MICROBIOLOGIA

UNIV ERSID AD E ESTAD UAL D E MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

MANUAL DE AULAS PRÁTICAS

E nferm gem

Celso Luiz Cardoso
Lourdes Botelho Garcia
Maria Cristina Bronharo Tognim

2022
Maringá- Paraná
 ÍNDICE

1. Apresentação do laboratório de microbiologia. . ............................................ 2

2-3. Ubiquidade de microrganismos e higienização das mãos. ......................... 9
4. Lavagem e preparo (acondicionamento) da vidraria
comumente utilizada na rotina bacteriológica... ............................................... 14
5. Esterilização e desinfecção. Técnicas de esterilização pelo
calor seco, úmido e por filtração ...................................................................... 19
6. Segurança e higiene no trabalho microbiológico. Técnicas e
processos de manipulação asséptica .............................................................. 25
7. Considerações gerais sobre meios de cultura ............................................. 31
8. Técnicas de semeadura de bactérias em meios de cultivo líquidos e
sólidos. Isolamento de bactérias em cultura pura ............................................ 40
9. Revisão em técnica de microscopia ótica comum de campo claro (seco e
imersão). Preparações microscópicas a fresco (entre lâmina e lamínula e em
gota pendente). ................................................................................................ 45
10. Preparações microscópicas coradas: estruturas e morfologia
de microrganismos . ......................................................................................... 53
11. Preparações microscópicas coradas: Coloração de Gram ....................... 57
12. Controle de microrganismos por agentes físicos e químicos. .................. 64
13. Conjugação bacteriana .............................................................................. 71
14. Medida quantitativa do crescimento bacteriano ......................................... 75
15. Urinocultura.......... ...................................................................................... 79
16. Considerações gerais sobre provas bioquímicas ...................................... 85
17. Teste de susceptibilidade microbiana as drogas. Técnica de
difusão em ágar (Kirby-Bauer) ......................................................................... 99

1
1 APRESENTAÇÃO DO LABORATÓRIO
DE MICROBIOLOGIA
O setor de microbiologia é um ambiente singular em relação aos aspectos de segurança, pois
as amostras de microrganismos manipulados significam um risco ao pessoal do setor. Em todas as
divisões do laboratório os funcionários devem ser treinados para que possam trabalhar com segurança.
Também o acadêmico necessitará de treinamentos para que então possa manipular microrganismos
com segurança.

NORMAS ADOTADAS PARA TRABALHO DIÁRIO NO LABORATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE

MICROBIOLOGIA

01. Antes de iniciar os trabalhos práticos lavar as mãos com água e sabão ou detergente
durante 15-20 segundos (lavagem higiênica), e enxugar em papel toalha. Fazer desinfecção da
bancada de trabalho com álcool 70% ;
02. Cuidado ao acender o bico de Bunsen (gás). Verificar se não existe material inflamável por
perto. Prender o cabelo para evitar acidentes;
03. Manter nas proximidades do local de trabalho um desinfetante, como por exemplo,
hipoclorito 1,5%, fenol 5%, álcool 70%;
04. Flambar alças e agulhas de níquel-cromo antes e após o uso;
05. Fazer as manipulações assépticas atrás da chama do bico de Bunsen. A chama do gás
deve estar colocada obrigatoriamente entre o operador e o material que está sendo manipulado;
06. Nunca colocar pipetas contaminadas na bancada de trabalho;
07. Nunca desprezar o material contaminado no cesto de lixo;
08. Nunca desprezar líquidos contaminados na pia do laboratório;
09. Desprezar todas as culturas e a vidraria utilizada (material contaminado) em recipiente
apropriado (cemitério - em hospitais = área de expurgo), para posterior descontaminação (esterilização)
e lavagem;
10. Cada aluno é responsável pelo material que receber;
11. Seguir as normas de uso dos equipamentos, particularmente quando da utilização do
microscópio;
12. Em caso de acidentes comunicar imediatamente o professor responsável para que sejam
tomadas as medidas adequadas;
13. Ao final dos trabalhos práticos fazer a desinfecção da bancada com álcool 70%. Fazer a
higienização simples das mãos. A antissepsia das mãos com álcool etílico a 70% (ex.: fricção
antisséptica das mãos) pode substituir a higienização simples das mãos com água e sabão quando as
mãos não estiverem visivelmente sujas;
14. Ao sair do laboratório: fechar o registro de gás da mesa de manipulação, desligar os
aparelhos de ar condicionado e apagar as luzes.

2
O Laboratório de Microbiologia

1.1 Atividades Básicas

As atividades básicas de um Laboratório de Microbiologia consistem em:

• Elaborar e viabilizar normas para colheita, conservação e transporte de material de interesse

clínico;
• Estabelecer e executar rotinas microbiológicas, dentro dos padrões técnico-científicos vigentes,
que permitam o isolamento e identificação dos principais agentes infecciosos de importância
clínica, por gênero e, se possível, por espécie;
• Determinar a sensibilidade às drogas antimicrobianas;
• Efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos de esterilização;
• Divulgar e pôr em prática normas de biossegurança;
• Participar junto com a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do rastreamento
epidemiológico dos surtos de infecção hospitalar;
• Fornecer periodicamente dados relacionados com a etiologia das infecções hospitalares e da
resistência às drogas;
• Executar outras atividades afins de natureza não rotineira e de relevância em determinadas
situações como, por exemplo, estudos microbiológicos de materiais inanimados, portadores,
desinfetantes, etc.

1.2. Segurança em Laboratório de Microbiologia

A rotina do Laboratório de Microbiologia envolve riscos relacionados à exposição, tanto com material
clínico e reagentes químicos, como com potenciais agentes patogênicos concentrados em meio de
cultura. A adoção e prática de normas de segurança e uso de equipamentos afins são considerados
imprescindíveis.

1.2.1 Medidas Gerais de Prevenção

Adoção de manuais de procedimentos adequados e de primeiros socorros, acompanhados de

treinamento e orientação verbal, sempre que necessário.

• Localização adequada para os equipamentos de segurança em lugar visível, de fácil acesso,

incluindo extintores de incêndio, vistoriados regularmente.
• Realização anual de radiografia de tórax para os funcionários que se dedicam à rotina de
tuberculose (seguir as orientações do Programa Nacional de Controle de Infecção Hospitalar).
• Proibição de fumar, com advertência sobre: aumento do risco de contaminação com
microrganismos potencialmente patogênicos ou produtos químicos; risco de incêndio e
inconveniência com relação aos colegas de trabalho.
• Recomendação quanto à inconveniência de comer e beber no local de trabalho, devendo haver
área destinada para esse fim.
• Recomendação sobre o uso de avental, para proteção da pele e das roupas.
• Recomendações: lavar as mãos frequentemente; prender os cabelos; não usar anéis e
pulseiras; não usar roupa social de mangas compridas; não usar cosméticos gordurosos.
• Adoção de cuidados especiais na pipetagem e no manuseio de material contaminado.

3
 • Advertência: as vidrarias contaminadas devem ser colocadas em desinfetante químico
(hipoclorito a 1%), imediatamente após o uso, antes de serem lavadas e reutilizadas.
• Rotulação e datação de todos os vidros que contenham reagentes.
• Emprego de autoclave para material clínico, placas e tubos de cultura, antes de serem
descartados no lixo hospitalar ou mesmo quando encaminhados para incineração.
• Desinfecção, com hipoclorito a 1% ou álcool a 70%, das bancadas e de outras superfícies de
trabalho no início e ao final do expediente.
• Utilização de material descartável(seringas, agulhas, luvas, toalhas, etc.).

1.2.2 Cuidados Relativos a Produtos Químicos

O laboratorista está diariamente em contato com produtos químicos potencialmente perigosos, cujos
efeitos geralmente se apresentam logo após eventuais acidentes, que podem ocorrer por:

• contato direto: com a pele (quebra de recipiente, derramamento de líquidos, etc.); com a boca
(durante a pipetagem); com o esôfago e o estômago (ingestão acidental);
• inalação de vapores e pós finos, com conseqüentes danos pulmonares; absorção (efeitos
tóxicos no nível da medula óssea, dos rins e do fígado).

Deve haver no laboratório, à imediata disposição do acidentado, um chuveiro, com grande fluxo de
água, e um lavador de olhos. O uso de tais equipamentos pode vir a evitar graves deformações e
cegueiras.

Não se deve pipetar diretamente com a boca produto químico irritante ou tóxico, deve-se fazer uso de
buretas ou pró-pipetas de borracha.

1.2.3 Cuidados Relativos aos Riscos de Contaminação

O Laboratório de Microbiologia recebe diariamente grande número de amostras de fluidos corporais

e outros espécimes clínicos que são, potencialmente, infecciosos. Os maiores perigos estão
relacionados com os vírus da hepatite e HIV, bacilos da tuberculose, salmonelas, fungos, protozoários,
etc.

É difícil quantificar o risco no trabalho em laboratórios, com relação aos agentes

infecciosos.Tem-se por base, porém, que o risco individual aumenta com a freqüência e com os níveis
de contato com o agente infeccioso. O primeiro cuidado a ser tomado no laboratório que trabalha com
espécimes clínicos é com o risco de exposição à infecção. Por outro lado, deve-se considerar que os
riscos são influenciados por uma relação variável entre o agente infectante, o hospedeiro e a atividade
desempenhada. Fatores aplicáveis ao agente incluem a virulência, a carga infectante, o ciclo e a
toxigenicidade. Algumas das principais variáveis que influem no risco do hospedeiro são: idade, sexo,
raça, gravidez, uso de antimicrobianos, imunidade (vacinação prévia), e o uso de drogas
imunossupressoras. Finalmente, a natureza da atividade laboratorial (por exemplo: diagnóstico,
produção, pesquisa) pode afetar significativamente o risco pessoal devido ao tipo, quantidade e
concentração dos agentes empregados, a manipulação dos agentes e a eficácia primária e secundária
dos equipamentos de proteção e práticas de laboratório.

4
 Existem várias portas de entrada de microrganismos, mas, no laboratório, a via respiratória tem
maior importância. Três fatores principais contribuem para isto: a facilidade com que partículas
pequenas são produzidas por técnicas comuns de laboratório, o fato de muitas destas partículas serem
suficientemente pequenas, não capturadas no trato respiratório superior, e a habilidade que a maioria
dos patógenos tem de invadir o pulmão.

a) Produção de Aerossóis

O uso incorreto de equipamento de laboratório – como pipetas, alças de inoculação, agulhas,

seringas, centrífugas e homogeneizadores – pode produzir grandes quantidades de aerossóis
potencialmente infectantes.

Exemplos de procedimentos que produzem aerossóis:

• destampar frascos que foram fechados com tampa de pressão;

• esvaziar seringas, eliminar o ar das seringas;
• quebrar frascos que contenham cultura de microrganismos;
• centrifugar tubos ou frascos sem tampa adequada.

Quando houver risco de contaminação por aerossóis, recomenda-se o emprego de capelas de

segurança biológica (fluxo laminar), juntamente com o uso de luvas, máscaras e óculos de proteção.
Nestas condições, manusear frascos e seringas envolvendo-os com gaze ou algodão, embebidos em
álcool a 70% ou hipoclorito a 0,5%.

b) Pipetagem de Material Clínico

É contra-indicada a pipetagem, com a boca, de material clínico (sangue, líquor, urina, etc.) ou de
suspensões bacterianas. Devem-se utilizar, sempre que possível, pipetas automáticas ou bulbos de
borracha.

c) Flambagem de Alça Bacteriológica

A flambagem da alça bacteriológica durante a manipulação do material biológico ou na

transferência de massa bacteriana (raspado de colônias) deve ser feita através de chama, que deve
estar entre o manipulador e a alça. Recomenda-se esgotar a alça num frasco contendo álcool a 95% e
areia. Quando se trabalha com Mycobacterium tuberculosis é recomendável o emprego de fenol a 0,5%
ou hipoclorito a 0,5% e areia, flambando-se a alça em seguida.

d) Disseminação de Esporos de Fungos

Ao se trabalhar com fungos, particularmente os filamentosos, recomenda-se o uso de capelas

bacteriológicas apenas com proteção de vidro ou acrílico, sem fluxo de ar.

1.2.4 Medidas Básicas de Proteção

a) Higienização das Mãos

5
 Fazendo-se, ou não, uso de luvas, lavar as mãos sempre que houver mudança de atividade, na
saída do laboratório e antes de comer, beber e mesmo fumar. A lavagem deve envolver mãos e
antebraços, usando-se água e sabão líquido. Friccionar com álcool a 70% contendo 1% a 2% de
glicerina. Outra opção é o uso de solução degermante à base de iodeto de polivinilpirrolidona (PVP-I) a
10%. Usar de preferência toalhas descartáveis.

b) Uso de Luvas

O uso de luvas é obrigatório, quando houver possibilidade de contato com sangue e com
fluidos corpóreos, especificando-se:

• Luva plástica – descartável, deve ser desprezada após cada uso. Indicações: para proteção
exclusiva do usuário em situações como colheita de sangue, recebimento ou entrega de
material biológico, etc.
• Luva doméstica – que pode ser antiderrapante; não descartável. Seu uso é indicado para
lavagem e desinfecção de materiais e superfícies. Após o uso, lavar as mãos enluvadas com
água e sabão e descontaminar as luvas em solução de hipoclorito a 0,5%, por 30 a 60 minutos.
• Luva cirúrgica (látex) – Indicada para uso em técnicas assépticas (para proteção do paciente
e do usuário), tais como cateterização vesical, exames endoscópicos, punção para obtenção
de líquor, líquido articular, líquido pleural, etc.

c) Uso de Máscaras, Protetores Oculares e Aventais

• Máscaras cirúrgicas e protetores oculares (óculos com proteção lateral) – são utilizados
para evitar a exposição das mucosas da boca e dos olhos e impedir o risco de inalação nos
procedimentos que possam produzir aerossóis ou causar borrifamento de sangue; também
devem ser usadas no manuseio de material biológico.
• Aventais – devem ser usados durante os procedimentos acima descritos, no manuseio de
culturas microbiológicas e no contato com material orgânico. Os aventais devem ser de
mangas longas e, se possível, de tecido sanfonado (tipo avental cirúrgico).

1.2.5 Medidas a Serem Tomadas em Caso de Acidente

De acordo com o Manual de Condutas em Exposição Ocupacional a Material Biológico do

Ministério da Saúde, após a exposição ao material biológico, cuidados locais com a área exposta
devem ser imediatamente iniciados. Em caso de exposição percutânea, recomenda-se lavagem
exaustiva com água e sabão ou solução antisséptica de degermante (PVP Iodo ou clorexidina ).

Após a exposição em mucosa, está recomendada a lavagem exaustiva com água ou solução
fisiológica. A indicação do uso de antirretrovirais deve ser baseada em uma avaliação criteriosa do
risco de transmissão do HIV em função do tipo de acidente ocorrido e da toxicidade dessas
medicações.

1.2.6 Eliminação de Resíduos, Amostras Clínicas e Material Usado

1.2.6.1 Resíduos químicos tóxicos

6
 O resíduo deve ser armazenado no local onde é gerado, em ambiente específico e arejado,
acondicionado em saco plástico branco, dentro de suas próprias embalagens primárias. Para o caso da
inexistência de suas embalagens, devem-se utilizar frascos de até dois litros, resistentes, com tampa
rosqueada, vedante e identificado com o nome e fórmula do produto químico, símbolo e expressão de
resíduo químico tóxico.

Dependendo do volume gerado e o tempo de acondicionamento para o tratamento ou

disposição final, o laboratório deve também possuir local específico para o abrigo de resíduos, fora da
unidade geradora e fora da edificação do estabelecimento.

1.2.6.2 Resíduos Microbiológicos Amostras Clínicas e Material Usado

Todos os materiais empregados no laboratório de microbiologia (meios de cultura inoculados,

meios de transporte, espécimes clínicos, swabs empregados na coleta, etc.) devem ser previamente
autoclavados antes de serem descartados como resíduo hospitalar. Os materiais perfuro e cortantes
(agulhas, seringas, lancetas e outros assemelhados) devem ser descartados em recipientes estanques,
rígidos, com tampa, e identificados com símbolo e expressão de resíduo infectante. As agulhas não
devem ser reencapadas ou retiradas manualmente e os recipientes não podem ser esvaziados para
reaproveitamento.

FONTE: Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Hospitalar.
Ministério da Saúde, Unidade de Controle de Infecção em Serviços de Saúde - Agência Nacional de Vigilância
Sanitária. 2000.

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 LIVROS TEXTOS UTILIZADOS EM MICROBIOLOGIA

1. TRABULSI, L.R.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O.F.; CANDEIAS, J.A.N. Microbiologia. 4ª edição,
revisada , São Paulo, Editora Atheneu, 718p. ; 2005
2. Murray, P.R.; Rosenthal, K.S.; Pfaller, M.A. Microbiologia Médica. 5ª edição, Rio de Janeiro, Elsevier
Editora Ltda., 978 p. tradução, 2006

4. Mims, C.; Dockrell, H.M.; Goering, R.V.; Roit, I.; Wakelin, D.; Zuckerman, M. Microbiologia Médica. 3ª
ed., Rio de Janeiro, Elsevier Editora Ltda., 710 p., tradução , 2005.

LIVROS COMPLEMENTARES

BIER, O. Bacteriologia e Imunologia. 3ª edição, São Paulo, Editora Melhoramentos, 1985.

PELCZAR JR, M.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. Microbiologia. Conceitos e Aplicações. Volumes I e
II, 2ª edição, São Paulo, Makron Books do Brasil Editora Ltda, 1997.

FORBES, B.A.; SAHM, D.F.; WEISSFELD, A.S. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. 10ª
edição, St Louis, Mosby Inc., 1998.

HOLT, J.G.; KRIEG, N.R.; SNEATH, P.H.A.; STALEY, J.T.; WILLIAMS, S.T. Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology. 9ª edição, Baltimore, Williams & Wilkins, 1994.

TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiology. An Introduction. 6ª edição,

Benjamin/Cummings Publishing Company Inc., 1998.

8
 2/3 UBIQUIDADE DE MICRORGANISMOS/
HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS

1. INTRODUÇÃO

Não há parte da biosfera onde não se encontram microrganismos. Na grande maioria dos casos fazem
parte do ecossistema, onde exercem profunda influência no equilíbrio biológico e conseqüentemente,
na preservação da natureza – neste caso são chamados de autóctones ou nativos. No solo (em
qualquer parte do globo terrestre), nas águas, na superfície externa e interna do organismo animal
(pele, boca, estômago, intestino), na superfície externa dos vegetais e em certos casos, no interior de
seus tecidos estão os microrganismos presentes, permanentemente ou transitoriamente.

2. MICROBIOLOGIA DO AR

A população microbiana da atmosfera é transitória e variável. O ar não é um meio no qual possam

crescer os microrganismos; ele é antes, um portador de matéria particulada, pó e gotículas, que podem
estar carregadas com micróbios. O número e os tipos de germes contaminantes do ar são
determinados pelas fontes de contaminação existentes no ambiente; os organismos são, por exemplo,
disseminados pela tosse e pelo espirro, a partir do trato respiratório humano, enquanto partículas de
poeira circulam pelas correntes aéreas desde a superfície terrestre. Os microrganismos veiculados pelo
ar podem ser espalhados em partículas de pó, em grandes gotas, que resultam da evaporação de
pequenas gotas líquidas. Os organismos introduzidos no ar podem ser transportados ao longo de
alguns centímetros ou alguns quilômetros; alguns morrem em questão de segundos; outros sobrevivem
por semanas, meses ou mais. O destino final dos microrganismos transportados pelo ar é governado
por um conjunto de circunstâncias, incluindo as condições atmosféricas (umidade, luz solar,
temperatura), as dimensões das partículas portadoras dos germes e a natureza dos microrganismos,
ou seja, o grau de susceptibilidade ou resistência de uma espécie em particular ao novo ambiente
físico ou sua capacidade de formar esporos ou cistos resistentes. A demonstração de organismos na
atmosfera é de grande importância e de aplicação em diferentes campos das atividades dos
microbiologistas (na medicina, na indústria, na agricultura, nas técnicas microbiológicas, etc.). Quanto
mais movimentado e populoso for o ambiente, maior é a quantidade de microrganismos que pode ser
disseminada pela movimentação do ar e pelas correntes aéreas.

9
3. CONTROLE DA MICROBIOTA DAS MÃOS

A pele e as membranas abrigam uma variedade de microrganismos que podem ser distribuídos em
dois grupos:

(1) Microbiota residente: É composta de tipos relativamente fixos de microrganismos

encontrados regularmente em uma determinada área e em uma certa idade; quando alterada,
ela prontamente se recompõe;

(2) Microbiota transitória: É constituída de microrganismos não patogênicos ou potencialmente

patogênicos que habitam a pele ou as mucosas durante horas, dias ou semanas; ela é
proveniente do ambiente e não se estabelece de modo permanente na superfície do corpo
humano. Os membros da flora transitória são geralmente de pouca importância desde que a
flora residente permaneça íntegra. Entretanto, se a flora residente for alterada, microrganismos
transitórios podem colonizar, proliferar e produzir doenças. Os microrganismos pertencentes a
flora residente das mãos estão firmemente aderidos, multiplicam-se e persistem sobre a pele
sendo principalmente representados por germes não patogênicos ou oportunistas,
especialmente estafilococos, micrococos, corinebactérias aeróbicas e anaeróbicas. A flora
transitória das mãos inclui quaisquer microrganismos adquiridos através do contato com
pessoas e objetos fontes ambientais ou que são artificialmente depositados sobre a pele mas
que não se multiplicam sobre ela. Esta flora pode ser removida pela lavagem com água e
sabão ou detergente, pelo emprego de anti-sépticos, ou pala combinação de ambos. A ação
mecânica da lavagem das mãos com água e sabão remove os germes transitórios, mas é
ineficiente na retirada dos residentes. Os anti-sépticos, por sua vez, são mais ativos reduzindo
de forma significativa até a flora residente.

4. OBJETIVOS DA AULA:

1. Verificar o grande número de microrganismos que existe na natureza e na pele;

2. Observar a eficácia da higienização das mãos e do uso de um antisséptico na redução dos

microrganismos da pele.

10
5. ATIVIDADES PRÁTICAS
Trabalho em grupo

Técnica da sedimentação em placas

1. Colocar duas séries de 3 placas de Petri 100x15 mm contendo ágar sangue (série 1: – Placas
números 1,2, e 3 e série 2: - placas número 4,5,6) em diferentes locais. Retirar as tampas
das placas e deixa-las expostas ao ar durante os seguintes períodos de tempo : A) cinco
minutos placas 1 e 4; B) Dez minutos placas 2 e 5 ; c) quinze minutos placas 3 e 6.
Incubar durante 2 a 5 dias a série de placas 1,2 e 3 na estufa a 27oC e a outra série de placas
4,5 e 6 em temperatura ambiente. Proceder a leitura e registrar os resultados no quadro 15.
Interpretar os resultados encontrados

Trabalho individual

1. Avaliação da microbiota: AMBIENTE INANIMADO x SUPERFÍCIE DO CORPO HUMANO

Método

Dividir o fundo da placa de Petri contendo ágar-simples em duas partes com caneta de
retroprojetor. Identificar a placa; sendo um dos lados objeto ou AMBIENTE INANIMADO e do outro lado
SUPERFÍCIE DO CORPO HUMANO

1.1. AMBIENTE INANIMADO

Friccionar um swab umedecido em salina 0,85% em uma SUPERFÍCIE INANIMADO presente

no laboratório. Ex: bancada, na sola de seu sapato, celular, ou qualquer outra superfície
inanimada. Em seguida, espalhá-lo na superfície da placas de Petri contendo ágar simples

1.2. SUPERFÍCIE DO CORPO HUMANO

Friccionar um swab umedecido em salina 0,85% em uma superfície do corpo humano (pele ou
mucosa). Ex: mãos, ponta dos dedos, garganta, ouvido, região embaixo da unha, dente etc.;.
Em seguida, espalhá-lo na superfície da placas de Petri contendo ágar simples

1.3. Incubar a temperatura ambiente durante 48 horas. Proceder a leitura e registrar os

resultados no quadro abaixo. Interpretar os resultados encontrados.

11
 TÉCNICA DE HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS

2. Avaliação da microbiota das mãos:

Método

1. Dividir o fundo da placa de Petri contendo ágar-simples em três partes com caneta de
retroprojetor. Identificar a placa com o nome do operador e a data do experimento;
2. Deslizar o dedo no ágar. Identificando n.º 1 = “mãos sem lavar”;
3. Lavar as mãos com detergente (sabão), vigorosamente, em todas as superfícies, durante 2
minutos e enxugá-las com toalha esterilizada. A seguir, deslizar o dedo no ágar. Identificar n.º
2 = “mãos lavadas com sabão”;
4. Lavar as mãos (2 minutos com sabão) e em seguida fazer a antissepsia com álcool 70%
(durante 1 minuto). Em seguida, deslizar o dedo no ágar. Identificar n.º 3 = “mãos após
lavagem e antissepsia”.
5. Para que o experimento dê resultados satisfatórios, padronize muito bem a maneira de
deslizamento de modo que em todos os setores da placa seja realmente exposta a mesma
parte da pele, pois a flora é muito variável em cada setor de nossa pele
.

Mãos sem
lavar (1)

Mãos lavadas
2’ com sabão (2)

Mãos lavadas +
Álcool 70% (3)

12
LEITURA E INTERPRETAÇÃO

Quadro 1. Ubiquidade de microrganismos.

Tempo de exposição Local de exposição Número de colônias

das placas das placas
Fungos Bactérias Total
Série 1 : Placas incubadas na estufa 37oC
01 - 05 minutos
02 - 10 minutos
03 - 15 minutos
Série 2 : Placas incubadas à temperatura ambiente
01- 05 minutos
02 - 10 minutos
03 - 15 minutos

Quadro 2. Avaliação da microbiota do ambiente animados e superfícies do corpo humano.

Local de coleta Número de colônias

Fungos Bactérias Total

Quadro 3. Microbiota das mãos.

SETOR DA PLACA PROCEDIMENTO Nº DE COLÔNIAS (UFC)

01 Sem lavar

02 Água, sabão

03 Água, sabão, antisséptico

Responda:
1. Qual a importância da lavagem das mãos para os profissionais da saúde?
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

2. Qual o procedimento que deverá ser realizado ao iniciar e ao finalizar as aulas práticas?
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

13
4
LAVAGEM, PREPARO
(ACONDICIONAMENTO) DA VIDRARIA
COMUMENTE UTILIZADA NA ROTINA
BACTERIÓLOGICA
1. INTRODUÇÃO

A lavagem e a esterilização da vidraria são atividades de fundamental importância na rotina

microbiológica. É reconhecido que alguns detergentes tem influência no crescimento de
microrganismos e, no caso de não serem totalmente removidos do material, poderão comprometer as
análises a serem executadas. Os resíduos dos meios de cultura e metabólicos que não forem
convenientemente eliminados da vidraria também irão interferir nos constituintes das soluções e meios
de cultura, e consequentemente, nos resultados dos exames. A lavagem do material em microbiologia
pode ser definida como a eliminação de resíduos orgânicos, de proteínas e produtos de metabolização
dos componentes do meio de cultura, após o seu uso.

2. DESCONTAMINAÇÃO DO MATERIAL

Antes da lavagem, todo material contaminado (que foi anteriormente depositado nos
cemitérios) é esterilizado na autoclave a 121ºC durante 15-20 minutos, procedendo-se da seguinte
forma para os diversos materiais: (1) colocar os tubos de ensaio na posição vertical, com as tampas
voltadas para cima (no caso de tampas de rosca, afrouxá-las") em caixas vazadas; (2) separar as
tampas e os fundos das placas de Petri com meio de cultura e imergir em solução de detergente a
0,5% contida em recipiente de alumínio ou aço inoxidável; (3) depositar as pipetas horizontalmente em
recipientes de aço inoxidável, contendo solução de detergente a 0,5%.

3. LAVAGEM DE VIDRARIA

• Tubos de ensaio: (a) após a descontaminação dos tubos, descartar seus conteúdos; (b) colocar
os tubo s em recipiente de aço inoxidável contendo solução de detergente a 0,5% e autoclavar
a 121ºC durante 15 minutos para eliminar os resíduos do meio de cultura; (c) caso persistam os
resíduos após a fervura, escovar a parte interna de cada tubo de ensaio com o auxílio de um
gaspilhão (escovinha); (d) enxaguar 10 vezes em água corrente enchendo e esvaziando totalmente
os tubos; (e) enxaguar uma vez em água destilada ou deionizada.

14
• Placas de Petri: (a) após a descontaminação, lavar individualmente cada uma das partes da placa
(tampa e fundo), com o auxílio de uma esponja, para retirar marcas de lápis dermatográfico e
resíduos do meio de cultura; (b) enxaguar 10 vezes em água corrente, esfregando sempre com a
mão, as superfícies internas e externas de cada uma das partes da placa. Tomar todas as
precauções para que este enxágüe seja perfeito, para que todos os resíduos sejam eliminados; (c)
enxaguar uma vez cada uma das partes da placa (tampa e fundo) em água destilada ou
deionizada.

• Pipetas: (a) após a descontaminação, tomando cuidado para não quebrar o bocal, retirar o tampão
de algodão (bucha) de cada pipeta através de vácuo ou estilete de ponta fina (palitos, agulhas); (b)
colocar as pipetas em recipientes contendo solução de detergente a 0,5%, e autoclavar a 121ºC
durante 15 minutos para eliminar os resíduos das paredes; (c) enxaguar 10 vezes em água
corrente enchendo e esvaziando totalmente as pipetas; (d) enxaguar uma vez em água destilada
ou deionizada.

• Lavagem de lâminas e lamínulas: Ferver as lâminas e lamínulas em uma solução a 5% de

dicromato de potássio durante trinta minutos, adicionando-se a cada 5-10 minutos um pouco de
ácido sulfúrico concentrado. Lavar em água corrente durante 12 horas e deixar uma semana em
álcool a 95ºGL adicionando-se algumas gotas de ácido clorídrico (HCl). Lavar em água corrente
para retirar o ácido, em água destilada e conservar as lâminas e lamínulas em álcool 95ºGL.

• Lavagem com "solução" sulfo-crômica: a lavagem de vidraria em geral com "solução" sulfo-
crômica se faz necessário quando esta apresentar resíduos que resistiram a lavagem com
detergente. Para isso, proceder da seguinte maneira: (a) após a descontaminação, esvaziar os
conteúdos de cada frasco (tubos, pipetas, placas, etc.); (b) adicionar 50 mL da "solução" sulfo-
crômica no frasco a ser lavado; (c) agitar com os devidos cuidados cinco a seis vezes; (d) com
o auxílio de um funil transferir a "solução" sulfo-crômica usada para o próximo frasco a ser
lavado; (e) agitar cuidadosamente cinco a seis vezes; (f) proceder conforme descrito em d;
usando a mesma "solução" para lavar no máximo 10 frascos; (g) enxaguar 10 vezes em água
corrente (torneira), enchendo e esvaziando totalmente os frascos; (h) enxaguar uma vez em
água destilada ou deionizada, realizando medidas de pH da água destilada ou deionizada
antes e depois do enxágüe (de preferência deixar o frasco em teste com água destilada
durante a noite e logo após realizar a medida do pH em potenciômetro (pHmêtro).
Preparo da mistura ou "solução" sulfo-crômica:
Fórmula: Ácido sulfúrico concentrado.............469mL
Dicromato de potássio (K2Cr2O7)....60g
Água destilada..................................200mL

Preparo: Pesar o dicromato de potássio e dissolver na água destilada a quente. Deixar resfriar.
Adicionar o ácido sulfúrico cuidadosamente pouco a pouco agitando sempre e resfriando a
mistura em água fria ou banho de gelo.
Nota: Sempre adicionar o ácido sobre a água.

15
4. SECAGEM

Deixar escorrer toda a água e colocar a vidraria em geral na posição emborcada na estufa de
secagem a 100ºC durante o período de uma hora.

5. ACONDICIONAMENTO

Todo o material utilizado no trabalho microbiológico deve ser não só perfeitamente limpo, mas
também estéril, isto é, isento de germes. A vidraria após cuidadosa lavagem e secagem, é
acondicionada com papel (Kraft, Tigre, Jornal, Lista Telefônica, etc.) e esterilizada em autoclave a
121ºC por 15-20 minutos ou no forno de Pasteur a 170-180ºC por duas horas. A boca de toda a vidraria
como tubos, garrafas e balões é fechada com tampões de algodão, que não devem ser folgados ou
demasiadamente apertados; e se bem feitos, não se desfazem ao serem retirados. As garrafas,
Erlenmeyers, balões de fundo chato, etc., além da bucha de algodão, levam também um invólucro de
papel, o qual é amarrado com barbante. Os tubos de ensaio depois de fechados com algodão
(embuchados), são em número variável, empacotados em papel de embrulho. As placas de Petri são
totalmente envoltas em papel em número de 1, 2, 5, 10 etc., fixando-se o pacote com barbante ou fita
crepe. As seringas e cotonetes (zaragatoas, swabs), empregados para a colheita do material em
microbiologia clínica (secreções diversas, abcessos), são montados em tubos de ensaio e envolvidos
parcialmente em papel. Para o acondicionamento individual de pipetas, são observados os seguintes
critérios: a extremidade destinada a aspiração é provida de uma pequena bucha de algodão colocada
com o auxílio de uma agulha ou estilete, sendo então totalmente envolta em papel embrulho. Podem
ser também acondicionadas em pacotes de papel (conjunto de 5, 10, 20), ou em cilindros de aço
inoxidável, especialmente fabricados para este propósito. Esta pequena bucha de algodão colocada no
bocal das pipetas apresenta as seguintes finalidades: (1) não permitir a penetração de germes de
contaminação; (2) proteger o operador contra a ingestão de líquidos contaminados.

5.1. ROTINA TÉCNICA DE ACONDICIONAMENTO DO MATERIAL: TÉCNICA DO ENVELOPE

5.1. Em papel Kraft

1. Separar o material necessário: - Folha de papel Kraft dupla; - Fita teste para autoclave a vapor;
- Material a ser empacotado.
2. Colocar o material no centro do campo, que deve estar na posição diagonal;
3. Pegar a ponta voltada para o funcionário e cobrir o material, fazendo uma dobra externa na ponta;
4. Pegar uma das laterais do campo e trazer sobre o objeto a ser empacotado, fazendo uma dobra
externa na ponta;
5. Repetir o procedimento com a outra lateral;
6. Completar o pacote trazendo a ponta restante sobre o objeto, finalizando o envelope;

16
7. Fechar o pacote com fita teste para autoclave a vapor ou fita crepe normal
Técnica de acondicionamento pelo método do envelope

A/B

C/D

E/F

5.2. Em papel grau cirúrgico: Normalmente os envelopes já estão prontos

1. Escolher o envelope de acordo com o tamanho, forma e volume do material;

2. Preencher e fixar a etiqueta com a identificação do material;
3. Ter o devido cuidado ao embalar material frágil;
4. Proteger as pontas do material para evitar perfurações na embalagem (espuma sintética);
5. Desconectar as partes do material de forma a permitir o contato com o agente esterilizante;
6. Cuidar, ao trabalhar com bobinas de papel grau cirúrgico, para que o indicador químico permaneça
visível, ao ser cortada a embalagem;
5.3. Orientações básicas para identificação de pacotes

2. A identificação deverá conter: o nome da instituição, o nome do pacote de acordo com a

padronização, a data de esterilização, o número do lote, validade, assinatura legível de quem preparou
o pacote; Usar fita adesiva branca indicadora de temperatura

17
 7. ATIVIDADES PRÁTICAS

TRABALHO INDIVIDUAL

- Embuchamento e acondicionamento de frascos de penicilina e tubos 13x100mm

- Preparo e acondicionamento de “swabs” em tubo e em pacote.

- Acondicionamento de gaze pela técnica do envelope.

- Embuchamento e acondicionamento de pipetas.

TRABALHO DEMONSTRATIVO EM GRUPO

- Acondicionamento de placas de Petri.

- Acondicionamento de Erlenmeyers.

- Acondicionamento de marmita.

- Acondicionamento de seringa pela técnica do envelope.

ANOTAÇÕES

__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

18
 5

ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO.
TÉCNICAS DE ESTERILIZAÇÃO PELO
CALOR SECO, ÚMIDO E POR FILTRAÇÃO
1. INTRODUÇÃO

A esterilização pode ser definida como o processo que mata ou remove todos os tipos de
microrganismos, inclusive os esporos bacterianos. Os artigos que estão livres de organismos vivos são
denominados estéreis. Como a presença mesmo de um único micróbio torna o artigo não-estéril, os
termos como “parcialmente estéril” ou “quase estéril” não devem ser usados.

2. ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO

O calor úmido sob a forma de vapor de água saturado sob pressão, é o mais prático e eficiente
agente de esterilização. Na prática microbiológica, este procedimento é realizado em equipamentos
especiais denominados autoclaves. O funcionamento da autoclave é baseado no princípio da marmita
de Papin, isto é, a água aquecida em recipiente fechado onde o vapor fica retido sob pressão, pode
atingir temperaturas superiores a 100ºC sem ferver.

A autoclave de Chamberland consiste essencialmente em uma caldeira cilíndrica de paredes

resistentes, fechada na parte superior por uma tampa, que veda perfeitamente, dotada de uma
guarnição de borracha e parafusos (manipuladores) de fixação. No interior da caldeira existe um
suporte (cruzeta) sobre o qual se coloca uma cesta metálica e o fundo da caldeira fica um espaço, que
se enche de água, onde está localizado duas resistências elétricas protegidas por material isolante. A
tampa da autoclave possui um orifício de escapamento, uma válvula de segurança e um manômetro
que indica a pressão e a correspondente temperatura.

19
TÉCNICA DE ESTERILIZAÇÃO NA AUTOCLAVE:

01. Abrir a tampa da autoclave e colocar água na caldeira até quase

atingir a cruzeta (um dedo abaixo);

02. Introduzir o cesto metálico contendo o material a ser esterilizado;

03. Fechar a tampa, apertando por igual os manipuladores;

04. Ligar a chave elétrica (D) no máximo de intensidade;

05. Abrir o registro (C) do orifício de escapamento. A princípio há

expulsão do ar contido na caldeira. Quando a água começa a ferver, sai um
jato intermitente de ar misturado com vapor de água. Quando todo o ar
residual é expulso do aparelho, começa a sair um jato contínuo de vapor de
água. Nesse momento, fechar o registro (C) do orifício de escapamento. O
manômetro (A) começa a acusar o aumento da pressão;

06. Ao atingir a temperatura de 121ºC (1 atmosfera de pressão), diminuir a intensidade de calor

girando a chave elétrica (D) para a posição média ou mínima, de forma que a pressão permaneça
estável;

07. Marcar o tempo de esterilização de 15 minutos;

08. Desligar a chave elétrica (D) girando-a para a posição desligado;

09. Aguardar que a pressão retorne a zero atmosfera;

10. Abrir o registro (C) do orifício de escapamento para equalizar a pressão da autoclave com a
do ambiente;

11.Com auxílio de luvas de amianto, de cano longo, afrouxar os manipuladores;

12. Proteger o rosto contra a projeção de vapor. Retirar o cesto com o material esterilizado.

NOTA: Para regular a válvula de segurança, deslocar o contra-peso (B) para frente ou para trás, de
maneira a estabilizar a pressão desejada, observando-se o limite de até 1,5 atmosferas. O registro (E)
é usado para a drenagem da água da caldeira por ocasião da limpeza da autoclave.

3. ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR SECO

A esterilização pelo calor seco é realizada em estufas especiais denominadas de forno de

Pasteur. Basicamente, o forno de Pasteur consiste de uma câmara dotada de um elemento aquecedor
elétrico (RESISTÊNCIA) que aquece a câmara o seu conteúdo; além disso, existe um termostato que
regula a temperatura desejada e um orifício na parte superior que permite a colocação de termômetro.
Devido o calor seco apresentar menor poder de penetração do que o calor úmido, a esterilização pelo
calor seco requer temperaturas mais elevadas (140 - 180ºC) e o tempo de exposição mais prolongado
(1 - 3 horas), seu uso é indicado para a esterilização da vidraria, instrumentos de corte ou de ponta
passíveis de serem oxidados pelo vapor, pós e produtos impermeáveis como ceras, pomadas, e óleos.

20
 Os materiais são efetivamente esterilizados quando tratados por uma das várias combinações
de temperatura-tempo, de eficácia comprovada6:

1. 121ºC, durante 12 horas;

2. 160ºC, durante 2 horas;

3. 170ºC, durante 1 hora.

A combinação mais utilizada na prática microbiológica é a do item 2. Outras formas de

esterilização pelo calor seco utilizadas no laboratório de microbiologia incluem a incineração de
materiais descartáveis e a flambagem. A flambagem é o método empregado para a esterilização de
alças e agulhas de níquel-cromo que são aquecidas ao rubro, diretamente na chama do Bico de
Bunsen.

TÉCNICA DE ESTERILIZAÇÃO NO FORNO DE PASTEUR:

1 Ligar o forno e ajustar a temperatura para 160ºC com auxílio do botão do termostato e do
termômetro graduado até 200ºC;

2. Após o forno atingir a temperatura de 160ºC, utilizando luvas de amianto, de cano longo,
abrir a porta do forno e colocar o material limpo, seco e devidamente acondicionado no interior do
forno, de forma adequada para permitir a circulação do ar quente na câmara. Alguns tipos de forno são
dotados de ventilador interno para uniformizar a circulação do ar;

3. Fechar a porta do forno e aguardar a temperatura subir e estabilizar a 160ºC;

4. A partir deste momento, marcar o tempo de esterilização de 2 horas. Nunca abrir a porta do
forno durante o ciclo de esterilização;

5. Desligar o forno e deixar resfriar naturalmente, com a porta fechada;

6. Com auxílio de luvas de amianto, abrir a porta do forno para a retirada do material quando o
termômetro acusar temperatura de 60-80ºC.

4. ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

A esterilização de líquidos e gases pode ser efetuada por meio da filtração através de materiais
capazes de reter microrganismos. Atualmente, dois tipos de filtros são amplamente empregados no
laboratório de microbiologia: disco filtrante (Seitz) e membrana filtrante (Millipore). Os discos Seitz são
discos de amianto, extremamente adsorventes, que retêm os microrganismos principalmente por
diferenças de cargas elétricas. As membranas filtrantes são constituídas de ésteres de celulose e
contém milhões de poros microscópicos com diâmetros uniformes variando de 0,01 a 14 micrômetros.

21
 Essas membranas retêm, em sua superfície, todas as partículas que excedem o tamanho dos
seus poros. Na prática bacteriológica, geralmente são utilizadas membranas com poros de 0,45 a 0,22
micrômetros. Os discos e membranas filtrantes são muito utilizados no laboratório de microbiologia
para a esterilização de soluções termolábeis, como por exemplo: soro, plasma, açúcares, antibióticos,
vitaminas, adicionadas assepticamente em meios de cultivo.

TÉCNICA DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO:

Para a filtração de soluções, em discos ou membranas, é necessário forçar o líquido através do

filtro, aplicando uma pressão negativa ao fraco de filtração, por meio de uma bomba de vácuo ou de
uma trompa de água, ou impondo uma pressão positiva acima do líquido de filtração. Normalmente, o
disco Seitz é acoplado a um suporte que por sua vez é adaptado a um frasco de Kitasato, sendo este
conjunto acondicionado e esterilizado na autoclave. As membranas filtrantes podem ser montadas em
suportes de diferentes tamanhos, que variam de acordo com o diâmetro da membrana. Para a filtração
de um pequeno volume de líquido, o suporte previamente esterilizado com a membrana é adaptado a
uma seringa, podendo o líquido rapidamente filtrado sob pressão, ser recolhido assepticamente em um
tudo de ensaio estéril. Para maiores volume de líquidos são utilizados adaptadores semelhantes para
os discos Seitz, processando-se a filtração sob pressão a vácuo. O controle de esterilidade da solução
filtrada é realizado pela semeadura de alíquotas em meios de cultivo apropriados. A ausência de
turvação do meio de cultivo, após incubação a 37ºC durante 24-48 horas, comprova a eficácia do
processo de esterilização.

5. CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO

5.1. Indicador químico Fita Indicadora4 - Fixar, sob a superfície dos objetos a serem
esterilizados, um pedaço de aproximadamente 30-50 mm da fita indicadora. Observar que a fita
apresenta uma coloração creme uniforme. Após a autoclavação, verificar s a fita apresenta faixas
pretas paralelas, indicando que a temperatura do processo de esterilização atingiu a 121ºC;

5.2. Indicador químico Anidrido Succínico5 - Colocar em um béquer de 100 mL de capacidade

um tubo de ensaio 13x100mm, com tampa de algodão, acondicionado com invólucro de papel,
contendo 1g da anidrido succínico (C4H4O3). Esta substância tem ponto de fusão de 119,6ºC e se
apresenta a temperatura ambiente no estado sólido. Após a esterilização, observar se o anidrido está
fundido (líquido) indicando que a temperatura do processo de esterilização ficou próxima a 120ºC;

5.3. Indicador biológico (Sterikon) - Este bioindicador consiste em uma ampola que contém
caldo nutriente, açúcar, um indicador de pH e esporos de uma bactéria não patogênica, Geobacillus
stearothermophilus (ATCC 7953). A resistência térmica destes esporos é tal que o microrganismo é
completamente morto pela autoclavação a 121ºC durante 15 minutos (D121 = 3 + 1 minutos). Em
temperaturas ou tempos de exposição menores, os esporos sobrevivem.

22
TÉCNICA DE REALIZAÇÃO DO CONTROLE BIOLÓGICO

Colocar em um béquer de 100 mL de capacidade uma ampola de Sterikon® (Teste = Ampola

1) juntamente com o material a ser esterilizado na autoclave. Em paralelo, deixar outra ampola do
bioindicador a temperatura ambiente (Controle positivo = Ampola 2). Após a esterilização, retirar a
ampola teste da autoclave e incubá-la, juntamente com a ampola controle positivo, em banho maria a
60ºC durante 24-48 horas.

Após a autoclavação, a eficácia do processo de esterilização, é verificada pela incubação das

ampolas para evidenciação da germinação dos esporos. A ausência de crescimento indica
esterilização adequada. Neste caso, o bioindicador apresenta coloração violeta clara. Se a esterilização
for inadequada, os esporos do Geobacillus stearothermophilus sobrevivem ao tratamento térmico e
germinam. O conteúdo da ampola apresenta coloração amarela dentro de 24 horas, devido a formação
de ácidos decorrentes da fermentação do açúcar e também apresenta turbidez devido ao crescimento
bacteriano.

Os resultados podem apresentar as seguintes combinações:

Ampola 1 Ampola 2
Processo de Esterilização
Teste Controle positivo

+1 + Inadequado

-2 + Adequado

- - ?3

1: Crescimento: Turbidez e coloração amarela

2: Ausência de Crescimento: Límpido e coloração violeta
3: Bioindicador inativo, substituí-lo

ATIVIDADE PRÁTICA

TRABALHO INDIVIDUAL

1. Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%;

2. Lavar as mãos com água e sabão durante 15-20 segundos (lavagem higiênica);

3. Técnica de flambagem de alça e agulha de semeadura bacteriológica.

23
TRABALHO EM GRUPO

1. Técnica de esterilização em autoclave. Controle do processo de esterilização através do uso

de indicadores químicos: fita indicadora e anidrido succínico; e biológico: esporos de G.
stearothermophilus.

TRABALHO DEMONSTRATIVO EM GRUPO

1. Técnica de esterilização em forno de Pasteur;

2. Técnica de esterilização de líquidos através do emprego de disco filtrante (Seitz) e de

membrana filtrante (Millipore).

NOTA: Ao término dos trabalhos, cada aluno deve fazer a desinfecção da bancada com álcool 70% e a
seguir a antissepsia e higienização das mãos.

24


6SEGURANÇA E HIGIENE NO TRABALHO

MICROBIOLÓGICO. TÉCNICAS E
PROCESSOS DE MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA

1. INTRODUÇÃO

Cada laboratorista é responsável pela sua segurança e a de seus companheiros de trabalho. O

acidente típico de laboratório de microbiologia é a infecção por microrganismos patogênicos, estando
sujeitos a estas infecções, todo o pessoal que trabalha e/ou circula pelo laboratório.
A via mais importante de infecção é a respiratória, por inalação do ar contaminado do
local de trabalho. Ao lado desta, outras vias devem ser consideradas, como: pele: (escoriações,
picadas de agulha, mordidas de animais inoculados e etc.); mucosa bucal e vias digestivas (ingestão
de alimentos, líquidos durante o trabalho, insuficiente desinfecção das mãos antes de comer ou fumar,
e etc.); olhos e ouvidos (projeção de cultura microbiana, mãos contaminadas e etc.).
No sentido de se evitar qualquer tipo de infecção acidental durante a jornada de trabalho,
observar sempre as seguintes normas gerais no Laboratório de Microbiologia: “Não correr riscos
desnecessários, usar equipamentos de segurança apropriados, estar preparado para agir rapidamente
em caso de acidentes, não fumar ou comer no laboratório”.

2. SEGURANÇA E HIGIENE NO TRABALHO MICROBIOLÓGICO

Cada laboratório trabalha em condições diferentes e os riscos de infecção a que estão

expostos os empregados variam segundo a organização da instituição, sua equipe e seus métodos de
trabalho, assim como as operações que ali se efetuam. Não obstante, algumas medidas devem ser
aplicadas em laboratórios de microbiologia para prevenir os riscos de infecção do pessoal.
2.1. Pessoal. A seleção de pessoal para trabalhar em laboratórios de microbiologia deve ser feita
baseada na capacidade mental e na habilidade manual dos candidatos. Todos os empregados,
inclusive o pessoal auxiliar, devem possuir conhecimentos básicos em matéria de higiene,
epidemiologia e desinfecção. Cada um deve ser informado dos riscos que tem seu trabalho e ter sido
sistematicamente informado dos métodos, procedimentos e comportamento pessoal para prevenir,
qualquer infecção ou a eventual propagação de uma epidemia fora do estabelecimento. Antes de ser
admitido no trabalho de laboratório, cada empregado deve ser submetido a um exame médico para
determinar se goza de boa saúde, se tem boa capacidade física e resistência para o trabalho com
agentes infecciosos ou se apresenta alguma contra indicação às vacinas requeridas. Os exames
devem ser repetidos e os prazos fixados segundo a natureza dos riscos.

25
2.2. Área contaminada. Essa denominação é dada ao local onde se manipulam produtos ou materiais
que contenham ou possam conter microrganismos patogênicos. Como o risco principal nesta área é a
inalação de aerossóis, cuidados especiais devem ser tomados nas seguintes etapas: (1) ao abrir os
recipientes com amostras, sobretudo quando em meio líquido; (2) ao preparar esfregaços; (3) ao
pipetar suspensões microbianas, o que deve ser feito com bulbo de borracha, e nunca com a boca; (4)
ao agitar os tubos com a mão ou com agitador mecânico; (5) ao desprezar líquidos sobrenadantes; (6)
ao abrir frascos ou tubos depois de centrifugar ou agitar; (7) ao flambar a alça ou agulha de semeadura
bacteriológica. O trabalho nesta área deve realizar-se levando em consideração ainda as seguintes
recomendações: evitar a entrada e o trânsito de pessoas estranhas, trabalhar sempre com avental de
proteção, evitar quem trabalha nesta área sair e entrar continuamente e manter sempre à mão um
frasco com desinfetante (fenol 5 –10%).
2.3. Equipamentos de segurança. São instrumentos que tem por finalidade evitar ou amenizar um
acidente. Os equipamentos de segurança que se pode dispor na maioria dos laboratórios são limitados
devido ao seu alto custo. Poucos contam com câmara ou cabines assépticas, dotadas de sistema de
exaustão e de luz ultra-violeta. Em laboratórios que possuem câmara asséptica, alguns cuidados
básicos devem ser observados: usar lâmpadas de UV com emissão de raios de comprimento de onda
em torno de 250-260nm; não operar com a luz UV ligada, pois seus raios causam sérios danos a
visão e a pele; ligar a luz UV pelo período de 1-2h antes de iniciar o trabalho, assim como ao término
do mesmo; limpar os bulbos das lâmpadas cada 2 semanas com álcool etílico para remover o pó.
Existem no entanto equipamentos de segurança simples e econômicos com os quais é indispensável
contar: um recipiente metálico, de preferência de aço inoxidável, destinado a receber líquidos
contaminados; um frasco contendo areia e álcool para limpar a alça de semeadura bacteriológica antes
de flambá-la; estantes de madeira ou arame, suficientemente estáveis; recipientes metálicos com
tampa para o material a ser autoclavado (cemitério); pera de borracha para aspirar e vazar líquidos
com a pipeta; pipetas contendo bucha de algodão na parte destinada a aspiração; recipiente para
depositar pipetas contaminadas e outros equipamentos de segurança individual como por exemplo:
óculos, luvas, máscaras, botas, aventais, gorros, etc..
2.4. Higiene pessoal. É indispensável em um laboratório de microbiologia, uma rigorosa limpeza. Cada
técnico deve ser responsável pela sua bancada de trabalho e pelos seus instrumentos. Sendo assim,
devem ser observadas as seguintes regras de higiene durante o trabalho: (a) antes de iniciar o trabalho
o técnico deve colocar o seu avental, este nunca deverá ser intercambiado com colegas depois de
usados; (b) depois de cada contato com o material infeccioso, efetuar cuidadosamente a antissepsia
das mãos e, somente depois lavá-las com água corrente e sabão; (c) antes de abandonar o local de
trabalho contaminado deve-se dispor do avental e colocá-lo em local apropriado, a seguir efetuar a
antissepsia das mãos e lavá-las com água corrente e sabão; (d) para qualquer trabalho com maior risco
de contaminação, utilizar instrumentos, pinças, luvas e pera de borracha para pipetas. Durante o
trabalho com germes transmissíveis pelo ar, utilizar uma máscara; (e) não fumar, beber ou comer no
laboratório; (f) não roer unhas, esfregar os olhos; (g) usar somente panos estéreis para a limpeza; (h)
não introduzir livros ou revistas no setor contaminado.
2.5. No caso de acidentes. Um dos acidentes mais perigosos devido a grande produção de aerossóis,
é a quebra de tubos durante a centrifugação. No entanto, a que ocorre mais frequentemente é a queda
e quebra de tubos, frascos, pipetas ou recipientes contendo microrganismos patogênicos. Nestes
casos deve-se proceder da seguinte forma: despejar sobre o tubo quebrado e seus arredores, solução

26
de fenol 5-10%. Cobrir a área com papel toalha ou jornal e recobrí-la novamente com fenol. Se o tubo
cair no piso, o pessoal deve abandonar o laboratório por 30 minutos. Quando o tubo quebra-se dentro
da centrífuga, esta não deve ser aberta até que se completem 30 minutos, tempo necessário para que
os aerossóis sedimentem. Recolher os cacos de vidro com uma pinça e desinfetar a centrífuga. No
caso de ocorrer a contaminação da bancada de trabalho quando das manipulações assépticas,
proceder a imediata desinfecção. Na ocorrência da ingestão e/ou contaminação da cavidade oral com
líquidos contendo micróbios patogênicos, lavar a boca abundantemente com água e sabão, fazer um
gargarejo com uma solução anti-séptica, conforme a gravidade procurar a orientação e o tratamento
médico.

3. CAUSAS DE ACIDENTE DE TRABALHO

As causas dos acidentes de trabalho em geral podem ocorrer devido aos atos inseguros e/ou
condições inseguras. O ato inseguro é a maneira pela qual as pessoas se expõem a riscos de
acidentes. Quanto às causas freqüentes de atos inseguros podemos citar: (a) desconhecimento dos
riscos de acidentes; (b) treinamento inadequado dos trabalhadores; (c) falta de interesse ou aptidão
para o trabalho; (d) excesso de confiança em si mesmo. Atitudes impróprias, tais como: (a) violência,
revolta, etc.; (b) incapacidade física para o trabalho, são aquelas que põem em riscos a integridade
física e/ou a saúde dos trabalhadores ou a própria segurança das instalações.

4. SEGURANÇA NO TRABALHO

É o conjunto de medidas técnicas, administrativas, educacionais, médicas, psicológicas que

são empregadas para prevenir acidentes, quer eliminando condições inseguras do ambiente, quer
instruindo ou convencendo pessoas na implantação de práticas preventivas. Sob o aspecto técnico, os
acidentes, são todas as ocorrências não programadas, estranhas ao andamento normal do trabalho,
das quais poderão resultar danos físicos e/ou funcionais, e danos materiais e econômicos à empresa.
A prevenção de acidentes é o ato de se por em prática as regras e medidas de segurança a fim de se
evitar a ocorrência do acidente.

27
 ATIVIDADE PRÁTICA

1. Desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%. Lavagem das mãos.

2. Manipulação de placas de Petri: treinar repetidas vezes a técnica de abrir e fechar uma placa de
Petri 100 x 15mm, utilizando-se de apenas uma das mãos, conforme demonstração do instrutor.

3. Manipulação de pipetas (tipo Mohr): a partir de um Becker contendo água destilada, transferir com o
auxílio de uma pipeta de 5 mL, um volume de 5mL para um tubo de ensaio 13 x 100mm (tubo n.º 01). A
partir do tubo n.º 1, passar com o auxílio de uma pipeta de 2mL, volumes de 1mL sucessivamente para
os tubos n.º 02, 03, 04 e 05. Retornar manualmente ao volume inicial do tubo n.º 01 e deste ao Becker

28
4. Manipulações assépticas:

4.1. A partir de um Erlenmeyer, contendo aproximadamente 50 mL de água destilada previamente

esterilizada em autoclave (121ºC por 15 minutos) transferir com o auxílio de uma pipeta de 5mL uma
alíquota de 5,0mL para um tubo de ensaio 13 x 100mm (tubo n.º 01). A partir do tubo n.º 01, passar
com o auxilio de uma pipeta de 1mL, volumes de 1,0mL sucessivamente para os tubos n.º 02, 03, 04 e
05. Retornar manualmente ao volume inicial do primeiro tubo e deste ao Erlenmeyer.

4.2 Se necessário novamente a partir do Erlenmeyer, transferir com o auxílio de uma pipeta de 10mL,
um volume de 10 mL para um tubo de ensaio 18 x 180mm (tubo n.º01). A partir do tubo n.º 01, com
auxílio de uma pipeta de 2mL passar volumes de 2,0mL sucessivamente para os tubos n.º 02, 03, 04 e
05. Retornar manualmente ao volume do tubo n.º 01 e deste ao Erlenmeyer.

4.3. Enumerar 5 tubos de ensaio 13 x 100mm, previamente esterilizados, com os números de 1 a 5.

Identificar com o nome do operador, número de turma e data. A partir de um tudo de ensaio 16 x
150mm (Tubo A) contendo 10mL de caldo nutritivo previamente esterilizado, transferir assepticamente
com o auxílio de uma pipeta de 1mL volumes de 1,0mL, respectivamente para os tubos n.º 1, 2, 3, 4 e
5. Incubar o material (tubos n.º 1, 2, 3, 4 e 5 e o tubo A) na estufa a 35ºC. Realizar a leitura após 48-72
horas de incubação e registrar os resultados no quadro abaixo.

5. Desinfecção da bancada de trabalho com álcool a 70%. Antissepsia e lavagem das mãos.

29
 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGA
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA
RELATÓRIO DA ____. AULA PRÁTICA

Aluno(a):_______________________________________________ Turma:____ Curso:________

Data do experimento:_________________ Data da leitura:_________________

QUADRO DE REGISTRO DE RESULTADOS

TUBOS TURBIDEZ NÃO TURBIDEZ

N.º 01

N.º 02

N.º 03

N.º 04

N.º 05

TUBO A

Interpretação dos resultados:

30
7 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE MEIOS DE
CULTURA.
TÉCNICA DE PREPARO E DISTRIBUIÇÃO
ASSÉPTICA DE ÁGAR SIMPLES, ÁGAR SANGUE E
ÁGAR CHOCOLATE
1. INTRODUÇÃO

Uma população microbiana em crescimento ativo em um meio nutritivo, constitui uma cultura.
Nos meios naturais os microrganismos raramente estão isolados, as espécies estão em geral
misturadas e se desenvolvem conjuntamente se as condições são favoráveis. A cultura de uma única
espécie é chamada “cultura pura”. Todos os trabalhos de laboratório são baseados em culturas puras,
que são as únicas que permitem estudos precisos da morfologia e fisiologia microbiana. Os meios de
cultura comumente utilizados em bacteriologia têm por base o infuso de carne, o qual contém proteínas
solúveis, carboidratos, sais e quando enriquecidos pela adição de peptonas e cloreto de sódio, constitui
o que se denomina “Caldo Simples” (líquido) que pela adição de ágar-ágar (gelose) é chamado de
“Ágar Simples” (sólido). O desenvolvimento de microrganismos em um meio de cultura está relacionado
a fatores muito importantes como: (1) disponibilidade de nutrientes apropriados, (2) necessidade ou
não de oxigenação (aeração); (3) necessidade de um certo grau de umidade; (4) manutenção de pH
apropriado; (5) incubação a temperatura adequada; (6) o meio de cultivo deve estar estéril para o uso;
(7) utilização de técnicas assépticas para evitar a contaminação do meio quando da semeadura, leitura,
etc...

2. MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura, por definição, destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos, e

podem de uma maneira geral, serem classificados de acordo com as seguintes características e/ou
aplicações:
2.1. Consistência. Relacionada usualmente com o estado físico, considerando-se o teor de ágar-ágar.
•Líquidos. Não contém ágar-ágar. Ex. caldo simples, leite desnatado, caldo tripticase-soja, etc.
•Fluídos. A porcentagem de ágar é inferior a 0,1%. Ex. Meio de Tioglicolato.
•Semi-sólidos. Participação de 0,3-0,5% de ágar. Ex. Meio de SIM, Cary & Blair, etc.

31
•Solidificados. São meios de cultura que apesar de sólidos podem ser liquefeitos. Usualmente
contém 1,5 a 2% de ágar-ágar. Ex. Ágar-simples, ágar-sangue, etc.
•Sólidos. Aqueles que embora não contenham ágar, apresentam-se naturalmente no estado sólido.
Ex. Fatias de batatas, usadas ocasionalmente para o cultivo especial de bactérias.

2.2. Procedência. Considerando-se a origem do meio de cultivo.

•Naturais. Aqueles que não sofrem alteração na sua composição. Ex. batata, cenoura, leite, suco de
laranja, etc...
•Artificiais. São preparados pela mistura de diversas substâncias. Ex. ágar simples, ágar chocolate,
ágar Mueller-Hinton, etc...

2.3. Composição. De acordo com os componentes da fórmula do meio de cultura.

•Simples. São destinados ao cultivo de germes pouco exigentes ou servem de base para outros meios
de cultura. Ex. soluções aquosas de sais minerais, água peptonada, caldo simples, etc...
•Enriquecidos. Meios de composição simples adicionados de substâncias que melhoram o seu valor
nutritivo. Ex. ágar sangue, ágar chocolate, Thayer-Martin, etc..
•Complexos. Aqueles em que não se conhece a composição exata dos seus ingredientes. Ex. ágar
sangue, ágar extrato de levedura, Loewenstein-Jensen, etc...

2.4. Finalidades. Referentes as suas aplicações no trabalho microbiológico.

•Conservadores e/ou de transporte. São meios utilizados no caso de não ser possível realizar a
cultura logo após a coleta de um determinado material biológico e possuem a finalidade de manter
mais ou menos estável a população microbiana presente neste material. Ex. Salina-Glicerinada
(Teague-Clurman), Stuart, etc...
•Enriquecimento. São meios usualmente líquidos, adicionados de determinados substâncias que
inibem o crescimento de certas linhagens ou favorecem o crescimento de outras. Na cultura
prevalecerá então o germe que se deseja isolar. Ex. Caldo Selenito (Leifson), Caldo Tetrationato
(Mueller), Etc...
•Seletivos. São meios sólidos que também contém substâncias inibidoras para determinados grupos
microbianos com finalidade de permitir a dominância absoluta e o crescimento muito mais rápido do
germe que se deseja isolar. A intensidade desta seletividade pode ser variável, como acontece com
alguns meios empregados para o isolamento de enterobactérias: (a) baixa impediência – ágar
MacConkey, ágar eosina azul de metileno, ágar desoxicolato; (b) média impediência – ágar Salmonela-
Shigela, ágar desoxicolato, citrato, ágar Hektoen, ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD); (c) Alta
impediência – ágar sulfito de bismuto, ágar verde brilhante, etc...
•Diferenciais: São meios que evidenciam determinadas propriedades úteis à identificação de
diferentes espécies microbianas. Ex. ágar sangue que permite a verificação da produção de hemólise.

32
•Seletivo – diferenciais. Aqueles que combinam seletividade e diferenciação. Ex. Ágar Eosina Azul
de Metileno (Teague) seletivo para bacilos Gram negativos (enterobactérias) e diferencia os germes
lactose positivos (colônias escuras) dos germes lactose negativos (colônias claras); Ágar Manitol
Salgado, seletivo para estafilococos devido o alto teor de sal, diferenciando o S. aureus (colônia
amarela) do S. epidermidis (colônias brancas), através da fermentação do manitol.
•Dosagem: Meios de composição definida (sintéticos) empregados para a dosagem de vitaminas,
aminoácidos e antibióticos. Existem também meios especiais para avaliação de desinfetantes. Ex.
Antibiótico ágar n.º 1, 2, 3, 5 e 11. (Grove & Randall medium n.º 1, 2, 3, 5 e 11).
•Contagem. Tipos específicos de meios de cultura destinados a contagem microbiana cuja
composição deve obedecer a recomendações padronizadas. Ex. Plate Count Agar (ágar triptona,
glicose, extrato de levedura) usado para se estimar a densidade bacteriana em amostras de água.
•Identificação. Existe uma grande variedade de meios rotineiramente utilizados em microbiologia para
a identificação bioquímica de microrganismos. Ex. A prova da: ureia (Christensen), citrato (Simmons).
indol, fermentação da glicose, etc.
•Estoque. São meios especiais destinados a manutenção adequada da viabilidade e das
características fisiológicas de um determinado microrganismo, mantido no laboratório por certos
períodos de tempo. Ex. caldo nutriente, ágar nutriente semi-sólido, ágar nutriente, etc.

3. COMPONENTES DE MEIOS DE CULTURA

3.1. Ágar-ágar. O ágar-ágar é um polissacarídeo ácido obtido a partir de algas marinhas

(Rhodophyceae), que por hidrólise fornece D-galactose e pequena quantidade de L-lactose e ácido
sulfúrico. O ágar-ágar é utilizado como agente solidificante dos meios de cultura, não sendo
considerado como fonte nutritiva para os microrganismos. O ágar se constitui num dos melhores
agentes solidificantes devido as seguintes propriedades: (1) em soluções aquosas na concentração de
1-2% se liquefaz somente a 95ºC, mas permanece líquido até 45-48ºC. O meio de cultura autoclavado
e resfriado a 45ºC, poderá então, ser semeado sem o risco de inativar os microrganismos; ou ainda
poderá ser enriquecido pela adição de proteínas coaguláveis, (sangue, soro, etc.), vitaminas ou fatores
de crescimento termolábeis. Depois de solidificado, o meio contendo ágar, adquire uma consistência
firme e pode ser incubado a 35-37ºC, sem perder a consistência; (2) resistem a autoclavação a 121ºC
(exceto em pH menor que 4 e maior que 9); (3) é destituído de toxicidade para os microrganismos; (4)
praticamente não é atacado (hidrolisado) por microrganismos; (5) na concentração de1,5-2% confere
um certo grau de umidade a superfície do meio de cultivo permitindo no entanto, a obtenção de
colônias isoladas; (6) a estrutura do gel quando na concentração de 1-2%, impede a mobilidade
bacteriana, porém favorece a difusão de nutrientes. Existem muitos tipos de ágar disponíveis no
comércio, cabendo ao microbiologista selecioná-los de acordo com as suas necessidades.
3.2. Extratos. Os extratos são concentrados aquosos desidratados, obtidos a partir de carne (livre de
tendões e graxas), de leveduras ou de malte. Os extratos de carne e de levedura geralmente estão
isentos de carboidratos fermentáveis, ao contrário do extrato de malte que possui elevado teor
sobretudo de maltose, sendo particularmente indicado para a preparação de meios de cultivo para
leveduras e fungos. O valor nutritivo dos extratos é devido as substâncias solúveis obtidas a partir da

33
matéria prima tais como: carboidratos, compostos orgânicos de nitrogênio, vitaminas hidrossolúveis e
sais.
3.3. Peptonas. Sob a denominação de peptonas estão compreendidas as substâncias de origem
protéica que a partir do estado coloidal das proteínas nativas, foram transformadas em fragmentos
hidrossolúveis e não coaguláveis. Em microbiologia chamamos geralmente “peptonas” quanto são
obtidas por via enzimática e “hidrolisado”, quando por via inorgânica. As peptonas constituem uma
mistura de peptídeos que, segundo a proteína de origem e a enzima utilizada, apresentam determinada
composição. Os hidrolisados consistem uma mistura mais ou menos irregular de diversos peptídios e
aminoácidos livres. As peptonas e os hidrolisados apresentam as substâncias basais mais importantes
para a preparação dos meios de cultura para os microrganismos. Como exemplos de peptonas
podemos citar: peptonas de carne obtida por digestão péptica, peptona de caseína obtida por digestão
tríptica (alto conteúdo de triptofano), peptona de farinha de soja obtida por digestão papaínica, etc.
Como exemplos de hidrolisados: caseína hidrolisada, hidrolisado de caseína isentos de vitaminas e etc.
As peptonas mistas são misturas de peptonas e que apresentam uma elevada qualidade nutritiva, com
alta proporção de peptídeos de baixo peso molecular, aminoácidos livres e fatores de crescimento. São
adequados para multiplicação de microrganismos exigentes como por exemplo: proteose-peptona,
triptose, etc. Podemos resumir o valor nutritivo das peptonas em geral, como sendo a principal fonte de
nitrogênio orgânico, podendo conter algumas vitaminas e as vezes carboidratos, dependendo do tipo
de material protéico digerido.

4. Meios de cultura desidratados

Os meios de cultivo desidratados apresentam-se no mercado sob a forma de pó ou de

granulados. Os meios de cultura desidratados em forma de pó, são fabricados principalmente pela
trituração e a mistura de seus componentes; os granulados, sofrem um processo adicional de
granulação. Os meios de cultivo desidratados apresentam um baixo conteúdo microbiano e em geral
estão livres de microrganismos termo-resistentes. São mais ou menos higroscópicos. Por este motivo,
os frascos que os contém são hermeticamente fechados com tampa de rosca e somente devem ser
abertos em ambientes secos. A introdução de água proveniente do ambiente, ou a liberação de água
no seu interior motivada por grandes oscilações de temperatura, dão lugar ao desenvolvimento dos
germes no material o que leva a um consumo de substâncias nutritivas, variações do pH e alteração da
cor e do balanceamento da sua fórmula de composição. Também a ação intensa da luz, altera as
substâncias componentes dos meios de cultura desidratados. Desta forma, estes meios devem ser
conservados em ambientes secos e frescos (porém nunca a temperaturas inferiores a 10ºC), e
protegidos contra a luz. A conservação destes meios é limitada inclusive sob condições ótimas de
conservação, e naturalmente dependem da sua com posição. De uma forma geral, eles resistem bem a
um período de armazenamento durante 2-3 anos. Quando o meio se apresentar muito alterado
externamente como no caso de “empedramento”, mudança no estado físico, devem ser considerados
deteriorados, e serem descartados (fora de uso). Os meios de cultura desidratados apresentam
algumas vantagens como por exemplo: uma estabilidade elevada; são de utilização simples e preparo
rápido; podem ser preparados pouco tempo antes da sua utilização; um volume mínimo de meio
desidratado fornece uma quantidade razoável de meio pronto; exigem um espaço mínimo para fins de
armazenamento; apresentam grande economia em relação aos meios comprados prontos para uso. A
técnica empregada para reidratar os meios secos tem decisiva importância na obtenção de um meio de
boa qualidade. De uma maneira geral convém dissolver a quantidade de pó necessária, apenas em

34
uma parte do volume total de água destilada. Homogeneizar evitando a formação de bolhas e espuma.
Adicionar então o restante da água destilada, lavando as paredes do frasco. No caso do meio conter
ágar-ágar é indispensável deixar em repouso a temperatura ambiente por 10-15 minutos com a
finalidade de “encharcar” o ágar. Dissolver o meio por aquecimento em Banho-Maria, agitar
frequentemente evitando porém a ebulição do meio de cultura. Evitar ao máximo um superaquecimento
inútil. O meio se apresenta completamente dissolvido, quando as partículas de ágar não mais aderirem
às paredes do recipiente, observando-se neste caso, a formação de água de condensação no pescoço
no balão de fundo chato, o que em microbiologia é conhecido como “fazer o ágar chorar”. Testar o pH,
se necessário, ajustá-lo ao valor recomendado pelo fabricante. Os meios assim preparados não
necessitam de filtração. A seguir, acondicionar o frasco (bucha de algodão + invólucro de papel) e
autoclavar segundo as recomendações do fabricante. Certos meios podem ser utilizados sem que seja
necessário sua esterilização na autoclave, mesmo porque, alguns não suportam a autoclavagem. Após
a esterilização, resfriar a 45-50ºC e dispensar assepticamente em placas de Petri ou tubos de ensaio,
de maneira a evitar a formação de água de condensação. Os meios gelosados dispensados em placas
de Petri devem ser preferencialmente utilizados no mesmo dia de sua preparação. Pode-se conservá-
los todavia, durante alguns dias no refrigerador, sendo necessário, a sua prévia ambientação à
temperatura do laboratório, antes do seu uso. A esterilidade deve ser cuidadosamente controlada antes
da utilização dos meios de cultura desidratados.
NOTA: para a realização da rotina bacteriológica no laboratório de análises clínicas, é necessário
dispor de alguns componentes básicos para a preparação dos meios de cultura, como: ágar, extratos,
peptonas, sais; assim como alguns meios desidratados indicados para o isolamento, cultivo,
identificação e manutenção das principais bactérias de interesse em patologia humana.

35
 ATIVIDADE PRÁTICA

1. Desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%. Lavagem das mãos.

2. Preparo de caldo simples e ágar simples (trabalho em equipe)

2.1. Caldo simples (Equipe n.º 01)

Fórmula: Extrato de carne......................5,0g
Peptona.................................10,0g
Cloreto de sódio......................5,0g
Água destilada.......................1000mL
Preparo: adequar a fórmula de preparação do meio de cultura, a fim de obter 3 tubos de caldo simples
por aluno. Pesar os ingredientes do meio. Dissolver em água destilada fria. Aquecer em placa
aquecedora com agitação magnética porém, evitar a formação de bolhas e/ou espuma. Tomar cuidado
para que o meio de cultivo não entre em ebulição. Distribuir volumes de 3,0mL com o auxílio de um
funil ou pipeta, para tubos de ensaio 13x100mm. Acondicionar e esterilizar na autoclave durante 15
minutos a 121ºC. Fazer o controle de esterilidade (estufa 35ºC, 24-48h). Manter os meios de cultura em
refrigerador a 4ºC.

2.2. Ágar simples inclinado (Equipe n.º 02)

Fórmula: Extrato de carne......................5,0g

Peptona.................................10,0g
Cloreto de sódio......................5,0g
Ágar-ágar..............................20,0g
Água destilada...................1000mL
Preparo: adequar a fórmula de preparação do meio de cultura de modo a obter 3 tubos contendo ágar
simples inclinado por aluno. Pesar os ingredientes do meio. Acrescentar a água destilada fria e deixar
em repouso por 15 minutos a temperatura ambiente. Aquecer em placa aquecedora com agitação
magnética porém, evitando a formação de bolhas e/ou espuma, até a completa dissolução do meio de
cultivo. Tomar cuidado para que o meio de cultura não entre em ebulição. Com o auxílio de um funil ou
pipeta, distribuir volumes de 3,0-3,5mL para tubos de ensaio 13x100mm. Acondicionar e esterilizar na
autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Retirar da autoclave, inclinar os tubos adequadamente e deixar
solidificar a temperatura ambiente. Fazer o controle de esterilidade (estufa 35ºC por 24-48h). Manter os
meios de cultura em refrigerador a 4ºC.

36
2.3. Ágar simples em placas (Equipe n.º 03)
Fórmula: descrita no item 2.2.

Preparo: adequar a fórmula do meio de cultura a fim de obter um volume suficiente para 09 placas de
Petri 100x15mm. Proceder a pesagem e a dissolução do meio conforme descrito no item 2.2. Distribuir
volumes de aproximadamente 15mL para 09 tubos de ensaio 18x180mm. Utilizar para esta operação o
auxílio de um funil (operação rápida devido a solidificação do meio de cultura). Acondicionar e
esterilizar na autoclave por 15 minutos a 121ºC.

3. Técnica de preparo e distribuição asséptica do ágar simples, ágar sangue e do ágar chocolate
em placas de Petri (Equipes nº. 1, 2 e 3).

3.1. Conservação dos meios liquefeitos. Retirar da autoclave os 09 tubos de ágar simples (item 2.3).
Colocar 06 destes tubos em banho-maria a 56ºC e os 03 restantes em um outro banho-maria a 80ºC
3.2. Preparação da bancada de trabalho. Desinfetar o local de trabalho com álcool 70% e acender o
bico de Bunsen. Cuidadosamente, retirar os invólucros de papel das placas de Petri que serão
utilizadas e dispô-las empilhadas nas proximidades da chama do bico de gás (03 placas por equipes).
3.3. Plaqueamento do ágar simples. Retirar um tubo do banho-maria a 56ºC. Enxugá-lo
externamente. Deixar resfriar a temperatura de aproximadamente 45ºC. Vazá-lo assepticamente para a
placa de Petri (15mL = volume para 01 placa 100x15mm)

3.4. Preparo e plaqueamento do ágar sangue. Retirar um tubo do banho-maria a 56ºC. Enxugá-lo
externamente. Deixar resfriar a temperatura de 45-50ºC. Adicionar assepticamente 0,75 a 1,5mL de
sangue*. Homogeneizar evitando a formação de bolhas e/ou espuma e vazá-lo assepticamente para a
placa de Petri.

37
3.4. Plaqueamento do ágar sangue. Retirar um tubo do banho-maria a 56ºC. Enxugá-lo
externamente. Deixar resfriar a temperatura de aproximadamente 45-50ºC. Adicionar assepticamente
0,75 a 1,5mL de sangue*. Homogeneizar evitando a formação de bolhas e/ou espuma e vazá-lo
assepticamente para a placa de Petri.

3.5. Preparo e distribuição do ágar chocolate. Retirar um tubo do banho-maria a 80ºC. Enxugá-lo
externamente e adicionar 0,75 a 1,5mL de sangue. Homogeneizar evitando a formação de bolhas e/ou
espuma. Levar ao banho-maria a 80ºC e aquecê-lo durante 2 minutos, agitando cuidadosamente.
Retirar do banho-maria. Enxugá-lo externamente. Deixar resfriar até aproximadamente a temperatura
de 45ºC. Vazá-lo assepticamente para a placa de Petri.

Nota 1: Uma outra forma para a distribuição dos meios de cultura em placas, consiste em: preparar
volumes de 100-500mL em balões de fundo chato. Acondicionar e esterilizar na autoclave por 15
minutos a 121ºC. Retirar da autoclave e resfriar em banho Maria (45-50ºC) e vazar assepticamente
para as placas de Petri, previamente esterilizadas. Deixar solidificar a temperatura ambiente nas
proximidades da chama de um bico de Bunsen (30-60 minutos). Levar a estufa a 35ºC durante 24-48
horas a fim de realizar o controle de esterilidade (placas invertidas). Conservar em refrigerador a 4ºC.

38
No caso da utilização dos meios de cultura guardados no refrigerador, repetir a prova de controle de
esterilidade com incubação no mínimo de 24 horas na estufa a 35ºC. Durante esta incubação ocorre
também a eliminação da água de condensação usualmente formada sobre a superfície dos meios de
cultura quando mantidos em temperaturas frias.

Nota 2: No caso de ocorrer a formação de bolhas após o vazamento dos meios para as placas, colocá-
las em contato direto (placa – entreaberta) com a chama de gás que elas desaparecerão. Esta
operação só pode ser realizada quando o meio ainda se encontrar liquefeito.

* Sangue contendo anticoagulante ou sangue desfibrinado.

Anotações

__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

39
8 TÉCNICAS DE SEMEADURA DE BACTÉRIAS
EM MEIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS E
SÓLIDOS.
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS EM CULTURA PURA

1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE CULTURA PURA:

A grande maioria dos trabalhos práticos no laboratório de microbiologia é realizada a partir de

culturas puras, isto é, populações microbianas provenientes de uma única célula. Cabe ao
bacteriologista então, usar técnicas adequadas a fim de isolar um determinado microrganismo em
cultura pura a partir de materiais que contém uma flora mista de microrganismos, como por exemplo:
os alimentos, água, espécimes biológicos etc., considerando-se naturalmente a especialidade da rotina
mantida pelo laboratório. Dentre as técnicas empregadas para este propósito, encontramos:

- Ágar liquefeito - Pour Plate

DILUIÇÃO

- Ágar solidificado - Superfície

ESTRIAS EM SUPERFÍCIE - Contínuo - Tubos e Placas

(ESGOTAMENTO)

- Descontínuo - Placas

MICROMANIPULADOR - Estudos Especiais

Quando uma célula bacteriana isolada se reproduz dentro de um meio sólido ou à sua
superfície, sua progênie vai se acumulando na forma de uma massa de células conhecida como
colônia, visível macroscopicamente. Inicialmente o crescimento de uma colônia é exponencial em
relação ao tempo. Após algumas divisões, entretanto, a ordem de crescimento se torna muito complexa

40
devido à grande proximidade das células acumuladas. Esta proximidade cria uma situação que pode
ser chamada “Aglomeração Fisiológica”, na qual as células individuais competem entre si pelos
nutrientes disponíveis e afetam-se mutuamente pelo acúmulo localizado de produtos residuais.

Como os nutrientes precisam se difundir no meio circundante para as células, enquanto os

produtos residuais do metabolismo devem se difundir das células para o ambiente; os membros
individuais das colônias ficam sujeitas a uma variedade de condições ambientes, segundo sua
localização dentro da colônia. O crescimento das colônias bacterianas é afetado, não só pelas
interações celulares dentro de cada colônia, mas também por interações entre colônias vizinhas. Se as
colônias estiverem muito próximas, elas interferem com o crescimento umas das outras pela depleção
no meio, de nutrientes necessários, ou pela excreção de produtos residuais tóxicos. O fenômeno é
regularmente observado em “Placas Semeadas por Estrias”, utilizadas para o isolamento de bactérias.
Em tais placas, as colônias que estão muito juntas são pequenas, enquanto as que estão bem isoladas
atingem tamanhos maiores.

2. MANUTENÇÃO E ESTOQUE DE CULTURAS PURAS

Após a obtenção das culturas puras, faz-se necessário em alguns casos, o seu estoque em
laboratório, para estudos posteriores. É essencial que o método de conservação e manutenção
preserve todas as características da espécie, tais como a forma evidenciada no momento do seu
isolamento. No Laboratório, dispõe-se das seguintes técnicas para a estocagem de culturas puras:

2.1. Transferência periódica para meios de cultura novos;

2.2. Conservação das culturas sob camada de óleo mineral;

2.3. Conservação por dessecação rápida e congelamento (Liofilização);

2.4. Estocagem em temperaturas muito baixas. Ex.: nitrogênio líquido a -196 ºC.

Existem organizações cuja principal função é a de manter em estoque culturas puras autênticas de
amostras tipos (padrões internacionais) de bactérias, fungos, algas e protozoários, assim como
também, de células animais. Como exemplos destas instituições podemos citar:
1. American Type Culture Collection (ATCC) em RockVille - Maryland;

2. Instituto Pasteur de Paris;

3. National Collection of Type Culture (NCTC) em Londres;

4. Japanese Type Culture Collection em Nagao - Tóquio, entre outros.

Estas culturas puras de amostras padrões são solicitadas à estas instituições, sendo utilizadas em
trabalhos de pesquisa, de controle de qualidade da rotina microbiológica, etc.. Usualmente estas
amostras são remetidas em ampolas (liofilizadas), mediante a compra e/ou doação.

41
 ATIVIDADE PRÁTICA

1. Desinfecção da bancada com álcool 70%. Lavagem das mãos.

2. Semeadura de bactérias em meios líquidos e sólidos
2.1. Semeadura em meios líquidos: Identificar os tubos contendo caldo simples numerando-os de 1 a
3. Com o auxílio de uma pipeta de 1,0mL, previamente esterilizada, transferir 0,1mL de um cultivo de
microrganismos em meio líquido (amostra em tubo), para o caldo simples (tubo n.º 1). Com a alça de
semeadura bacteriológica, passar “uma alçada” da amostra em tubo, para o caldo simples (tubo n.º 2).
Utilizando-se de uma agulha de semeadura bacteriológica “PESCAR” uma colônia de um cultivo
bacteriano em meio sólido (amostra em placa) e semear por dispersão em caldo simples (tubo n.º 3).

2.2. Semeadura em meio sólido (ágar inclinado): Identificar o tubo contendo ágar simples inclinado
com o número 4. A partir de um cultivo microbiano em meio sólido (amostra em placa) “pescar” uma
colônia com o auxílio de uma agulha de semeadura bacteriológica e semear por estrias a superfície do
ágar simples inclinado (tubo n.º4).

2.3. Isolamento por esgotamento (placas): Identificar as três placas de ágar simples com os números
5, 6 e 7. A partir de um cultivo microbiano em meio líquido (amostra em tubo), com o auxílio de uma
alça de semeadura bacteriológica, “esgotar por estrias contínuas” as placas de n.º 5 e 6 e; por “estrias
descontínuas”, a placa n.º 7.

42


3. Leitura e interpretação: Incubar as culturas na estufa a 35-37ºC por 24-48 horas. Realizar a leitura
e a interpretação dos resultados de acordo com os critérios descritos abaixo:

CRITÉRIOS PARA A AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA DO CRESCIMENTO BACTERIANO EM MEIOS DE

CULTURA:
Crescimento em meios líquidos
FORTE: Acentuada turvação com formação de depósito e/ou película superficial.
MODERADO: Turvação regular.
ESCASSO: Leve turvação.
MUITO ESCASSO: Turvação quase imperceptível.
Crescimento em meios sólidos (estrias descontínuas)
FORTE: Mais de 10 colônias na estria final (4ª estria).
MODERADO: 0 a 5 colônias na estria final (4ª estria).
ESCASSO: 0 a 5 colônias na segunda estria.
MUITO ESCASSO: 1 a 5 colônias na primeira estria.
Crescimento em meios sólidos (ágar inclinado)
FORTE: Estria apresentando crescimento abundante.
MODERADO: Estria apresentando um contorno definido.
ESCASSO: Estria apresentando falhas em alguns pontos, podendo até apresentar colônias
isoladas.
NULO: Ausência de crescimento.

43
 RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA

TÉCNICAS DE SEMEADURA

Aluno(a):_______________________________________Turma:_____Curso:_______

Após 24 a 48 horas de incubação na estufa a 35ºC avaliar macroscopicamente o crescimento

bacteriano nos tubos e placas das amostras semeadas na aula prática. Utilizar os critérios da Apostila
de Aulas Práticas (página 58) para responder os ítens 1 e 3.

1. TUBOS:

TUBOS CRESCIMENTO
1 (caldo simples)

2 (caldo simples)

3 (caldo simples)

4 (ágar simples inclinado)

2. PLACAS 5 e 6 (ESTRIAS CONTÍNUAS):

CRESCIMENTO PLACA 5 PLACA 6

Obtenção de crescimento bacteriano? Sim ( ) Não ( ) Sim ( ) Não ( )

Obtenção de colônias isoladas? Sim ( ) Não ( ) Sim ( ) Não ( )

Número de colônias isoladas ________ colônias ________ colônias

3. PLACA 7 (ESTRIAS DESCONTÍNUAS):

PLACA CRESCIMENTO

4. Observações:

__________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________

44
9
REVISÃO EM TÉCNICA DE MICROSCOPIA
ÓTICA COMUM DE CAMPO CLARO
PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS A FRESCO
Há muitos instrumentos que o microbiologista deve ser capaz de usar com facilidade, para a
manipulação apropriada das amostras e identificação das amostras cultivadas. O domínio
destes instrumentos requer muita prática, necessitando de uma boa técnica que garanta a
obtenção dos resultados satisfatórios.

Fonte:http://biocelunb.blogspot.com/2011/05/visualizacao-de-celulas-ao-microscopio.htmL

45
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O MICROSCÓPIO

Um microscópio simples nada mais é do que uma lente biconvexa, porém o microscópio
composto, emprega dois sistemas de lentes separadas, conseguindo desta forma, maiores aumentos.
Pelo fato do microscópio composto se constituir num instrumento fundamental ao estudo da
microbiologia, os conhecimentos dos princípios básicos da microscopia assim como a perícia no seu
emprego e manipulação, são requisitos imprescindíveis para qualquer estudo desta ciência. Existem
muitos tipos de microscópio composto de acordo com a sua construção e o seu manejo, porém todos
se baseiam nos mesmos princípios fundamentais. O microscópio, basicamente conta de um sistema
ótico (para aumentar) e um sistema de iluminação (para visualizar adequadamente o objeto). Para
compreender o funcionamento dos sistemas óticos e de iluminação, é necessário entender o
significado da ampliação, do poder de resolução e da iluminação, assim como, entender as relações
que existem entre eles.
1.1. Ampliação.
A ampliação em um microscópio composto se obtém mediante dois sistemas de lentes. O situado mais
próximo do objeto a ser examinado, é chamado de objetiva, que amplia e produz uma imagem real. A
ocular amplia esta imagem real, fornecendo uma imagem virtual que é vista pelo olho do operador. A
ampliação total é igual ao produto das ampliações produzidas pela ocular e pela objetiva. O sistema de
lentes da objetiva é uma combinação de lentes convexas e côncavas, de tipos distintos de vidros, que
corrigem as aberrações esféricas e cromáticas, inerentes as lentes convexas simples. Os microscópios,
para a maioria dos laboratórios de bacteriologia possuem 03 objetivas: objetiva a seco de poucos
aumentos (16mm), a objetiva a seco de muitos aumentos (4mm) e a objetiva de imersão (1,8mm). A
objetiva que se deseja utilizar, é colocada na sua posição, girando-se o revolver (porta objetivas). Os
números 16-4-1,8mm indicam a distância focal de cada objetiva. Quanto mais curta é a distância focal
das objetivas, é mais curta também a distância de trabalho. A lente da objetiva enfoca os raios de luz
procedentes da amostra, formando uma imagem real dentro do tubo do microscópio. A imagem real é
ampliada posteriormente pelo sistema de lentes da ocular, o qual está situado na extremidade do tubo
e é formado por duas lentes. A mais baixa, lente de campo, coloca a imagem real, no plano da lente
mais alta ou lente ocular, a qual atua como uma simples lente de ampliação, permitindo ao olho do
observador a imagem virtual do objeto a ser visualizado. Em termos de ampliação, considerando-se as
lentes acima descrito teremos um aumento de 100 diâmetros para uma objetiva de 16 milímetros com
uma ocular de x10, 440 diâmetros para uma objetiva de 4mm com uma ocular de x10, e finalmente um
aumento de 950 diâmetros quando do emprego da objetiva de 1,8 mm combinado a uma ocular de x10.
1.2. Poder de resolução.
Considerando-se que a ampliação total de um microscópio composto é produto da ampliação de dois
sistemas de lentes, poder-se-ia aumentar indefinidamente esta ampliação, empregando-se sistemas de
lentes adicionais. Isto porém não é possível devido a uma propriedade das lentes conhecida como
poder de resolução. O poder de resolução de uma lente é a sua capacidade de distinguir dois pontos
muito próximos. Esta propriedade é função do comprimento de onda da luz empregada e a uma
característica do sistema de lentes, conhecida como abertura numérica. Então, quanto mais curto for o
comprimento da onda da luz utilizada, melhor o poder de resolução. Em termos práticos porém, o
aumento do poder de resolução pela diminuição do comprimento de onda de luz utilizada tem valor

46
limitado. O maior aumento no poder de resolução é conseguido pelo aumento da abertura numérica. A
abertura numérica, é função do diâmetro real da objetiva em relação a sua distância focal e o poder de
desviar o raio luminoso, o índice de refração do meio que existe entre a amostra a ser examinada e a
objetiva. Os fatores óticos limitam as modificações que se podem praticar numa objetiva, visando
aumentar a sua abertura numérica. Pelo fato de que o índice de refração do ar é menor que o do vidro,
os raios luminosos se refratam ou desviam quando passam do porta objeto (lâmina) ao ar. Assim, a
maioria dos raios luminosos que atravessam o objeto se refratam num ângulo tão grande, que não são
captados pela objetiva. Interpondo entre o porta objetos e as lentes da objetiva o óleo de imersão que
tem aproximadamente o mesmo índice de refração do vidro, consegue-se diminuir muito o desvio, e
uma porcentagem maior de raios luminosos provenientes do objeto em exame passam diretamente a
objetiva, conseguindo-se desta forma uma maior resolução e uma imagem mais clara. A relação entre
o comprimento de onda da luz utilizada e a abertura numérica para determinar a resolução é válida
somente para raios paralelos. Quando a amostra é iluminada com raios paralelos e oblíquos, esta
relação passa a ser P.R. = comprimento de onda/2 x abertura numérica. O condensador situado abaixo
da platina proporciona tanto iluminação direta como oblíqua e assim melhora a resolução de um
microscópio de campo claro.
1.3. Iluminação.
Da mesma forma que a obscuridade ou o resplendor da luz solar direta pode impedir a visão, a
iluminação escassa pode obscurecer o campo de observação de um microscópio. Uma iluminação
adequada é essencial para aproveitar convenientemente os aumentos e a resolução do microscópio. A
fonte luminosa mais acessível é a luz solar comum, porém devido a sua variação, é utilizada mais
frequentemente as lâmpadas artificiais, geralmente de tungstênio. As fontes de iluminação mais
precisas, controlam a intensidade, a cor e o tamanho dos raios de luz. O tamanho do cone de luz que
atravessa o condensador e penetra no microscópio, difere segundo a finalidade desejada. Quando
aumenta a ampliação das lentes objetivas diminui a distância de trabalho e aumenta o ângulo de
abertura da objetiva. Por conseguinte, deve chegar na objetiva um cone de luz maior, quando sua
ampliação é grande. O tamanho do cone luminoso é controlado pelo uso do diafragma íris, situado
imediatamente abaixo do dispositivo do condensador. Quando se usam as objetivas a seco de poucos
ou muitos aumentos, que ampliam respectivamente 10 e 44 vezes, o diafragma íris é colocado
parcialmente aberto, em conseqüência de que a definição e os detalhes nestes aumentos são mais
claros quando a iluminação não é demasiadamente intensa. Quando, se emprega a objetiva de
imersão, que amplia 95 vezes, a distância de trabalho é menor, e se abre mais o diafragma de abertura
do condensador.
Nota: na microscopia de imersão, o condensador deve estar sempre na parte mais elevada do seu
suporte.

47
2. MICROSCOPIA A SECO: 10, 20 E 40 X OCULAR

2.1. Posição do microscópio e do operador: o instrumento deve estar sobre a mesa de trabalho em
posição normal, enquanto que o operador deve estar sentado em uma cadeira de altura conveniente a
manter o corpo ereto, de tal modo que para olhar pela ocular basta fazer um pequeno movimento de
corpo a frente e inclinar a cabeça.
2.2. Ligar o microscópio: ligar o sistema de iluminação, e escolher a objetiva de menor aumento que
pode ser identificada pela numeração existente no corpo da objetiva, indicando o seu aumento ou pelo
diâmetro maior da lente frontal voltada para o objeto.
2.3. Deslocar a platina (subir ) de tal modo que ela fique distante cerca de10mm da objetiva. Esta
operação visa prevenir acidente ao ser colocada a lâmina com o objeto na platina.
2.4. Colocar a lâmina com o objeto na platina: para isso, trazer a lâmina pela extremidade anterior da
platina, abrir os dispositivos de fixação da lâmina, deslizar esta sobre a platina proceder até os
encostos e depois prender a lâmina.
Obs.: para retirar a lâmina da platina proceder de modo inverso saindo a mesma pela frente da platina.
2.5. Transportar o objeto da lâmina até o centro da lente frontal do condensador ou eixo do
microscópio: movimentando os parafusos do "Chariot", dispor uma parte do objeto facilmente
perceptível pela sua opacidade, coloração ou forma, o que permitirá focalizar com maior comodidade.
2.6. Olhando lateralmente, com os olhos dispostos na altura do tubo canhão subir a platina com o
auxílio do botão de movimento macrométrico até que a objetiva fique o mais próximo possível do
objeto. Nestas circunstâncias temos certeza de que o foco anterior da objetiva estará necessariamente
abaixo do plano do objeto.
2.7. Olhando pela ocular verificar o sistema de iluminação: verificar se campo do microscópio está
uniformemente iluminado. Corrigir se necessário a intensidade luminosa, fechando quase
completamente o diafragma de abertura do condensador. Com esta operação se obtém uma maior
profundidade do campo de observação, e com isso torna-se mais fácil a focalização do objeto.
2.8. Observando pela ocular, deslocar a lâmina com o objeto e verificar se existe efetivamente parte do
objeto no eixo ótico do microscópio: ao ser movimentada a lâmina com o objeto, nota-se no campo da
ocular uma mancha desfocada ou coloração idêntica aquela do objeto. Manter a sombra, ou mancha
ou coloração no campo de observação, o que permite se saber com toda certeza de que existe
efetivamente no eixo ótico do microscópio uma parte do objeto que deverá necessariamente aparecer
ao ser feito a focalização.
2.9. Focalizar o objeto: olhando pela ocular, fazer descer a platina com o auxílio do botão de
movimento macrométrico até o aparecimento da imagem do objeto no campo de observação da ocular.
2.10. Examinar o objeto: deslocar a lâmina com o objeto com o auxílio do "Chariot". Retificar a
focalização do objeto com o auxílio do botão de movimento micrométrico. Os dois movimentos devem
ser efetuados simultaneamente, utilizando-se as duas mãos.
* Existem microscópios em que o tubo canhão é móvel.

48
3. MICROSCOPIA DE IMERSÃO: 100 X OCULAR

3.1. Proceder como descrito anteriormente com as seguintes modificações:

3.2. Escolher a objetiva de imersão: a objetiva de imersão do microscópio pode ser facilmente
identificada através dos seguintes detalhes: é uma objetiva que produz sempre grandes aumentos de
imagem do objeto, como 90x ou 100x; em geral apresenta no corpo da objetiva uma ou duas faixas ou
cintas estreitas de cor preta; apresenta no corpo da objetiva as abreviações "oel im" (imersão em óleo)
"HI" (Homogenous immersion); a lente frontal da objetiva, aquela voltada para o objeto possui um
diâmetro muito pequeno, com cerca de 2 mm, muito menor do que os das demais objetivas.
3.3. Sobrepor ao objeto uma gota de óleo de cedro: (nD = 1.515). Escolher de preferência a parte do
objeto (esfregaço) em que permita uma fácil percepção pela sua opacidade, coloração ou distribuição
do material.
3.4. Colocar a lâmina com o objeto na platina:
3.5. Olhando lateralmente: Com os olhos dispostos na altura do tubo canhão do microscópio, subir a
platina com o auxílio do botão de movimento macrométrico, até que a objetiva (lente frontal) entre em
contato com a gota de óleo de cedro disposta na lâmina porta objeto, e depois baixar a platina até uma
distância que ainda permita manter o contato da objetiva com o óleo de cedro. Nestas circunstâncias
temos plena certeza de que o foco anterior da objetiva necessariamente estará acima do plano do
objeto.
3.6. Focalizar o objeto: olhando pela ocular, fazer subir a platina com o auxílio do botão de movimento
macrométrico, até o aparecimento da imagem do objeto no campo de observação da ocular. Para
executar esta operação, de preferência utilizar as duas mãos e subir lentamente a platina.

4. CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO

Considerando-se que o microscópio composto é um aparelho de precisão e de preço

geralmente elevado, é conveniente assegurar-lhe um bom rendimento e uma larga duração por meio
de todas as classes de cuidados e atenções. Os maiores inimigos do microscópio é a poeira, a graxa, o
óleo de imersão e os golpes, que afetam tanto a parte mecânica como a parte ótica. Para se manter
limpo o microscópio e as lentes, observar sempre: (a) não tocar nunca nas lentes, se estas estiverem
sujas, limpá-las suavemente com papel absorvente; (b) nunca deixar a lâmina porta objeto na platina
do microscópio depois de sua visualização; (c) limpar sempre a objetiva de imersão depois de utilizá-la.
Se acidentalmente ocorrer o contato das outras objetivas com o óleo de cedro, limpá-las imediatamente
com papel absorvente. No caso de acontecer que o óleo de imersão seque na lente, pode-se limpar
com papel umedecido com xilol e logo imediatamente com papel seco. Um excesso de xilol pode
dissolver a cola que une as lentes; (d) manter sempre seca e limpa a platina do microscópio. Quando
se derrama algum líquido sobre ela, secar imediatamente. No caso do óleo de cedro, limpar com um
pano umedecido em xilol; (e) nunca inclinar o microscópio quando se trabalha com óleo de imersão,
este pode cair no sistema mecânico da platina onde é difícil a sua limpeza, ou pode pingar no
condensador e ali solidificar; (f) quando não se utilizar o microscópio este deve estar convenientemente
coberto com uma capa e guardado em sua caixa.

49
 Para evitar danificações ao instrumento, obedecer aos seguintes critérios:
(a) não forçá-lo nunca. Todas as conexões devem funcionar suave e facilmente. Se algo não
funcionar bem, chamar imediatamente o instrutor ou professor responsável;
(b) as lentes objetivas não devem nunca tocar a lâmina porta objeto;
(c) nunca subir a platina do microscópio com o auxílio do botão de movimento macrométrico
enquanto se está observando pela lente ocular;
(d) nunca intercambiar as objetivas ou as oculares de microscópios distintos e sob nenhuma
circunstância se deve separar as lentes frontais das objetivas (desmontar); (e) quando não se utiliza o
microscópio guardá-lo em sua caixa. Deixar com a objetiva de poucos aumentos no eixo ótico e
assegurar-se que a parte mecânica da platina, não sobressai ao bordo da mesa.

MICROSCOPIA À FRESCO: ENTRE LÂMINA E LAMÍNULA E EM GOTA PENDENTE.

A microscopia pode ser realizada com o objetivo de observar os microrganismos vivos pelo
exame a fresco, ou mortos em preparação microscópicas coradas. O exame microscópico de
preparações a fresco permite a observação e o estudo dos principais caracteres morfológicos dos
microrganismos tais como dimensões celulares, formas e arranjos, motilidade etc.. As preparações a
fresco preservam a forma natural dos organismos e reduzem as distorções que ocorrem quando as
preparações são secas e fixadas. Por outro lado, em vista da semitransparência das células, estas
preparações não permitem discernir claramente as estruturas internas das mesmas. As preparações a
fresco exigem o manuseio completo do microscópio de campo luminoso, sendo necessário que se
façam ajustes na intensidade de luz que ilumina os objetos a serem observados, bem como a
regulagem adequada do condensador. Duas técnicas de preparações microscópicas a fresco são
comumente empregadas em laboratórios de microbiologia: (a) exame de material entre lâmina e
lamínula; (b) exame de material em lâmina escavada (gota pendente).
5.1. Exame microscópico do material entre lâmina e lamínula
O exame do material entre lâmina e lamínula é feito colocando-se uma gota da suspensão de
microrganismos sobre uma lâmina limpa e desengordurada e em seguida recobrindo-se com uma
lamínula. Examinar ao microscópio ótico usando a objetiva de fraco aumento.
5.2. Exame microscópio do material em gota pendente
Para realizar uma preparação em gota pendente, usar uma lâmina especial escavada (lâmina
de Koch). Tomar uma gotícula da suspensão do microrganismos e depor no centro de uma lamínula.
Untar os bordos da escavação da lâmina de Koch com vaselina, e adaptar esta sobre a lamínula. Fazer
ligeira pressão para que ela fique aderente à vaselina de tal maneira que virando-se bruscamente a
lâmina, a gota da suspensão bacteriana fique pendente no centro da escavação, sem encostar no
fundo dela. Ao microscópio, focalizar primeiramente em fraco aumento, colocar o bordo da gota no
centro do campo microscópico e focalizar. A seguir passar aos aumentos mais fortes até a objetiva de
imersão. Desta maneira, os materiais clínicos podem ser examinados "in natura" ou diluídos em água
destilada esterilizada, quando espessos, ex. urina. Para as culturas em meios líquidos ou sólidos,
proceder de maneira semelhante.

50
 ATIVIDADE PRÁTICA

1. Desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%. Lavagem das mãos.

2. Exame do material entre a lâmina e lamínula: depositar no centro de uma lâmina limpa e
desengordurada, previamente identificada, uma gota de um cultivo de microrganismos em meio líquido.
Colocar uma lamínula sobre a gota e em seguida examinar ao microscópio usando as objetivas a seco
(10, 20 e 40). Observar a forma e a dimensão dos microrganismos presentes no material.

2.1. Resultados da observação de lâmina e lamínula

AMOSTRA___ AMOSTRA___

51
3. Exame do material em gota pendente: montar a lâmina em gota pendente conforme a técnica
descrita no item 5.2 da apostila, utilizando-se uma cultura de microrganismos em meio líquido.
Examinar ao microscópio com auxílio das objetivas a seco (10, 20 e 40) e finalmente com a objetiva de
imersão. Observar a dimensão, forma e movimento dos microrganismos presentes no material.

4. Resultados.

3.1. Resultados da observação da gota pendente

AMOSTRA___ AMOSTRA___

AMOSTRA___ AMOSTRA___

ANOTAÇÕES:______________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

52
 10 PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS

CORADAS
1. Introdução

As preparações microscópicas coradas são os exames microscópicos mais comumente

empregados em microbiologia pois proporcionam uma melhor visualização dos microrganismos,
permitindo diferenciar vários tipos morfológicos, assim como, o estudo de suas estruturas (como por
exemplo, parede celular, cápsula, endosporo e flagelo), quando da utilização de técnicas específicas
de colorações.

2. Corantes

Os corantes são substâncias orgânicas possuidoras de grupamentos cromóforos que podem

conferir aos corpos celulares uma dada pigmentação. Os corantes são comercialmente preparados
como sais, os quais apresentam um dos íons coloridos. Desta forma podem ser divididos em dois
grandes grupos: corantes básicos, quando a cor do corante reside no íon carregado positivamente
(cátion) e corantes ácidos, quando o responsável pela coloração é o íon carregado negativamente
(ânion).
2.1. Colorações com corantes básicos. As bactérias coram-se com mais facilidade pelos corantes
básicos, pois a superfície bacteriana possui uma débil carga negativa em pH do meio próximo a
neutralidade, e esta diferença de cargas elétricas portanto, traduz a "afinidade" entre o corante básico e
a célula bacteriana. Os corantes básicos mais utilizados em bacteriologia são: azul de metileno, cristal
violeta e fucsina básica, todos derivados a anilina.
2.2. Colorações com corantes ácidos. Os corantes ácidos dão origem a Coloração Negativa ou
indireta pois esses corantes não coram as células bacterianas, apenas se depositam ao seu redor.
Este método tem uma vantagem frente a coloração com corantes básicos, pois proporciona uma
observação mais exata da célula bacteriana em relação ao seu tamanho e sua forma. São exemplos de
corantes ácidos a nigrosina, tinta nanquim, fucsina ácida.
2.3. Soluções corantes. As soluções corantes podem ser aquosas, hidro-alcoólicas ou hidro-alcoólicas
acrescidas de mordentes (substâncias que, quando adicionadas aos corantes têm propriedade de fixá-
los nas bactérias. Ex.: fenol, iodo, tanino, formol). As soluções corantes de uso corrente na prática, são
hidrofenicadas. A adição de fenol aos corantes tem a vantagem de preservá-los da contaminação de
bolores ou bactérias, além de funcionar como mordente. Os elementos que entram na composição da
fórmula padrão de um corante são distribuídos proporcionalmente da seguinte maneira:

53
Fórmula:

Substância corante................1,0 a 2,0g

Ácido fênico............................2,0 a 5,0g
Álcool absoluto.......................10,0mL
Água destilada........................100,0mL
A melhor maneira de preparar uma solução corante é a seguinte: (a) Colocar num frasco com
rolha esmerilhada o corante completamente pulverizado e juntar o álcool. Fechar o frasco e deixar na
estufa a 35º por 24 horas, agitando de vez em quando; (b) Acrescentar o ácido fênico e a água e levar
novamente à estufa durante 24horas; (c) Filtrar e transferir com auxílio de um funil para um frasco de
rolha esmerilhada de cor âmbar para estocar; (d) "Sempre que recarregar" os frascos conta-gotas
(soluções de uso) das baterias de coloração, estes devem ser previamente lavados e enxaguados com
água destilada. O corante deve ser novamente filtrado.

3. Metodologia das preparações coradas

As preparações coradas são realizadas em três etapas: confecção do esfregaço, fixação e

coloração.

3.1. Confecção do esfregaço. Com o auxílio da alça ou agulha de semeadura, flambada ao rubro e
resfriada, retirar um pouco do material a ser examinado e depositar no centro de uma lâmina de vidro
limpa e desengordurada. Com a mesma alça, "espalhar" o material até obter um esfregaço de forma
oval, bem delgado e uniforme. Deixar secar espontaneamente ao ar. Na confecção dos esfregaços, ter
o máximo cuidado para evitar a formação de aerossóis, utilizando equipamentos de segurança,
obrigatoriamente, como por exemplo, frascos de álcool-areia.
Observações: (a) Quando o material a ser examinado for muito espesso, diluir com solução salina ou
simplesmente água destilada esterilizada. (b) Quando o material for líquido e pobre em germes,
centrifuga-se a 2500-3000 rpm durante 5 a 15 minutos e o esfregaço é confeccionado a partir do
sedimento.

3.2. Fixação. Tem a finalidade de matar os microrganismos, coagular o citoplasma da célula

microbiana e fazer aderir o material à lâmina para que não se desprenda nas manipulações
posteriores. O agente fixador ideal preserva as estruturas das células com sua forma e posição, sem
produzir artefatos (estruturas que não existam na célula viva). O processo de fixação pode ser feito de
diversas maneiras:
(a) Pelo calor: cortar com a lâmina, a chama do bico de Bunsen duas a três vezes com movimento
regular e com a face da lâmina com o material voltada para cima, a fim de não ter contato
direto com o fogo;
(b) Pelo álcool a quente: cobrir a lâmina com álcool absoluto e inflamá-lo imediatamente;

54
 (c) A frio: recomenda-se o uso deste processo quando o material sofrer alteração pelo calor, por
exemplo coloração de sangue, líquor, protozoários, riquétsias. Utilizar como agente fixador
álcool-éter (1:1), álcool metílico, bicloreto de mercúrio e outros.

3.3. Coloração. As técnicas de coloração podem ser divididas em dois grandes grupos: simples e
composta. Quando se deseja apenas uma noção sobre a morfologia dos microrganismos, recorre-se a
colorações simples, nas quais utilizamos apenas um corante, que cora igualmente os germes e outros
elementos presentes na lâmina. Quando precisamos saber mais detalhes com relação aos caracteres
dos germes, usamos as denominadas colorações compostas ou combinadas. Estas colorações, além
da morfologia, colocam em evidência certas propriedades tintoriais dos microrganismos, facilitando
assim a sua identificação (Ex. coloração de Gram), ou permitem o estudo de estruturas internas das
suas células (Ex. coloração de esporos bacterianos). Nestas colorações utilizam-se dois ou mais
corantes, o corante principal, que confere a cor à estrutura em análise e o corante de fundo ou de
contraste que cora os outros elementos, combinados aos mordentes e agentes diferenciadores.

ATIVIDADE PRÁTICA

1. Desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%. Lavagem das mãos.

2. Exame do material entre a lâmina e lamínula:
2.1. Observar ao microscópio ótico comum de campo claro as preparações microscópicas indicadas no
quadro abaixo, utilizando a objetiva de imersão

LÂMINAS COLORAÇÃO CORANTES UTILIZADOS OBJETIVOS

1e2 Negativa ou Técnica de Tinta Nanquim, Nigrosina Visualização da morfologia

Burri

3e4 Simples Fucsina, Cristal Violeta Visualização da morfologia

5 Fontana-Tribondeau Nitrato de Prata Visualização de

(Impregnação pela prata) espiroquetas

6 Hiss Violeta Genciana, Sulfato de Cobre Visualização de cápsula

7 Wirtz-Conklin Verde Malaquita, Safranina Visualização de esporos

8 Coloração de Kodaka Cristal violeta saturado Visualização de flagelos

9 Albert-Laybourn Azul de Toluidina, Verde de Visualização de granulações

Malaquita metacromáticos

10 Giemsa Eosina, Azul de Metileno células eucarióticas

(diferenciação núcleo-
citoplasma)

55
2. Registrar as características morfológicas e tintoriais dos microrganismos ou das estruturas
observadas:

Anotações:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________

56


11 COLORAÇÃO DE GRAM

1. INTRODUÇÃO
A coloração de Gram foi originalmente descrita por Christian Gram em 1884. O método de
Gram se baseia no fato de que quando certas bactérias são coradas pelo cristal violeta (corante azul) e
depois tratadas pela solução de iodo-iodetada (lugol), forma-se um composto de coloração escura
entre o iodo e o corante - complexo iodo-para-rosa-anilina, que é fortemente retido por um grupo de
bactérias e não pode ser removido pelo descoramento subsequente com o álcool, como ocorre com as
bactérias Gram positivas ou que tomam o Gram. Outras bactérias, denominadas de Gram negativas,
não tomam o Gram, deixam-se descorar facilmente pelo álcool. Se após a adição do álcool se efetuar
uma coloração de fundo utilizando-se fucsina básica (corante vermelho), as bactérias Gram negativas
aparecerão coradas em vermelho, ao passo que as Gram positivas se apresentarão roxas, isto é,
conservarão a cor violeta do primeiro corante empregado.

O mecanismo da coloração de Gram não está ainda bem definido, porém, sem dúvida, está
relacionado a diferença de permeabilidade da parede celular. Nas bactérias Gram positivas a parede
celular é constituída essencialmente pelo componente mucopeptídico e o tratamento com o álcool
resulta em uma desidratação e consequente diminuição da permeabilidade que impede ou dificulta a
eluição do complexo iodo-corante. O mesmo não acontece nas bactérias Gram negativas, nas quais o
solvente orgânico atua em sentido contrário, determinando o aumento da permeabilidade celular.

2. OBJETIVOS

O objetivo da coloração de Gram é a observação das características morfotintoriais (forma,

tamanho, arranjo das células e propriedades tintoriais) das bactérias. Estas propriedades podem ser
influenciadas por muitos fatores, como por exemplo: idade da cultura, meio de cultivo, atmosfera de
incubação, presença de substâncias inibidoras e o método de coloração utilizado. Os esfregaços
corados pela técnica de Gram podem ser preparados a partir de espécimes clínicos, culturas em caldo
ou colônias desenvolvidas em meios solidificados. Culturas jovens (<24 horas) provenientes de meios
de cultivo não inibitórios e espécimes clínicos recentemente obtidos, apresentam resultados mais
favoráveis em relação à coloração de Gram.

O comportamento geral das bactérias de interesse médico frente à coloração de Gram,

pode ser facilmente memorizado observando-se as seguintes regras gerais

Os cocos são geralmente Gram positivos, excetuando-se aqueles pertencentes ao gênero

Neisseria: N. gonorrhoeae (gonococo) e N. meningitidis (meningococo);
Os bacilos são em geral Gram negativos, com exceção daqueles pertencentes aos seguintes
gêneros: Corynebacterium - C. diphtheriae (bacilo diftérico), Bacillus - B. anthracis (bacilos do
carbúnculo hemático), Clostridium - C. tetani (bacilo do tétano), C. botulinum (bacilo do

57
 botulismo), C. perfringens (bacilo da gangrena gasosa) e Mycobacterium - M. tuberculosis
(bacilo da tuberculose) e M. leprae (bacilo da hanseníase).

Na prática médica, a coloração de Gram pode ser utilizada na identificação presuntiva de 80 a

90% das bactérias envolvidas nas septicemias; infecções geniturinárias, respiratórias e anaeróbias;
meningites, diarréia; em um tempo mínimo de aproximadamente cinco minutos. Com base nas
propriedades morfotintoriais do possível agente etiológico, o médico pode adotar uma melhor conduta
de tratamento enquanto aguarda o resultado do laboratório referente à identificação e ao antibiograma.

3. REAGENTES E TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM:

3.1. CORANTE PRINCIPAL: Cristal violeta fenicado, segundo Nicolle.

Cristal violeta............................................. 1g
Álcool a 95ºGL............................................ 10mL
Fenol Fundido............................................. 2g
Água destilada............................................100mL
NOTA: O fenol fundido é preparado pela dissolução do fenol cristalizado em Banho-Maria a 50-60 ºC e
adição de 10% de água destilada.

TÉCNICA DE PREPARO:

1. Triturar, com auxílio de pistilo, o cristal violeta em um gral e adicionar o álcool. Homogeneizar e
juntar o fenol fundido;
2. Acrescentar em torno de 50 mL da água destilada e transferir o material para um béquer;
3. Lavar o gral duas a três vezes com o restante da água destilada e transferir para o béquer. Deixar
em repouso durante 24 horas;
4. Filtrar, com auxílio de funil e algodão ou papel de filtro, para frasco estoque âmbar de rolha
esmerilhada;
5. Manter a temperatura ambiente e indicar no frasco o prazo de validade de 12 meses.

NOTA: 1) Utilizar cristal violeta com grau de pureza de 90-95%; 2) Quando da transferência do corante
do frasco estoque para o frasco conta-gotas, filtrar novamente com auxílio de funil e algodão.

3.2. MORDENTE:

Solução de Lugol,
Iodo............................................... 1g
Iodeto de Potássio......................... 2g
Água destilada..............................300mL

58
 TÉCNICA DE PREPARO:

1. Triturar em um gral, com auxílio de pistilo, o iodo com o iodeto de potássio;

2. Adicionar aos poucos a água destilada. Homogeneizar;
3. Filtrar com auxílio de funil e algodão ou papel de filtro, para estoque em frasco âmbar de rolha
esmerilhada;
4. Manter a temperatura ambiente e indicar no frasco o prazo de validade de 6 meses.

3.3. AGENTE DESCORANTE:

Álcool-cetona:
Álcool Etílico 95%.................................. 100mL
Acetona.................................................. 100mL

TÉCNICA DE PREPARO:
1. Com auxílio de proveta medir 100mL do álcool e transferir para frasco âmbar de rolha
esmerilhada;
2. Juntar 100mL da acetona. Estocar a temperatura ambiente e indicar no frasco o prazo de
validade de 12 meses.

NOTA: Utilizar solventes P.A.

3.4. CORANTE DE FUNDO: Fucsina de Ziehl diluída 1:10:

FÓRMULA E PREPARO DA SOLUÇÃO A:

Fucsina Básica........................................... 3g
Álcool Etílico 95%..................................... 100mL
* Triturar em um gral, com auxílio de pistilo, o corante com o álcool.
FÓRMULA E PREPARO DA SOLUÇÃO B:
Fenol Cristalizado...................................... 100g
Água Destilada........................................... 10mL
* Adicionar a água destilada e dissolver o fenol cristalizado em Banho-Maria 50-60ºC.
FÓRMULA E PREPARO DA FUCSINA DE ZIEHL:
Solução A................................................... 100mL

59
 Solução B................................................... 55mL
Água Destilada q.s.p................................... 1000mL
* Após o preparo da Fucsina de Ziehl, deixar a solução em repouso por 24 horas. Filtrar, com auxílio de
funil e algodão ou papel para frasco estoque âmbar de rolha esmerilhada.
TÉCNICA DE PREPARO DA FUCSINA DE GRAM:
1. Diluir a Fucsina de Ziehl 1:10 com água destilada.
2. Filtrar com auxílio de funil e algodão ou papel de filtro para frasco estoque âmbar de rolha
esmerilhada.
3. Manter a temperatura ambiente e indicar no frasco o prazo de validade de 12 meses.

NOTA: Sempre filtrar quando da transferência do corante para o frasco conta-gotas.

TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM

1. Cobrir o esfregaço por 1 minuto com cristal violeta;

2. Escorrer o corante. Cobrir 1 minuto com lugol;

3. Lavar em água corrente de baixa pressão;

4. Descorar com álcool-cetona por 1-5 segundos;

5. Lavar em água corrente de baixa pressão;

6. Corar com Fucsina de Ziehl-Nielsen 1:10 por 30 segundos;

7. Lavar em água corrente de baixa pressão;

8. Deixar secar espontaneamente ao ar;

9. Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

60

ATIVIDADE PRÁTICA

TRABALHO INDIVIDUAL

1. Fazer a desinfecção da bancada com álcool 70%;

2. Lavar as mãos com água e sabão durante 15-20 segundos (lavagem higiênica);

3. Identificar duas lâminas de microscopia 26X76mm, limpas e desengorduradas, respectivamente,

com os números 1, 2 e nome do operador:

3.1. LÂMINA 1: Preparar um esfregaço a partir de uma mistura 1:1 de Yakult e iogurte (amostra 1)
utilizando a seguinte técnica, conforme demonstração do instrutor: com auxílio de alça de níquel cromo
(Fio BS 24, 45-50 mm de comprimento e 3 mm de diâmetro interno), flambada ao rubro e resfriada,
transferir assepticamente uma alçada da amostra para o centro da lâmina. Com a mesma alça espalhar
o material na região central da lâmina aplicando movimentos circulares, até se obter um esfregaço de
forma oval, bem delgado e uniforme. Deixar secar espontaneamente ao ar. Fixar pelo calor passando a
lâmina, com o lado do esfregaço voltado para cima, duas a três vezes na chama do bico de Bunsen.

3.2. LÂMINA 2: Preparar dois esfregaços a partir de um cultivo bacteriano de 18-24 horas em ágar
simples inclinado (Amostras 2 e 3), utilizando a seguinte técnica, conforme demonstração do instrutor:
com auxílio de alça de níquel-cromo, flambada ao rubro e resfriada, transferir uma a duas alçadas de
água destilada para duas regiões da lâmina (figura 2). Seguir as técnicas assépticas conforme descrito
acima, observando o seguinte cuidado: tocar com a agulha na massa bacteriana e friccioná-la na água
destilada, previamente depositada na lâmina, até observar o desprendimento de pequenas partículas
do material. Neste ponto, interromper o processo e remover o excesso do material da agulha no frasco
areia-álcool. Flambar a agulha, deixar resfriar e preparar uma suspensão do material na lâmina,
aplicando movimentos circulares até se obter uma suspensão homogênea e a seguir distribuir o
material, do centro para a periferia, até se obter um esfregaço de forma oval, delgado e uniforme.
Deixar secar espontaneamente ao ar. Fixar pelo calor.

4. Coloração de Gram Corar as duas lâminas pela técnica de Gram, conforme demonstração do
instrutor.

61
FIGURA 1

Lâmina 01

Amostra 01

FIGURA 2

Lâmina 02 Água destilada

Amostra 03 Amostra 02

62
5. Exame microscópico: observar ao microscópio utilizando objetiva de imersão. Registrar as
propriedades morfotintoriais das bactérias presentes nas amostras 1, 2, e 3. Fazer a leitura quantitativa
de 10-20 campos microscópicos, utilizando os critérios numérico ou descritivo.

6. Leitura e registro dos resultados: registrar as características morfotintoriais das amostras.

AMOSTRA 1

AMOSTRA 2

AMOSTRA 3

Fazer um desenho esquemático de um campo microscópico representativo do esfregaço:

AMOSTRA 1 AMOSTRA 2 AMOSTRA 3

NOTA: Ao término dos trabalhos, cada aluno deve fazer a desinfecção da bancada com álcool 70% e a
seguir a antissepsia e lavagem higiênica das mãos.

BACTERIOSCOPIA QUANTITATIVA

CRITÉRIO NUMÉRICO CRITÉRIO DESCRITIVO

+ <1 por campo microsc. Raros <1 por campo microsc.

++ 1 por campo microsc. Poucos 1-5 por campo microsc.

+++ 2-10 por campo micros. Moderados 5-10 por campo micros.

++++ >10 por campo microsc. Muitos >10 por campo microsc.

63
 12 CONTROLE DE MICRORGANISMOS POR

AGENTES FÍSICOS E QUÍMICOS

1. INTRODUÇÃO

Sempre que nos deparamos com o seguinte questionamento: Para este tipo de material, qual
deverá ser o tipo de tratamento adotado? Esterilização? Desinfecção de alto, médio ou baixo nível?
Devemos então nos fazer o questionamento subseqüente: De acordo com o Centro para Controle e
Prevenção de Doenças (CDC, USA), em que categoria este tipo de material é enquadrado? Artigos
críticos, semicríticos ou não críticos?

Há cerca de 30 anos atrás, Earle H. Spaulding desenvolveu uma classificação racional na

desinfecção e esterilização dos artigos ou equipamentos de primeiros socorros. Esta classificação é tão
clara e lógica que foi melhorada, refinada, e usada com sucesso no controle profissional de infecção no
planejamento de métodos para desinfecção e esterilização. Spaulding acreditava que a natureza da
desinfecção poderia ser entendida mais prontamente se os instrumentos e os itens para primeiros
socorros fossem divididos em 3 categorias, baseadas no risco de infecção envolvida no uso destes
equipamentos.

As 3 categorias descritas foram Crítica, Semicrítica e Não-Crítica. O CDC empregou esta

terminologia no seu “Guia para Lavagem das Mãos e Controle Hospitalar e de Meio Ambiente” e “Guia
para a Prevenção da Transmissão do Vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV) e do Vírus da Hepatite
B (HBV) em Profissionais de Saúde e Segurança Pública”.

2. ARTIGOS CRÍTICOS

Artigos críticos são assim chamados devido ao alto risco de infecção por estes materiais,
quando contaminados por qualquer microrganismo, incluindo esporos de bactérias. Estes objetos
entram em contato com tecidos estéreis ou sistema vascular e por isso, devem ser esterilizados. Esta
categoria inclui instrumentos cirúrgicos, para implantes, agulhas, cateteres cardíacos e urinários.
Muitos dos itens desta categoria já são comprados esterilizados, ou devem ser esterilizados por
autoclavação, se possível. Se não suportar o aquecimento, o objeto deve ser tratado com óxido de
etileno ou com uma nova tecnologia de esterilização a baixas temperaturas.
Os artigos críticos não deverão ser tratados com esterilizante químico se outros métodos
puderem ser utilizados. Alguns germicidas ditos esterilizantes químicos como as formulações de
glutaraldeído básico a 2%, peróxido de hidrogênio estabilizado a 6%, e ácido peracético, só esterilizam

64
se o equipamento estiver limpo totalmente, e se o guia de características orgânicas (tempo de contato,
temperatura e pH), forem seguidos cuidadosamente.

3. ARTIGOS SEMICRÍTICOS

Os objetos semicríticos entram em contato com as membranas mucosas ou com a pele não
intacta. Estes artigos devem estar livres de qualquer microrganismo ou esporos de bactéria.
Membranas mucosas intactas geralmente são resistentes à infecção por esporos de bactérias comuns,
mas são susceptíveis a outros organismos como o bacilo da tuberculose e vírus. Endoscópios,
termômetros e equipamentos para terapia respiratória e de anestesias estão incluídos nesta categoria.

A maioria dos artigos semicríticos necessita pelo menos a pasteurização a vapor ou um alto
nível de desinfecção usando desinfetantes químicos como o glutaraldeído, peróxido de hidrogênio
estabilizado, ácido peracético, cloro, ou compostos clorados. No entanto, alguns artigos semicríticos,
como os termômetros usados em pacientes cuja pele não esteja intacta, devem ser desinfetados
efetivamente com desinfetantes potentes (P.ex., cloro) ou desinfetantes de nível médio (P.ex.,
fenólicos, iodóforos, álcoois).

Em geral, o manipulador deveria enxaguar os artigos semicríticos com água destilada (estéril)
para prevenir organismos que podem estar em água de torneira (ex.: micobactérias e espécies de
Legionella), contaminando os instrumentos. Se o instrumento não puder ser enxaguado com água
destilada (estéril), deveria ser utilizado primeiro a água de torneira e então o álcool sendo em seguida
secos com ar comprimido e guardados assepticamente.

4. ARTIGOS NÃO-CRÍTICOS

Estes artigos entram em contato com a pele íntegra e não com as membranas mucosas. A pele
intacta é uma barreira efetiva à maioria dos microrganismos. Por isso, artigos que estão em contato
com a pele não necessitam ser estéreis e são considerados “não-críticos”. Exemplos de artigos não-
críticos incluem aparelhos de pressão sangüínea, muletas, carrinhos de cama, roupas de cama ou do
doente, utensílios de comida, criados, mobília, e chão. Em contraste aos artigos críticos e alguns
semicríticos, a maioria dos artigos não-críticos reutilizáveis podem ser limpos onde eles estão sendo
usados, e não precisam ser transportados até a área de processamento central. Existe um pequeno
risco de transmissão de agentes infecciosos a pacientes, através de artigos não críticos. No entanto,
estes artigos poderiam contribuir à contaminação secundária através de contaminação das mãos dos
profissionais de saúde, ou do equipamento médico que subsequentemente será usado para outros
pacientes. Desinfetantes de baixo nível podem ser usados no processo de desinfecção dos artigos
não-críticos.

65
5. EFEITOS DE AGENTES FÍSICOS SOBRE O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS

O mais antigo e conhecido agente de destruição de microrganismos é o calor, que pode ser
úmido ou seco como já vimos em assuntos anteriores. O efeito do calor úmido, produzindo “morte
térmica” dos microrganismos é dado pela desnaturação das proteínas celulares, principalmente as
enzimas. A morte bacteriana causada pelo calor seco parece dever-se à oxidação dos componentes
celulares. Experimentos demonstraram que quanto mais seca a preparação, maior a resistência ao
calor.

6. EFEITOS DOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE O CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS “IN

VITRO”

Desinfetantes são substâncias ou produtos capazes de destruir, indiscriminadamente os

microrganismos de uma superfície ou instrumento, sem entretanto eliminar as formas esporuladas.
Vários tipos de desinfetantes são utilizados para a desinfecção de diferentes itens (superfícies,
instrumentos, chão, aparelhos, etc.). A escolha do desinfetante químico deve ser feita cuidadosamente,
pois um produto usado para uma finalidade, pode não ser igualmente efetivo para outra. Os produtos
químicos usados como desinfetantes, geralmente comportam-se como “venenos protoplasmáticos”,
agindo das seguintes maneiras:

1. Ação em membrana: produzem dano inicial na membrana citoplasmática das bactérias, resultando
em perda de constituintes celulares vitais (ácidos nucléicos e potássio). Atuam desta maneira:
clorexidina, compostos quaternários de amônia, fenóis e álcoois.
2. Ação de fixação da membrana: atuam selando ou fixando a membrana citoplasmática, bloqueando
a saída de componentes celulares, matando os microrganismos. O glutaraldeído e o formaldeído
agem desta maneira.
3. Oxidação dos constituintes celulares: atuam através de oxidação. Agem desta maneira os
compostos à base de cloro (hipocloritos) e iodo (iodóforos).

ATIVIDADE PRÁTICA

TRABALHO EM EQUIPE (4 EQUIPES)

1. Objetivos:

1.1.Observar o efeito do calor sobre os microrganismos;

1.2.Demonstrar que uns microrganismos são mais resistentes ao calor que outros.
1.3.Verificar a ação dos desinfetantes sobre os microrganismos;
1.4.Observar que diferentes desinfetantes possuem ação variável sobre os diferentes microrganismos.

66
2. Microrganismos (uma amostra por equipe):

Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Candida albicans Escherichia coli

3. Preparo das suspensões de microrganismos: assepticamente, com auxílio de alça bacteriológica,

transferir várias colônias de um cultivo bacteriano (cultura pura) de 18-24 horas em placa de ágar
nutriente para um tubo de ensaio 13x100 contendo 2,0 mL de solução salina esterilizada. Atritar a
massa bacteriana contra a parede interna do tubo de ensaio de forma a obter uma suspensão
homogênea, de forte turbidez. Homogeneizar em mixer durante 30 segundos.

4. Padronização das suspensões: transferir algumas gotas da suspensão microbiana previamente

preparada para 4 tubos contendo 3,0 mL de água destilada estéril, até atingir uma turvação comparável
àquela do tubo ½ da escala de McFarland, o que equivale a uma suspensão contendo
aproximadamente 108 células microbianas/mL

Identificar os 4 tubos de ensaio de cada microrganismo a ser testado:

Tubo 1. Nome da equipe, nome do microrganismo utilizado e T=0 e T=5 minutos

Tubo 2. Nome da equipe, nome do microrganismo utilizado e T= 10 minutos

Tubo 3. Nome da equipe, nome do microrganismo utilizado e T= 20 minutos

Tubo 4. Nome da equipe, nome do microrganismo utilizado e D=desinfetante

Observação: cada equipe será responsável pela preparação da suspensão padrão de um tipo de
microrganismo

5. Procedimento para o teste de resistência ao calor (agente físico)

5.1. Dividir o fundo da placa de Petri contendo ágar-nutriente em 4 partes. Identificar (nome e
número da equipe) e marcar (0, 5, 10 e 20 minutos);
5.2. Com alça de níquel-cromo, semear o microrganismo do tubo T=0 no quadrante
correspondente da placa;
5.3. Colocar os 3 tubos (T=5, T=10 e T=20) no banho-maria fervente. Após 5 minutos de fervura
retirar o tubo T=5 e semear, com alça, no quadrante correspondente;
5.4. Após 10 minutos de fervura, retirar do banho maria o tubo T=10 e semear no quadrante
correspondente da placa;
5.5 Repetir a operação com o tubo T=20 após 20 minutos de fervura;
5.6. Incubar a placa a 37ºC durante 48 horas;
5.7. Realizar a leitura e interpretar os resultados, considerando os resultados obtidos pelas 4
equipes.

6. Procedimento para o teste da ação dos desinfetantes e anti-sépticos (agentes químicos)

6.1. Pipetar 0,5 mL do microrganismo a ser utilizado (cada equipe deverá realizar o experimento
com um microrganismo) e transferir para um tubo contendo solução salina e para os três
outros tubos contendo os diferentes desinfetantes;

67
6.2. Aguardar 15 minutos;
6.3. Dividir o fundo da placa contendo ágar nutriente com lápis para vidro, e marcar os
desinfetantes correspondentes;
6.4. Semear com alça a partir dos tubos com desinfetante + microrganismos, para os quadrantes
correspondentes da placa;
6.5. Incubar a 37ºC durante 48 horas.
6.6. Realizar a leitura, observando o crescimento nas partes correspondentes à ação de cada
desinfetante, nas placas semeadas durante a aula. Contar o número de colônias (quando
possível) e interpretar os resultados

68
LEITURA DO EXPERIMENTO

Quadro 1. Leitura da ação do calor sobre o cultivo microbiano.

Microrganismo Tempo zero* 5 minutos 10 minutos 20 minutos

Número de Número de Número de Número de
colônias colônias colônias colônias

Staphylococcus aureus
Escherichia coli

Candida sp.

Bacillus subtilis
*Controle do crescimento microbiano

Qual dos microrganismos testados demonstrou maior resistência ao calor? Por que?

_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
Quadro 2. Leitura da ação de agentes químicos sobre o cultivo microbiano.

Microrganismo Salina* Álcool 70% Clorexidina PVP-I

Número de Número de Número de Número de
colônias colônias colônias colônias

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Candida sp.

Bacillus subtilis
*Controle do crescimento microbiano

Qual dos microrganismos testados foi mais resistente aos desinfetantes? Por que?

_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________

69


13 CONJUGAÇÃO BACTERIANA
1. INTRODUÇÃO

A conjugação bacteriana foi descrita pela primeira vez por Lederberg e Tatum (1946), em
mutantes nutricionais de Escherichia coli K12. A conjugação é um processo “sexual” de transferência
de genes de uma bactéria doadora para uma bactéria receptora. Para que uma linhagem bacteriana
seja doadora ela deve conter um plasmídeo conjugativo.

Plasmídeos são elementos extracromossômicos não essenciais às funções vitais das células.
Eles apresentam capacidade de replicação autônoma e alguns podem se integrar ao cromossoma
bacteriano (epissoma).

Na conjugação, o elemento extracromossômico responsável pelo processo foi denominado de

fator F ou plasmídeo F. Este plasmídeo pode estar integrado ou não ao cromossomo bacteriano. No
primeiro caso, a linhagem bacteriana é chamada de Hfr (grande freqüência de recombinação) e as
bactérias transferem seqüencialmente marcadores localizados no cromossoma, sendo o fator F
raramente transferido. Quando o plasmídeo não está integrado ao cromossoma, a linhagem é
denominada de F+ e uma réplica do plasmídeo F é transferido para as bactérias receptoras. Após a
descoberta do fator F, outros plasmídeos conjugativos foram descobertos (Col, R). O plasmídeo R foi
descoberto no Japão no final da década de 50 em Shigella e Escherichia coli. Este plasmídeo contém
essencialmente marcadores para resistência a drogas antibacterianas e normalmente não se integram
ao cromossoma bacteriano.

2. CONJUGAÇÃO BACTERIANA

2.1. Meios de Cultura

2.1.1. Caldo Nutriente:

Extrato de carne ....................................................................................................................3,0 g

Peptona. ................................................................................................................................5,0 g
Cloreto de sódio.....................................................................................................................1,0 g
Água destilada.............. ......................................................................................................1000,0 mL
Preparo: pH 7,4. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

70
2.1.2. Ágar Mac Conkey

Peptona de caseína........................................................................................................... ...27,000 g

Peptona de carne....................................................................................................................3,000 g
Lactose...................................................................................................................................10,000 g
Mistura de sais biliares............................................................................................................1,500 g
Cloreto de sódio......................................................................................................................5,000 g
Vermelho neutro.....................................................................................................................0,030 g
Cristal violeta..........................................................................................................................0,001 g
Ágar.......................................................................................................................................13,500 g
Água destilada................................................................................................................. .....1000 mL
Preparo: pH 7,1. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

2.2. Soluções de antibióticos

Droga Concentração Estoque Concentração de Uso

(mg/m)l (µg/mL)
Estreptomicina 12,0 300,0
Tetraciclina 1,2 30,0
Cloranfenicol 0,8 20,0
Preparo: solubilizar os antibióticos em água destilada e esterilizar por filtração. Preparar as soluções no
dia do uso.

2.3. Microrganismos

•Escherichia coli BH100 (F+, doadora): Lactose positiva com resistência plasmidial para penicilina,
canamicina, tetraciclina, cloranfenicol e mercúrio.

•Escherichia coli K12 (F-, receptora): Lactose negativa, com resistência cromossômica para
estreptomicina.

71
 ATIVIDADE PRÁTICA

1. Desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%. Lavagem das mãos.

2. Inocular as linhagens BH100 e K12 separadamente em tubos de ensaio contendo 5,0 mL de caldo
nutriente e incubar a 37ºC durante 18 a 24 horas.

3. Semear separadamente, com o auxílio de uma alça de vidro 0,1 mL das linhagens BH100 e K12 em
placas de Petri contendo:

MacConkey + Estreptomicina + tetraciclina + cloranfenicol

MacConkey + Tetraciclina + cloranfenicol

MacConkey + Estreptomicina

MacConkey Sem antibiótico

4. Retirar, com o auxílio de uma pipeta estéril 0,2 mL da linhagem BH100 e 0,8 mL da linhagem K12
(item 2) e adicionar em um tubo de ensaio contendo 4,0 mL de caldo nutriente, agitando bem (cultura
mista).

5. Após 3 a 6 horas de incubação da cultura mista, semear com o auxílio de uma alça de vidro 0,1 mL
em placas de Petri contendo:

MacConkey + estreptomicina + tetraciclina

MacConkey + estreptomicina + cloranfenicol

MacConkey + estreptomicina + tetraciclina + cloranfenicol

6. Incubar a 37ºC durante 24 horas.

7. Fazer a leitura anotando o número de colônias de cada placa da mistura (transconjugantes).

8. Resultados

8.1. Culturas Controles

Meios de cultura Crescimento

BH100 K12
MacConkey (MCK)

MCK + estreptomicina

MCK + tetraciclina + cloranfenicol

MCK + estreptomicina + tetraciclina + cloranfenicol

72
8.2. Transconjugantes

Meios de cultura n.º de colônias

MCK + estreptomicina + tetraciclina

MCK + estreptomicina + cloranfenicol

MCK + estreptomicina + tetraciclina + cloranfenicol

OBSERVAÇÕES:
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

73
14 MEDIDA QUANTITATIVA DO
CRESCIMENTO MICROBIANO.
DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE
CÉLULAS BACTERIANAS VIÁVEIS PELA
CONTAGEM DE COLÔNIAS EM PLACAS.

1. Introdução

As bactérias podem ser contadas diretamente ao microscópio, utilizando-se uma câmara de

contagem, ou em contador eletrônico de partículas ou, ainda, indiretamente através da contagem de
microrganismos viáveis, utilizando-se técnicas que possibilitem a multiplicação das células (contagem
de células viáveis em placas). Entretanto, existem vários outros métodos empregados para determinar
a população bacteriana de uma cultura: determinação da densidade celular por turbidimetria;
determinação da concentração celular pela medida do nitrogênio protéico; determinação do peso seco
das células e determinação da massa celular pela verificação de alterações químicas específicas
produzidas num constituinte do meio.

2. Contagem de células viáveis em placas

A técnica de contagem em placa é baseada no princípio de que cada organismo viável, quando
cultivado em meio de cultura solidificado, cresce e se multiplica formando uma massa visível, que é a
colônia. Assim sendo, a contagem de colônias desenvolvidas em um meio de cultura em placa, após
um determinado período de incubação, revela a população microbiana viável de uma cultura.
Para as várias técnicas de contagem de viáveis, o material contendo bactérias ou outros
microrganismos é diluído seriadamente, e alíquotas de cada diluição são semeadas em placas
contendo um meio de cultura e em seguida incubadas em temperatura adequada. Para efetuar a
contagem das colônias presume-se que a suspensão bacteriana seja homogênea e que não existam
agregados de células. Caso a cultura tenha tendência para formar agregados de células, como os
cocos, as contagens resultantes serão mais baixas do que o número de células individuais, pois cada
um dos agregados formará apenas uma colônia. Por este motivo as contagens são expressas como
“unidades formadoras de colônias” (UFC/mL ou UFC/g) e não apenas como número de bactérias por
mililitro ou grama.
O método de contagem de viáveis em placa é o mais utilizado nos trabalhos bacteriológicos de
rotina e apresenta resultados satisfatórios na aferição das populações bacterianas do leite, água,

74
alimentos e de muitos outros materiais. É de fácil realização e apresenta grande sensibilidade
permitindo, desta forma, a avaliação quantitativa de culturas com número reduzido de microrganismos.
A contagem de colônias de bactérias ainda pode ser realizada através do emprego de
membranas filtrantes. Após a filtração de uma determinada quantidade da amostra, a membrana com
as bactérias retidas, é colocada em uma placa contendo um meio de cultura adequado e, após um
período de incubação, as colônias aparecem sobre a superfície da membrana. Esta técnica é
especialmente valiosa na determinação do número de bactérias existentes em grandes volumes de ar,
água ou de outros espécimes que tenham um número reduzido de células viáveis.

ATIVIDADE PRÁTICA

1. Desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%. Lavagem das mãos.

2. Preparo das diluição da amostra (Equipes n.º 1 e n.º 2)
2.1. Identificar 7 tubos de ensaio contendo 9,0 mL de solução salina 0,85% esterilizada com os valores
correspondentes as diluições 10-1 a 10-7.
2.2. Transferir, assepticamente, com uma pipeta esterilizada, 1,0 mL de uma suspensão bacteriana
(amostra cultivada em caldo nutritivo por 24 horas a 35ºC), para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
salina (diluição 10-1).
2.3. Agitar e transferir, assepticamente, com outra pipeta esterilizada, 1,0 mL da diluição 10-1 para um
outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL de salina (diluição 10-2).
2.4. Utilizar o mesmo procedimento descrito acima para preparar sucessivamente as diluições 10-3, 10-
4, 10-5, 10-6 , 10-7 e 10-8.

*Até 10-7 - Técnica de Semeadura por superfície

*Até 10-8 - Técnica de Pour Plate

3. Contagem de bactérias viáveis em placa técnica do “Pour plate” (Equipe n.º 1)

3.1. Identificar 8 placas de Petri esterilizadas, com valores das diluições 10-7, 10-6, 10-5e 10-4 (2 placas
para cada diluição).
3.2. Pipetar, assepticamente, volumes de 1,0 mL da diluição 10-7 (preparada no ítem n.º 2), e transferir
para as placas respectivas.
3.3. Repetir este procedimento para os tubos das diluições 10-6, 10-5 e 10-4, transferindo 1,0mL para
cada uma das respectivas placas.
3.4. Adicionar em cada placa 15 mL de ágar nutriente previamente esterilizado, fundido e mantido em
banho-maria a 50ºC.
3.5. Fazer movimentos de rotação para homogeneizar o inóculo com o meio.

75
3.6. Esperar solidificar o meio de cultura. Inverter as placas. Incubar em estufa a 35ºC por 24-48 hora

4. Contagem de bactérias viáveis em placa pela técnica de semeadura em superfície (Equipe n.º
2)
4.1. Identificar 8 placas de Petri contendo ágar nutriente com os valores das diluições 10-7, 10-6, 10-5 e
10-4. Utilizar 2 placas para cada diluição.
4.2. Transferir assepticamente volumes de 0,1 mL da diluição 10-7 para a superfície do ágar das placas
respectivas.
4.3. Com um bastão de vidro em forma de L, espalhar o inóculo sobre a superfície de cada placa.
4.4. Repetir o mesmo procedimento com as diluições 10-6,10-5e 10-4.
4.5. Inverter as placas e incubar a 35ºC por 24-48 horas.
Observações: Para que um único bastão de vidro seja utilizado nesta operação, iniciar o espalhamento
pela diluição maior (10-7), a seguir 10-6, 10-5 e finalmente 10-4.

5. Leitura
5.1. Retirar as placas da estufa após 24-48 horas de incubação.

76
5.2. Proceder a contagem das colônias. Utilizar um contador de colônias para facilitar a contagem.
Observação: As contagens serão realizadas preferencialmente nas placas que apresentarem entre 30
e 300 colônias.
5.3. Registrar as contagens no quadro do item 6.
5.4. A média do número de colônias multiplicado pelo título da diluição dará o número de bactérias
viáveis ou “Unidades formadoras de colônias” (UFC) por mililitro da suspensão bacteriana empregada.

6. Quadro de registro dos resultados

Contagem (colônias/placa) Média das contagens

Diluição
Pour Plate Superfície Pour Plate Superfície

1x10-4

1x10-5

1x10-6

1x10-7

Pour Plate: __________________________________________UFC/mL

Superfície: __________________________________________UFC/mL

ANOTAÇÕES

__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

77
15 URINOCULTURA
1. INTRODUÇÃO:

A infecção do trato urinário é uma das doenças bacterianas mais comuns, e a conduta clínica
adequada a ser utilizada exige o conhecimento do número e tipo de bactérias envolvidas. Assim,
quando métodos quantitativos e semi-quantitativos são usados, o exame bacteriológico da urina pode
ser uma ajuda valiosa no diagnóstico e no controle terapêutico. A maioria das infecções urinárias
resultam de infecção ascendente por microrganismos introduzidos através da uretra. As infecções
agudas são mais freqüentes nas mulheres do que nos homens devido a uretra ser mais curta e haver
maior probabilidade de contaminação. Existem fatores que predispõem à infecção tais como: gravidez,
tumor, litíase, distúrbios neurológicos, diabetes mellitus, fatores mecânicos, etc.. As infecções do trato
urinário são causadas predominantemente por bacilos Gram negativos da família Enterobacteriaceae
sendo a E. coli o agente mais frequentemente isolado. Outros microrganismos como o enterococo,
Pseudomona sp., S. aureus, S. epidermidis e Candida albicans, podem ser encontrados.

2.COLETA DO MATERIAL:

O cuidado na coleta, preservação e transporte da urina é da maior importância. As melhoras

técnicas de laboratório para contar e identificar bactérias são de pouco valor se o material não é
coletado e semeado imediatamente.

• A escolha do recipiente: Utilizar sempre frasco de boca larga, rigorosamente limpo e estéril e
corretamente identificado com a hora exata da coleta.
• Transporte e estocagem da urina: A urina é um excelente meio de cultura, e bactérias
contaminantes provenientes do períneo podem multiplicar-se nos espécimes mantidos a temperatura
ambiente e invalidar os resultados dos exames. Portanto é necessário transportar a urina o mais
rapidamente possível no laboratório após sua micção, e quando impossibilitado utilizar meio de
transporte (Stuart) ou refrigeração à 4º C, por no máximo 24 horas.

78
• Espécimes de urina podem ser coletados por diversas técnicas, dependendo do estágio em que se
encontra o paciente, podendo citar entre elas: Coletor de plástico, Jato médio de micção espontânea,
cateterização, aspiração suprapúbica.

• Coleta de material feminino: A paciente deve tirar toas as peças íntimas. As mãos devem ser
muito bem lavadas com água e sabão, enxaguadas e secas em toalhas descartáveis. Com uma mão a
paciente deve separar os lábios vulvares e mantê-los continuadamente separados até que a urina seja
eliminada no recipiente. Tomando uma peça de gaze umedecida na solução de sabão, ela deve lavar
cuidadosamente a vulva passando da frente para trás. Ainda com a vulva aberta, ela deve repetir a
lavagem com água morna estéril, para eliminar possibilidade de contaminação da espécime com
sabão. A paciente urina e após a eliminação do primeiro jato o espécime é coletado diretamente em
frasco estéril.

79
• Coleta de material masculino: As mãos devem ser muito bem lavadas com água e sabão,
enxaguadas e sacas em toalhas descartáveis. O prepúcio deve ser completamente recolhido e a
glande limpa com gaze embebida em sabão. A seguir, o sabão é removido com água morna estéril. O
paciente despreza o primeiro e o último jato de urina e colhe o jato médio no frasco estéril.

3. CULTIVO:

Existem muitas técnicas que podem ser utilizadas para se fazer uma cultura de urina. As mais
utilizadas na rotina microbiológica são a técnica da alça calibrada, a técnica de Pour Plate, e a técnica
por diluição.

80
• Técnica da Alça Calibrada: Essa técnica é bastante utilizada por conseguir resultados satisfatórios,
além de ser prática e econômica. Usa-se uma alça calibrada da 0,001 mL e semeadura no meio de
Cled, de modo a permitir contagem de colônias isoladas. O meio de Cled é escolhido por favorecer o
crescimento de bacilos Gram negativos como de cocos Gram positivos, além de inibir o crescimento
em véu - “swarming” do Proteus mirabilis. Uma alça padronizada, calibrada para dispensar 0,001 mL é
usada para inocular as placas empregadas na cultura (Cled, Ágar sangue, Meios seletivos diferenciais).
A alça flambada e resfriada é mantida verticalmente e imersa logo abaixo da superfície da urina
homogeneizada; a alça é movimentada para cima e para baixo. Uma alçada de urina é então
depositada na superfície do meio e o material é, a seguir, espalhado por toda a placa. Esse
procedimento proporciona, invariavelmente uma separação que permite a contagem de colônias na
faixa de importância clínica e a seleção de colônias isoladas para estudos taxonômicos subsequentes.
O volume dispensado pela alça calibrada pode mudar com o uso repetido, devido à deformação,
corrosão, ou acúmulo de material incinerado. Ela deve ser regularmente inspecionada para se
confirmar que é ainda circular e que o anel esta íntegro. A alça não deve ser usada para semeadura de
rotina ou para outros espécimes a não ser que seja necessário quantificação.

NOTA: O volume carreado pela alça deve ser confirmado pelo menos mensalmente, pela
comparação com a contagem obtida pela técnica de “Pour Plate”, ou pelo método colorimétrico usando
corante diluído.

• Técnica de “Pour Plate”: Esta é considerada a técnica clássica para cultura de urinas. Quando
bem realizada fornece resultados confiáveis. Para realizar esta técnica deve-se preparar diluições de
urina 1:100 e 1:1000, em água destilada estéril. Acrescentar 1,0 mL de cada uma dessas diluições em
tubos com 20 mL de ágar simples fundido e resfriado a cerca de 50º C. Misturar as diluições de urina
nos tubos e imediatamente transferir os conteúdos dos tubos para duas placas de Petri estéreis. Deixar
solidificar o ágar das placas e incubar na estufa à 35-37º C por 18-24 horas. Se houver crescimento,
multiplicar o número de colônias da primeira placa por 100 e da segunda placa por 1000, para obter o
número de colônias por mL da urina.

• Técnica por diluições: É uma técnica também bastante utilizada e quando bem realizada fornece
bons resultados. Diluir 1,0 mL da urina recentemente colhida em 9,0 mL de água destilada estéril
(diluição 1:10). Tomar 1,0 mL dessa urina diluída e diluir em outros 9,0 mL de água destilada estéril
(diluição 1:100). Com o auxílio de uma pipeta de 1,0 mL previamente esterilizada, pipetar 0,1 mL da

81
solução 1:100 para o meio de Teague (EMB) ou MacConkey a 0,1 mL para o meio de ágar sangue.
Espalhar os inóculos com uma alça de Drigalski e incubar as placas em estufa à 35-37ºC por 18-24
horas. Se houver crescimento, contamos as colônias da placa de ágar sangue e o número de colônias
é multiplicado por 1000, pois o resultado é o número de colônias por 1,0 mL de urina.

4. CONTAGEM DE COLÔNIAS E INTERPRETAÇÃO:

Se a placa apresentar menos de 10 colônias, a probabilidade de contaminação é grande, e o

suficiente para não se fazer a identificação e o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos. Se a
placa apresentar 10 a 100 colônias com o predomínio de um único tipo de microrganismo, ele deve ser
identificado, mas se há dois ou mais tipos de bactérias, relata-se como “flora mista”, e requisita-se um
novo espécime. Se estão presentes mais do que 100 colônias e as placas forem adequadamente
semeadas, colônias isoladas devem estar presentes. Se mais de um tipo de colônia está presente em
número suficientemente elevado, cada tipo deve ser identificado e os testes de susceptibilidade dos
antimicrobianos realizados quando solicitados. Não se faz nenhuma tentativa para isolar e identificar
aqueles microrganismos que estão presentes em pequenas quantidades.

ATIVIDADE PRÁTICA

Atividade individual

1. Desinfecção do local de trabalho com álcool 70%;

2. Urinocultura:

SEMEADURA EM PLACA:

2.1. A partir de um frasco contendo amostra de urina, com auxílio de uma alça calibrada (1 µL), semear
em toda a placa contendo meio de Cled, conforme figura abaixo (três planos).

2.2. A partir de um frasco contendo amostra de urina, com auxílio de uma alça de semeadura, semear
em meio de MacConkey, pelo método de estrias descontínuas, conforme esquema abaixo.

82
 ÁGAR CLED

ALÇA

CALIBRADA

1µl

estria Plano Plano Plano

inicial horizontal perpendicular diagonal

ÁGAR MacConkey

Urina

ALÇA

COMUM

1ª estria 2ª estria 3ª estria 4ª estria

Flambar entre a
1ª. e 2ª. estrias

Leitura

1. PLACAS

MACCONKEY

CLED UFC/mL

2. Interpretação dos resultados obtidos a partir da semeadura em CLED:

LACTOSE Positiva ( ) Negativa ( )

INFECÇÃO URINÁRIA SIM ( ) NÃO ( )

3. Observações:

83
16 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE
PROVAS BIOQUÍMICAS

1. INTRODUÇÃO
Em microbiologia, as provas bioquímicas consistem na verificação das transformações
químicas que ocorrem num substrato pela ação de um determinado germe. Elas são utilizadas como
valioso recurso auxiliar para a identificação das espécies microbianas. Todo germe produz alterações
químicas nos meios em que se desenvolvem, decorrente das atividades metabólicas. Na grande
maioria estas transformações são devidas a ação das enzimas que os microrganismos elaboram, ou
apenas fisiológicas isto é, sem a participação enzimática. Cada germe possui um sistema enzimático
específico (Perfil Bioquímico), resultando daí, propriedades bioquímicas diversas, utilizáveis na prática
na sua caracterização.

2. METABOLISMO E PROVAS BIOQUÍMICAS

As provas bioquímicas baseiam-se em fenômenos como:

2.1. Utilização de carboidratos como fonte principal de energia. (a) polissacarídios - amido,
glicogênio, inulina, etc.; (b) trissacarídios - rafinose, melicitose, etc.; (c) dissacarídios - maltose,
sacarose, lactose, celobiose, melibiose, etc.; (d) álcoois e polihidrícos - manitol, glicerol, sorbitol, etc.;
(e) glicosídios - salicina, amigdalina, esculina.

2.2. Decomposição microbiana de compostos nitrogenados. (a) desaminação e descarboxilação de

aminoácidos; (b) produção de gás sulfídrico; (c) produção de indol; (d) desdobramento da ureia; (e)
nitrificação; (f) desnitrificação e etc.

2.3. Utilização de outros substratos. Ex: citrato, malonato, cianeto de potássio, etc.
Para a realização das provas bioquímicas, existe necessidade de se utilizar meios de cultivo especiais
contendo o substrato a ser ensaiado e fornecer aos microrganismos as condições ambientais
necessárias ao seu desenvolvimento. Na rotina bacteriológica usa-se conjuntos de provas bioquímicas
específicas para determinados grupos microbianos, como é o caso por exemplo de provas bioquímicas
aplicadas para a identificação de enterobactérias, estafilococos, estreptococos e etc.

Vemos como exemplo a diferenciação de alguns gêneros da família Enterobacteriaceae

Tabela 1. Identificação bioquímica das enterobactérias*

84
 S. typhi Salmonella Shigella E. coli Klebsiella Enterobacter Proteus
Glicose + + + + + + +
Nitrato + + + + + + +
Oxidase - - - - - - -
Indol - - V + - - V
V. Metila + + + + - - +
V. - -
- - + + -
Proskauer
Citrato - - - - + + V
Ureia - - - - + - +
Mobilidade + + - V - + +
Lisina + + - V V V -
Malonato - - - - + V -
Lactose - - - + + + -
*Tabela parcial simplificada. + = 90% ou mais de positividade; - = 10% ou menos de positividade;
v = variável.

3. EXEMPLOS DE PROVAS BIOQUÍMICAS

3.1. UREIA
Princípio: determinar a habilidade de um determinado microrganismo em degradar, enzimaticamente
(Urease) a ureia com a formação de duas moléculas de amônia.

Bioquímica envolvida: o substrato ureia é uma diamina do ácido carbônico, sendo frequentemente
referida como carbamina. A hidrólise da ureia é catalisada por uma enzima específica "urease",
rendendo duas moléculas de amônia (NH3). Em solução, a hidrolise da ureia fornece como produto final
o carbonato de amônia.

2(H2N)-C=O + 2H2O =urease=> CO2 + H2O + 2NH3 <==> (NH4)2CO3

A urease é uma importante enzima relacionada a decomposição microbiana de compostos

orgânicos. Ela é considerada uma enzima constitutiva pois é sintetizada pela bactéria na presença ou
ausência do substrato ureia.

Meio de cultura: (Ureia Ágar base - Christensen, pH 6,8)

85
Fórmula:
Peptona............................................................................................................1,0g
Glicose..............................................................................................................1,0g
Cloreto de sódio................................................................................................5,0g
Fosfato dipotássico...........................................................................................2,0g
Vermelho de fenol..........................................................................................0,012g
Ágar-ágar............................................................................................... .......12,0g
Água destilada.............................................................................................1000mL
Técnica de preparo e distribuição asséptica: Ureia Ágar base, segundo Christensen – (Merck).
Suspender 21g em 950 mL de água destilada ou desmineralizada. Deixar em contato por 15 minutos.
Dissolver em Banho-Maria fervente e autoclavar a 121ºC durante 15 minutos. Adicionar ao meio ainda
liquefeito (aproximadamente 55ºC) 50mL de uma solução a 40% de ureia previamente esterilizada por
filtração (Seitz ou Millipore). Homogeneizar. Distribuir assepticamente volumes de 3,0 a 4,0 mL para
tubos de ensaio 13 x 100mm, previamente esterilizados. Deixar o meio resfriar na posição inclinada
(superfície longa e base curta).

Indicador de pH: vermelho de fenol.

Ácido: pH 6,8 (amarelo)

Alcalino: pH 8,0 (vermelho)

Meios de cultura desidratados: Difco, BBL, Merck.
Técnica de semeadura: por estria superficial com auxílio de uma alça de semeadura bacteriológica,
utilizando-se um inóculo "pesado".
Leitura e interpretação:
Positivo: desenvolvimento de uma coloração vermelha.
Negativo: desenvolvimento de uma coloração amarela.

86
3.2. INDOL
Princípio: determinar a habilidade de um determinado microrganismo em produzir o INDOL a partir da
molécula de triptofano.
Bioquímica envolvida: o triptofano é um aminoácido que quando degradado por certas bactérias
levam a formação principalmente dos seguintes produtos metabólicos intermediários: indol, escatol
(metil indol) e ácido indol-acético (AIA). As várias enzimas intracelulares envolvidas neste processo
fisiológico são coletivamente denominadas de "TRIPTOFANASES". Os produtos intermediários
formados em maior quantidade na degradação do triptofano é representado pelo ácido indol pirúvico,
que produz indol por desaminação-deaminação e pelo escatol formado pela descarboxilação do ácido
indol-acético. A presença do indol no meio é revelada pela adição do reativo de Kovacs, ocorrendo
então a seguinte reação química: o p-dimetil-amino-benzaldeído se liga a molécula do indol produzindo
um composto quinoidal de coloração vermelha, evidenciado pela formação de um anel na camada
alcoólica superficial do meio. A reação de cor, é na realidade, devido a reação dos grupos CH2 do anel
pirrólico da molécula do indol com o aldeído, que num meio ácido forma uma quinona.
Meio de cultura
Fórmula:
Triptona.........................................................................................................10,0g
Cloreto de sódio................................................................................................5,0g
Água destilada..............................................................................................1000mL
Meios de cultura desidratados: "Trypticase Peptone Broth" (BBL) ou "Tryptone Broth" (Difco).
Técnica de preparo e distribuição: pesar os ingredientes da água triptonada. Dissolver em BM
fervente e distribuir volumes de 4,0mL para tubos de ensaio 13 x 100mm. Esterilizar em autoclave a
121ºC por 15 minutos. Controlar a esterilidade do meio. Fazer o controle de qualidade do meio.
Técnica de semeadura: semeadura por dispersão, com auxílio de alça ou agulha de semeadura
bacteriológica. Utilizar um inóculo pequeno.
Reativo de Kovacs
Fórmula:
Ácido clorídrico concentrado.........................................................................................50mL
Álcool amílico, isoamílico ou butílico.............................................................................150mL
P-dimetil-amino-benzaldeído..........................................................................................10,0g
Preparo: dissolver o aldeído no álcool. Cuidadosamente adicionar o ácido a mistura aldeído-alcoólica.
Conservar em refrigerador a 4.ºC (controle semanal).

Leitura e interpretação: para testar um cultivo com 24h de incubação, separar assepticamente 2,0mL
do meio e adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs e agitar cuidadosamente. Se negativo repetir o teste
com o cultivo de 48h nos 2,0mL restantes.

87
 Positivo: desenvolvimento de anel vermelho na superfície do meio de cultivo.

Negativo: sem desenvolvimento da cor na camada alcoólica.

Variável: desenvolvimento de uma coloração laranja na superfície do meio devido a presença

de escatol, que pode ser um dos precursores para a formação do indol.

3.3. VERMELHO DE METILA (VM)

Princípio: testar a habilidade de um certo microrganismo em produzir ácidos orgânicos relativamente
estáveis a partir da fermentação da glicose, de modo a suplantar a capacidade tampão existente no
meio de cultivo.
Bioquímica envolvida: o teste do VM é baseado na acidificação decorrente da fermentação da glicose
por alguns microrganismos e que é revelada pelo indicador de pH Vermelho de Metila (ácido-4-dimetil-
benzenoazo-2-carboxílico = C15H15N3O2). Quando do cultivo de enterobactérias em meio de VM/VP
(Clark & Lubs) ocorre a produção de ácido e/ou ácido e gás com 18-24h de incubação. Se
prolongarmos o período de incubação (2 a 5 dias), aqueles germes "VM positivos" continuam a produzir
mais ácidos resultando a mesma diminuição do pH (4,2 ou menos) que por sua vez suplanta o sistema
tampão fosfato presente no meio de cultivo; revelado pelo desenvolvimento de uma coloração
vermelha, devido ao indicador de pH. Como exemplo, podemos citar a E. coli que produz grandes
quantidades de ácidos (lático, acético, fórmico que pode ser desdobrado em CO2 e H2, succínico). As
enterobactérias "VM negativas" também produzem ácidos a partir da fermentação da glicose (acético,
lático, fórmico), mas não promovem uma grande acidificação do meio devido a degradação destes
ácidos orgânicos em carbonatos, dióxido de carbono e principalmente a formação de grande
quantidade de um composto neutro denominado "Acetil-metil-carbinol (acetoína)" e o 2-3-butanediol.

88
Esta fraca acidez é evidenciada quando da adição do indicador de pH, pelo desenvolvimento de uma
coloração amarela. Exemplificando este tipo de metabolismo de degradação da glicose, citamos o
grupo Klebsiella-Enterobacter.
Meio de cultura e reagente empregado:
Fórmula:
Peptona tamponada....................................................................................................7,0g
Fosfato dipotássico.......................................................................................................5,0g
Glicose.........................................................................................................................5,0g
Água destilada...........................................................................................................1000mL
Meios desidratados: DIFCO, BBL, MERCK.
Técnica de preparo e distribuição: pesar os ingredientes segundo a fórmula. Dissolver em água
destilada e levar ao BM fervente para a completa dissolução. Distribuir o volume de 5,0mL para tubos
de ensaio 15x150mm. Autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Controlar a esterilidade do meio. Fazer o
controle de qualidade.
Técnica de semeadura: semear por dispersão um pequeno inóculo com o auxílio de uma alça ou
agulha de semeadura bacteriológica.
Indicador: "Vermelho de Metila", dissolver 0,1g do vermelho de metila em 330mL de álcool etílico
absoluto. Adicionar 200mL de água destilada.
pH ácido - cor vermelha, pH 4,4 (fortemente ácido)

pH alcalino - cor amarela, pH 6,0 (fracamente ácido)

Leitura e interpretação: após um período mínimo de incubação de 48h (recomendado 3-5 dias a
35ºC); adicionar 5 gotas de solução hidro-alcoólica de vermelho de metila a uma alíquota* de 2,5mL do
meio VM/VP com o crescimento do germe a ser ensaiado.

Positivo: desenvolvimento de uma coloração vermelha.

Negativo: desenvolvimento de uma coloração amarela.

* fazer a prova de VP a partir dos 2,5mL restantes.

89
 PROVA DE VERMELHO DE METILA

3.4. VOGES PROSKAUER (VP)

Princípio: determinar a habilidade de um certo germe em produzir um composto neutro, o acetil-metil-
carbinol (acetoína) a partir da fermentação da glicose.

Bioquímica envolvida: o teste de Voges & Proskauer é baseado na detecção do acetil-metil-carbinol

(acetoína), um produto neutro, derivado do metabolismo da glicose. Quando as enterobactérias
degradam a glicose por fermentação ácida mista elas diferenciam-se em dois grandes grupos
considerando-se os produtos finais obtidos: (1) aquelas que produzem ácidos e gases como por
exemplo a E. coli; (2) aquelas que além da produção de ácidos e gases, acumula grande quantidade
de 2-3-butanediol e/ou acetil-metil-carbinol, como é o modelo de fermentação apresentado pelo grupo
Enterobacter-Klebsiella. Na presença de oxigênio atmosférico e de álcali ocorre uma oxidação destes
produtos neutros em Diacetila que representa o reagente de cor no teste de Voges & Proskauer. Ao
realizarmos o teste de VP empregando o reativo de Barrit, inicialmente há oxidação da acetoína em
presença de alfanaftol, KOH 40% e oxigênio atmosférico em diacetila.

Numa segunda etapa, a Diacetila liga-se ao núcleo "Guanidínico" da arginina e com o alfanaftol com a
produção de uma coloração vermelha, indicativa de um teste positivo (presença de acetoína).

Meio de cultivo: VM/VP (Clark & Lubs)

Reagentes empregados: (Barrit)

1. Solução alcoólica de alfanaftol a 5%.
Preparo: dissolver 5g de alfanaftol em 80mL de álcool etílico absoluto, transferir para um balão
volumétrico e completar o volume para 100mL com álcool etílico absoluto.

90
2. Solução de hidróxido de potássio a 40%.
Preparo: pesar 40g de hidróxido de 'potássio e dissolver em água destilada (aproximadamente 80mL),
aquecer se necessário. Levar a um balão volumétrico com a capacidade de 100mL e completar o
volume com água destilada. Guardar os reagentes em refrigerador a 4ºC.

Leitura e interpretação: a uma alíquota de 2,5mL do meio VM/VP (retirado assepticamente) e com
48h de incubação, adicionar 0,6mL da solução alcoólica de alfanaftol; 0,2mL da solução de hidróxido
de potássio a 40%. Homogeneizar cuidadosamente (retirar a bucha de algodão). Deixar a temperatura
ambiente por 10 a 15 minutos (tempo de leitura).
Positivo: desenvolvimento de uma coloração vermelha na superfície do meio.
Negativo: desenvolvimento de uma coloração amarela na superfície do meio (cor dos reativos). A
mistura dos reativos pode ocasionar o aparecimento de uma cor acobreada.
PROVA DE VP

3.5. CITRATO (SIMMONS)

Princípio: determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono
para o seu crescimento com consequente alcalinização.
Bioquímica envolvida: normalmente, o metabolismo do citrato envolve a condensação de uma
molécula acetil com a coenzima A mais o oxalacetato, para iniciar o ciclo de Krebs. A grande maioria
das bactérias utiliza o citrato pelo ciclo dos ácidos tri-carboxílicos ou através da via fermentativa. A
clivagem do citrato envolve a participação da citratase. O citrato é transformado em acetato e

91
oxalacetato sendo este último transformado em piruvato e CO2. O meio de cultivo utilizado para a
fermentação do citrato também contém um sal inorgânico de amônia. O microrganismo que usa o
citrato como única fonte de carbono também utiliza o sal de amônia como única fonte de nitrogênio. A
degradação destes sais produz amônia (NH3) com a consequente alcalinização.

Meio de cultura: Simmons, pH 6,9.

Fórmula:
Sulfato de magnésio..................................................................................................0,2g

Fosfato dihidrogenado de amônia.............................................................................1,0g

Fosfato dipotássico....................................................................................................1,0g

Citrato de sódio..........................................................................................................2,0g

Cloreto de sódio.........................................................................................................5,0g

Ágar-ágar..................................................................................................................15,0g

Solução alcoólica de azul de bromotimol a 1%..........................................................0,08g

Água destilada.......................................................................................................1000mL
Indicador de pH: Azul de Bromotimol.
Ácido - coloração amarela, pH 6,0

Alcalino - coloração azul da prussia

Meio não inoculado - coloração verde, pH 6,9

Meios desidratados: Difco, BBL, Merck

Técnica de Semeadura: Estria superficial = risco.

Leitura e interpretação:
Positivo: crescimento bacteriano com o desenvolvimento na superfície do meio de uma coloração azul
intensa.

Negativo: ausência do crescimento microbiano. Não ocorre alteração na cor do meio de cultivo.

92
PROVA DE CITRATO

4. EXEMPLOS DE ALGUNS MEIOS DE CULTIVO SELETIVOS DIFERENCIAIS

4.1. ÁGAR MANITOL SALGADO:

Finalidade: Ágar seletivo para a demonstração de estafilococos patogênicos em material clínico, leite,
carne, pescado ou outro material objeto de investigação.

Modo de atuação: A elevada concentração de sal (7,5%) suprime o crescimento da maioria das outras
bactérias, os estafilococos crescem mais ou menos livremente. A degradação da manita (manitol) a
ácido, característica que pode aparecer paralelamente a patogenicidade, é comprovada pela viragem
do indicador de pH (vermelho de fenol).

Fórmula:

Peptona especial....................................................................................................10,0`g
Extrato de carne ....................................................................................................... 1,0 g
Cloreto de sódio ..................................................................................................... 75,0 g
D(-) Manita ............................................................................................................. 10,0 g
Vermelho de fenol .................................................................................................... 0,025 g
Ágar-ágar ............................................................................................................... 12,0 g
Água destilada ................................................................................................... 1000,0 mL

93
Preparo: Suspender 108,0 g do meio desidratado (MERCK) em 1000,0 mL de água destilada ou
desmineralizada (recente). Deixar em contato por 15 minutos (encharcar o ágar). Dissolver em BM
fervente até a completa dissolução, agitando constantemente. Autoclavar por 15 minutos a 121ºC.
Resfriar o meio a 45-50ºC. Vazar volumes de aproximadamente 15 mL para placas de Petri 100x15
mm. Deixar solidificar a temperatura ambiente. Controlar a esterilidade e a qualidade do meio
preparado.

NOTA: devido ao intenso efeito inibidor, semear as placas com um “pesado” inóculo do material a ser
investigado. Incubar a 35ºC durante 24-48 h.

Leitura e Interpretação: Os estafilococos manitol positivos apresentam colônias com um halo amarelo
luminoso. As colônias dos estafilococos manitol negativos não apresentam qualquer alteração na cor
original do meio de cultura, podendo às vezes, no entanto, produzir uma ligeira modificação na cor do
meio.

4.2. ÁGAR EOSINA AZUL DE METILENO (HOLT.HARRIS & TEAGUE):

Finalidade: Ágar seletivo para o isolamento de germes Gram negativos (enterobactérias) a partir de
fezes, água e outros materiais, objeto de investigação.

Modo de atuação: os corantes do meio de Teague (azul de metileno e “eosina Y”) formam o sal
eosinato-azul de metileno responsável pela cor achocolatada do meio de cultura. Quando ocorre o
desenvolvimento de germes lactose positivos a fermentação de lactose provoca a acidificação do meio
de cultura, resultando na dissociação do complexo eosinato-azul de metileno e a eosina retoma a sua
cor original amarela com um “brilho metálico” (fluorescência através da luz refletida) e também o azul
de metileno, que promove uma coloração escura (azul escuro ou preto) sobre as colônias dos germes
lactose positivos. O conteúdo da lactose e sacarose possibilita a diferenciação de salmonelas e
shigelas, lactose negativas e sacarose negativas da flora contaminante lactose negativa, porém
sacarose positiva (P. vulgaris, Citrobacter). Os germes acompanhantes indesejáveis, sobretudo a flora
Gram positiva é amplamente inibida pelos corantes existentes, presentes no meio (azul de metileno e
eosina amarela).

Fórmula:
Peptona de caseína ............................................................................................... 10,0 g
Lactose ..................................................................................................................... 5,0 g
Sacarose .................................................................................................................. 5,0 g

94
 Fosfato dipotássico .................................................................................................. 2,0 g
Eosina “Y” (amarela) ................................................................................................ 0,4 g
Azul de metileno....................................................................................................0,065 g
Ágar-ágar ............................................................................................................ ...13,5 g
Água destilada ................................................................................................... 1000,0 mL

Preparo: Suspender 36 g de meio desidratado e deixar em contato com 1000,0 mL de água destilada
ou desmineralizada. Dissolver em BM fervente até a completa dissolução. Autoclavar por 15 minutos a
121ºC. Resfriar em água corrente até aproximadamente 50ºC e vazar volumes de aproximadamente
15,o mL para placas de Petri 100x15 mm. O pH do meio assim preparado deve ficar em torno de 7,1.

Leitura e interpretação: Colônias transparentes, ou âmbar, salmonelas ou shigelas E. coli, colônias

pretas com brilho metálico. Colônias de Enterobacter maiores que a da E. coli, mucosas centro pardo
escuro.

ATIVIDADE PRÁTICA

1. A partir de dois cultivos bacterianos em ágar inclinado (amostras n.º 1 e n.º 2) com 18-24 h de
incubação na estufa a 35ºC, semear respectivamente para os meios de cultura abaixo relacionados.

1.1. ÁGAR-UREIA: semear por estria superficial, utilizando-se o auxílio de uma alça de semeadura
bacteriológica e incubar na estufa a 35ºC por 24 h (até 6 dias). Proceder a leitura e a interpretação.

1.2. CALDO VM/VP: semear com o auxílio de uma agulha de semeadura bacteriológica, um pequeno
inóculo por dispersão e incubar na estufa a 35ºC durante 2 a 5 dias. Proceder a leitura e a
interpretação.

1.3. CALDO INDOL: semear por dispersão, utilizando-se o auxílio de uma agulha de semeadura
bacteriológica, incubar na estufa a 35ºC por 24-48 h. Proceder a leitura e interpretação.

1.4. ÁGAR CITRATO: semear com o auxílio de uma agulha de semeadura bacteriológica, uma
pequena estria (risco de 1-2 cm), incubar na estufa a 35ºC durante 24-48 h. Proceder a leitura e
interpretação.

95
 INDOL
Tubo 13x100mm
Inóculo leve
Semeadura por dispersão

VM
Tubo 12x120mm
Inóculo leve
Semeadura por dispersão

VP
Tubo 12x120mm
Inóculo leve
Semeadura por dispersão

Amostra
CITRATO
Tubo 13x100mm / Inóculo leve
Semeadura por estria superficial

Ureia
(Tubo 13x100 mm)
Semeadura por estrias superficiais
Inóculo pesado

96
 2. LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

PROVAS BIOQUÍMICAS RESULTADOS

AMOSTRA 01* AMOSTRA 02*

Ureia Christensen

Indol

Vermelho de metila

Voges Proskauer

Citrato de Simmons

*Identificação da amostra

__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

3. Definir prova bioquímica e citar qual a sua aplicação em microbiologia.

______________________________________________________________________

______________________________________________________________________

97
17
TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS
AGENTES ANTIMICROBIANOS:
ANTIBIOGRAMA

1. INTRODUÇÃO

A sensibilidade dos microrganismos a drogas pode ser investigada em rotina pelos métodos de
diluição (técnicas de microdiluição e macrodiluição em caldo, técnica de diluição em ágar), de Etest®,
de difusão em ágar (técnica de difusão em ágar) e de eluição do disco em caldo (bactérias anaeróbias).
Nos métodos de diluição, concentrações previamente determinadas da droga são incorporadas ao
meio de cultura, o microrganismo é semeado e o sistema incubado em temperatura e atmosfera
adequadas. Depois de um período de tempo definido, verifica-se a menor concentração da droga que
foi capaz de impedir o crescimento do microrganismo. O meio pode ser líquido ou sólido. Nos métodos
de difusão, deixa-se a droga difundir no meio de cultura sólido a partir de um reservatório, que pode ser
um orifício no meio de cultura, uma tira ou um disco de papel de filtro ou mesmo uma pastilha.

Depois que o microrganismo é uniformemente semeado, coloca-se a droga no meio de cultura,

incuba-se o sistema e verifica-se depois de 18-24 horas, se o crescimento do microrganismo foi inibido.
O significado da inibição é interpretado de acordo com a técnica usada. Considerando-se que na
prática bacteriológica a técnica mais utilizada é a de difusão em ágar pelo sistema de discos proposta
por Kirby-Bauer, descrevemos abaixo os principais aspectos técnicos deste procedimento, com base
nas recomendações de especialistas nacionais e estrangeiros.

a. Definições

Concentração inibitória mínima (CIM) – é a menor concentração de um agente antimicrobiano

que impede o crescimento visível no microrganismo em testes de sensibilidade.

Concentração bactericida mínima (CBM) – é a menor concentração de um agente

antimicrobiano capaz de provocar morte celular (efeito irreversível).

98
 Sendo assim, o valor de CIM = 4 µg/ml e CBM = 8 µg/ml.

b. Teste de sensibilidade aos agentes antimicrobianos

1.2.1 Método Qualitativo:

Disco difusão: baseia-se no depósito de discos de papel de filtro impregnados de antibiótico à

superfície das placas de Petri contendo meio de cultura.

Figura 1. Para a leitura dos resultados deve-se observar e medir o halo de inibição,
comparando com a tabela abaixo para determinar a susceptibilidade aos antibióticos: S (Sensível), R
(Resistente) e I (Intermediário).

99
 1.2.2 Métodos Quantitativos

1.2.2.1 Diluição em caldo

a) Macrodiluição em tubos: Implica no preparo de diluições seriadas e logarítmicas de

antimicrobiano (por exemplo 1, 2, 4, 8 µg/ml) em um meio de cultura líquido.

b) Microdiluição: corresponde à miniatura da técnica de diluição em tubos. Implica no uso de

uma placa de Elisa estéril, com 96 poços, com fundo em formato de “U”, que permite uma melhor
visualização do crescimento bacteriano.

1.2.2.2 Diluição em ágar: compreende incorporação de concentrações seriadas e logarítmicas de

um antimicrobiano em meio de cultura na forma de ágar e distribuído em placas de Petri individuais.
Cada placa representa uma concentração de antimicrobiano. O uso do replicador de Steers permite a
inoculação simultânea de 32 amostras bacterianas simultaneamente sobre o ágar contido na placa de
Petri.

1.2.2.3 Etest®: é uma fita plástica disponível comercialmente, impregnada por concentrações
crescentes de antimicrobiano na face ventral e marcada, na face dorsal, com a escala das
concentrações testadas.

1.3 Interpretação

A categoria que a bactéria é colocada, isto é, Resistente, Intermediária ou Sensível, é obtida

pelo tamanho do halo de inibição, medido em mm, de acordo coma tabela padronizada por comitês
internacionais. Nos laboratórios do Brasil utiliza-se a padronização do BrCAST Brazilian Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing que a cada ano publica tabela com valores atualizados.

Os critérios de interpretação adotados nas tabelas (sensível, resistente e intermediário) são

desenvolvidos por correlação entre halos de inibição e concentração inibitória mínima (CIM), em testes
de sensibilidade realizados pelos métodos padronizados de diluição em caldo e em ágar. Os pontos de
corte estabelecidos nas tabelas para a determinação de sensibilidade ou resistência se relacionam as
concentrações séricas das drogas utilizadas

Abaixo estão descritas as categorias de Sensível, Resistente ou Intermediário de acordo com o

CLSI documento M100-S15 traduzido pela ANVISA para os laboratórios Brasileiros

As interpretações ‘sensível’, ‘intermediária’, ou ‘resistente’ das mensurações do diâmetro dos

halos de inibição são liberadas como indicado a seguir.

100
 1.3.1 Sensível (S)

A categoria “sensível” significa que uma infecção por uma determinada cepa pode ser tratada
adequadamente com a dose de agente antimicrobiano recomendada para esse tipo de infecção e
espécie infectante, exceto quando contra-indicado.

1.3.2 Intermediária (I)

A categoria “intermediária” inclui isolados com CIMs do agente antimicrobiano que se

aproximam de níveis sanguíneos e tissulares atingíveis e para os quais as taxas de resposta podem
ser inferiores àquelas para isolados sensíveis. A categoria “intermediária” implica eficácia clínica nos
sítios corpóreos de concentração fisiológica das drogas (por exemplo, quinolonas e ß-lactâmicos na
urina) ou quando é possível usar uma dose da droga maior que a normal (por exemplo, ß-lactâmicos).
Essa categoria também inclui uma zona-tampão, o que deverá impedir que pequenos fatores técnicos
não sujeitos a controle causem discrepâncias importantes na interpretação, especialmente no caso de
drogas com margens estreitas de farmacotoxicidade.

1.3.3 Resistente (R)

As cepas “resistentes” não são inibidas pelas concentrações sistêmicas dos agentes
antimicrobianos geralmente atingíveis nos regimes terapêuticos normais e/ou se inserem na faixa de
maior probabilidade de ocorrência de mecanismos específicos de resistência microbiana (por exemplo,
ß-lactamases), além da eficácia clínica não ter sido confiável nos estudos terapêuticos.

Assim entende-se que matematicamente que:

Bactéria resistente é aquela que possui a CIM≥ concentração sérica do antimicrobiano testado;

Bactéria sensível é aquela que possui a CIM≤1/3 da concentração sérica do antimicrobiano testado;

Bactéria intermediária é aquela que a CIM ≤ R ou a CIM é ≥ S.

2. TÉCNICA DE DIFUSÃO EM ÁGAR

2.1. Meio de cultura:

Entre os vários meios de cultura disponíveis, o ágar de Mueller-Hinton é considerado o melhor

para a realização dos testes de susceptibilidade de rotina, devido os seguintes fatores:

• Boa reprodutibilidade em diferentes partidas do meio;

• Apresenta baixa concentração de inibidores para sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas

• Proporciona crescimento satisfatório da maioria dos patógenos

101
 • Devido a tradição de uso encontra-se disponível na literatura, para estudos comparativos, uma
grande quantidade de resultados do antibiograma obtidos com este meio de cultura. O meio de
Mueller-Hinton deve ser adicionado de sangue de carneiro ou coelho quando as necessidades
do germe o exigirem. Para as espécies do gênero Haemophilus o meio deve ser preparado sob a
forma de ágar chocolate.

2.2. Estocagem dos discos:

Os cartuchos ou frascos contendo os discos de papel de filtro impregnados com os agentes

antimicrobianos geralmente são fornecidos em recipientes individualizados apropriados. Os métodos de
acondicionamento devem assegurar as condições anidras adequadas. Para estocagem dos discos por
longo período de tempo, é necessário observar os seguintes cuidados:

• Manter os discos refrigerados (≤ 8ºC) ou congelados a -14ºC, ou até mesmo em temperaturas

inferiores a -14ºC, dependendo da droga;

• Para preservar a potência, congelar os discos contendo drogas da família dos ß-lactâmicos.
Estes discos, quando refrigerados (2-8ºC), apresentam validade de uma semana;

• Retirar os frascos de discos do refrigerador ou freezer uma a duas horas antes do uso. Antes de
abri-los, mantê-los fechados até ocorrer o equilíbrio com a temperatura ambiente. Este
procedimento reduz ao mínimo a formação de água de condensação devido ao choque térmico;

• No caso do uso de dispositivo mecânico para aplicação dos discos, ele deve estar acondicionado
em recipiente fechado e rígido, contendo um agente dessecante. Antes de abri-lo, observar os
cuidados descritos anteriormente para evitar o choque térmico;

• Evitar excesso de umidade nos recipientes que contém os discos, substituir o agente dessecante
quando o indicador mudar de cor;

• Quando fora de uso, manter o dispositivo para aplicação de discos em refrigerador (2-8ºC);

• Utilizar os discos contendo agentes antimicrobianos dentro do prazo de validade indicado pelo
fabricante no rótulo do produto. Descartar de uso os discos após expirado o prazo de validade.

102
 2.3. Suspensão padrão de sulfato de bário

É usada para padronizar a densidade do inóculo em aproximadamente 1,5x108 UFC/ml, que

corresponde a uma turbidez equivalente ao tubo ½ da escala de McFarland.

Técnica de preparo:

• Adicionar 0,5mL de uma solução 0,048M de Cloreto de Bário (11,7g de BaCl2.H2O para 1000mL
de água destilada) à 99,5mL de uma solução de 0,36N (1% v/v) de ácido Sulfúrico (1mL de
H2SO4 para 99mL de água destilada);

• Verificar a densidade da turbidez desta suspensão padrão em espectrofotômetro a 625nm. A

absorbância encontrada deve estar entre 0,08 a 0,1;

• Distribuir volumes de 4-6mL para tubos de ensaio com tampa de rosca de tamanho idêntico
aqueles usados para o preparo do inóculo;

• Apertar bem as tampas de rosca dos tubos. Selar com parafina ou Parafilm®. Estocar os tubos a
temperatura ambiente, ao abrigo da luz;

• Antes do uso, agitar rigorosamente a Suspensão Padrão de Sulfato de Bário em agitador de

tubos tipo “mixer”;

• Após 3 meses do preparo, substituir a Suspensão Padrão de Sulfato de Bário ou verificar a

densidade em espectrofotômetro (625nm).

2.4. Preparo do inóculo

Método padrão:

• A partir de um cultivo em placa de ágar nutriente, selecionar 4 a 5 colônias bem

isoladas e do mesmo tipo morfológico;

• Assepticamente, com auxílio de alça bacteriológica, tocar a parte superior do centro de

cada colônia e transferi-las para um tubo de ensaio contendo 4-5mL de caldo Mueller-Hinton

103
 • Ajustar a turbidez do contendo as colônias bacterianas a uma turbidez visualmente
comparável com aquela da suspensão padrão de sulfato de bário. Para executar esta etapa
da técnica de forma apropriada, usar iluminação adequada e para auxiliar a comparação
visual da turbidez, observar os tubos (teste e padrão) contra um fundo branco com linhas
pretas contrastantes, ou sobre um texto de jornal.

Procedimento alternativo padronizado: método do crescimento

• A partir de um cultivo em placa de ágar nutriente, selecionar 4 a 5 colônias bem isoladas e do

mesmo tipo morfológico;

• Assepticamente, com auxílio de alça bacteriológica, tocar a parte superior do centro de cada
colônia e transferi-las para um tubo de ensaio contendo 4-5mL de caldo Mueller Hinton

• Incubar na estufa em aerobiose a 35-37ºC até obter ou exceder a turbidez da Suspensão

Padrão de Sulfato de Bário (geralmente de 2 a 8 horas);

• Ajustar a turbidez da cultura em crescimento ativo em caldo com solução salina esterilizada
(NaCl 0,85%) ou caldo nutriente até obter uma turbidez visualmente comparável com aquela da
suspensão padrão de sulfato de bário.

2.5. Semeadura da placa

Dentro de 15 minutos da padronização da turbidez da suspensão do inóculo, assepticamente,

introduzir um cotonete ou “swab”, pressioná-lo firmemente contra a parede interna do tubo de ensaio,
acima do nível do líquido, para remover o excesso da suspensão do inóculo do “swab”. A seguir,
semear a superfície do ágar de Mueller-Hinton de maneira uniforme. Efetuar a semeadura três vezes,
sem recarregar o “swab”, inoculando por estrias nos planos paralelo, perpendicular e diagonal ao
diâmetro da placa. Deixar a placa secar à temperatura ambiente por três a cinco minutos.

2.6. Aplicação dos discos

Os discos podem ser aplicados com dispositivos mecânicos múltiplos ou individuais, ou

manualmente com auxílio de uma pinça ou de um estilete. Qualquer que seja o procedimento, os

104
discos devem ser pressionados levemente contra a superfície do meio, para assegurar o contato
adequado e a difusão uniforme da droga. Os discos devem ser colocados pelo menos 20mm da borda
da placa e devem distar um do outro de pelo menos 30mm. Considerando-se que algumas drogas se
difundem quase que instantaneamente, o disco não pode ser movido de posição após o contato com a
superfície do ágar de Mueller-Hinton. Colocar no centro da placa os discos dos antibióticos que se
difundem com menos intensidade, como por exemplo, polimixina, bacitracina e vancomincina. Uma
sugestão a respeito dos agentes antimicrobianos a serem testados na prática bacteriológica é
mostrado na tabela 01.

2.7. Incubação das placas

Inverter as placas e colocá-las na estufa, em anaerobiose, a 35ºC dentro de 15 minutos após a

aplicação dos discos.

2.8. Leitura das placas

Após 16 a 18 horas de incubação, examinar cada placa e medir, com auxílio de uma régua, o
diâmetro da zona de completa inibição incluindo o diâmetro do disco. O halo de inibição do ágar
Mueller-Hinton é medido macroscopicamente, em mm, pelo lado externo do fundo da placa, utilizando-
se luz refletida sobre um fundo escuro. Se o organismo testado for uma amostra de Staphylococcus
spp., a placa deve ser incubada por 24 horas e usar luz transmitida para facilitar a visualização de
amostras resistentes a meticilina (oxacilina). No caso do Mueller-Hinton ser adicionado de sangue,
medir as zonas de inibição do crescimento na superfície do meio de cultura, com a tampa da placa
removida, utilizando luz refletida.

3. Controle de qualidade:

Com a finalidade de avaliar a precisão e a exatidão dos testes, utilizam-se amostras padrões
onde sua sensibilidade para os diferentes antimicrobianos e diferentes metodologias é conhecida. Por
exemplo, Staphylococcus aureus (ATCC - American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD, 29852, USA - 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 27853), que devem ser testadas quando do preparo ou aquisição de cada lote de discos ou dos
painéis contendo os agentes antimicrobianos.

NOTA: O método de difusão em ágar pelo sistema de discos tem sido padronizado para testar
patógenos de crescimento rápido que incluem enterobactérias, Staphylococcus spp., Pseudomonas

105
spp., Acinetobacter spp. e alguns estreptococos e foi modificado para testar algumas espécies
fastidiosas, tais como Haemophilus spp., Neisseria spp., e Streptococcus pneumoniae. Este método
não é ainda aplicado para outras bactérias.

ATIVIDADE PRÁTICA

TRABALHO INDIVIDUAL:

1. Ao início da aula prática, o aluno deve fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%,
e lavar as mãos com água e sabão durante 15-20 segundos;

2. PREPARO DO INÓCULO

2.a. Assepticamente, com auxílio de alça bacteriológica, transferir várias colônias de um cultivo
bacteriano (cultura pura) de 18-24 horas em placa de ágar nutriente para um tubo de ensaio
13x100mm contendo 4mL de caldo Mueller Hinton, previamente identificado com o número da amostra
a ser testada, nome do operador e data, até obter uma turvação visualmente comparável a turbidez da
Suspensão Padrão de Sulfato de Bário, equivalente ao tubo ½ de McFarland (aproximadamente
1,5x108 UFC/ml), conforme demonstração do instrutor

3. SEMEADURA DA PLACA

3.a. Identificar uma placa de Petri 100x15mm contendo ágar Mueller-Hinton com o número da
amostra a ser testada, nome do operador e data;

3.b. Assepticamente, introduzir um “swab” no inoculo preparado e homogeneizar

cuidadosamente por movimento de rotação. Ao retirar o “swab”, pressioná-lo firmemente contra a
parede interna do tubo de ensaio, acima do nível do líquido, para remover o excesso de inóculo do
“swab”. A seguir semear a superfície do ágar de Mueller-Hinton de maneira uniforme. Efetuar a
semeadura em três sentidos sem recarregar o “swab”, inoculando por estrias nos planos paralelo,
perpendicular e diagonal ao diâmetro da placa, conforme demonstração do instrutor. Deixar a placa
secar à temperatura ambiente por três a cinco minutos;

106
4. APLICAÇÃO DOS DISCOS

Com auxílio de um estilete ou de uma pinça, assepticamente, aplicar três discos dos diferentes
agentes antimicrobianos a serem testados na superfície de uma placa 100x15mm contendo ágar de
Mueller-Hinton, previamente identificada com o número da amostra, nome do operador e a data.
Colocar os discos, pelo menos a 20mm da borda da placa e observar a distância de 30mm entre eles
para facilitar a leitura. Após a aplicação, pressionar levemente o disco na superfície do ágar, para
assegurar a difusão uniforme da droga no meio, conforme demonstração do instrutor;

2,0ml

gotas

=

Amostra Salina 0,5ml Salina 4,0ml Tubo ½ de

McFarland

Plano horizontal Plano perpendicular Plano Diagonal Borda

Diâmetro 20mm 3 a 5 minutos

Raio

24 horas
30mm
37ºC
107
5. INCUBAÇÃO DAS PLACAS

Incubar as placas em aerobiose na estufa a 37ºC, durante 16-20 horas.

6. DESINFECÇÃO DA BANCADA E ANTI-SEPSIA DAS MÃOS

Ao término do trabalho, fazer a desinfecção da bancada com álcool 70% e a seguir a anti-sepsia
e a lavagem higiênica das mãos

7. LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

A categoria que a bactéria testada é colocada, isto é, resistente, sensível ou intermediária, é

obtida pela leitura da medida em mm do diâmetro do halo de inibição (incluindo o disco). Interpretar os
resultados encontrados de acordo com a tabela 02. Discutir os resultados encontrados com o professor
responsável.

1. LEITURA E INTERPRETAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA:

A leitura deverá ser realizada segundo as tabelas de sensibilidade que são atualizadas
anualmente. Utilizar as tabelas em anexo.

Agentes antimicrobianos Símbolo Potência Diâmetro do halo de Categoria

inibição (mm)

2. QUESTÕES:

2.1. Definir Concentração Inibitória Mínima (CIM) de um agente antimicrobiano.

2.2. Conceituar bactéria sensível a um determinado agente antimicrobiano.

108
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

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ü LERNER, H. & G.F. DE GODOY. Microbiologia: Aulas Práticas. Curitiba, Faculdade de
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