVE ≤ 40% (p = 0,007). Foi encontrada
correlação positiva entre KCNE1 e fração de ejeção (r = 0,557; p = 0,001). Houve
um risco de 12,25 vezes (IC 95%: 1,33 - 113,06; p = 0,027) de disfunção do VE para
pacientes com menor expressão de KCNE1. A expressão de KCNE1 mostrou alto
AUROC (AUROC: 0,811, IC 95%: 0,642-0,979, p = 0,007), indicando a expressão de
KCNE1 como um bom preditor em desfechos cardíacos. Análise da literatura
mostrou que os miRNAs mais associados com o desenvolvimento da IC isquêmica
são miR-499, miR-1, miR-133a, e miR-208b, sendo o miR-1 já descrito como
regulador da expressão do KCNE1, de acordo com banco de dados público miRNet.
Dessa forma, este estudo sugere que a expressão de KCNE1, bem como seus
mecanismo regulatórios como o miR-1, podem estar relacionados com os níveis de
FEVE e, portanto, com o risco de desenvolvimento da IC pós-IAM.

Palavras-chave: Insuficiência cardíaca; infarto agudo do miocárdio; expressão

gênica; marcadores.

viii
 15

ABSTRACT
Heart failure (HF) is a progressive syndrome characterized by the heart's inability to
pump enough blood to other tissues, and its main cause is acute myocardial infarction
(AMI). Despite advances in identifying markers associated with left ventricular (LV)
remodeling, the ideal marker for early and accurate detection of ischemic HF has not
yet been found. Therefore, this study aims to evaluate the expression of 13 genes
previously associated with AMI in patients with LV dysfunction after AMI, comparing
them with those who had no complications after AMI. In addition, this study sought to
summarize the miRNAs most frequently cited in the literature as they are related to
the development of ischemic HF and to verify their influence on the expression of the
13 genes. Patients who suffered previous AMI were classified into two groups: LV
dysfunction [LV ejection fraction (LVEF) ≤ 40%, n = 14] and normal LV function (LVEF
> 40%, n = 14). Expression of ALOX15, AREG, BCL2A1, BCL2L1, CA1, COX7B,
ECHDC3, IL18R1, IRS2, KCNE1, MMP9, MYL4 and TREML4 were updated by RT-
PCR. Only KCNE1 expression decreased in the LVEF ≤ 40% group (p = 0.007). A
positive correlation was found between KCNE1 and ejection fraction (r = 0.557; p =
0.001). There was a 12.25-fold risk (95% CI: 1.33 - 113.06; p = 0.027) of LV
dysfunction for patients with lower expression of KCNE1. KCNE1 expression showed
high AUROC (AUROC: 0.811, 95% CI: 0.642-0.979, p = 0.007), indicating KCNE1
expression as a good predictor of cardiac outcomes. Literature analysis showed that
miR-499, miR-1, miR-133a, and miR-208b are the miRNAs most associated with the
development of ischemic HF. According to miRNet public database, miR-1 is already
described as a regulator of KCNE1 expression. Thus, this study suggests that the
expression of KCNE1, as well as its regulatory mechanisms such as miR-1, may be
related to LVEF levels and, therefore, to the risk of development of post-AMI HF.

Keywords: Heart failure; acute myocardial infarction; gene expression; markers.

ix
 16

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACTB Beta Actina

ACCF / AHA Do inglês American College of Cardiology Foundation/
American Heart Association
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
AUROC Do inglês Area Under the ROC
CCS Centro de Ciências da Saúde
cDNA DNA complementar
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
FEVE Fração de Ejeção do Ventrículo Esquerdo
HDL Lipoproteina de alta densidade
HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes
IAMCSST Infarto agudo do miocárdio com supradesnível do segmento
ST
IC Insuficiência Cardíaca
IMC Índice de massa corporal
kg Kilograma
LDL Lipoproteina de baixa densidade
miRNA Micro RNA
mRNA RNA mensageiro
NYHA Do inglês New York Heart Association
ROC Do inglês Receiver Operating Characteristic
RT-PCR Reação em cadeia da polimerase em tempo real
RVE Remodelamento do ventrículo esquerdo
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
VE Ventrículo Esquerdo
X2 Qui-quadrado
% Porcentagem

x
 17

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Artigos aceito e publicado na área de cardiologia durante o doutorado

..............................................................................................................................41
Tabela 2. Resumos publicados em eventos científicos na área de cardiologia
durante o doutorado..............................................................................................41

xi
 18

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Classificação da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (Imagem adaptada de

Yancy CW, et al. 2013 ACCF/AHA guideline for the management of heart
failure)...............................................................................................................................14

xii
 19

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 14
2. JUSTIFICATIVA 19
3. OBJETIVOS 20
3.1. Objetivo geral. 20
3.2. Objetivos específicos 20
4. MÉTODOS 21
4.1. Descrição do estudo e participantes 21
4.2. Parâmetros bioquímicos 21
4.3. Isolamento de RNA e Reação em Cadeia da Polimerase em tempo 22
real (RT-PCR)
4.4. Análise Estatística 23
4.5. Estratégia de busca bibliográfica para potenciais miRNA como 24
biomarcadores de IC isquêmica e seleção dos estudos
5. ARTIGOS EM PRODUÇÃO E PRODUZIDOS 25
5.1. Artigo 1: Publicado 25
5.2. Artigo 2: Produzido para Submissão 35
5.3. Artigos desenvolvidos em colaborações durante o período do 37
doutorado
6. CONCLUSÕES 38
7. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES 39
8. REFERÊNCIAS 44
9. APÊNDICES 47
Apêndice A: TCLE 47
Apêndice B: Questionário 49
10. ANEXOS 51

xiii
 14
1. INTRODUÇÃO

A insuficiência cardíaca (IC) é uma condição crônica e progressiva, definida

como a falta de capacidade do coração suprir os tecidos periféricos com as
quantidades de sangue e oxigênio necessárias para suas funções metabólicas,
geralmente devido a uma diminuição ou defeito no bombeamento cardíaco. Ela está
frequentemente associada a altas taxas de hospitalização, morbidade e mortalidade
cardiovascular e é considerada um problema de saúde pública global, atingindo
cerca de 26 milhões de pessoas (1,2).

A principal causa da IC é o infarto agudo do miocárdio (IAM) que leva ao

comprometimento da perfusão miocárdica, sendo o desenvolvimento de IC nesses
pacientes um indicador de mau prognóstico (3). Gerber et al. indicam que 70% dos
pacientes que desenvolvem IC após o IAM vão a óbito dentro de 7,6 anos (4).

A IC isquêmica geralmente está associada a uma diminuição na fração de

ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), parâmetro que indica a porcentagem de
sangue que sai do VE durante a sístole. A FEVE é considerada preservada quando
de 70% a 50% do sangue é ejetado para a aorta em cada contração. Quando essa
porcentagem se encontra entre 49% e 41%, a FEVE é considerada intermediária. E
quando igual ou abaixo de 40% a FEVE é considerada reduzida (Figura 1) (5).

Figura 1. Classificação da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (Imagem

adaptada de Yancy CW, et al. 2013 ACCF/AHA guideline for the management of
heart failure).
 15

Os sinais e sintomas clássicos da IC incluem dispneia, cansaço, taquicardia e

edema periférico. Baseado nesses parâmetros, os pacientes com IC podem ser
classificados de acordo com os estágios da American College of Cardiology
Foundation/ American Heart Association (ACCF/AHA) e com a classificação
funcional da New York Heart Association (NYHA). Os estágios da ACCF/AHA e a
classificação funcional NYHA são parâmetros utilizados para o diagnostico clinico
juntamente com os sintomas e são úteis ao fornecer informação complementar sobre
a presença e severidade da IC (5,6).

A ACCF/AHA classifica o paciente em 4 estágios de acordo com o

desenvolvimento e progressão da doença levando em consideração fatores de risco
e anormalidade na estrutura cardíaca associadas com a IC. A progressão entre
estágios é irreversível e é associada à redução na sobrevida em 5 anos e aumento
da concentração plasmática dos peptídeos natriuréticos. A intervenção terapêutica
em cada estagio visa modificar os fatores de risco, tratar as alterações estruturais
cardíacas e tentar reduzir a morbimortalidade. Já a classificação funcional NYHA
foca na severidade dos sintomas de pacientes que estão nos estágios C e D da
ACCF/AHA. É uma avaliação unicamente clinica realizada pelo medico e pode mudar
frequentemente em pouco tempo. É amplamente utilizada na pratica clinica porém
pode apresentar problemas quanto a sua reprodutibilidade e veracidade por ser uma
avaliação subjetiva, apesar de ser um bom preditor de mortalidade (6–8).

Segundo a Diretriz Brasileira sobre tratamento do Infarto Agudo do Miocárdio

com Supradesnível do Segmento ST, o tempo desde o início dos sintomas até a
reperfusão é diretamente proporcional à severidade dos eventos clínicos, sendo o
tempo um fator fundamental para o benefício do tratamento, tanto imediato quanto
tardio. Entretanto, frequentemente há atrasos no atendimento ao paciente com dor
torácica, principalmente em idosos, do sexo feminino, e naqueles com baixa
condição socioeconômica, de tal forma que, na pratica clínica, apenas cerca de 20%
desses pacientes chegam ao setor de emergência com até 2 horas após o início dos
sintomas (9).

A fisiopatologia da IC isquêmica inicia com a extensa lesão no miocárdio e a

isquemia decorrentes do IAM causando um estresse na parede do VE, o que gera
uma dilatação compensatória a fim de melhorar sua função. A dilatação, por sua vez,
 16

causa mais estresse nessa região, estabelecendo um feedback positivo. Esse ciclo,
associado à morte de miócitos, desbalanço entre consumo e fornecimento de
oxigênio, estresse oxidativo, inflamação e fibrose levam ao remodelamento do VE
(RVE), caracterizado por alterações no tamanho, formato e funcionamento do
coração. A disfunção sistólica no paciente pós-IAM é frequente, sinalizando o início
da IC, porém não demonstrando sinais e sintomas observáveis neste momento. De
acordo com a literatura, um terço dos pacientes que sofreram IAM com supradesnível
do segmento ST (IAMCSST) desenvolvem RVE (10–13).

O início e a progressão da IC envolvem a ativação de mecanismos

compensatórios, os quais envolvem a dilatação das câmaras cardíacas (a fim de
bombear um maior volume de sangue), hipertrofia dos cardiomiócitos (para que o
coração tenha mais força na contração), taquicardia (aceleração do débito cardíaco
para suprir a demanda de oxigênio nos demais tecidos), entre outros mecanismos
sistêmicos (6).

O sucesso da compensação é temporário, mascarando a IC sem resolvê-la.

Assim, a doença continua a progredir até que os mecanismos compensatórios não
sejam mais capazes de bloquear o surgimento dos sinais e sintomas, e nesta etapa
é onde o paciente geralmente procura auxílio clínico. Isso explica porque algumas
pessoas não têm conhecimento do estabelecimento e progressão da IC, e só
procuram o tratamento poucos anos antes da função cardíaca declinar,
necessitando, em casos extremos, de transplante cardíaco (6).

A detecção precoce do RVE e ocorrência de IC após o IAM é essencial para

evitar a morbidade e mortalidade nesse paciente. Exames de imagem, como o
ecocardiograma, podem ser realizados para a visualização da alteração morfológica
e funcional do coração, quando esses parâmetros já se encontram
macroscopicamente alterados (14). Além disso, pode-se observar essas alterações
estruturais com FEVE preservada ou intermediária. Os sinais e sintomas
apresentados pelo paciente, bem como os fatores de risco também podem ser úteis
para o diagnóstico (7).

Apesar dos avanços na identificação de marcadores associados ao RVE, o

marcador ideal para uma detecção precoce e acurada da IC isquêmica ainda não foi
 17

encontrado. O ecocardiograma pode fornecer informações importantes a respeito de

alterações na anatomia e função cardíaca, além da FEVE, porém é importante
ressaltar que alterações estruturais podem ocorrer simultaneamente com a FEVE
preservada ou intermediária (5). Além disso, a concentração sérica de peptídeos
natriuréticos também pode ser correlacionada com a IC, apesar de ser mais
associada a sua descompensação e prognóstico de eventos de IC aguda, do que no
prognóstico do IAM ou no processo de RVE (15). A ausência de um teste de
diagnóstico único para a IC ocorre por ela ser uma síndrome amplamente baseada
em diagnóstico clínico, amparado em uma análise clínica cuidadosa do paciente,
juntamente com seu histórico clínico (16).

A IC é uma doença complexa que apresenta fisiopatologia molecular ainda

não bem compreendida, o que torna interessante a busca por marcadores
moleculares envolvidos no seu estabelecimento para auxiliar no diagnóstico precoce.
Essa abordagem permite a adoção de medidas terapêuticas antes da deterioração
funcional e metabólica mais acentuada do tecido cardíaco, na tentativa de controlar
a progressão da doença e melhorar a qualidade de vida do paciente (9).

Diferentes padrões de expressão gênica podem ocorrer em condições de

estresse, resultantes de distintas combinações de genes, ativação e desativação de
eventos envolvidos na transcrição e tradução, como processamento diferencial de
mRNA (splicing alternativo), modificações pós-traducionais e outros, e muitos desses
diferentes padrões vem sendo utilizados como marcadores de risco, diagnóstico e
prognóstico de doenças complexas (17,18).

Análises recentes de genomas humanos mostraram que a maioria dos

transcritos de RNA não são traduzidos em proteínas, denominados “RNA não
codificantes”. Dentre estes se destacam os microRNAs (miRNAs) que possuem
aproximadamente 19 a 25 nucleotídeos. Os miRNAs ligam-se na região 3' não
traduzida do mRNA alvo, podendo causar degradação do mRNA e a inibição da
tradução proteica (19). Dessa forma, essas moléculas desempenham um papel
crucial na regulação da expressão gênica e de diversos processos celulares.

Diante deste cenário, a avaliação da expressão de mRNA e miRNA nas

células de sangue periférico de pacientes com IC se torna uma estratégia promissora
 18

para o conhecimento de mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento,

estabelecimento e progressão da doença, bem como podem ser úteis no auxílio à
prática clínica para a descoberta de marcadores de diagnóstico mais precoce e de
evolução, bem como na avaliação da eficácia terapêutica.
 19

2. JUSTIFICATIVA

Apesar dos avanços no tratamento e no manejo do paciente que sofreu IAM,

essa condição continua sendo uma causa persistente de mortalidade, principalmente
quando acompanhada de desenvolvimento progressivo de IC. Sendo assim, a IC
pós-IAM permanece um problema epidemiológico, econômico e clínico e os
marcadores cardíacos clínicos conhecidos não são bons indicadores prognósticos
acurados de RVE ou IC pós-IAM. Portanto, biomarcadores precoces e precisos
podem auxiliar na identificação confiável de pacientes com alto risco de desenvolver
IC após IAM.

Nesse contexto, um estudo prévio do nosso grupo utilizando a metodologia de

micro-arranjo mostrou que, dentre 539 genes, 13 (ALOX15, AREG, BCL2A1,
BCL2L1, CA1, COX7B, ECHDC3, IL18R1, IRS2, KCNE1, MMP9, MYL4, e TREML4)
se encontravam diferentemente expressos em leucócitos de pacientes durante as
primeiras 48 horas do IAM, representando potenciais marcadores de estágios
precoces do IAM (20). Em seguida, nosso grupo observou que entre estes genes, o
TREML4 e ECHDC3 se relacionavam também com o risco de desenvolver o IAM em
pacientes com aterosclerose, mostrando ser um potencial marcador de risco
relacionado a expressão gênica diferencial (21).

Uma vez que a influencia dos mais variados tipos de RNAs no

desenvolvimento da IC já vem sendo observado (22), buscamos investigar
expressão destes genes, relacionados ao IAM, em eventos pós isquêmicos, como
da disfunção do ventrículo esquerdo, para identificar suas contribuições no
desenvolvimento dos desfechos cardíacos e prognóstico do IAM.
 20

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar a expressão de 13 genes previamente relacionados com o IAM em

leucócitos de pacientes com disfunção do ventrículo esquerdo, comparando com
pacientes que sofreram IAM mas não desenvolveram a disfunção, a fim identificar a
possível influencia desses genes no desenvolvimento da IC isquemica.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Comparar o perfil biodemográfico, variáveis clínicas, intervenções

terapêuticas e parâmetros laboratoriais entre pacientes com com disfunção
do ventrículo esquerdo pós-IAM e aqueles que sofreram IAM mas sem
complicações;
• Comparar os perfis de expressão de mRNA de genes candidatos em sangue
periférico de pacientes com disfunção do ventrículo esquerdo pós-IAM
comparando com pacientes pós-IAM sem disfunção, utilizando a tecnologia
de PCR em tempo real;
• Verificar a existência de correlação e associação entre o nível de expressão
dos 13 genes e a FEVE dos pacientes selecionados;
• Identificar a possibilidade de a expressão genica apresentar poder preditor da
variação da FEVE;
• Buscar na literatura os miRNAs que estão relacionados com o
desenvolvimento da IC isquêmica;
• Investigar a relação dos miRNAs encontrados com os genes avaliados que se
mostrarem diferentemente expressos, por meio de análise de banco de dados
públicos.
 21

4. MÉTODOS

4.1. Descrição do estudo e participantes

Entre julho de 2018 e dezembro de 2019, selecionamos 65 indivíduos que

haviam sofrido IAMCSST há pelo menos três meses antes da sua inclusão no
estudo, verificado em seu prontuário hospitalar, foram inscritos para triagem neste
estudo transversal. Os pacientes foram recrutados durante sua consulta de rotina no
ambulatório de cardiologia do Hospital Universitário Onofre Lopes da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brasil. O perfil clínico dos
pacientes com IAMCSST foi determinado pela FEVE após o tratamento do IAM,
medida em até ± 3 meses a partir da data da coleta de sangue venoso. Como a
fração de ejeção é amplamente usada para determinar a disfunção do VE, os
pacientes foram classificados em dois grupos: aqueles com disfunção do VE e
sintomas de IC (FEVE ≤ 40%, n = 14) e aqueles com função do VE normal (FEVE >
40%, n = 14), de acordo com a Diretriz da American Heart Association para o Manejo
da IC (5). Os critérios de exclusão foi a existência de outras doenças cardíacas que
poderiam levar à IC como cardiomiopatias congênitas, cardiomiopatia dilatada,
fibrilação atrial, doença de Chagas, hipertensão não tratada; bem como os pacientes
que foram para transplantes cardíacos não foram inscritos.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital

Onofre Lopes - UFRN, que atende à Declaração de Helsinque, sob o número de
protocolo 2.017.026 (Anexo 1). O consentimento informado por escrito foi obtido de
cada participante antes da coleta da amostra (Apêndice 1), e todos os experimentos
foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes. Os dados
clínicos foram avaliados de cada paciente em seus registros hospitalares.

4.2. Parâmetros bioquímicos

As concentrações séricas de glicose, colesterol total, LDL-colesterol, HDL-

colesterol, triglicerídeos, sódio, potássio, uréia e creatinina, bem como a atividade
enzimática da alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase foram
 22

medidos usando kits de Wiener e o analisador bioquímico automático CMD-800

(Wiener, Rosario, Argentina).

A concentração de hemoglobina, hematócrito, número de leucócitos e

plaquetas foram medidos em sangue total usando o analisador automático XT-2000i
(Sysmex Corporation, Kobe, Japão).

Todas as análises foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas do

HUOL/UFRN.

4.3. Isolamento de RNA e Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (RT-

PCR)

Os leucócitos foram isolados a partir de 4 mL de sangue total em EDTA

usando cloreto de amônio como solução de lise de hemácias. Os leucócitos foram
armazenados em Trizol (Invitrogen, Massachusetts, EUA) a -80 ºC até a análise.

O RNA total foi extraído com Trizol, de acordo com o protocolo do fabricante,
e sua concentração e pureza foram medidas em espectrofotômetro Nanodrop
(NanoDrop ND-1000, Montchanin, DE, EUA). A integridade do RNA foi determinada
por eletroforese em gel de agarose (2% agarose / MOPS). O gel foi corado com
GelRed (Uniscience, São Paulo, SP, Brasil), revelando a presença de duas bandas
em aproximadamente 5 e 1,8 Kb, correspondendo ao RNA ribossômico 28S e 18S,
respectivamente (23). O cDNA foi obtido usando o High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) seguindo as instruções
do fabricante.

As expressões de ALOX15, AREG, BCL2A1, BCL2L1, CA1, COX7B,

ECHDC3, IL18R1, IRS2, KCNE1, MMP9, MYL4 e TREML4 foram avaliadas por RT-
PCR. O gene de referência foi selecionado a partir de um estudo de normalização
de três genes candidatos endógenos: GAPDH (Hs.592355_g1), ACTB
(Hs.520640_g1) e 18S rRNA (Hs.626362_g1). O ACTB foi escolhido como o gene
de referência seguindo análises do geNorm (versão 3.44) e do software NormFinder
(24).
 23

Os ensaios de expressão gênica TaqMan (Applied Biosystems, Foster City,

CA, EUA) ALOX15 (Hs00993765_g1), AREG (Hs00950669_m1), BCL2A1
(Hs06637395_s1), BCL2L1 (Hs00236329_m1), CA1 (Hs00266139_m1), COX7B
(Hs00371307_m1), ECHDC3 (Hs00226727_m1), IL18R1 (Hs00977691_m1), IRS2
(Hs00275843_s1), KCNE1 (Hs00264799_s1), MMP9 (Hs00957562_m1), MYL4
(Hs04187281_m1), e TREML4 (Hs01080584_g1) foram usados para as analises de
expressão.

As análises foram realizadas em termociclador 7500 Fast Real-Time PCR

(Applied Biosystems, CA, EUA). As reações foram realizadas em duplicata de acordo
com o protocolo TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EUA) em um volume total de 10 µL contendo 20 ng de cDNA. As
condições de ciclagem de RT-PCR foram: 20 min a 95 ° C, seguido por 45 ciclos
consistindo em 3 s a 95 ° C e 30 s a 60 ° C.

A expressão relativa foi calculada usando o método 2−ΔCt, usando ACTB como
gene de referência (24).

4.4. Análise Estatística

A distribuição das variáveis foi analisada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov.

Variáveis com distribuição normal foram submetidas ao teste t de Student. Variáveis
não-paramétricas foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney. A correlação foi
avaliada pelo teste de Pearson ou Spearman. As diferenças entre as variáveis
categóricas foram testadas por χ2 ou teste exato de Fisher. A análise de regressão
logística univariada foi realizada para avaliar as variáveis associadas à disfunção do
VE pós-IAM. As expressões genicas foram introduzidas como variáveis
independentes. A curva de característica de operação do receptor (ROC) foi traçada
para analisar o poder discriminativo das ferramentas de previsão. A área sob a curva
ROC (AUROC) e os respectivos intervalos de confiança de 95% (IC) foram
calculados.
 24

Os dados foram analisados pelo software SPSS versão 15.0 (SPSS Inc.,
Chicago, IL, EUA) e GraphPad PRISM, versão 5.0 (GraphPad Software, Inc., San
Diego, CA, EUA). A significância foi estabelecida em p <0,05.

4.5. Estratégia de busca bibliográfica para potenciais miRNA como

biomarcadores de IC isquêmica e seleção dos estudos

O banco de dados público PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) foi

pesquisado usando os termos em inglês "ischemic heart failure” ou “heart failure” e
“circulating” ou “plasma” ou “serum” e “microRNA” ou “miRNA” ou “miR” e
“myocardial infarction” ou “heart attack.” Todos os artigos publicados até 31 de
janeiro de 2019 foram incluídos na busca.

Os estudos foram selecionados preliminarmente de acordo com seus título e

resumo, com réplicas e artigos não relacionados sendo descartado. As citações
potencialmente relevantes foram então acessadas como manuscritos completos e
avaliados quanto à conformidade com critérios de inclusão e exclusão. Como critério
de inclusão o estudo deveria ser em humanos investigando a relação entre miRNAs
circulantes (soro, plasma, ou sangue total) e o desenvolvimento, monitoramento ou
prognóstico da IC isquêmica. Apenas artigos em inglês foram selecionados. Além
disso, estudos usando modelos animais, aqueles com base em culturas de células e
tecidos humanos, e aqueles que não focavam na IC isquêmica foram excluídos.
 25

5. ARTIGOS EM PRODUÇÃO E PRODUZIDOS

5.1. Artigo 1: Publicado

Título: miRNAs emerge as circulating biomarkers of post-myocardial infarction heart

failure

DOI: https://doi.org/10.1007/s10741-019-09821-1

Periódico: Heart Failure Reviews ISSN: 1382-4147

Fator de impacto: 4.214 (2020)

Scopus: 83% Qualis: A2

26
27
28
29
30
31
32
33
34
 35

5.2. Artigo 2: Produzido para Submissão

No presente momento, o trabalho encontra-se finalizado e submetido para revisão.

Titulo: KCNE1 expression as indicator of left ventricular dysfunction post-acute

myocardial infarction

Periódico: Scientific Reports ISSN: 2045-2322

Fator de impacto: 4.379 (2020)

Scopus: 93% Qualis: A1

 36

KCNE1 expression as indicator of left ventricular dysfunction post-acute myocardial

infarction

Marina Sampaio Cruz 1,2, Karla Simone Costa de Souza 1, Ananília Medeiros Gomes da Silva
1
, Rayssa Alinne da Silva Dantas 1,3, Rosiane Viana Zuza Diniz 4, André Ducati Luchessi 1*†,
Vivian Nogueira Silbiger 1*†

1
Department of Clinical and Toxicology Analysis, Federal University of Rio Grande do Norte,
Natal, RN, Brazil.

2
Graduate Program in Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,
RN, Brazil.

3
Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte,
Natal, RN, Brazil.

4
Clinical Medicine Department, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN,
Brazil.

*Corresponding authors:

V.N. Silbiger: Av. General Gustavo Cordeiro de Farias, 384, Faculdade de Farmácia,
Petrópolis, CEP: 59012-570, Natal, RN, Brazil; Phone: +55 84 99939 4224; E-mail:
vivian.silbiger@ufrn.br

A.D. Luchessi: Av. General Gustavo Cordeiro de Farias, 384, Faculdade de Farmácia,
Petrópolis, CEP: 59012-570, Natal, RN, Brazil; Phone: +55 84 99903 3577; E-mail:
andre.luchessi@outlook.com

†
These authors have equal contributions.
 37

5.3. Artigos desenvolvidos em colaborações durante o período do doutorado

O artigo THE IMPACT OF VITAMIN D SUPPLEMENTATION ON VDR GENE

EXPRESSION AND BODY COMPOSITION IN MONOZYGOTIC TWINS:
RANDOMIZED CONTROLLED TRIAL foi publicado no periódico Scientific Reports
que possui fator de impacto 3.998 e Qualis A1 da CAPES para área Medicina II.

O artigo FACTORS ASSOCIATED WITH INCREASED ALPHA-TOCOPHEROL

CONTENT IN MILK IN RESPONSE TO MATERNAL SUPPLEMENTATION WITH
800 IU OF VITAMIN E foi publicado no periódico Nutrients que possui fator de
impacto 4.171 e Qualis A2 da CAPES para área Medicina II.

O artigo TREML4 MRNA EXPRESSION AND POLYMORPHISMS IN BLOOD

LEUKOCYTES ARE ASSOCIATED WITH ATHEROSCLEROTIC LESION
EXTENSION IN CORONARY ARTERY DISEASE foi publicado no periódico
Scientific Reports que possui fator de impacto 3.998 e Qualis A1 da CAPES para
área Medicina II.

O artigo RELATIONSHIP BETWEEN CIRCULATING VCAM-1, ICAM-1, E-

SELECTIN AND MMP9 AND THE EXTENT OF CORONARY LESIONS foi publicado
no periódico Clinics que possui fator de impacto 1.435 e Qualis B2 da CAPES para
área Medicina II.

O artigo ASSOCIATION BETWEEN KIDNEY FUNCTION AND FRAMINGHAM RISK

SCORE IN AN ADMIXED POPULATION OF BRAZIL foi publicado no periódico
Brazilian Journal Of Pharmaceutical Sciences (Online) que possui fator de impacto
0.814 e Qualis B3 da CAPES para área Medicina II.

O artigo ASSOCIATION OF SERUM ALPHA-TOCOPHEROL AND RETINOL WITH

THE EXTENT OF CORONARY LESIONS IN CORONARY ARTERY DISEASE foi
publicado no periódico Journal Of Nutrition And Metabolism que possui Qualis B2 da
CAPES para área Medicina II.
 38

6. CONCLUSÕES

Esse estudo observou que, dentre os 13 genes avaliados, a baixa expressão

do KCNE1 pode estar relacionada com a diminuição da FEVE e, portanto, com o
estabelecimento da IC isquêmica. Além disso, a expressão do KCNE1 revelou ter
um potencial preditor da disfunção do VE.

Quanto a análise dos miRNAs, ainda existem poucos estudos na literatura que
associam essas moléculas à IC isquêmica e ainda há muita variação nas populações
e tipos de amostra analisadas. Mesmo assim, foi possível identificar 4 miRNAs (miR-
499, miR-1, miR-133a, e miR-208b) que estão diferentemente expressos no
desenvolvimento da IC em mais de um estudo.

A influência do miR-1 sobre a expressão do KCNE1 e a desregulação de

ambos podem ser mais aprofundadas em busca de mais informações a respeito dos
mecanismos moleculares da IC após o IAM. Estudos futuros longitudinais podem
auxiliar não somente na identificação de novos alvos para o diagnóstico precoce,
bem como na identificação de alvos terapêuticos, além de consolidar o poder de
diagnóstico do KCNE1.
 39

7. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES

Iniciei no Laboratório de Bioanálise e Biotecnologia Molecular no segundo

semestre de 2015, onde me dediquei a organizar e submeter ao comitê de ética em
pesquisa (CEP) do HUOL o projeto intitulado ESTUDO FARMACOGENÉTICO DO
PROLONGAMENTO DO INTERVALO QT EM PACIENTES EM USO DE
PSICOFÁRMACOS, o qual foi uma colaboração de nosso grupo com a Universidade
de Santiago de Compostela, Espanha, que financiaria o projeto. Após aprovação no
CEP, iniciei a triagem dos pacientes, e já havíamos incluído no estudo
aproximadamente 35 pacientes quando submeti o projeto na seleção de doutorado
do PPGCSA no primeiro semestre de 2016. Entretanto, no final de 2016, mesmo com
uma boa quantidade de pacientes, vimos que não tínhamos conseguido incluir
nenhum em nosso grupo caso, uma vez que buscávamos uma condição
extremamente rara.

Diante desse desafio, no início de 2017, resolvemos mudar o foco do projeto

para algo que já fosse mais familiar ao laboratório e nesse momento a professora
Vivian Silbiger entrou como minha co-orientadora, uma vez que eu assumi o projeto
de cardiologia, linha de pesquisa liderada por ela. Dessa forma, no primeiro semestre
de 2017 minhas atividades foram relacionadas ao desenho do projeto, busca de
colaborações com o setor de cardiologia do HUOL e submissão ao CEP/HUOL. No
segundo semestre de 2017, assim que aprovado, iniciamos as coletas dos pacientes.

Algumas alterações no projeto inicial foram necessárias. Tínhamos a ideia de

um grupo controle sem doença cardíaca, mas descartamos esse grupo uma vez que
já tínhamos esses resultados em estudos prévios do nosso grupo. Além disso, o
nosso N amostral precisou ser reduzido uma vez que nem todos os pacientes
aceitavam participar da pesquisa (principalmente por envolver coleta de sangue) e
muitos apresentavam condições que os excluíam do estudo. Por fim, a reta final do
projeto cursou paralelamente com a pandemia do COVID-19, o que limitou as
colaborações, a entrega de insumos, bem como a utilização dos laboratórios
universitários. Sendo assim, optamos por abrir mão da análise de miRNAs no plasma
dos pacientes e nos dedicamos à revisar a literatura em busca dos miRNAs mais
envolvidos com a IC isquêmica, o que resultou na primeira publicação relacionada a
este projeto.
 40

No final de 2018 eu fui contemplada com uma bolsa do Programa de

Doutorado-Sanduiche no Exterior – CAPES, e tive a oportunidade de passar 12
meses em um dos melhores laboratórios de cardiologia da Universidade da Califórnia
– San Diego, EUA, liderado pelo Prof. Dr. Eric David Adler. Lá, apesar do projeto
inicial também ter sofrido algumas alterações, trabalhei com cardiomiopatia
diabética, cardiomiopatia hipertrófica e Doença de Dannon em modelo in vitro de
cardiomiócitos derivados de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSC) e
desenvolvi técnicas de western blotting, RT-PCR, imunofluorescencia e transfecçao
de vetor viral. Infelizmente voltei pouco antes do inicio da pandemia e não pude
aplicar em meu projeto as técnicas que aprendi.

Durante todo o período de doutoramento, ao qual me dediquei de forma

exclusiva, busquei fazer colaborações e auxiliar os colegas de laboratório, o que me
gerou publicações em periódicos nacionais e internacionais em áreas como
cardiologia e nutrição. Na etapa final do doutorado, já em pandemia, participei do
projeto “DETERMINANTES GENÉTICOS E BIOMARCADORES GENÔMICOS DE
RISCOS EM PACIENTES COM INFECÇÃO POR CORONAVIRUS” do período maio
de 2020 até agosto de 2020, coordenado pelo Prof. Dr. André Ducati Luchessi, que
configura missão institucional no consorcio internacional criado e coordenado pelo
Prof. Dr. Angel Carracedo da Universidade de Santiago de Compostela-Espanha
com o objetivo de encontrar os determinantes genéticos / genômicos de risco e má
evolução que permitam uma melhor estratificação dos pacientes e a adaptação e
otimização de protocolos terapêuticos contra a COVID-19.

Durante meu tempo no Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

da UFRN vivenciei novas experiências, muito aprendizado e crescimento
profissional, principalmente nos períodos em que meu orientador e co-orientadora
estavam em seu pós-doutorado e em meu tempo no doutorado sanduiche. Expandi
minha área de pesquisa e vivenciei da pesquisa básica à aplicada, onde tive a
oportunidade de aprender várias metodologias desconhecidas por mim, me tornando
mais preparada para aplica-las em diferentes áreas.

Os resultados deste projeto contribuem para a elucidação das alterações

genéticas e moleculares que levam a complicações após o IAM e podem ser úteis
no diagnóstico precoce da IC isquêmica, evitando ou atrasando a deterioração do
 41

tecido cardíaco nesses pacientes. Estudos futuros devem ser realizados a fim de
analisar o perfil de expressão do KCNE1 e do miR-1 em leucócitos de pacientes em,
pelo menos, 2 momentos distintos: logo após o IAM e 6 meses depois. Dessa forma,
a habilidade diagnóstica desses marcadores poderia ser mais bem investigada e
relacionada com o desenvolvimento da disfunção cardíaca antes mesmo do
estabelecimento da doença.

Por fim, durante estes anos mantive minha produção científica com
publicações em anais de congressos e artigos científicos, além de participar de
palestras, bancas de TCC e contribuir com orientações científicas.

Produção acadêmica relacionada ao doutorado

Artigos Aceito e Publicado:

Tabela 1. Artigos aceito e publicado na área de cardiologia durante o doutorado

DUARTE, V.H.R.; MIRANDA, C.T.O.F.; CRUZ, M.S.; et al. TREML4 mRNA
Expression and Polymorphisms in Blood Leukocytes are Associated with
Atherosclerotic Lesion Extension in Coronary Artery Disease. Scientific Reports,
v. 9, p. 7229, 2019.

SANTOS, J. C.; Cruz, M.S.; BORTOLIN, R. H.; et al. Relationship between

circulating VCAM-1, ICAM-1, E-selectin and MMP9 and the extent of coronary
lesions. CLINICS, v. 73, p. e203, 2018.

FERNANDES MIRANDA, C.T.O.; DUARTE, V.H.R.; CRUZ, M.S.M.; DUARTE,

M.K.R.N.; et al. Association of Serum Alpha-Tocopherol and Retinol with the
Extent of Coronary Lesions in Coronary Artery Disease. JOURNAL OF
NUTRITION AND METABOLISM, v. 2018, p. 1-6, 2018.

Resumos:

Tabela 2. Resumos publicados em eventos científicos na área de cardiologia durante

o doutorado
DUARTE, M. K. R. N.; ARAUJO, J. N. G.; DUARTE, V. H. R.; FERNANDES, C. T.
O.; OLIVEIRA, J. M.; SILVA, A. M. G.; CRUZ, M.S.; LUCHESSI, A. D.; SILBIGER,
 42

V. N. Relationship of habitual nutrient intake, visceral fat and ECHDC3 mRNA

expression with extent of coronary lesion. In: XIII Congresso Internacional de
Nutrição Funcional, 2017, São Paulo. Anais do XIII Congresso Internacional de
Nutrição Funcional, 2017.

ARAUJO, J. N. G.; SANTOS, J. C.; CRUZ, M.S.; OLIVEIRA, K. M.; DUARTE, V.

H. R.; SILVA, A. M. G.; SANTOS, ; OLIVEIRA, J. M.; PAIVA, M. S. M. O.;
LUCHESSI, A. D.; REZENDE, A. A.; HIRATA, M. H.; HIRATA, R. D. C.; SILBIGER,
V. N. . Circulating VCAM-1 as potential biomarker of atherosclerosis. In: 69th AACC
Annual Scientific Meeting & Clinical Lab Expo, 2017, San Diego. Clinical Chemistry,
2017. v. 63.

DUARTE, V. H. R.; DUARTE, M. K. R. N.; ARAUJO, J. N. G.; SANTOS, A. M. Q.

S.; SILVA, A. M. G.; CRUZ, M.S.; OLIVEIRA, J. M.; PAIVA, M. S. M. O.; REZENDE,
A. A.; HIRATA, M. H.; HIRATA, R. D.; LUCHESSI, A. D.; SILBIGER, V. N. .
TREML4 polymorphisms and mRNA expression in blood leukocytes are associated
with the extension of the atherosclerotic lesions in patients with coronary artery
disease. In: 69th AACC Annual Scientific Meeting & Clinical Lab Expo, 2017, San
Diego. Clinical Chemistry, 2017. v. 63.

FERNANDES, C. T. O.; DUARTE, V. H. R.; ARAUJO, J. N. G.; SILVA, A. M.

G.; CRUZ, M.S.; DUARTE, M. K. R. N.; SANTOS, I. C. C.; SANTOS, J. C.;
SANTOS, A. M. Q. S.; COSTA, C. H. B.; ARAUJO, A. P. C.; OLIVEIRA, J. M.;
HIRATA, M. H.; HIRATA, R. D. C.; RIBEIRO, K. D. S.; LUCHESSI, A. D.;
SILBIGER, V. N. . The association of the vitamin A, vitamin E level and potential
biomarkers of mRNA expression with the extent of coronary lesion. In: 69th AACC
Annual Scientific Meeting & Clinical Lab Expo, 2017, San Diego. Clinical Chemistry,
2017. v. 63.

DANTAS, J. M.; SANTOS, J. C.; Cruz, M.S.; ARAUJO, J. N. G.; DUARTE, V. H.

R.; SILVA, A. M. G.; SANTOS, I. C. C.; OLIVEIRA, J. M.; REZENDE, A. A.;
HIRATA, M. H.; HIRATA, R. D. C.; LUCHESSI, A. D.; SILBIGER, V. N. . The
relationship between circulating VCAM-1, ICAM-1, E-selectin and MMP9 and the
extent of the coronary lesion VCAM-1 and the extent of coronary lesion. In: 44º
Congresso da Sociedade Brasileira de Análises Clínicas, 2017, João Pessoa.
Revista Brasileira de Análises Clínicas, 2017. v. 49. p. 40.

DUARTE, V. H. R.; Cruz, M.S.; ARAUJO, J. N. G.; DUARTE, M. K. R. N.; SANTOS,

A. M. Q. S.; ARAUJO, A. P. C.; COSTA, C. H. B.; SANTOS, I. C. C.; FERNANDES,
 43

C. T. O.; SANTOS, J. C.; SILVA, A. M. G.; OLIVEIRA, J. M.; LUCHESSI, A. D.;

SILBIGER, V. N. TREML4 polymorphisms and mRNA expression in blood
leukocytes are associated with the extension of atherosclerotic lesions in patients
with coronary artery disease. In: 44º Congresso da Sociedade Brasileira de
Análises Clínicas, 2017, João Pessoa. Revista Brasileira de Análises Clínicas,
2017. v. 49. p. 40.

CRUZ, M.S.; SANTOS, J. C.; OLIVEIRA, K. M.; OLIVEIRA, J. M.; REZENDE, A.

A.; HIRATA, M. H.; HIRATA, R. D.; SILBIGER, V. N.; LUCHESSI, A. D. . Adhesion
molecules as potential biomarkers for classification of cardiovascular risk. In: 45
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da Sociedade Brasileira de Bioquímica, 2016.
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 47

9. APÊNDICES

Apêndice A: TCLE
48
 49

Apêndice B: Questionário
50
 51

10. ANEXOS

Parecer Consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa/UFRN

52
53