Técnicas de Fracionamento

Cromatografia em papel
Eletroforese em papel

Ana Claudia do Amaral Melo

DBq/IQ/UFRJ
Diferenças na solubilidade
Precipitação isoelétrica
Efeitos “salting-in” e “salting-out”
Precipitação pela adição de solventes orgânicos
Partição entre uma fase orgânica e outra aquosa
1. Cromatografia em papel
2. Cromatografia gás-líquido
3. Cromatografia em camada fina
Cromatografia em papel
Na cromatografia em papel, o principal fenômeno responsável pela
separação das substâncias é o de partição entre duas fases imiscíveis,
formadas por uma mistura solvente (solvente pouco polar e solvente
bem polar - normalmente água) e o papel.

As misturas solventes podem ser binárias (ex:. fenol/água) ou ternárias

(ex.: butanol/HAc/água). A escolha da mistura é feita empiricamente,
baseando-se nas diferenças de solubilidade dos solutos nos diferentes
componentes da mistura solvente.

O papel (constituído de fibras de celulose contendo um certo teor de

umidade) funciona como um suporte inerte para a água que atua,
então, como agente de partição. A partição do soluto ocorre entre esta
fase aquosa (fase estacionária) e o solvente (fase móvel).
CONCEITO DAS CONSTANTES R

• A migração de uma substância em relação ao deslocamento total do solvente

(Front do solvente) em um sistema cromatográfico é constante e característica
para esta substância. O termo que expressa esta migração é designado por Rf.

𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅 𝒆𝒆𝒆𝒆 𝒄𝒄𝒄𝒄 𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑 𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑 𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂 (𝒂𝒂)

𝑹𝑹𝑹𝑹 𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 − 𝒇𝒇𝒇𝒇𝒇𝒇𝒇𝒇 =
𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅𝒅 𝒆𝒆𝒆𝒆 𝒄𝒄𝒄𝒄 𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑 𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑 𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎𝒎 𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔𝒔 (𝒃𝒃)
 Rf tab dos padrões
LIS = 0,14
ALA = 0,38 Front do solvente 11,5 cm
ILE = 0,72
7,8 cm Rf EXP A = 2,2/11,5 = 0,19
7,3cm
Rf experimental dos padrões
Rf EXP B = 3,5/11,5 = 0,30
Rf = migração do AA/migração do solvente
RfLIS = 1,5/11,5 = 0,13 Rf EXP C = 5,6/11,5 = 0,48
RfALA = 4,7/11,5 = 0,37 5,6 cm
RfILE = 7,8/11,5 = 0,68 Rf EXP D = 7,3/11,5 = 0,64

ΔRf = Rf tabelado – Rf experimental 4,3 cm

Correção Rfexp+ ΔRf
LIS = 0,14 – 0,13 = 0,01 3,5 cm Rfc A = 0,19 + 0,01 = 0,20
ALA = 0,38 – 0,37 = 0,01
ILE = 0,72 – 0,68 = 0,04 Rfc B = 0,30 + 0,01 = 0,31
2,2 cm
1,5 cm
Rfc C = 0,48 + 0,01 = 0,49

C
AD
B
Ponto de aplicação Rfc D = 0,64 + 0,04 = 0,68
P ?
A=0,20
B=0,31
C=0,49
D=0,68
Eletroforese em papel
É o meio mais simples e mais usado na separação de uma vasta gama de produtos
carregados, muito embora não se obtenha, em alguns casos, uma boa separação e ocorra
sempre eletroendosmose.

Método:
A amostra é aplicada no papel previamente cortado no tamanho conveniente que é colocado
na cuba eletroforética e saturado com o tampão. Fecha-se a cuba e aplica-se a diferença de
potencial conveniente. Depois do tempo estipulado para a corrida o papel é retirado e seco.

Revelação:
Se a amostra contiver quantidade suficiente e for colorida pode ser localizada diretamente.
Compostos incolores podem ser visualizados através de reações coloridas específicas feitas
no próprio papel ou através de propriedades físicas como fluorescência ou radioatividade.
 +
papel
-

tampão

+ -

origem
pH > pI = NEGATIVA
pH < pI = POSITIVA
 GLU
COOH COO- COO - COO -
I +
I +
I I
+
-Cα-NH3 -Cα-NH3 -Cα-NH3 -Cα-NH2
I I I I
-C- -C- -C- -C-
pK1=2,19 pK2=4,25 pK3=9,67
I I I I pH > pI = NEGATIVA
-C- -C- -C- -C-
I I I I pH < pI = POSITIVA
COOH COOH COO - COO -
pH 0 pH 14
3,22
+1 0 -1 -2

pK1+pK2
pI =
2

2,19+4,25
pI = = 3,22
2
 Eletroforese em papel

+ HIS -
?
ASP ARG

GLU
LIS
Tampão acetato de piridina pH = 6,0 LEU

Ponto de aplicação
GLU pI = 3,22 HIS pI = 7,58 LEU pI = 5,98
PM = 147,13 PM = 155,16 PM = 131,18
ASP pI = 2,97 ARG pI = 10,76
PM = 133,11 PM = 174,20
LIS pI = 9,74
PM = 146,14