Joana Figueira, nº 202000192 AVALIAÇÃO DE DIFERENTES

João Coelho, nº 202000189 PROCESSOS DE PRÉ

Álvaro Alves, nº 202000059 TRATAMENTO DE BIOMASSA
Shelsea Amaral, nº 201900072 LINHOCELULÓSICA PARA
PRODUÇÃO DE ETANOL

Miniprojecto

Licenciatura em Tecnologia do Petróleo

ORIENTADORA: Drª. Nilmara Dias

Mês 2022 II
Agradecimentos
Primeiro de tudo, queremos agradecer à STEX® pelo fornecimento da biomassa
de eucalipto, pois sem ela não conseguíamos realizar este mini projeto. Temos de
agradecer à professora Nilmara Dias, professora Joana Tudella e à professora Fátima
Serralha pela sua dedicação e ajuda que nos deram durantes as aulas laboratoriais,
sem ajuda delas tínhamos explodido o laboratório.

iv
Índice
Agradecimentos................................................................................................................... iv

Índice de Figuras ............................................................................................................. VII

Índice de Tabelas ............................................................................................................... IX

Lista de Siglas e Abreviaturas ............................................................................................ X

Resumo ............................................................................................................................... XI

Palavras-Chave .................................................................................................................. XI

Abstract ............................................................................................................................ XII

Keywords .......................................................................................................................... XII

1. Introdução ............................................................................................................. 13

1.2. Objetivos do mini projeto ...................................................................................... 13

1.3. Caracterização da Instituição de Acolhimento .................................................... 14

1.4. Caracterização da empresa envolvida .................................................................. 15

1.5. Atividades desenvolvidas ....................................................................................... 15

1.6. Cronograma do desenvolvimento do trabalho ..................................................... 15

2. Fundamentos teóricos ........................................................................................... 16

2.1. Caracterização do problema ................................................................................. 18

2.3. Valorização da biomassa ...................................................................................... 23

3. Materiais/ reagentes e Métodos ............................................................................ 24

3.1. Metodologia.................................................................................................................. 25

3.2. Preparação da solução de DNS .................................................................................. 26

V
 3.3. Solução de acetato de sódio 0.2M, pH 4.8 ............................................................................. 27

3.4. Origem das amostras ............................................................................................. 28

3.5. Pré-tratamento ...................................................................................................... 29

3.5.1. Pré-tratamento químico .............................................................................................. 29

3.6. Pré-tratamento biológico ...................................................................................... 34

3.6.1 Pré-tratamento Físico-químico..................................................................................................... 34

3.7. Análise do material lignocelulósico – quantificação de açúcares ...................... 35

4. Resultados e Discussão ......................................................................................... 42

5. Considerações finais ............................................................................................. 54

6. Final remarks ........................................................................................................ 55

7. Bibliografia............................................................................................................ 56

Anexo 57

VI
 Índice de Figuras

FIGURA 1- A PARTIR DO EUCALIPTO PRODUZIMOS BIOETANOL (FONTE PRÓPRIA) .................................................................... 13

FIGURA 2- A) ANTIGAS INSTALAÇÕES DA ESTBARREIRO, B) AS INSTALAÇÕES ATUAIS.("(20+) ESTBARREIRO | BARREIRO |
FACEBOOK" S.D.) ............................................................................................................................................. 14
FIGURA 3- EUCALIPTO (POTENCIAL FLORESTAL S.D.)......................................................................................................... 17
FIGURA 4- MOLÉCULA DNS ("ÁCIDO 3,5-DINITROSALICÍLICO P.A. 25 G | NEON COMERCIAL 02938" S.D.) .... 17
FIGURA 5 – GRÁFICO DA TEORIA HUBBERT(DIAS S.D.) ...................................................................................................... 18
FIGURA 6- CICLO DE VIDA DO BIOETANOL("BIOCOMBUSTÍVEIS-NILMARA DIAS" S.D.) ............................ 20
FIGURA 7-ESTRUTURA DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA(ANUKAM ET AL. 2020)............................................... 20
FIGURA 8- ESTRUTURA QUÍMICA DA LIGNINA("LIGNINA - COMPOSTO QUÍMICO - INFOESCOLA" S.D.) ............... 21
FIGURA 9- ESTRUTURA QUÍMICA DA HEMICELULOSE("HEMICELULOSE: CLASSIFICAÇÃO, ESTRUTURA, BIOSSÍNTESE E FUNÇÕES -
MAESTROVIRTUALE.COM" S.D.) .......................................................................................................................... 22
FIGURA 10- ESTRUTURA QUÍMICA DA CELULOSE("O QUE É CELULOSE? - BRASIL ESCOLA" S.D.) ................................................. 22
FIGURA 11- O PROCESSO COMO FUNCIONA A ENZIMA AO QUEBRAR UMA MOLÉCULA.("BIODIESEL FATTY ACID
METHYL ESTERS (FAME)" S.D.).......................................................................................................................... 24
FIGURA 12- METODOLOGIA DO PROCESSO (FONTE PRÓPRIA)............................................................................ 25
FIGURA 13- A) PESAR 1 G DE ÁCIDO 3,5-DINITROSALICÍLICO, B) PESAR 30 G DE TARTARATO DE SÓDIO E POTÁSSIO, C) PESAR 20 G DE
HIDRÓXIDO DE SÓDIO (PEROLAS) E DISSOLVER COM ÁGUA DESTILADA, D) COLOCAR 1 G DE ÁCIDO 3,5-DINITROSALICÍLICO, 30 G
DE TARTARATO DE SÓDIO E POTÁSSIO E SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE SÓDIO NUM BALÃO VOLUMÉTRICO DE 100 ML, E)
DISSOLVER A SOLUÇÃO, SE FOR PRECISO COLOCAR NUMA MANTA DE AQUECIMENTO E AO MESMO TEMPO DISSOLVER (FONTE:
PRÓPRIA). ....................................................................................................................................................... 27
FIGURA 14- A) PESAR 11,5 G DE ÁCIDO ACÉTICO E COLOCAR NUM BALÃO VOLUMÉTRICO DE 1000 ML, B) ADICIONAR ÁGUA DESTILADA
ATÉ AO MENISCO E AGITAR O BALÃO VOLUMÉTRICO (FONTE: PRÓPRIA). ...................................................................... 27
FIGURA 15- A) PESAR 27,2 G DE ACETATO DE SÓDIO E COLOCAR NUM BALÃO VOLUMÉTRICO DE 1000 ML, B) ADICIONAR ÁGUA
DESTILADA ATÉ AO MENISCO E AGITAR O BALÃO VOLUMÉTRICO, C) COLOCAR A 29.6 ML DE SOLUÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO E 70.4
ML DE SOLUÇÃO DE ACETATO DE SÓDIO NUM FRANCO DE ÂMBAR (FONTE: PRÓPRIA)..................................................... 28
FIGURA 16- O EUCALIPTO FOI FORNECIDO PELA STEX (FONTE: PRÓPRIA) ............................................................................. 28
FIGURA 17- A) E B) PREPARAÇÃO DE H2SO4 DE 0,30 M E 0,60 M. (FONTE PRÓPRIA) ..................................... 30
FIGURA 18- PREPARAR 2 BALÕES VOLUMÉTRICOS DE PERÓXIDO COM 30% V/V, UM BALÃO DE 250 ML COM 2,5 M E OUTRO COM
7,5 (FONTE: PRÓPRIA). ..................................................................................................................................... 30
FIGURA 19- A) E B) PESAGEM DA NOSSA BIOMASSA (EUCALIPTO), C) MEDIÇÃO DE 225 ML DE H2SO4, D) COLOCAR H2SO4, NOS
ERLENMYERS, E) COLOCAÇÃO DE COMPRESSAS DE ALGODÃO OU PAPEL NOS 6 ERLENMEYERS, F) COLOCAÇÃO DOS 6
ERLENMEYRS NA ICUBADORA A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 40 MINUTOS, G) RETIRAM-SE AMOSTRAS DOS
ERLENMEYERS E COLOCAM-SE EM TUBOS DE EPPENDORF (FONTE: PRÓPRIA); ............................................................... 31
FIGURA 20- A) PESAGEM DE GLICOSE, B) DILUIÇÃO DE 0,1 GRAMAS DE GLICOSE COM 20 ML DE ÁGUA
DESTILADA, C) COLOCAR A SOLUÇÃO DE 20 ML DE GLICOSE NUM BALÃO VOLUMÉTRICO E ENCHER ATÉ AO
MENISCO COM ÁGUA DESTILADA, D) SUPORTE COM OS TUBOS DE ENSAIO, E) RETIRAR 1 ML DE DNS
PARA OS TUBOS, F) RETIRAR QUANTIDADES DE VOLUME DE GLICOSE DO BALÃO VOLUMÉTRICO PARA OS
TUBOS, G) RETIRAR QUANTIDADES DE VOLUME DE ÁGUA DESTILADA DO COPO PARA OS TUBOS , H)
COLOCAR CADA TUBO NO VÉRTEX PARA MISTURAR MUITO BEM A NOSSA SOLUÇÃO, I) COLOCAR OS
NOSSOS TUBOS COM A SOLUÇÃO DE DNS COM GLICOSE MAIS ÁGUA EM BANHO MARIA DE ÁGUA A UMA
TEMPERATURA A 100ºC DURANTE 10 MINUTOS, J) APÓS O BANHO DE ÁGUA QUENTE, COLOCAR NUM

VII
 BANHO DE ÁGUA FRIA, K) COLOCAR 8 ML DE ÁGUA DESTILADA EM CADA TUBO, L) COLOCAR NO VÉRTEX
CADA TUBO PARA MISTURAR MUITO BEM A NOSSA SOLUÇÃO, M) COLOCAR PEQUENAS AMOSTRAS DOS
NOSSOS TUBOS NO ESPETROFOTÓMETRO PARA MEDIR OS AÇUCARES REDUTORES (FONTE PRÓPRIA) . 37
FIGURA 21- A) E B) ADICIONAR 0,25 ML DO HIDROLISADO EM CADA TUBO (FAZER TRIPICADO) + 0,75 ML DE ÁGUA DESTILADA, C)
COLOCAR 1 ML DE DNS EM CADA TUBO, D) COLOCAR CADA TUBO NO VÉRTEX, , E) COLOCAR OS TUBOS 10× E 100× EM
BANHO MARIA DE ÁGUA A UMA TEMPERATURA A 100ºC DURANTE 10 MINUTOS, J) APÓS O BANHO DE ÁGUA QUENTE,
COLOCAR NUM BANHO DE ÁGUA FRIA, K) COLOCAR 8 ML DE ÁGUA DESTILADA EM CADA TUBO, L) COLOCAR NO VÉRTEX CADA
TUBO PARA MISTURAR MUITO BEM A NOSSA SOLUÇÃO, M) COLOCAR PEQUENAS AMOSTRAS DOS NOSSOS TUBOS NO
ESPETROFOTÓMETRO PARA MEDIR OS AÇUCARES REDUTORES .................................................................................... 39
FIGURA 22- DISSOLUÇÃO DO HIDROLISADO (10× E 100×)................................................................................................. 40
FIGURA 23- A) E C) PESAR 12 G DE EUCALIPTO E COLOCAR NO BALÃO VOLUMÉTRICO (C), B) E C) COLOCAR 1 ML DE ENZIMA NO BALÃO
VOLUMÉTRICO (C), D) ENCHER COM ÁGUA DESTILADA ATÉ AO MENISCO, E) COLOCAR A SOLUÇÃO TAMPÃO NO BALÃO
VOLUMÉTRICO, F) MEDIR O PH DA NOSSA SOLUÇÃO (ENZIMA + EUCALIPTO+ SOLUÇÃO TAMPÃO), O PH TEM QUE ESTAR ENTRE 5
E 5,2.............................................................................................................................................................. 34
FIGURA 24- A) REFRATÓMETRO DE BANCADA E B) REFRATÓMETRO DE CAMPO ....................................................................... 35
FIGURA 25- ESPECTROFOTÓMETRO (FONTE: PRÓPRIA)...................................................................................................... 36
FIGURA 26- GRÁFICO COM OS RESULTADOS DE CADA TUBO COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO EM RELAÇÃO Á ABSORBÂNCIA
SEM BRANCO E AR (G/L) (FONTE: PRÓPRIA) .......................................................................................................... 43
FIGURA 27- GRÁFICO QUE REPRESENTA OS RESULTADOS DA ANÁLISE DO HIDROLISADO COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO
EM RELAÇÃO Á ABSORBÂNCIA SEM BRANCO E AR (G/L) (FONTE: PRÓPRIA) .................................................................. 45
FIGURA 28- GRÁFICO QUE COMPARA OS RESULTADOS DOS ACÚCARES REDUTOS ENTRE O H2SO4 E H2O2. ................................... 47
FIGURA 29 ............................................................................................................................................................... 48
FIGURA 30- GRÁFICO QUE REPRESENTA OS RESULTADOS DA ABSORBÂNCIA DE SOLUÇÃO DE GLICOSE + ÁGUA DESTILADA + DNS (FEITO
POR OUTRA TURMA).......................................................................................................................................... 50
FIGURA 31- GRÁFICO QUE REPRESENTA OS RESULTADOS DA ABSORBÂNCIA DE SOLUÇÃO DE GLICOSE + ÁGUA DESTILADA + DNS (FEITO
POR NÓS) ........................................................................................................................................................ 52
FIGURA 32- SOLUÇÃO COM EUCALIPTO CONTAMINADA DE BACTÈRIAS.................................................................................. 53
FIGURA 33- A) PESAGEM DA BIOMASSA, 25G SEM O PESO DO ERLENMEYER; B) ADIÇÃO DE 225ML DE ÁGUA NA
PROVETA; C) TRANSFERÊNCIA DA ÁGUA PARA O ERLENMEYER; D) COMPOSIÇÕES DAS AMOSTRAS EM
ÁGUA, E NAS DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO SULFÚRICO (1%, 3% E 5%).E) INSERÇÃO DAS
AMOSTRAS NA INCUBADORA; F) TEMPERATURA E AGITAÇÃO EM QUE SE ENCONTRA A INCUBADORA,
(FONTE PRÓPRIA). ....................................................................................................................................... 57
FIGURA 34- FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO DA HIDRÓLISE (FONTE PRÓPRIA) ............................................. 58
FIGURA 35- DOIS ERLENMEYERS COM VOLUME DE 500 ML, MAS COM QUANTIDADE DE PERÓXIDO DIFERENTES
(FONTE PRÓPRIA) ........................................................................................................................................ 32
FIGURA 36- A) PESAR 15 G DE EUCALIPTO, B) MEDIR 135 ML DE PEROXIDO, C) COLOCAR EM CADA UM DOS ERLENMEYERS PEROXIDO,
D) E E) JUNTAMENTE COM A SOLUÇÃO DE NAOH É MEDIDO O PH DE CADA UM DOS ERLENMEYERS ATÉ OBTER UM PH DE 11,5,
F) COLOCAR COMPRESSAS DE ALGODÃO OU PAPEL NO ERLENMEYER COMO ROLHA PARA O ÁCIDO NÃO EVAPORAR, G) METER NA
INCUBADORA OS 6 ERLENMYERS, A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 2 INTERVALOS DE 20 MINUTOS, A CADA 20 MINUTOS
H) RETIRAM SE AMOSTRAS DOS ERLENMYERS E COLOCAM-SE EM TUBOS DE EPPENDORF; (FONTE PRÓPRIA)........................ 33

VIII
 Índice de Tabelas

TABELA 1 - CRONOGRAMA COM PLANIFICAÇÃO DA REALIZAÇÃO DO ESTÁGIO AO LONGO DAS 20 SEMANAS

(FONTE: PRÓPRIA) ....................................................................................................................................... 15
TABELA 2- QUANTIDADE DE VOLUME DE GLICOSE, VOLUME DE ÁGUA E VOLUME DE DNS TEM DE SE METER
NOS 10 TUBOS, (FONTE: PRÓPRIA) ............................................................................................................ 36
TABELA 3- QUANTIDADE DE VOLUME DE HIDROLISADO, VOLUME DE ÁGUA E VOLUME DE DNS QUE DEVE
COLOCAR NOS 10 TUBOS ........................................................................................................................... 38
TABELA 4- RESULTADOS DE CADA TUBO COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO EM RELAÇÃO Á ABSORBÂNCIA SEM BRANCO E AR
(G/L) (FONTE: PRÓPRIA) .................................................................................................................................... 42
TABELA 5- OS RESULTADOS DA ANÁLISE DO HIDROLISADO COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO EM RELAÇÃO Á ABSORBÂNCIA
SEM BRANCO E AR (G/L) (FONTE: PRÓPRIA) .......................................................................................................... 44
TABELA 6- RESULTADOS DO PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO (PERÓXIDO DE HIDROGÉNIO) DA ABSORBÂNCIA SEM BRANCO E AR (G/L)
(FONTE: PRÓPRIA) ............................................................................................................................................ 46
TABELA 7- RESULTADOS DA ABORBÂNCIA DE SOLUÇÃO DE GLICOSE + ÁGUA DESTILADA + DNS (FEITO POR OUTRA TURMA) ............ 49
TABELA 8- OS RESULTADOS DA ABSORBÂNCIA DE SOLUÇÃO DE GLICOSE + ÁGUA DESTILADA + DNS (FEITO POR NÓS)..................... 51
TABELA 9- RESULTADOS DA ABSORBÂNCIA SEM BRANCO E AR (G/L) DO PRÉ TRATAMENTO ENZIMÁTICO .................................... 53
TABELA 10- QUANTIDADES DE ÁCIDO PRESENTES EM CADA SOLUÇÃO, (FONTE: PRÓPRIA) . ERRO! MARCADOR NÃO
DEFINIDO.

IX
 Lista de Siglas e Abreviaturas

ESTB-IPS - Biotecnologia da Escola Superior de Tecnologia do Barreiro – Instituto

Politécnico de Setúbal
DNS- Solução de Ácido dinitrosalicílico
AR- Açucares Redutores
ACB- Absorbância sem branco
LNEG- Laboratório Nacional de Energia e Geologia
STEX® - Steam explosion
BRIX- é uma escala numérica e hidrométrica de índice de refração de uma solução,
amiúde utilizada para determinar a quantidade de açúcar presente nessa mesma
solução.

X
 Resumo

O trabalho que se segue contém a descrição da experiência relacionada com o

tratamento da biomassa de Eucalyptus globulus com origem em resíduos florestais,
pré-tratado nas instalações da STEX® no LNEG no Lumiar, de modo a se melhor
compreender hidrolises enzimáticas e pré tratamento químico, calcular açúcares
redutores através do método DNS, a determinação da curva-padrão, o BRIX, e os
processos (químicos e/ou físicos) que envolvem o tratamento da biomassa que nos
permitem obter os resultados pretendidos.

Palavras-Chave

STEX®

LNEG

Hidrólise enzimática

Análise e determinação dos açúcares redutores

Método DNS

Curva-padrão

pré-tratamento químico

açúcares redutores

BRIX

processos (químicos e/ou físicos)

XI
 Abstract

The following report contains the description of the experiment regarding the
treatment of Eucalyptus globulus biomass originated from forest residue, pretreated at
STEX®’s installations in Lumiar’s LNEG, to better understand enzymatic hydrolyses
and chemistry pretreatment, calculation of reducing sugar through the DNS method,
the determination of the standard curve, BRIX determination, and the processes
(chemical and/or physical) that are involved in the treatment of the biomass that allow
us to achieve our expected results.

Keywords
Enzymatic Hydrolysis

analysis and obtaining of the reducing sugars.

DNS method

the standard curve

STEX®

LNEG

chemical pretreatment

reducing sugars

BRIX

processes (chemical and/or physical)

CUF

CTESP

XII
 1. Introdução

O presente relatório serve como exemplo de um relatório de estágio curricular que

se encontra integrado no 3º ano da licenciatura Tecnologia do petróleo, da Escola
Superior de Tecnologia do Barreiro – Instituto Politécnico de Setúbal (ESTB-IPS).
O principal objetivo deste estágio é proporcionar uma experiência em âmbito de
trabalho laboratorial, para além daquela tida durante a licenciatura em ambiente
escolar. O Trabalho laboratorial abordou a produção de bioetanol a partir de
resíduos de Eucalyptus Globulus (de Portugal), que foram fornecidos pela STEX®.
Este trabalho laboratorial foi realizado no laboratório de química da escola superior
Tecnologia do Barreiro.

1.2. Objetivos do mini projeto

O principal objetivo deste trabalho laboratorial é a produção de bioetanol a partir

de biomassa lignocelulósica, o eucalipto (Figura 1).

Figura 1- A partir do eucalipto produzimos bioetanol (Fonte própria)

13
 1.3. Caracterização da Instituição de Acolhimento

O trabalho foi desenvolvido no laboratório de química da Escola Superior Tecnologia

do Barreiro.

A ESTBarreiro é uma instituição integrada no instituto Politécnico de Setúbal.

A ESTBarreiro foi criada em 1999, que estava situada no bairro Operário da CUF,
mais precisamente nas instalações que pertenciam à “Antiga Escola Primária da CUF”
(Figura 2, a)), que foram reabilitadas na sua totalidade para receber a
ESTBarreiro/IPS.
Em 2007, foram criadas instalações (Figura 2, b)), devido ao aumento de procura de
novas oportunidades. Assim alargando as suas ofertas, começaram a ter novos
cursos. Em 2009, a ESTBarreiro recebe um prémio Internacional de Arquitetura
atribuído pelo Chicago Athenaeum: Museum of Architecture and Design, tendo sido
igualmente reconhecidas pela revista Única do semanário Expresso como um dos
edifícios de culto da década no ano de 2009.
No início da criação da ESTBarreiro, só tinha cursos na área da engenharia civil, em
2009 começaram a criar cursos na área da química, como a licenciatura de engenharia
química (foi substituída por licenciatura biotecnologia e licenciatura tecnologia do
petróleo), licenciatura de bioinformática, CTESP e mestrados.

Figura 2- a) Antigas instalações da ESTBarreiro, b) As instalações atuais.[1]

14
 1.4. Caracterização da empresa envolvida

A STEX® é uma empresa que tem como foco utilizar resíduos para produzir novos
produtos, porque a madeira, a rolaria vai para as papeleiras e indústrias de móveis,
assim vão acumulando resíduos que depois não fazem o seu aproveitamento.

1.5. Atividades desenvolvidas

Este trabalho envolveu uma revisão bibliográfica de artigos científicos anteriormente

publicados, que abordavam o tema deste trabalho, permitindo assim uma melhor
compreensão do trabalho a desenvolver quer no desenvolvimento de um processo,
quer na componente laboratorial, quer na interpretação e discussão dos resultados
quer ainda na redação deste relatório.

O desenvolvimento do mini projeto envolveu diferentes experimentos, onde foram

avaliadas diferentes variáveis. Ao total foram avaliados 2 processos, dos quais um se
destacou por ter sido o processo que apresentou maior foi pré-tratamento biológico.

1.6. Cronograma do desenvolvimento do trabalho

As atividades foram executadas de acordo com a calendarização apresentada na

Tabela 1.

Tabela 1 - Cronograma com planificação da realização do estágio ao longo das 20 semanas

(Fonte: própria)
Semanas
Atividades 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Revisão bibliográfica

Escolha da biomassa
Desenvolvimento de um
protocolo
Trabalho
laboratorial/análises dos
resultados
Interpretação e discussão
dos resultados
Redação do relatório

15
2. Fundamentos teóricos

Eucalipto e açúcares redutores

Eucalipto (Figura 3) é o nome comum dado a muitas espécies dos géneros

Eucalyptus, Corymbia, Angophora e globulus. Neste trabalho utilizamos o eucalipto
globulus, que foi fornecido pela STEX®. A boa adaptação ao solo e clima nacional, a
rapidez de crescimento e as propriedades da madeira contribuíram para que uma se
destacasse em Portugal (Florestas.pt s.d.).

Para além do aroma das folhas e dos frutos em forma de botão, a madeira de
eucalipto começou por ser usada na construção de travessas para os caminhos-de-
ferro e na estrutura das minas, entre outros fins (Florestas.pt s.d.).

Desde meados do século XX que o eucalipto mais comum em Portugal, o

Eucalyptus globulus, tem sido plantado como fonte de madeira para produzir pasta
para papel de reconhecida qualidade. Desde então, a área de plantação de eucalipto
cresceu e em 2015 representava 845 mil hectares em Portugal, cerca de um quarto
da floresta nacional (26%), de acordo com o 6.º Inventário Florestal Nacional (IFN6,
2019) (Florestas.pt s.d.).

Em Portugal em 2017, de toda a área florestal, 24,4% é composta por eucaliptos.

Desta forma existe uma disponibilidade considerável de resíduos florestais
provenientes desta árvore, daí a ênfase na utilização desta árvore como matéria-
prima, na sua forma residual, em processos de obtenção de açúcares. Açúcares
redutores são açúcares que, em solução básica, apresenta um grupo carbonílico livre
aldeído e a Sua capacidade de redução se dá pela presença de um grupo aldeído ou
cetona livre. Todo monossacarídeo, alguns dissacarídeos e oligossacarídeos (Infarma
s.d.).

16
 Figura 3- Eucalipto (Potencial Florestal s.d.)

Caracterização da Lignina

A lignina é uma macromolécula constituída de três unidades fenilpropanóides

derivadas dos álcoois p-cumárico, coniferílico e sinapílico. Os tipos fenólicos de tais
compostos diferem no substituinte metoxil e são chamados de unidades p-hidrofenila
(H), guaiacila (G) e siringila (S), respetivamente. Em geral, as ligninas são
classificadas de acordo com as quantidades relativas das unidades p-hidroxifenila,
guaiacila e siringila.

Método DNS

Neste trabalho vamos aplicar o método DNS. O método DNS é o teste de DNS
(ácido dinitrosalicílico, Figura 4) baseia-se na reação entre o açúcar redutor e o ácido
3,5-dinitrosalicílico (cor amarelo), que é reduzido a um composto colorido
avermelhado, o ácido 3-amino5-nitrosalicílico, oxidando o monossacarídeo redutor
("Protocolo para determinação de açucares totais em hortaliças pelo método DNS"
2022).

Figura 4- Molécula DNS [2]

17
 2.1. Caracterização do problema

Na década de 70, começaram a surgir ideias de combustíveis menos poluentes

devido ao embargo do petróleo que houve em 1973. Em 1970, a empresa americana
Clean Air Act, preparou o terreno para a discussão sobre combustíveis menos
poluentes, a ideia era arranjar aditivos para adicionar ao combustível, mas só após 3
anos, depois do embargo do petróleo é que houve incentivo para o desenvolvimento
dos biocombustíveis, surgindo cada vez mais conferências nos EUA.

Em 1956, foi desenvolvida uma teoria, chamada teoria de Hubbert (Figura 5), um
geofísico americano M. King Hubbert afirmou que a produção de petróleo ia atingir o
seu pico nos anos 70, foi mais uma das razões para se investir na busca de
biocombustíveis, mas com o avanço de tecnologias, a produção de petróleo continuou
a aumentar.

Figura 5 – Gráfico da teoria Hubbert[3]

O bioetanol é um biocombustível de maior sustentabilidade em relação à gasolina,

pois emite menos gases, mas a probabilidade de ocorrer uma reação de oxidação no
depósito do carro é muito maior. Não possui eficiência energética superior à gasolina
e como tal não é o suficiente para substituir a gasolina.

Para visualizar melhor qual será o combustível com melhores condições em termos
de emissões de gases teremos de fazer um ciclo de vida para cada um dos
biocombustíveis, ou seja, temos de comparar o (bio)etanol com a gasolina (Figura 6).

18
 A gasolina é um combustível fóssil, produzido a partir do petróleo. Desde a
extração do crude até a produção de gasolina, emitem-se muitos GEE.

Já o bioetanol é produzido a partir de biomassas que tenham na sua composição

glicose. A biomassa utilizada normalmente são resíduos ou alimentos, como o milho
ou o cana de açúcar. Estes alimentos têm que ser recolhidos através de produtores,
mas é necessário também haver uma grande quantidade destas matérias-primas pois
para produzir uma grande quantidade de bioetanol é preciso uma grande quantidade
de biomassa, nesta situação já existe impacto ambiental, porque para ter sempre
grandes quantidades de matéria prima, utilizam-se fertilizantes e pesticidas e estes
produtos químicos contaminam o solo e as águas subterrâneas, para não falar na
desflorestação necessária para se criar terreno essencial. No caso da gasolina,
existem grandes quantidades de petróleo o que nos permite obter vários produtos,
como a gasolina, gasóleo, querosene, etc. em grandes quantidades, com
consequências ambientais também associadas.

Após a recolha da nossa biomassa, temos de armazená-la e transportá-la até uma

biorrefinaria. O transporte é feito através de camiões que são abastecidos com
combustível fóssil, já é outro impacto ambiental, vamos produzir bioetanol, mas
precisamos de combustível fóssil para levar a matéria-prima para o locar que será
tratada para a produção bioetanol. Na gasolina teremos a mesma consequência que
com o bioetanol, ambos tem impacte ambiental devido ao transporte.

Na parte da produção do biocombustível, teremos de usar grandes quantidades de

energia e de água, já na gasolina não teremos de gastar grandes quantidades de
água e de energia.

Quando obtemos o nosso bioetanol, este tem de ser transportado para vários
países, o seu transporte é feito através de camiões ou navios que consomem
combustível fóssil. A gasolina requer o mesmo nível de poluição já que o combustível
destes transportes é dos combustíveis mais poluentes, sem alternativa ecológica
sustentável existente no presente.

Agora refletindo um bocadinho, será que vale a pena produzir bioetanol em larga
escala?

19
 Figura 6- Ciclo de vida do Bioetanol[4]

2.2. Biomassa lignocelulósica

A biomassa lignocelulósicos é composta por lignina, hemicelulose e celulose. (Figura 7)

Figura 7-Estrutura da biomassa lignocelulósica[5]

20
A lignina (Figura 8) é uma macromolécula amorfa encontrada nas plantas terrestres, em
associação com a celulose na parede celular, de natureza polimérica e tridimensional, com
finalidade de conferir rigidez, impermeabilidade e resistência contra ataques biológicos
aos tecidos vegetais. A lignina é formada por unidades de p-propilfenol, com substituintes
metoxila no anel aromático, unidas por ligações do tipo éter e que estabelecem ligações
cruzadas entre si. A lignina tem como função conferir rigidez, impermeabilidade e resistência
a ataques microbiológicos e mecânicos aos tecidos vegetais.

A lignina representa um dos maiores estoques de carbono/energia da natureza e é o maior

depósito de estruturas químicas aromáticas, constituindo-se em uma fonte potencial de
valiosos insumos para a indústria química. Apesar de ser possível produzir diversos produtos
com base na lignina, atualmente o foco dos estudos tem se voltado para o uso desse material
como fonte de energia para os processos, o que garantiria a auto-suficiência e,
eventualmente, até a possibilidade de exportar alguma energia elétrica excedente.
Naturalmente, essa situação é positiva tanto para a viabilidade econômica da tecnologia
quanto para os quesitos ambientais, já que reduziria a dependência por recursos energéticos
fósseis externos.

Figura 8- Estrutura química da lignina[6]

A hemicelulose (Figura 9) é um polissacarídeo, composta por cadeias ramificadas de

açúcares, cujas unidades incluem principalmente aldopentoses, como xilose e arabinose, e
aldohexoses, como glicose, manose e galactose. Esta macromolécula contém ainda, ácidos
hexurônicos, como os ácidos β-D-glucurônico, D-4-O-metilglucurônico e β-D-galacturânico, e
deoxiexoses. Diferentemente da celulose, a hemicelulose não apresenta regiões cristalinas,
sendo, portanto, mais suscetível à hidrólise química sob condições mais brandas. Porém, a
fermentação dos açúcares de cinco carbonos (pentoses) ainda não é tão desenvolvida quanto
os processos envolvendo a glicose.

21
 Figura 9- Estrutura química da hemicelulose[7]

A celulose (

Figura 10)é um polissacarídeo, de estrutura linear que contém milhares de unidades de

moléculas de β-D-glicoses unidas por ligações glicosídicas β-1,4 carbono-carbono e por
ligações de hidrogênio intramoleculares, representada pela fórmula química c6H10O5, é
insolúvel á água. As ligações intermoleculares são responsáveis pela rigidez e pela formação
de fibrilas, estruturas altamente ordenadas que se associam formando as fibras de celulose.
As fibrilas apresentam desde regiões com elevado grau de cristalinidade, nas quais as cadeias
de glicana estão firmemente ligadas em paralelo, até regiões com menor grau de ordenação,
chamadas de regiões amorfas. Na região cristalina, as fibras têm maior resistência à tração,
ao alongamento e à absorção de solvente que na região amorfa, onde a fibra possui sua maior
flexibilidade. O índice de cristalinidade e o grau de polimerização são propriedades
importantes para a classificação dos polímeros celulósicos. Pode ser definido com base no
número médio de monômeros e no peso médio do polímero, assim como inferido a partir de
sua viscosidade. Estas características, juntamente com o envoltório de lignina, conferem à
macromolécula celulose grande resistência à hidrólise, o que representa um grande desafio
para a utilização dos materiais lignocelulósicos em aplicações biotecnológicas, como a
produção de etanol de segunda geração.

Figura 10- Estrutura química da celulose[8]

22
 2.3. Valorização da biomassa

Para a utilização da biomassa na produção do bioetanol, é necessário pé tratar a

biomassa. Existem diferentes métodos de tratamento de biomassa lignocelulósico
como:

✓ Secagem;
✓ Redução granulométrica;
✓ Peletização;
✓ Pré-tratamento químico;
✓ Pré-tratamento biológico;
✓ Hidrólise enzimática;
Para prepararmos bem a nossa biomassa para produzir bioetanol, precisamos
triturarmos (Redução granulométrica) para quebrar a parede vegetal. Peletização é
um processo de compressão e transformação em pellets, com interesse de usar a
biomassa para transformar em pellets. Pré-tratamento químico, pode ser ácido ou
alcalino, consiste no uso destes mesmos para um realinhamento dos materiais aos
quais estes são aplicados, expondo os componentes dos materiais que desejamos
obter, como por exemplo, lignina, celulose e hemicelulose. Os pré-tratamentos
biológicos envolvem a ação direta do metabolismo ou subprodutos microbianos em
substratos lignocelulósicos. O pré-tratamento microbiano da biomassa
lignocelulósica é um processo de baixo custo usado para aumentar a produção de
biogás durante a digestão anaeróbia. Em particular, o pré-tratamento biológico é um
processo ecológico comparado aos processos físicos ou químicos, devido à
necessidade de menor consumo de energia e ao uso de condições moderadas do
processo. A hidrólise enzimática (Figura 11) consiste numa reação
química catalisada por uma enzima (uma hidrólase) que utiliza água (H2O) para
quebrar uma molécula em duas outras moléculas.

23
 Figura 11- O processo como funciona a enzima ao quebrar uma molécula.[9]

3. Materiais/ reagentes e Métodos

✓ Espectrómetro e Célula;
✓ Refratómetro;
✓ Tubos de ensaio;
✓ Pipetas de 5ml e 10 ml;
✓ Micropipeta de 1000µl e de 100µl;
✓ Banho Maria (“Beaker” grande e placa de aquecimento);
✓ Balança analítica;
✓ Beaker resfriado;
✓ Erlenmyer 250ml;
✓ Glucose;
✓ Água destilada;
✓ Ácido sulfúrico;
✓ Vértex;
✓ Balão volumétrico de 50, 100, 250 e 1000 ml
✓ Copo de 20 ml;
✓ Funil;
✓ Vareta;
✓ Espátula;
✓ Gelo;
✓ Pinças;
✓ Ácido Acético;
✓ Acetato de sódio;
24
✓ Enzima;
✓ Resíduos de eucalipto
✓ Compressas de algodão;
✓ Medidor de pH;
✓ Hidróxido de sódio (perolas);
✓ Tartarato de sódio e potássio;
✓ Manta de aquecimento;
✓ Termómetro;
✓ Goblés;
✓ 2 Frascos de âmbar;
✓ Peróxido de hidrogénio;
✓ tubos de eppendorf;
✓ Proveta;
✓ Erlenmyers;
✓ Incubadora;
✓ Ácido 3,5-dinitrosalicílico;

3.1. Metodologia

Na Figura 12 representa a metodologia do nosso mini projeto.

Figura 12- Metodologia do processo (Fonte própria)

25
3.2. Preparação da solução de DNS

Procedimento da preparação da solução de DNS (Figura 13):

1. Dissolver 20 ml de 2 M de NaOH em água destilada, tivemos que calcular a

massa de NaOH para podermos pesá-lo (Equação 1 e Equação 2, cálculos
feitos no anexo, secção de cálculos);
𝑛 =𝑐×𝑉
Equação 1- Fórmula para achar o número de moles de NaOH, (Fonte: Própria)

𝑚
𝑛=
𝑀
Equação 2- Fórmula para achar a massa de NaOH, (Fonte: Própria)

Mas como não tínhamos balão volumétrico de 20 ml então utilizamos um balão

volumétrico de 250 ml, preparamos a nossa solução nesse balão, mas depois
retiramos 20 ml de NaOH desse mesmo balão ( Equação 3 e Equação 4,
cálculos feitos no anexo);
𝑛 =𝑐×𝑉
Equação 3- Fórmula para achar o número de moles de NaOH, (Fonte: Própria)

𝑚
𝑛=
𝑀
Equação 4- Fórmula para achar a massa de NaOH, (Fonte: Própria)

2. Adicionar 30g de tartarato de sódio e potássio

3. Adicionar 1 g de ácido Dinitrilico
4. Completar 100ml com água destilada

Nota: A solução de DNS deve armazenar-se a 4ºC em frascos âmbar

26
 Figura 13- a) Pesar 1 g de Ácido 3,5-dinitrosalicílico, b) Pesar 30 g de tartarato de sódio
e potássio, c) Pesar 20 g de hidróxido de sódio (perolas) e dissolver com água destilada, d)
Colocar 1 g de Ácido 3,5-dinitrosalicílico, 30 g de tartarato de sódio e potássio e solução de
hidróxido de sódio num balão volumétrico de 100 ml, e) Dissolver a solução, se for preciso
<colocar numa manta de aquecimento e ao mesmo tempo dissolver (Fonte: própria).

3.3. Solução de acetato de sódio 0.2M, pH 4.8

Para o preparo do tampão de acetato de sódio, deverá preparar duas soluções em

separado (Figura 14e Figura 15).

✓ Solução A: Solução de ácido acético 0.2 M (11.55g em 1000mL de água destilada)

Figura 14- a) Pesar 11,5 g de ácido acético e colocar num balão volumétrico de 1000 ml,
b) Adicionar água destilada até ao menisco e agitar o balão volumétrico (Fonte: Própria).

✓ Solução B: Solução de acetato de sódio 0.2M (27.2g de C2H3O2Na.3H2O em

1000 mL de água destilada) Para obter 100 mL de solução deverá misturar num
frasco âmbar 29.6 mL da solução A com 70.4 mL da solução B.

27
 Figura 15- a) pesar 27,2 g de acetato de sódio e colocar num balão volumétrico de 1000
ml, b) Adicionar água destilada até ao menisco e agitar o balão volumétrico, c) Colocar a
29.6 mL de solução de ácido acético e 70.4 mL de solução de acetato de sódio num franco de
âmbar (Fonte: própria).

3.4. Origem das amostras

A biomassa lignocelulósica, nomeadamente a serradura de eucalipto, foi fornecida por

uma start-up de biorrefinaria STEX (Figura 16).

Figura 16- O eucalipto foi fornecido pela STEX®, (Fonte: própria)

28
 3.5. Pré-tratamento

A biomassa residual florestal é triturada na floresta para aumentar a densidade e

viabilizar o transporte.

3.5.1. Pré-tratamento químico

No pré-tratamento químico, utilizámos um ácido o H2SO4 para obtermos os

açúcares redutores. A presença de açúcares redutores pode se comprovar pela
mudança de cor de amarelo para um laranja ou vermelho-tijolo. A intensidade da
cor está relacionada com a concentração dos açúcares redutores na amostra. O
procedimento foi o seguinte:

Procedimento da preparação do ácido (Figura 17):

1. Preparar um balão volumétrico de 1000 ml de H2SO4 com 0,30 M e outro

balão volumétrico 0,60 M de H2SO4;
2. Antes de preparar calculamos a massa para cada balão (Equação 5 e
Equação 6, cálculos feitos no anexo);
𝑛 =𝑐×𝑉
Equação 5- Fórmula para achar o número de moles de H2SO4, (Fonte: Própria)

𝑚
𝑛=
𝑀
Equação 6- Fórmula para achar a massa de H2SO4, (Fonte: Própria)

29
 Figura 17- a) e b) Preparação de H2SO4 de 0,30 M e 0,60 M. (Fonte: própria)

Procedimento da preparação do peróxido de hidrogénio (Figura 18):

1. Preparar uma solução de peróxido de hidrogénio com 30% V/V, um balão de

250 ml com 2,5 M e outro com 7,5.
2. Antes de medir o volume, tivemos de utilizar a equação seguinte (Equação 7,
cálculos feitos no anexo):
𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓

Equação 7- Fórmula para achar o volume do peróxido de hidrogénio, (Fonte: Própria)

Figura 18- Preparar 2 balões volumétricos de peróxido com 30% V/V, um balão de
250 ml com 2,5 M e outro com 7,5 (Fonte: própria).

30
 Procedimento da preparação da biomassa para o ácido (fazer este procedimento
duas vezes, uma a temperatura ambiente e outra a temperatura a 48ºc,Figura 19):

1. Pesar 10% m/m de eucalipto (a nossa biomassa florestal) para 250 ml de

Erlenmeyer, então 0,10 em 250 ml são 25 g de eucalipto que temos que
pesar, para 6 Erlenmyers (Equação 8, cálculos feitos no anexo) (3
Erlenmyers para 0,3 M de H2SO4 e 3 Erlenmyers para 0,6 M de H2SO4);
𝑚/𝑚
𝑚 (𝑒𝑢𝑐𝑎𝑙𝑖𝑝𝑡𝑜) = ×𝑉
100

Equação 8- Fórmula para calcular a massa do eucalipto, (Fonte: Própria)

2. Medir 225 ml de H2SO4 numa proveta e colocar nos 6 Erlenmyers;

3. Colocar compressas de algodão ou papel no Erlenmeyer como rolha para
o ácido não evaporar;
4. Por fim, meter na incubadora os 6 Erlenmyers, a temperatura ambiente ou
a temperatura a 48ºc durante 2 intervalos de 20 minutos, a cada 20 minutos
retiram se amostras dos Erlenmyers e colocam-se em tubos de eppendorf;

Figura 19- a) e b) Pesagem da nossa biomassa (eucalipto), c) Medição de

225 ml de H2SO4, d) colocar H2SO4, nos Erlenmyers, e) Colocação de
compressas de algodão ou papel nos 6 erlenmeyers, f) Colocação dos 6
erlenmeyrs na icubadora a temperatura ambiente durante 40 minutos, g)
Retiram-se as amostras dos Erlenmeyers e colocam-se em tubos de
eppendorf (Fonte: própria);

31
Pré-tratamento químico com peróxido

Neste pré-tratamento químico utilizamos o peróxido.

Preparação do ácido (Figura 20):

1. Medir 37,5 ml (v/v 2,5%) de peróxido para um balão volumétrico de 500 ml e

75 ml (v/v 5%) de peróxido para outro balão volumétrico;
2. Encher de água destilada os dois balões volumétricos até a menisco e agitar;

Figura 20- Dois Erlenmeyers com volume de 500 ml, mas com quantidade de
peróxido diferentes (Fonte própria)

32
Preparação da biomassa (Figura 21):

1. Pesar 15 g de eucalipto (a nossa biomassa) para cada 6 Erlenmyers;

2. Medir 135 ml de H2O2 numa proveta e colocar nos 6 Erlenmyers com a
biomassa;
3. Medimos o ph dos 6 Erlenmeyers com a biomassa mais ácido juntamente com
uma solução de NaOH até obter um ph de 11,5;
4. Colocar compressas de algodão ou papel no Erlenmeyer como rolha para o
ácido não evaporar;
5. Por fim, meter na incubadora os 6 Erlenmyers, a temperatura ambiente durante
2 intervalos de 20 minutos, a cada 20 minutos retiram se amostras dos
Erlenmyers e colocam-se em tubos de eppendorf;

Figura 21- a) Pesar 15 g de eucalipto, b) medir 135 ml de peroxido, c) colocar

em cada um dos Erlenmeyers peroxido, d) e e) juntamente com a solução de
NaOH é medido o ph de cada um dos Erlenmeyers até obter um ph de 11,5, f)
Colocar compressas de algodão ou papel no Erlenmeyer como rolha para o
ácido não evaporar, g) meter na incubadora os 6 Erlenmyers, a temperatura
ambiente durante 2 intervalos de 20 minutos, a cada 20 minutos h) Retiram se
amostras dos Erlenmyers e colocam-se em tubos de eppendorf; (Fonte:
própria)

33
 3.6. Pré-tratamento biológico

Na hidrólise enzimática utilizamos a enzima para poder quebrar a parede vegetal e a

molécula da glicose.

Procedimento da preparação do pré-tratamento enzimático (Figura 22):

1. Pesar 12 g de eucalipto;
2. Medir 1 ml de enzima;
3. Colocar o eucalipto e a enzima num balão volumétrico de volume 50 ml;
4. Encher com água destilada até ao menisco;
5. Colocar solução tampão e medir o pH, o nosso pH tem que ter entre 5 e 5,2;
6. Duração: 72h (pode ser reduzido para fins de uma atividade laboratorial)
7. Amostragens: 24h, 48h, 72h (pode ser adaptado para fins de uma atividade
laboratorial)

Figura 22- a) e c) Pesar 12 g de eucalipto e colocar no balão volumétrico (c), b) e c)

Colocar 1 ml de enzima no balão volumétrico (c), d) Encher com água destilada até ao
menisco, e) Colocar a solução tampão no balão volumétrico, f) Medir o pH da nossa solução
(enzima + eucalipto+ solução tampão), o ph tem que estar entre 5 e 5,2, (Fonte: Própria)

3.6.1 Pré-tratamento Físico-químico

Pré-tratamento Físico-Químico foi realizado pela STEX®, a explosão a vapor.

Após uma trituração prévia da matéria, na colheita desta mesma, foi realizada uma
explosão a vapor, 2 vezes, que teve como propósito a quebra das ligações das fibras
e outros componentes da matéria florestal (eucalipto) de modo a se conseguir obter a
maior quantidade de açúcares possíveis do material disponibilizado, esta matéria
sofreu uma hidrólise enzimática de modo ao potencial desses açúcares possa ser
obtido e alcançado.

34
 3.7. Análise do material lignocelulósico – quantificação de açúcares

A análise da quantificação dos açucares é feita a partir do refratómetro (medição

do BRIX) e espetrofotómetro (medição dos açucares redutores), que depois faz-se
uma curva-padrão dos valores obtidos.

Refração é a mudança da direção de um feixe de luz ao trocar de meio. Nesse caso,

a passagem do ambiente para a solução líquida. Essa mudança é medida em graus,
para a determinação do ângulo de refração. Utiliza-se um aparelho denominado
refratómetro para tal função. O refratómetro mede este desvio e retorna um valor de
índice de refração, que é comparado com um padrão, previamente calibrado.

O refratómetro (Figura 23) neste trabalho tem como função medir o BRIX, que é a
representação dos valores dos açúcares totais.

Figura 23- a) Refratómetro de bancada e b) refratómetro de campo

O espectrofotómetro (Figura 24) é um equipamento que permite comparar a

intensidade da luz transmitida através de uma amostra com a intensidade da luz
absorvida por esta amostra, que contém um soluto que se deseja quantificar. Todas
as substâncias são capazes de absorver energia radiante.

O espectrofotómetro é o aparelho que nesta experiência irá calcular os valores dos

açúcares redutores.

35
 Figura 24- Espectrofotómetro (Fonte: própria)

Curva padrão

A curva-padrão corresponde à relação gráfica entre os valores de absorbância e os

de concentração. Com base na análise gráfica é possível verificar a linearidade da
reação e calcular um fator de conversão de valores de absorbância em concentração.

Para se determinar a concentração de açúcares redutores deve-se realizar uma curva de

calibração que relacione a concentração dos açúcares e a absorção, para isso junto com
as amostras deve-se ter 7 tubos Falcon aos quais se adiciona o que se segue na Erro! A
origem da referência não foi encontrada.:

Tabela 2- Quantidade de volume de glicose, volume de água e Volume de DNS tem de se

meter nos 10 tubos, (Fonte: Própria)

[] q/L V de glicose (ml) V H2O DNS (ml)

(ml)
Branco 0 1 1
0,1 1 9 1
0,2 2 8 1
0,3 3 7 1
0,4 4 6 1
0,5 5 5 1
0,6 6 4 1
0,7 7 3 1
0,8 8 2 1
0,9 9 1 1
1 10 0 1

36
Procedimento da preparação da glicose, Erro! A origem da referência não foi encontrada.
e Figura 25):

1. Pesar 0,1 g de glicose para um copo de 20 ml e de seguida colocar 20 ml de água

destilada juntamente dissolver muito bem;
2. Colocar a nossa solução de 20 ml para um balão volumétrico de 100 ml e colocar 100
ml de água destilada até ao menisco.
3. Por fim, tapar o balão volumétrico e agitar um bocadinho;
4. Colocar o volume de glicose, volume de água e volume de DNS nos tubos de ensaio
de acordo com a tabela 2.
5. Homogeneizar as soluções dos tubos de ensaio no vortex;
6. Levar ao banho maria a 100ºc por 10 minutos;
7. Resfriar em banho de gelo por 5 minutos;
8. Adicionar 8 ml de H2O destilada;
9. Meter no espectrofotómetro e fazer uma leitura de absorbância a 540mm para todos
os tubos;
10. Construir um gráfico e obter a equação por regressão linear;

Figura 25- a) Pesagem de glicose, b) Diluição de 0,1 gramas de glicose com 20

ml de água destilada, c) Colocar a solução de 20 ml de glicose num balão volumétrico
e encher até ao menisco com água destilada, d) Suporte com os tubos de ensaio, e)
Retirar 1 ml de DNS para os tubos, f) Retirar quantidades de volume de glicose do
balão volumétrico para os tubos, g) Retirar quantidades de volume de água destilada
do copo para os tubos, H) colocar cada tubo no vértex para misturar muito bem a
nossa solução, I) Colocar os nossos tubos com a solução de DNS com glicose mais
água em banho maria de água a uma temperatura a 100ºC durante 10 minutos, J)
Após o banho de água quente, colocar num banho de água fria, K) colocar 8 ml de

37
água destilada em cada tubo, L) Colocar no vértex cada tubo para misturar muito bem
a nossa solução, M) Colocar Pequenas amostras dos nossos tubos no
espetrofotómetro para medir os açucares redutores (Fonte: própria)

Análise do hidrolisado

Para se determinar a concentração de açúcares redutores deve-se realizar uma curva de

calibração que relacione a concentração dos açúcares e a absorção, para isso junto com
as amostras deve-se ter 10 tubos Falcon aos quais se adiciona o que se segue na

Tabela 3

Tabela 3- Quantidade de volume de hidrolisado, volume de água e Volume de DNS que

deve colocar nos 10 tubos, , (Fonte: Própria)

Tubos Amostra Água (ml) DNS (ml)

hidrolisado (ml)

Branco 0 1 1

Hid 1 0,25 0,75 1

Hid 2 0,25 0,75 1

Hid 3 0,25 0,75 1

× 1 10× 0,25 0,75 1

× 2 10× 0,25 0,75 1

× 3 10× 0,25 0,75 1

× 1 100× 0,25 0,75 1

38
 × 2 100× 0,25 0,75 1

× 3 100× 0,25 0,75 1

Procedimento para se fazer a análise do hidrolisado (Figura 26)

1. Adicionar 0,25 ml do hidrolisado em cada tubo (fazer triplicado) + 0,75 ml de

água destilada;
Adicionar 1 ml de DNS (de acordo com a

2. Tabela 3);
3. Homogeneizar a solução no vértex;
4. Levar ao banho maria a 100ºc por 10 minutos;
5. Resfriar em água corrente ou em banho de gelo por 5 minutos;
6. Adicionar 8 ml de água destilada;
7. Levar ao espetrofotómetro;

Figura 26- a) e b) Adicionar 0,25 ml do hidrolisado em cada tubo (fazer

triplicado) + 0,75 ml de água destilada, c) Colocar 1 ml de DNS em cada
tubo, d) Colocar cada tubo no vértex, , e) Colocar os tubos 10× e 100× em
banho maria de água a uma temperatura a 100ºC durante 10 minutos, J)
Após o banho de água quente, colocar num banho de água fria, K) colocar
8 ml de água destilada em cada tubo, L) Colocar no vértex cada tubo para
misturar muito bem a nossa solução, M) Colocar Pequenas amostras dos
nossos tubos no espetrofotómetro para medir os açucares redutores,
(Fonte: Própria).

39
 Na Figura 27 representa a maneira como se deve fazer a dissolução do hidrolisado
para análise.

Figura 27- Dissolução do hidrolisado (10× e 100×)

Para se calcular a absorbância sem branco deve-se fazer a seguinte:

𝐴𝑆𝐵 = 𝐴𝐶𝐵 − 𝐵𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜

Equação 9- Fórmula para achar absorbância sem branco, (Fonte: Própria)

A curva de calibração permite relacionar a absorção medida e a concentração de

açúcares. Mediante uma regressão linear pode-se obter os dados para relacionar
mediante a fórmula y=mx+b onde m é o declive e b é o desvio. (É importante que o
coeficiente de coeficiente de relação R2 seja o mais próximo de 1).

40
Ao realizarmos a curva de calibração obtemos o valor do declive e do desvio, e
com a medição obtém-se a absorção. Logo, com a fórmula pode-se obter a
concentração de açúcares desprezando-se o x (Equação 10).

Exemplo:

Supondo que se tem a curva com um valor de m=0,00048, um valor de b=0,0948

e uma absorção da amostra de 0,098nm então substituindo os valores temos:

0,098 − 0,0948
= 𝑥 ⇔ 𝑥 = 6,67 𝑚𝑔/𝑚𝑙
0,00048

Equação 10- A fórmula para obter a concentração de açúcares desprezando-se o x

Mediante a relação pode-se determinar qua a amostra com a absorção de 0,098

tem uma concentração de 6,67 mg de glucose por cada ml de solução.

Açúcares redutores (Equação 11)

𝐴𝑅 (𝑔/𝐿) = 𝐴𝑆𝐵 × 1,2743 + 0,0739

Equação 11- Fórmula para achar os açucares redutores, (Fonte: Própria)

41
4. Resultados e Discussão

Neste trabalho fizemos 3 pré-tratamentos, dois químicos e um enzimático. Os

resultados seguintes representam a quantidade de açucares redutores foram obtidos
nestes três tipos de pré-tratamentos. Na Tabela 4 , representa os resultados da
absorbância com branco que foram obtidos através do espetrofotómetro e os
resultados da absorbância sem branco e os AR (g/L) (Cálculos feitos no anexo), que
também está representado na Figura 28.

Tabela 4- Resultados de cada tubo com diferentes concentrações de ácido em relação á

absorbância sem branco e AR (g/L) (Fonte: própria)

Tipo de pre Tempo Temperatura Absorbância Absorbância AR(g/L)

tratamento de (ºC) sem branco
recolha
(min)

Branco 22 0,06

Ácido 20 22 0,06 0 0,0739

(H2SO4 )0,3
M

Ácido 20 22 0,06 0 0,0739

(H2SO4 )0,3
M

Ácido 20 22 0,074 0,014 0,0917402

(H2SO4 )0,3
M

42
 Ácido 40 22 0,064 0,004 0,0789972
(H2SO4 )0,3
M

Ácido 40 22 0,068 0,008 0,0840944

(H2SO4 )0,3
M

Ácido 40 22 0,068 0,008 0,0840944

(H2SO4 )0,3
M

Os valores de açucares redutores obtidos (Figura 28), divergem conforme o tempo

de recolha, proporcionalmente, as 3 amostras com tempo de recolha de 20min têm
valores de AR inferiores às de 40min de recolha, uma vez que tiveram mais tempo na
incubadora. No entanto o valor obtido no terceiro ensaio ultrapassa todos os outros,
uma explicação possível seria talvez uma amostra com maior concentração de
açúcares. Existe equivalência em 2 valores de cada um dos tempos de recolha, essa
igualdade justifica-se através de um hipotético erro de medição, ou através de uma
semelhança extrema na qualidade das amostras que produziram resultados iguais.

A quantidade de AR (g/L) em cada ensaio

0,1
0,09
0,08
0,07
AR (g/L)

0,06
0,05
0,04
0,03 Série1
0,02
0,01
0
1 2 3 4 5 6
Série1 0,0739 0,0739 0,0917402 0,0789972 0,0840944 0,0840944
Tempo de recolha em 6 ensaios de concentração de 0,3 M

Figura 28- Gráfico com os resultados de cada tubo com diferentes concentrações de
ácido em relação á absorbância sem branco e AR (g/L) (Fonte: própria)

43
 Na Tabela 5, representa a absorbância dos ensaios que se fez o triplicado, que
também está representado na Figura 29.

Tabela 5- os resultados da análise do hidrolisado com diferentes concentrações de ácido

em relação á absorbância sem branco e AR (g/L) (Fonte: própria)

Tipo de pré-tratamento Média da absorbância

HA0,3 M/20 0,079846733

HA 0,3 M/40 0,084943933

HA 0,6 M, 20 0,093864033

HA 0,6 M, 40 0,084519167

HA0,3 M/20 0,076873367

HA 0,3 M/40 0,083244867

HA 0,6 M, 20 0,092164967

HA 0,6 M, 40 0,0802715

44
Na Figura 29, conforme o aumento da concentração de H2SO4, a concentração de
açúcares redutores aumenta respetivamente, no entanto aumentando o tempo de
recolha começa-se a notar uma descida ligeira dos AR, a razão para tal é
decomposição dos AR por parte do H2SO4, uma vez que exposição prolongada ao
ácido diminui a quantidade de açúcares.

AR (g/L) de cada ensaio com concentrações de

ácido sulfurico diferentes
0,1
0,09
0,08
0,07
AR (g/L)

0,06
0,05
0,04
Série1
0,03
0,02
0,01
0
0 2 4 6 8 10
Ensaios com concentrações diferentes ( a,3 M e 0,6 M)

Figura 29- Gráfico que representa os resultados da análise do hidrolisado com diferentes
concentrações de ácido em relação á absorbância sem branco e AR (g/L) (Fonte: própria)

45
 Na Tabela 6, representa 3 ensaios de peróxido aos 40 minutos, com uma
temperatura de 48ºC, da absorbância com branco que foram obtidos através do
espetrofotómetro e os resultados da absorbância sem branco e os AR (g/L) (Cálculos
feitos no anexo).

Tabela 6- Resultados do pré-tratamento ácido (Peróxido de hidrogénio) da absorbância

sem branco e AR (g/L) (Fonte: própria)

Tipo de pre Tempo Temperatura Absorbância Absorbância AR(g/L)

tratamento de (ºC) sem branco
recolha
(min)

Peróxido de 40 48 0,097 0,037 0,1210491

Hidrogénio
7,5 %

Peróxido de 40 48 0,102 0,042 0,1274206

Hidrogénio
7,5 %

Peróxido de 40 48 0,103 0,043 0,1286949

Hidrogénio
7,5 %

46
 Na Figura 30, como demonstrado pelos valores obtidos, no gráfico, a utilização de
H2O2 de modo a obter AR é mais eficiente pelo facto de ser um ácido fraco em relação
ao H2SO4 que é forte, essa diminuição de potência na reação é compensada pela
reatividade elevada do H2O2 em termos oxidativos, uma vez que é usado na síntese
de glicose.

H2O2 48ºC
0,14
0,12 H2SO4 20ºC H2SO4 48ºC
Açúcares redutores (mg/l)

0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0,3…

0,6…

0,6…

0,3…

0,6…

0,6…
3…

3…

H2O
HA0,

HA

HA

HA

HA0,

HA

HA

HA

Figura 30- Gráfico que compara os resultados dos açúcares redutos entre o H2SO4 e
H2O2, (Fonte: Própria)

Na Figura 31, verifica-se um aumento nos açúcares redutores quando se usa

H2O2 em vez de H2SO4. Existem algumas vantagens em comparação com o H2SO4,
sendo uma delas a esterilização por si próprio da biomassa e do ambiente, para além
de não ser tóxico.

47
 1,8
1,6
Açúcare redutores (mg/l)

1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
HE 0,3M HE 0,6M HE TQ
2 HORAS 4 HORAS

Figura 31- Gráfico que compara o prétratameneto quimico entre o ácido surfurico e
peroxido de hidrogenio.

Na Tabela 7, aos ensaios onde se usou o DNS feito por outros alunos, com data
de criação suposta em 2020, que também esta representado na Figura 32.

48
 Tabela 7- Resultados da absorbância de solução de glicose + água destilada + DNS
(Feito por outra turma) , (Fonte: Própria)

Ensaio Absorbância no espectrofotómetro

1º Experimento 2º Experimento Sem o branco

Branco 0,066 0,075

1 0,092 0,12 0,026

2 0,186 0,193 0,12

3 0,299 0,286 0,233

4 0,304 0,335 0,238

5 0,406 0,416 0,34

6 0,488 0,491 0,422

7 0,433 0,626 0,367

8 0,668 0,649 0,602

9 0,72 0,726 0,654

10 0,8 0,826 0,734

Na Figura 32, os valores obtidos neste gráfico são referentes aos ensaios onde se
usou o DNS feito por outros alunos, com data de criação suposta em 2020, sendo este
DNS uma substância já degradada, os valores obtidos refletem isso pela disparidade
e dispersão

49
 Curva-padrão de açúcar
Concentração de glicose (g/L)

1,2
1 y = 1,2743x + 0,0739
R² = 0,9595
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
Absorbância no espectrofotómetro sem o branco

Figura 32- Gráfico que representa os Resultados da absorbância de solução de glicose +

água destilada + DNS (Feito por outra turma), (Fonte: Própria)

50
 Na Tabela 8 , aos ensaios onde se usou o DNS feito por nós, com data de criação
suposta em 2023, que representa na Figura 33.

Tabela 8- os Resultados da absorbância de solução de glicose + água destilada + DNS

(Feito por nós), (Fonte: Própria)

Ensaio Absorbância no espectrofotómetro

1º Experimento 2º Experimento Sem o branco

Branco 0,01 0,01 0,01

1 0,072 0,077 0,078

2 0,132 0,134 0,132

3 0,149 0,15 0,176

4 0,259 0,269 0,269

5 0,34 0,341 0,351

6 0,411 0,411 0,412

7 0,478 0,48 0,478

8 0,566 0,567 0,566

9 0,585 0,585 0,585

10 0,704 0,709 0,71

51
 Na Figura 33, os valores obtidos neste gráfico são referentes aos ensaios onde se
usou o DNS feito por nós, sendo este DNS uma substância com uma qualidade
espectável para a realização dos ensaios, os valores obtidos refletem isso pelo facto
de manterem uma linearidade em relação à curva padrão e não divergirem.

Curva-padrão de açúcar
1,2
1 y = 1,4026x + 0,0285
R² = 0,9891
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
Absorbância no espectrofotómetro

Figura 33- Gráfico que representa os Resultados da absorbância de solução de glicose +

água destilada + DNS (Feito por nós) , (Fonte: Própria)

Na

Tabela 9 , representa diferentes tipos de ensaio do pré-tratamento enzimático.

Observa-se claramente um aumento dos açúcares redutores após hidrólise
enzimática da biomassa sem pré-tratamento. É importante reação, que após o tempo
de retenção de 24h em incubadora (42ºC, 150 rpm), observou-se uma proliferação de
microrganismos, que podem ter consumido o açúcar nesse período, contudo, esse é
um fator que poderá ser corrigido, ou parando a hidrólise as 2 H, porque um processo
desses, numa escala industrial, não poderá contar com tempo de retenção elevado,
ou usamos antibiótico. Outro fator importante e que deve ser realçado, é que grande
parte dos ensaios foram realizados por técnicos diferentes (alunos) e a solução de
DNS foi feita por alunos diferentes também. Esse conjunto de fatores reduz a
fiabilidade dos resultados, mas tendo em conta como a primeira etapa do mini projeto,
podemos concluir que o processo de lavagem após o tratamento ácido pode não ter
sido eficiente, o que pode ter resultado na inibição da enzimas.

52
 Tabela 9- Resultados da absorbância sem branco e AR (g/L) do pré-tratamento
enzimático

Na Figura 34 representa o problema que tivemos com a solução com eucalipto

sem pré-tratamento químico. Como não esterilizámos a nossa biomassa começou a
surgir bactérias, o que tivemos que matá-las com ácido, (Fonte: Própria).

Figura 34- Solução com eucalipto contaminada de bactérias

53
5. Considerações finais

Embora todos os passos do protocolo tenham sido seguidos celeremente,

encontraram-se revezes nos resultados obtidos devido a parâmetros que não foram
tidos em conta, sendo o que mais influenciou os resultados, de modo a ser notado, a
contaminação do ambiente de trabalho e consequentemente as próprias amostras.

Pelo facto de o ambiente de recolha, tratamento e armazenamento das amostras

não ser esterilizado, estas criaram microrganismos que consumiram e contaminaram
os açúcares presentes nas amostras, deste modo alterando significantemente os
resultados que se obteriam destas amostras.

Embora tenham sido removidos de modo a se prosseguir com a experiência,

certamente estas amostras ficaram irreversivelmente contaminadas e alteradas pela
presença e efeito destes microrganismos, bem como a ação de remoção destes
mesmos.

Concluindo-se deste modo, de futuro em operações desta natureza, seria no

melhor interesse dos envolvidos, proporcionar-se um ambiente esterilizado para a
realização desta experiência, bem como o armazenamento dos materiais e produtos
referentes a esta mesma nesse ambiente.

54
6. Final remarks

Although all previous protocols had been meticulously followed, in this instance there
were setbacks in the results that were obtained due to unaccounted for parameters,
being the one that was more noticeable, the contamination of the working environment
e consequently the samples themselves.

Due to the fact that the collecting, treatment and storage environment of the samples
weren´t sterilized, these began to fester microorganisms which consumed and
contaminated the sugars present within the samples, significantly altering the results
that would be expected to be obtained from the samples.

Even though these microorganisms were removed in order to proceed with the
experiment, most certainly these samples were irreversibly contaminated and altered
by the presence and effects of these contaminants, even with and because of the
removal of them.

We conclude that, for future experiments of this nature, it would in the best interest of
all involved, the availability and promotion of a sterilized environment for the successful
conclusion of this experiment, together with a proper storage of the materials and
products associated to the experiment in that environment.

55
7. Bibliografia

[1] «(20+) ESTBarreiro | Barreiro | Facebook».

https://www.facebook.com/ESTBarreiro/ (acedido Jan. 09, 2023).

[2] «Ácido 3,5-Dinitrosalicílico P.A. 25 g | Neon Comercial 02938».

https://www.vhtex.com.br/reagentes?product_id=200210 (acedido Jan. 09,
2023).

[3] B.-N. Dias, «FONTES DE ENERGIA LINHA DO TEMPO».

[4] «BIOCOMBUSTÍVEIS-NILMARA DIAS».

[5] A. Anukam, J. Berghel, A. Anukam, e J. Berghel, «Biomass Pretreatment and

Characterization: A Review», Biotechnological Applications of Biomass, Set.
2020, doi: 10.5772/INTECHOPEN.93607.

[6] «Lignina - Composto Químico - InfoEscola».

https://www.infoescola.com/compostos-quimicos/lignina/ (acedido Jan. 09,
2023).

[7] «Hemicelulose: classificação, estrutura, biossíntese e funções -

Maestrovirtuale.com». https://maestrovirtuale.com/hemicelulose-classificacao-
estrutura-biossintese-e-funcoes/ (acedido Jan. 09, 2023).

[8] «O que é celulose? - Brasil Escola». https://brasilescola.uol.com.br/o-que-

e/biologia/o-que-e-celulose.htm (acedido Jan. 09, 2023).

[9] «BIODIESEL Fatty Acid Methyl Esters (FAME)».

56
 Anexo

I- Análise prévia de tratamento ácido

Nesse primeiro experimento, de modo a conhecer melhor a biomassa, foi feito uma
análise do Brix pós tratamento ácido, em temperatura ambiente e temperatura a 48ºC.
É importante realçar que o uso de temperatura ambiente reduz os custos com energia,
o que poderá viabilizar economicamente o processo.

O pré-tratamento químico foi realizado com ácido sulfúrico em diferentes

concentrações (1, 3 e 5% (v/v)). As amostras foram preparadas a partir da biomassa
proveniente de resíduos florestais da cultura de Eucalipto. A preparação decorreu da
seguinte forma:

1. Foi medido 25g da biomassa em quatro balões de Erlenmeyer utilizando a

balança analítica e de seguida adicionou-se 225 ml de água destilada em
cada balão;
2. Dos quatro balões já com água destilada adicionou-se em três deles a
solução de ácido sulfúrico nas concentrações indicadas. E o quarto
permanecendo só com água destilada (Figura 35).

Figura 35- a) Pesagem da biomassa, 25g sem o peso do Erlenmeyer; b) Adição de

225ml de água na proveta; c) Transferência da água para o Erlenmeyer; d)
Composições das amostras em água, e nas diferentes concentrações de ácido
sulfúrico (1%, 3% e 5%).e) Inserção das amostras na incubadora; f) Temperatura e
agitação em que se encontra a incubadora, (Fonte própria).
57
 Na Figura 36, represa um pequeno um fluxograma do nosso trabalho laboratorial.
Pesamos a nossa biomassa, neste caso 25 gramas e num Erlenmeyer de 250 ml
juntamente com água e H2SO4 realizámos a hidrólise, por fim metemos num
refratómetro.

Figura 36- Fluxograma do procedimento da Hidrólise (Fonte Própria)

Após a preparação da solução para observação no refratómetro foi importante

primeiro fazer uma calibração com água destilada para perceber a diferença do Brix
ao observar as diferentes quantidades de ácido presentes em cada solução.
Obtivemos como resultado os seguintes valores, Tabela 10:

Tabela 10- quantidades de açucares totais presentes em cada solução, (Fonte:

Própria)

Copo T (ºc) Brix

(%)
TT1 18,4 0
TT2 21 0
TT H2O 29 0
1% 33 1,2
H2SO4
3% 31,1 3,8
H2SO4
5% 31,6 6
H2SO4

58
Como se pode verificar, nesta análise inicial, o Brix aumentou com a o aumento da
concentração do ácido. Isto comprova o facto de aplicando-se H2SO4 à solução ocorre
a quebra de ligações, expondo-se deste modo os açúcares totais, estes causam
refração, logo quanto maior a concentração de ácido, maior a quantidade de açúcares,
maior refração, maior Brix.

59
Perigos, pictogramas e cuidados a ter:
Na Tabela 11, representa os perigos, pictogramas e cuidados a ter.

Tabela 11- representa os Perigos, pictogramas e cuidados a ter

Reagentes Pitogramas Perigos Cuidados

✓ Usar bata;
Peróxido de ✓ Corrosivo; ✓ Usar luvas;
hidrogénio ✓ Nocivo ✓ Usar proteção ocular;

✓ Usar bata;
Ácido sulfúrico ✓ Corrosivo; ✓ Usar proteção ocular;
✓ usar luvas;

✓ Usar bata;
Ácido 3,5- ✓ Usar luvas;
dinitrosalicílico ✓ Nocivo ✓ Usar proteção ocular;

✓ Usar bata;
Hidróxido de ✓ corrosivo ✓ Usar luvas;
sódio (CarlRoth) ✓ Usar proteção ocular;

✓ Usar bata;
Enzima ✓ Perigo grave ✓ Usar luvas;
para a saúde; ✓ Usar proteção ocular;

✓ Usar bata;
Ácido acético ✓ Inflamável; ✓ Usar luvas;
✓ Corrosivo; ✓ Usar proteção ocular;
nenhum
Glicose Nenhum nenhum
Nenhum
tartarato Nenhum Nenhum
potássio sódio
Nenhum
Acetato de sódio Nenhum Nenhum

Água Nenhum nenhum ✓ Não desperdiçar água;

60
 Cálculos:

Preparação da Solução de DNS

Calcular a massa de NaOH para diferentes volumes:

𝑛 = 𝑐 × 𝑉 ⇔ 𝑛 = 2 × 0,020 ⇔ 𝑛 = 0,040 𝑚𝑜𝑙

𝑚
𝑛= ⇔ 𝑚 = 0,040 × 40 ⇔ 𝑚 = 1,6 𝑔
𝑀
𝑛 = 𝑐 × 𝑉 ⇔ 𝑛 = 2 × 0,250 ⇔ 𝑛 = 0,500 𝑚𝑜𝑙

𝑚
𝑛= ⇔ 𝑚 = 0,500 × 40 ⇔ 𝑚 = 20 𝑔
𝑀

Preparação do pré-tratamento químico

Calcular a massa de H2SO4 em diferentes concentrações

C=0,30 M
C=0,60 M
V100ml
M(H2SO4) = 98 g/mol
𝑛 = 𝑐 × 𝑉 ⇔ 𝑛 = 0,30 × 1000 ⇔ 𝑛 = 300 𝑚𝑜𝑙
𝑚
𝑛 = ⇔ 𝑚 = 300 × 98 ⇔ 𝑚 = 29 400 𝑔
𝑀
𝑛 = 𝑐 × 𝑉 ⇔ 𝑛 = 0,60 × 1000 ⇔ 𝑛 = 600 𝑚𝑜𝑙
𝑚
𝑛 = ⇔ 𝑚 = 600 × 98 ⇔ 𝑚 = 58800 𝑔
𝑀

Calcular o volume de peróxido para diferentes concentrações:

𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓
1º 𝐵𝑎𝑙ã𝑜 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜 → 30 × 𝑉𝑖 = 2,5 × 250 ⇔ 𝑉𝑖 = 20,8 𝑚𝑙
2º 𝐵𝑎𝑙ã𝑜 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜 → 30 × 𝑉𝑖 = 7,5 × 250 ⇔ 𝑉𝑖 = 62,5 𝑚𝑙

Calcular a massa da Biomassa:

10%m/m em 250 ml

𝑚 (𝑒𝑢𝑐𝑎𝑙𝑖𝑝𝑡𝑜) = 0,10 × 250 ⇔ 𝑚 (𝑒𝑢𝑐𝑎𝑙𝑖𝑝𝑡𝑜) = 25 𝑔

61
Análise de dados

Calcular a absorbância sem branco:

Exemplo 1:

Absorbância 1º tubo com ácido = 0,06

Absorbância do branco = 0,06

𝐴𝑆𝐵 = 𝐴𝐶𝐵 − 𝐵𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜 ⇔ 𝐴𝑆𝐵 = 0,06 − 0,06 ⇔ 𝐴𝑆𝐵 = 0

Calcular os açucares redutores:

𝐴𝑅 (𝑔/𝐿) = 𝐴𝑆𝐵 × 1,2743 + 0,0739 ⇔ 𝐴𝑅 (𝑔/𝐿) = 0 × 1,2743 + 0,0739

⇔ 𝐴𝑅 (𝑔/𝐿) = 0,0739 𝑔/𝐿

62