Hematologia Laboratorial

Hematologia Laboratorial
Brasília-DF.
Elaboração
Caroline Maria Marcos
Produção
Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração

Sumário
APRESENTAÇÃO.................................................................................................................................. 5
ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA..................................................................... 6
INTRODUÇÃO.................................................................................................................................... 8
UNIDADE I
HEMÁCIAS............................................................................................................................................. 9
CAPÍTULO 1
HEMATÓCRITO........................................................................................................................ 13
CAPÍTULO 2
DETERMINAÇÃO DE HEMOGLOBINA........................................................................................ 16
CAPÍTULO 3
FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITÁRIA................................................................................. 19
CAPÍTULO 4
VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS)........................................................................ 24
UNIDADE II
HEMOGLOBINA.................................................................................................................................... 27
CAPÍTULO 1
FERRO SÉRICO....................................................................................................................... 31
CAPÍTULO 2
CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DE FERRO (CTLF OU TIBC)............................................................. 36
CAPÍTULO 3
DETERMINAÇÃO DE HEMOGLOBINA ALCALINO-RESISTENTE...................................................... 38
CAPÍTULO 4
DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL....................................................................................... 41
CAPÍTULO 5
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA.......................................................................................... 43
CAPÍTULO 6
PROVA DE FALCIZAÇÃO.......................................................................................................... 45
UNIDADE III
COAGULOGRAMA............................................................................................................................... 49
CAPÍTULO 1
TESTE DE SANGRAMENTO........................................................................................................ 53
CAPÍTULO 2
TEMPO DE COAGULAÇÃO...................................................................................................... 56
CAPÍTULO 3
RETRAÇÃO DO COÁGULO...................................................................................................... 58
CAPÍTULO 4
PROVA DO LAÇO OU RUMPEL-LEEDE....................................................................................... 60
CAPÍTULO 5
TEMPO DE PROTROMBINA (TP)................................................................................................. 62
CAPÍTULO 6
TEMPO DE PROTROMBINA PARCIAL ATIVADA (TTPA)................................................................... 66
CAPÍTULO 7
TEMPO DE TROMBINA.............................................................................................................. 68
CAPÍTULO 8
PROVA DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA................................................................................... 70
UNIDADE IV
GRUPOS SANGUÍNEOS......................................................................................................................... 74
CAPÍTULO 1
DETERMINAÇÃO DOS GRUPOS SANGUÍNEOS DO SISTEMA ABO............................................... 82
CAPÍTULO 2
TESTE DE COOMBS.................................................................................................................. 86
CAPÍTULO 3
PROVAS DE COMPATIBILIDADE TRANSFUSIONAL....................................................................... 89
UNIDADE V
OUTROS PROCEDIMENTOS HEMATOLÓGICOS....................................................................................... 95
CAPÍTULO 1
CÉLULAS LE............................................................................................................................. 95
CAPÍTULO 2
ANTICORPOS ANTINUCLEARES (ANA)....................................................................................... 97
PARA (NÃO) FINALIZAR.................................................................................................................... 100
REFERÊNCIAS................................................................................................................................. 103
Apresentação
Caro aluno
A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se

entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade.
Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela
interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da
Educação a Distância – EaD.
Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos

conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da
área e atuar de forma competente e conscienciosa, como convém ao profissional que
busca a formação continuada para vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica
impõe ao mundo contemporâneo.
Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo

a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na
profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira.
Conselho Editorial
5
Organização do Caderno
de Estudos e Pesquisa
Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em

capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos
básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar
sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para
aprofundar os estudos com leituras e pesquisas complementares.
A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de
Estudos e Pesquisa.
Provocação
Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes
mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor
conteudista.
Para refletir
Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita
sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante
que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As
reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões.
Sugestão de estudo complementar
Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo,

discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso.
Praticando
Sugestão de atividades, no decorrer das leituras, com o objetivo didático de fortalecer

o processo de aprendizagem do aluno.
6
Atenção
Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a

síntese/conclusão do assunto abordado.
Saiba mais
Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões

sobre o assunto abordado.
Sintetizando
Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o

entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos.
Exercício de fixação
Atividades que buscam reforçar a assimilação e fixação dos períodos que o autor/
conteudista achar mais relevante em relação a aprendizagem de seu módulo (não
há registro de menção).
Avaliação Final
Questionário com 10 questões objetivas, baseadas nos objetivos do curso,

que visam verificar a aprendizagem do curso (há registro de menção). É a única
atividade do curso que vale nota, ou seja, é a atividade que o aluno fará para saber
se pode ou não receber a certificação.
Para (não) finalizar
Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem

ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado.
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Introdução
A Hematologia é a ciência que tem por finalidade o estudo do sangue. Tal palavra é
derivada de dois radicais gregos: Haima (de haimatos), que significa “sangue”, e logos
“estudo, discurso”. O sangue é o veículo por meio do qual as substâncias e os elementos
necessários à vida são transportados pelo organismo; ele é um tecido de coloração
vermelha e com consistência líquida, formado por plasma e diferentes tipos de células,
como: glóbulos brancos (leucócitos), vermelhos (hemácias ou eritrócitos) e plaquetas.
A Hematologia, portanto preocupa-se em compreender o sangue incluindo formação de
seus componentes; órgãos onde estes são produzidos (órgãos hematopoiéticos), como
medula óssea, baço e linfonodos; manutenção, bem como patologias a ele relacionadas.
Diferentes exames laboratoriais fazem parte do setor de Hematologia e são de extrema
importância na pesquisa de causas, monitoria de tratamentos, estabelecimento de
diagnósticos e prognósticos e direcionamentos, auxiliando, portanto, na Medicina. A
presença de um profissional atuando neste setor dentro de qualquer serviço de saúde,
seja ele hospital, laboratório ou clínica, é indispensável devido ao grande número de
doenças relacionadas ao sangue, atuando assim na melhoria da qualidade de vida e na
saúde das pessoas.
Sejam bem-vindos ao Caderno de Hematologia Laboratorial, neste módulo iremos

abordar as principais metodologias utilizadas dentro do setor de Hematologia que são
úteis na identificação de distúrbios sanguíneos bem como o entendimento básico dessas
fisiopatologias.
Objetivos
»» Preparar o aluno, do ponto de vista teórico e prático, para o exercício das
análises clínicas no que se refere ao campo da Hematologia.
»» Fornecer conhecimentos básicos sobre a formação das células sanguíneas;

alterações quantitativas e qualitativas destas células, bem como exames
que fazem parte de um setor de Hematologia.
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HEMÁCIAS UNIDADE I
Muitas doenças podem afetar tanto a produção como a função dos glóbulos
vermelhos, resultando em consequências para a saúde dos indivíduos por
elas acometidos. A mais conhecida dentre estas é a anemia, que possui
uma variedade de tipos devido às diferenças nas causas, desde produção
insuficiente de glóbulos vermelhos pela medula óssea, pela produção deles
com baixa taxa de hemoglobina ou destruição acelerada desses glóbulos
vermelhos. As anemias são consideradas como sinal de doenças de base
responsáveis por ocasionar alteração sanguínea. Entre as causas podemos
citar: ingestão baixa de ferro ou absorção reduzida pelo organismo que pode
ter caráter genético devido a mutações nas moléculas de hemoglobina ou
alteração da quantidade de hemoglobina produzida, defeitos genéticos nas
proteínas das membranas e/ou no citoesqueleto dos glóbulos vermelhos que
pode ser de origem autoimune, incapacidade da medula óssea em produzir
partículas sanguíneas entre outras.
Por isso, o conhecimento dos vários exames sanguíneos, cada um com

uma finalidade específica e realizado por metodologias diferentes – desde
abordagens mais simples até outras mais complexas, como, por exemplo:
hemograma, hematócrito, eletroforese de hemoglobina entre outros –, é de
grande importância para adquirir informações sobre alguma patologia que o
indivíduo possa ter contraído ou estar desenvolvendo (permitindo o combate
antes que ela se espalhe pelo organismo), sendo vital no estabelecimento de
diferentes diagnósticos e na determinação da terapêutica ou, ainda, obter
informações básicas sobre suas funções orgânicas.
Nesta unidade, vamos fornecer uma compreensão básica da função das hemácias,
como ocorre sua produção no organismo, sua morfologia e algumas patologias a elas
relacionadas.
O sangue pode ser definido como um tecido que se apresenta na forma de fluido
contendo várias substâncias químicas em solução e uma diversidade de células em
suspensão. Ele atua em todas as atividades vitais do organismo, desde respiração e
nutrição celular, até o controle de infecções e hemorragias. O sangue é constituído de
9
UNIDADE I │ HEMÁCIAS
duas frações: 55% para o plasma e 45% para as células. A porção acelular, ou plasma,
é constituída de 91,5% de água que serve de solvente das substâncias orgânicas e
minerais e ainda de veículo para as células, moléculas e íons, e o restante é formado
por proteínas, como fibrinogênio, importante para o processo de coagulação do sangue,
sais e outros constituintes orgânicos em dissolução (VIVAS, 2013). Entre as funções
do sangue, temos: transporte de gases, defesa do organismo, coagulação, veiculação
de nutrientes, regulação térmica e hídrica e manutenção do equilíbrio ácido-base. A
fração celular apresenta três tipos de células: glóbulos brancos (leucócitos), vermelhos
(hemácias ou eritrócitos) e plaquetas (trombócitos).
Figura 1. Demonstração dos componentes celulares encontrados no sangue.
Fonte: Giovanny Rebouças. Material didático. Disponível em: <http://www.cenapro.com.br/images/documentos/03-

sangueehematopoese-130216113700-phpapp02.pdf>.
A hematopoese, ou também hemocitopoese ou hematopoiese, é o processo

de formação e desenvolvimento das células sanguíneas e ocorre a partir de um
precurssor comum pluripotente (stem-cell ou célula-tronco).
A produção de glóbulos vermelhos e da maioria das células sanguíneas após o nascimento

é realizada pela medula óssea, miolo gelatinoso que preenche os ossos longos e do
esterno, participam também desta tarefa os tecidos linfoides que se localizam no timo,
nas amídalas, nos glânglios linfáticos, no baço e nas Placas de Peyer no intestino. Vale
lembrar que a medula óssea também possui certa quantidade de tecido linfoide, sendo
que em determinadas condições pode ser responsável única pela produção de células
do sangue.
No período intrauterino, as primeiras células sanguíneas do embrião são geradas

muito precocemente, a partir da terceira semana de gestação no folheto embrionário
denominado mesoderma, presente no saco vitelínico (19º dia até o 6º mês de gestação).
Posteriormente, fígado (por volta do primeiro mês) e baço passam a atuar como órgãos
hematopoiéticos temporários. A produção a partir da medula óssea ocorre a partir do
10
HEMÁCIAS │ UNIDADE I
6o ao 8o mês de gestação, até os cinco anos de idade. Após esse período ocorre uma
substituição gordurosa na medula dos ossos longos e, portanto, na vida adulta somente
ossos da pelve, esterno, crânio, úmero, fêmur e costelas serão capazes de produzir
células sanguíneas.
As hemácias, também conhecidas como eritrócitos, são os glóbulos vermelhos do

sangue, embora sejam anucleadas, constituídas apenas por uma membrana plasmática
e citoplasma, elas são bastante complexas. É o elemento presente em maior quantidade
no sangue. Existem cerca de 4,5 a 6 milhões de hemácias por milímetro cubo no sangue
de um homem adulto (e na mulher cerca de 4,5 a 5,5 milhões).
Sua produção ocorre na medula óssea pela maturação de eritroblastos em um fenômemo

denominado de eritropoiese. Esse processo é altamente regulado, uma vez que a
produção de hemácias ocorre sem que haja um aumento da massa eritrocitária, tal
evento é controlado principalmente pela eritropoietina. A eritropoietina, um hormônio
glicoproteico, quando há baixa da pressão de oxigênio ou diminuição do número de
glóbulos vermelhos, é secretada e atua estimulando a proliferação de células-tronco
precursoras de hemácias.
Na eritropoiese uma célula dita progenitora mieloide (stem-cell, pluripotencial) se divide

em outros tipos celulares conhecidos como linhagem grânulo-monocítica e linhagem
eritroide-megacariocítica (estes progenitores não são morfologicamente reconhecíveis).
A linhagem eritroide-megacariocítica origina a série eritroide, sendo os proeritroblastos

as primeiras células morfologicamente reconhecidas, estas sofrerão maturação
por meio da ação da eritropoietina, diferenciando-se em eritroblastos basófilos,
que se diferenciam em eritroblastos policromáticos (onde se inicia a produção de
hemoglobina), seguida da diferenciação para ortocromáticos (início da degeneração
nuclear). Posteriormente saem da medula óssea e caem na corrente sanguínea na forma
de reticulócitos (núcleo já expulso da célula), estas células ainda possuem RNA em seu
citoplasma e, portanto, apresentam capacidade de sintetizar proteínas, como as cadeias
de globina. Os reticulócitos amadurecidos perdem o conteúdo de RNA que possuem e
então se transformam em eritrócitos incapazes de sintetizar hemoglobina.
Figura 2. Representação da eritropoiese. Em ordem: proeritroblasto, eritroblasto basófilo, eritroblasto policromático,

eritroblasto ortocromático, reticulócito e eritrócito.
Fonte: <http://www.uff.br/hematolab/pluginfile.php/28/mod_folder/content/2/Hematopoiese.pdf?forcedownload=1>.
11
As hemácias contêm hemoglobina e, portanto, realizam o transporte de gases, como

o oxigênio dos pulmões até as células do corpo e uma pequena quantidade de gás
carbônico das células para os pulmões, a coloração vermelha é devido à presença da
hemoglobina. Em relação à sua morfologia, os glóbulos vermelhos apresentam a forma
circular e bicôncava sendo dotada de grande flexibilidade devido ao arranjo de sua
membrana. São elementos anucleados, mas que permanecem exercendo sua função
mesmo após a perda do núcleo devido à presença de enzimas citoplasmáticas capazes
de metabolizar pequenas quantidades de glicose. Seu diâmetro varia de 6 a 8 μm e
possui vida média de 120 dias.
O equilíbrio na quantidade de hemácias em um organismo ocorre devido ao balanço

entre a produção de hemácias – a eritropoise, que ocorre normalmente na medula
óssea, porém em fetos e situações especiais, como anemias severas, pode ocorrer em
outros órgãos, como fígado e baço – e a hemocarotese, que consiste na eliminação de
hemácias envelhecidas e que são destruídas por fagocitose pelo baço.
Figura 3.
A) Representação de hemácias. B) Esfregaço sanguíneo evidenciando eritrócitos.
Fonte: A - <http://vidaemfoco-bio.blogspot.com.br/2012_03_18_archive.html>. B - (THRALL et al., 2004).
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CAPÍTULO 1
Hematócrito
O nível de hematócrito mede basicamente o número ou a concentração de eritrócitos

no sangue. Os eritrócitos, como já dito anteriormente, possuem a hemoglobina que se
liga ao oxigênio e o transporta por meio do sangue a todos os tecidos do corpo. Quando
os níveis de oxigênio estão baixos na corrente sanguínea, o hormônio eritropoietina
estimula a produção de mais eritrócitos pela medula óssea.
O hematócrito (ou Ht ou Htc), ou volume globular, permite mensurar o volume

ocupado pelos glóbulos vermelhos em um determinado volume de sangue total.
Atualmente o hematócrito é obtido por aparelhos automatizados, no entanto a
metodologia automatizada não mede diretamente o hematócrito, mas, sim, o volume
da hemácia ou tamanho médio da hemácia (VCM) e quantifica o número de hemácias
no sangue. O valor do hematócrito é obtido então pelo cálculo: Ht= VCM x número
de hemácias/10.
Antigamente utilizava-se o método de hematócrito em que se obtinha a porcentagem

de hemácias pela centrifugação a 10.000 rpm por 5 minutos do sangue contido
dentro de um tubo capilar. O micro-hematócrito é uma técnica mais simples e de fácil
execução, mesmo com o avanço da tecnologia nesta área é de extrema importância
que o profissional domine a técnica de forma manual, impossibilitando que qualquer
problema na parte automatizada venha a comprometer a rotina laboratorial.
O micro-hematócrito consiste basicamente em coletar a amostra de sangue em um tubo

contendo anticoagulante (que pode ser EDTA ou citrato), após adiciona-se uma pequena
quantidade de sangue dentro de um microcapilar, bastando para isto encostar o tubo
na posição horizontal, levemente inclinado, e a amostra entrará por capilaridade, após
estes procedimentos, o capilar é fechado com o uso de selante ou chama, feito isso o
capilar é então centrifugado, após a centrifugação é possível notar a presença de 3 fases
distintas no capilar: o plasma que fica superficialmente, a camada de leucócitos que
normalmente é fina e esbranquiçada e a camada de hemácias que ficam compactadas
ao fundo, então realiza-se a leitura baseando-se em um cartão especial alinhando o
início da coluna de hemácias em zero e o final do plasma em 100% e, assim, se obtém o
valor em porcentagem.
Através desta técnica é possível diagnosticar e monitorar prováveis anemias resultantes

da deficiência de ferro ou sangramento recente e também policitemias resultantes de
uma desidratação (GALARÇA, 2012).
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O hematócrito baixo pode representar anemia, sangramento, desnutrição, falta ou

diminuição de vitamina B12, ácido fólico ou ferro, leucemia e hiper-hidratação. Já o
hematócrito alto pode indicar presença de desidratação (que diminui o nível de plasma
no sangue), baixos níveis de oxigênio no sangue, doença pulmonar (quando os pulmões
não são capazes de inalar quantidade suficiente de oxigênio, os rins reagem aumentando
a produção de células vermelhas), doença cardíaca congênita e eritrocitose, ele também
pode estar aumentado em casos de uso de eritropoietina, substância utilizada em casos
de doping no atletismo, por aumentar a capacidade de transporte de oxigênio pelo
aumento do número de hemácias.
Os valores de referência do hematócrito variam interlaboratorialmente, mas geralmente

o valor normal do hematócrito é: para mulheres, 35-45% e para homens, 40-50%.
Figura 4. Esquema representativo da técnica de micro-hematócrito.
Fontes: <http://adamogama.blogspot.com.br/2011/08/microhematocrito_12.html>, <http://www.ugr.es/~jhuertas/

EvaluacionFisiologica/Hematocrito/hemat.htm>.
A eritrocitose é definida como um aumento proporcional de glóbulos vermelhos

no sangue periférico.
A determinação de um paciente com eritrocitose deve ser cuidadosa para permitir um

diagnóstico preciso e o estabelecimento de uma relação causal, possibilitando a distinção
entre um distúrbio primário e uma alteração secundária.
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Caso os níveis de hematócrito permaneçam elevados, o indivíduo apresentará maiores

chances de formação de coágulos sanguíneos (trombose venosa profunda), doença
cardíaca e derrame. Na situação oposta, quando há um baixo hematócrito, pode-se ter
uma maior propensão a hemorragias e anemias. Quando o nível de Ht se eleva acima
dos limites de referência, o sangue se torna mais espesso, apesar da maior quantidade
de eritrócitos e, consequentemente, oxigênio, o sangue se movimenta mais lentamente,
portanto os tecidos do organismo na realidade poderiam estar recebendo menos
oxigênio que o normal, causando efeitos notáveis no corpo, como debilidade, fadiga,
dores de cabeça, intolerância ao calor, sudorese, febre, irritações na pele, entre outros.
Pessoas que vivem há mais de seis meses em altitudes superiores a 2.500 metros
passam a formar maior quantidade de eritrócitos, devido ao ar ser mais rarefeito e
consequentemente apresentar menor quantidade de oxigênio, e apresentam um
hematócrito elevado. Nesses indivíduos cerca de 60 a 65% do volume sanguíneo é
constituído de hemácias para superar as dificuldades impostas pela escassez de ar
atmosférico nos locais em que vivem. Isto justifica o porquê de muitos atletas preferirem
realizar seus treinamentos físicos em locais de alta altitude, com isto aumentam a
quantidade de hemácias no organismo adquirindo vantagens como maior energia e
menos cansaço em uma competição, pois seu “estoque de oxigênio” demora mais a
acabar (NIGRO, 2010).
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CAPÍTULO 2
Determinação de hemoglobina
A hemoglobina é uma proteína complexa, consistindo de uma unidade heme (que

contém um átomo de ferro no interior de quatro estruturas porfirínicas) e uma unidade
de globina (dois pares de cadeias polipeptídicas, um par de cadeias α e um par de cadeias
β). O teor de hemoglobina no sangue varia principalmente com o número de eritrócitos
e em menor grau com a quantidade de hemoglobina presente em cada eritrócito.
Para a determinação da hemoglobina, podemos utilizar diferentes métodos de

dosagem em que a hemoglobina é transformada em um composto estável. Para a
determinação, emprega-se aparelhos fotocolorimétricos ou espectrofotômetros, estes
devem estar calibrados, a curva de calibração auxilia na determinação da concentração
de hemoglobina, utilizando-se para isto padrões comerciais de boa qualidade ou que
tenham sido produzidos por meio de um método rigoroso (exemplo: a determinação de
ferro hemoglobínico). A partir de padrões bem-estabelecidos, as curvas de calibração
são geradas por técnicas como a colorimetria e os fatores de calibração são determinados
(fator de calibração = concentração do padrão/absorbância do padrão). Entre os
métodos para a determinação da concentração de hemoglobina temos os que seguem.
Método da cianometa-hemoglobina
Trata-se de um método colorimétrico que se baseia na oxidação da hemoglobina para
cianometa-hemoglobina por meio da adição de cianeto de potássio. Esta metodologia
denominada cianometa-hemoglobina baseia-se na oxidação do átomo de ferro (ferro II)
da molécula de hemoglobina pelo ferroacianeto de potássio em pH fracamente alcalino,
formando a meta-hemoglobina que é convertida em cianometa-hemoglobina após a
reação com cianeto de potássio, esta é então determinada por espectrofotometria. A
coloração avermelhada que se observa é proporcional à concentração de hemoglobina
presente na amostra (Bioclin). A amostra utilizada neste método é o sangue total obtido
livre de hemólise, colhido com EDTA, citrato ou oxalato. Podem ser utilizados kits
comerciais, com reagentes semiprontos e solução padrão comercial. Nesta metodologia
todas as formas da hemoglobina podem ser medidas, exceto sulfa-hemoglobina.
Neste método, coleta-se 0,02 mL de sangue em tubos de ensaio contendo 5 mL do

reativo de Drabkin (que contém 200 mg de ferrocianeto de potássio, 50 mg de cianeto
de potássio, 140 mg de fosfato monopotássico, 1 mL de detergente aniônico em 1 L de
água destilada). As amostras são homogenizadas suavemente, deixadas por 10 minutos
16
à temperatura ambiente e, após este período, realiza-se a leitura em espectrofotômetro,

na D.O. (densidade óptica) de 540 nm, como branco (para calibração) utiliza-se o reativo
de Drabkin. A leitura também pode ser realizada em fotocolorímetro com filtro verde. O
cálculo é realizado da seguinte maneira: absorbância obtida da amostra avaliada x fator
de calibração = concentração de hemoglobina no sangue (em g/dL).
Os valores de referência em g/dL, para o presente método são: Homens 12,5 a 17,5 g/dL e
mulheres 11,5 a 15,5 g/dL, porém estes valores podem variar dependendo do teste utilizado.
A determinação da hemoglobina, juntamente com resultados obtidos pelo hematócrito e
a contagem do número de reticulócitos, é de extrema valia para o diagnóstico de anemias
e policitemias bem como para a avaliação da evolução durante o tratamento.
Figura 5. Demonstração da determinação de hemoglobina pelo método de cianometa-hemoglobina.
Método da oxiemoglobina
Neste método a hemoglobina é capaz de ser convertida a oxiemoglobina quando
em contato com água, porém, atualmente, já não é tão utilizada. Ela não é capaz de
dosar compostos anormais que possam estar presentes, como meta-hemoglobina ou
sulfa-hemoglobina. Neste método, 0,020 mL de sangue são adicionados a 5 mL de água
destilada, são colocadas então duas gotas de amônia a 50% e realiza-se a homogeneização.
A leitura é realizada em espectrofotômetro (540 nm) ou fotocolorimétrico (filtro
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verde) contra um branco contendo água e duas gotas de amônia. O cálculo é realizado
(g de hemoglobina/100 mL de sangue) = absorbância X fator de calibração.
Método SLS-hemoglobina
Nesta metodologia é utilizado o surfactante laurilsulfato de sódio (que lisa as hemácias
liberando a hemoglobina). A reação segue a ordem: hemólise dos eritrócitos, alteração
da conformação da molécula de globina, oxidação do ferro e formação do complexo
SLS-hemoglobina. A quantificação é feita pela leitura da absorbância a 555 nm.
Método azida meta-hemoglobina

Este método se baseia na conversão da hemoglobina em um produto estável denominado
azida meta-hemoglobina, que apresenta espectro de absorbância semelhante à
cianometa-hemoglobina, porém utiliza-se um reagente menos tóxico.
Hemoglobinômetros portáteis
Consistem em equipamentos contendo fotômetro pré-calibrado, portátil, com
comprimento de onda fixo, que funciona com pilhas ou corrente elétrica, projetados
para a realização da medição de hemoglobina. Utilizam microcubetas contendo
deoxicolato sódico que atua hemolisando as hemácias, a hemoglobina livre é convertida
em meta-hemoglobina pelo nitrato de sódio. Após, a meta-hemoglobina é convertida em
azida meta-hemoglobina por adição de azida sódica. As amostras são lidas a 565 nme
880 nm.
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CAPÍTULO 3
Fragilidade osmótica eritrocitária
A fragilidade osmótica eritrocitária (F.O.E.) avalia a resistência osmótica das células

vermelhas em soluções tamponadas de NaCl em água destilada em concentrações
decrescentes de 0,85% a 0% . O volume da hemácia aumenta à medida que a
concentração de sal diminui, em concentrações de 0,40-0,48% algumas membranas
já se rompem, iniciando a hemólise e, em soluções ainda mais hipotônicas, isto é 0,34-
0,28%, a hemólise é total. No entanto, quando a resistência globular está diminuída,
observa-se hemólise de 0,6%-0,7%, o que representa um caso patológico.
As hemácias podem se romper quando em contato com soluções hipotônicas, como a

água, por exemplo. Isto ocorre porque a concentração de soluto da água é menor do que
a da hemácia, assim, a água é direcionada para o interior da hemácia difundindo-se por
todo o seu interior até rompê-la. Os esferócitos têm fragilidade osmótica aumentada,
pois apresentam uma membrana mais escassa do que a membrana de uma hemácia
normal, o que os impedem de acumular água em seu interior.
Figura 6. Mudança morfológica de hemácias de acordo com a hipotonicidade do meio.
Fonte: <http://descubrelasciencias.blogspot.com.br/2010/10/diario-de-una-entrada-ii.html>.
O esferócito é uma hemácia que apresenta defeito em sua membrana, que

resulta em instabilidade do citoesqueleto celular, a hemácia perde superfície
tornando-se esférica e de tamanho menor (perda da característica forma
bicôncava). É encontrado na esferocitose hereditária, e existem quatro tipos de
anormalidade na proteína da membrana da hemácia que podem ser a causa:
deficiência de espectrina (mais comum), deficiência de espectrina associada a
anquirina, deficiência da banda 3 ou defeitos na proteína 4.2.
A resistência depende da forma, do volume, do tamanho, do conteúdo da hemoglobina

e da meia-vida dos eritrócitos e pode ser alterada por vários fatores fisiológicos ou
19
patológicos (ELIAS et al., 2004). O controle do volume celular por meio da eliminação
ativa de solutos é um dos mecanismos pelos quais a lise da membrana eritrocitária é
evitada in vivo (MAKINDE; BOBADE, 1994). As células, quando suspensas em meio
hipotônico, aumentam até atingir um volume crítico de hemólise antes de serem
lisadas. Assim, a fragilidade celular varia conforme a concentração de sal e segue uma
distribuição normal em pessoas sadias (JAIN, 1973). As hemoglobinas normais são
solúveis em soluções de alta molaridade.
A curva avalia então a capacidade dos glóbulos vermelhos de incorporar água em seu
interior, sem que ocorra a lise da célula (CEACLIN, 2012). Por esse, motivo pode-se
dizer que a resistência é dependente da relação entre volume/superfície do glóbulo. A
habilidade dos glóbulos vermelhos normais em resistirem à hipotonicidade provém da
sua forma bicôncava, o qual permite que a célula aumente de volume até 70%, superado
este limite ocorre a lise.
Para melhor avaliação da F.O.E., os resultados são expressos em gráficos nos quais a
porcentagem de hemólise distribui-se no eixo das ordenadas, e as concentrações das
soluções hipotônicas de NaCl, no eixo das abscissas, resultando em uma curva sigmoide
que representa a distribuição da frequência acumulativa da fragilidade osmótica dos
eritrócitos em uma população de células normais (PONDER, 1948), ou por meio da
curva derivativa, idealizada por Perk et al., (1964).
Influenciam a fragilidade osmótica dos eritrócitos: forma, volume e tamanho do

eritrócito, assim como tipo e quantidade de hemoglobina, elasticidade das membranas
e composição estrutural e química delas (PERK; FREI; HERZ, 1964). Quando as
células são menores, elas apresentam uma capacidade limitada de expansão e por
isso atingem o volume hemolítico crítico mais precocemente. O tempo de vida dos
eritrócitos também influencia, já que eritrócitos mais “velhos” são mais frágeis que os
mais jovens e correspondem a quase 30% da população eritrocitária. É um teste de
difícil padronização e, por esse motivo, pouco realizado nos laboratórios.
Entre os fatores que podem afetar a composição da membrana celular, temos as doenças
associadas a alterações metabólicas, como insuficiência renal e doença hepática, que
alteram a proporção de fosfolipídios e colesterol na membrana dos eritrócitos, alterando
também a F.O.E.
A F.O.E. é um teste útil no auxílio da caracterização de diferentes anemias que

apresentam como característica principal a diferença de tamanho e forma das hemácias.
Fragilidade osmótica aumentada é encontrada em anemia ferropriva e talassemia,
e uma diminuição na esferocitose hereditária e esferocitose associada a anemias
hemolíticas autoimunes.
20
A curva apresentar-se-á aumentada em: anemia esferocítica eritrocitária, anemia

hemolítica não esferocítica adquirida, doença hemolítica do recém-nascido, após
queimaduras graves, anemias hemolíticas secundárias, gestação, cirrose, entre outros.
E apresentar-se-á diminuída: no início da infância, na anemia ferropriva, na talassemia,
na anemia falciforme e na anemia megaloblástica (WALLACH, 2003. CAIRES;
GILENO, 2012).
A anemia ferropriva corresponde a uma das anemias mais comuns por

distúrbios do metabolismo do ferro. É a desordem nutricional mais
prevalente em todo o mundo, acometendo principalmente crianças
menores de cinco anos e mulheres em idade fértil. Existem estimativas
de mais de meio bilhão de pessoas com deficiência de ferro no mundo.
Esta ocorre como resultado de perda sanguínea crônica, perdas urinárias,
ingestão e/ou absorção deficiente e aumento do volume sanguíneo. A
anemia é uma manifestação tardia e insidiosa da carência, que surge
quando as reservas orgânicas esgotam-se em virtude de um balanço
negativo. Os locais de reserva de ferro dos macrófagos estão depletados
e, portanto, não podem fornecê-lo para o plasma, consequentemente a
concentração plasmática de ferro cai a níveis que limitam a eritropoiese
(CARVALHO; BARACAT; SGARBIERI, 2006).
Diferentes tipos de doenças (que podem variar de acordo com a raça) ocorrem devido
a alterações genéticas na estrutura da hemoglobina. A população brasileira apresenta
uma grande mistura de raças que podem levar a uma diversidade de alterações na
estrutura da hemoglobina e consequentemente a diferentes patologias.
Dentre estas doenças, podemos citar a talassemia, na qual ocorre uma redução ou
ausência na produção de um dos tipos de cadeia de globina que compõem a hemoglobina.
Indivíduos heterozigotos normalmente não apresentam sintomas, embora se possa
detectar tal defeito por meio de exames laboratoriais. Já indivíduos que carregam mais
de um gene anormal (sejam homozigotos ou heterozigotos compostos – aqueles que
carregam uma associação de defeitos), apresentam manifestações clínicas, podendo
ser acometidos por anemia grave incompatível com a vida até a forma mais branda
praticamente assintomática. A talassemia pode acometer a produção tanto de cadeias
α como de cadeias β e, por isso, são classificadas em: α-talassemias e β-talassemias.
As α-talassemias, por sua vez, ainda podem ser subdivididas em traço talassêmico
(deleção de um ou dois genes α), doença da HbH (três genes α afetados) e a síndrome
da hidropsia fetal (quatro genes α afetados); e as β-talassemias, em talassemia menor,
intermediária e maior.
21
Na talassemia, a cadeia que não sofre alteração é produzida em taxas normais, porém
encontra-se em excesso dada a ausência da outra cadeia complementar com a qual
se possa formar o tetrâmero. As cadeias normais em excesso precipitam-se na célula,
lesando a membrana e provocando a destruição prematura da hemácia (TORRES;
BONINI-DOMINGOS, 2005), dificultando o processo de eritropoise e causando
hemoglobinização deficiente dos eritroblastos (SANTOS, 2011).
Alfa-talassemias
São mais frequentementes causadas por deleções dos genes correspondentes e podem
ter duas causas: hereditárias (mais comuns) ou adquiridas (geralmente devido a algum
processo patológico primário). O traço talassêmico α+ heterozigoto (-α/ α α), também
denominado portador silencioso, resulta em uma forma talassêmica praticamente
assintomática e com alterações laboratoriais mínimas ou ausentes. O traço talassêmico
α+ homozigoto e o traço talassêmico α0 heterozigoto, que correspondem à perda de dois
genes alfa, ou seja, -α/- α e --/ α α, respectivamente, caracterizam-se por apresentarem
anemia (Hb geralmente entre 11,0 a 13,0 g/dL), hemácias hipocrômicas e microcíticas
(VCM etre 75-80 fl) e presença de hemoglobina Barts no nascimento (5-10%). A
hemoglobina H formada na vida adulta é rapidamente proteolisada pela própria
hemácia, o que dificulta sua detecção (CANÇADO, 2006).
Hemoglobina Barts é formada por quatro cadeias gama, apresentando grande afinidade
ao oxigênio.
A interação entre as formas α+ e α0 resulta na doença da HbH. Os portadores dessa forma

apresentam de 25-50% de hemoglobinas Barts no nascimento e 5% a 30% de hemoglobina
H na vida adulta. Os quadros clínicos são mais evidentes, caracterizando-se por anemia
(Hb entre 8,0 a 11,0 g/dL), microcitose (VCM entre 55 a 65 fl), entre outros.
A outra forma é a homozigose da talassemia α0, denominada de hidropsia fetal, e é a

forma mais grave entre as talassemias, causando morte intrauterina ou logo após o
nascimento. Neste caso, a eletrofore de hemoglobina demonstra a presença de quase
100% de hemoglobinas Barts.
Beta-talassemias
Clinicamente são identificados dois grupos de talassemia beta: talassemia menor (traço
talassêmico ou talassemia heterozigota beta) e talassemia maior (talassemia homozigota
beta ou anemia de Cooley). Alguns pacientes ficam entre esses dois extremos, sendo
considerados portadores de talassemia intermediária (ELGHETANY; DAVEY, 1999). A
22
talassemia menor não requer tratamento, sendo considerada apenas uma característica
genética, e não uma doença. Seu portador não apresenta sintomas, por ser geralmente
assintomático, mas apresenta aumento discreto de glóbulos vermelhos caracterizando
uma policitemia hipocrômica, a concentração de hemoglobina varia de 10 a 1 g/dL
(Melo-Reis et al., 2006), porém é importante que a pessoa saiba que é portadora do
traço, pois esta pode ser transmitida aos filhos, gerando um portador de talassemia
maior caso o cônjuge também seja portador de traço talassêmico. Na intermediária,
o quadro pode variar desde leve anemia até casos em que pode haver necessidade de
transfusão de hemácias.
Na talassemia maior ocorre grave anemia hemolítica, microcítica e hipocrômica

com necessidade de transfusão de hemácias a cada 3-4 semanas, icterícia,
hepatoesplenomegalia e alterações ósseas.
A esferocitose hereditária pertence ao grupo de anemias hemolíticas caracterizadas pela

forma esférica do eritrócito ao invés da forma bicôncava e possui transmissão. Várias
evidências levaram à localização do defeito primário na membrana da hemácia, esta
patologia é ocasionada por alterações quantitativas e/ou qualitativas de proteínas da
membrana do eritrócito (GRANJO et al., 2003). Ocorre uma redução da composição
lipídica e consequentemente diminuição da superfície da membrana celular, isto esta
correlacionado com a gravidade da doença. Esta alteração proporciona uma maior
entrada de sódio ao interior do eritrócito, o que resulta em maior demanda de energia
para expulsar esse íon da célula, visando a homeostase; como consequência a hemácia
perde a sua capacidade de deformabilidade, sofrendo lesões em sua membrana. A herança
da esferocitose hereditária é do tipo autossômica dominante, sendo a heterozigose a
forma mais comum e a homozigose incompatível com a vida. Entre as proteínas que se
encontram alteradas nesta patologia, temos: espectrina, anquirina, banda 3 e proteína
4.2. Os sintomas mais evidentes associados são: anemia, icterícia e esplenomegalia.
Figura 7. A) Representação do teste de Fragilidade Osmótica Eritrocitária. Lise anormal de eritrócitos pode ser
observada em soluções levemente hipotônicas no canto direito da fila inferior de tubos1; B) Curva de Fragilidade
Osmótica Eritrocitária.
Fonte: <http://institutocoi.org/wp-content/themes/coi/pdf/Outras-anemias-hemoliticas.pdf>.
1 Fonte:<http://www.med-ed.virginia.edu/courses/path/innes/rcd/membrane.cfm>.
23
CAPÍTULO 4
Velocidade de Hemossedimentação (VHS)
Velocidade de hemossedimentação ou taxa de sedimentação de eritrócitos trata-se de

um teste simples e de baixo custo utilizado como marcador inespecífico de resposta
inflamatória, auxiliando na identificação de doença ativa (COLLARES; VIDIGAL,
2004). Este teste consiste em determinar a sedimentação de hemácias de uma
amostra de sangue venoso anticoagulado, em uma coluna de líquido graduada por um
determinado período de tempo, a medida é feita em milímetros, após 60 minutos. O
processo de sedimentação de hemácias é divido em três fases. Na primeira fase ocorre
a queda individual dos eritrócitos, antes da sedimentação. A segunda fase consiste na
formação de agregados globulares que sedimentarão em uma velocidade dependente de
tamanho e número, nesta etapa ocorre a sedimentação máxima. A terceira fase também
é conhecida como de sedimentação constante.
Os eritrócitos apresentam resíduos com carga negativa do ácido siálico em sua superfície,
o que faz com que haja repulsão entre as células e os eritrócitos permaneçam em
suspensão. Quando ocorre a neutralização dessas cargas, devido à presença de proteínas
plasmáticas que são carregadas positivamente, as hemácias se unem e precipitam. Os
eritrócitos são “puxados” para baixo pela gravidade e tendem a se aglomerar no fundo do
tubo. No entanto, as hemácias apresentam cargas elétricas negativas em sua superfície
e, portanto, à medida que se aproximam do fundo do tubo, repelem-se umas às outras.
Essa força magnética de repulsão se contrapõe à gravidade, diminuindo naturalmente
a velocidade com que as hemácias caem. Porém, se no plasma houver outras estruturas
com cargas positivas (proteínas), estas anulam as cargas negativas das hemácias,
permitindo a aglutinação e acelerando a velocidade de hemossedimentação.
Figura 8. Representação do principio do VHS.
Fonte: <http://www.reumatologiaavancada.com.br/wp-content/uploads/2011/02/VHS2.jpg>.
24
O método de referência utilizado é baseado na padronização da metodologia descrita por

Westergren na década de 1920, o qual consiste em utilizar sangue venoso anticoagulado
com citrato de sódio em uma diluição de 1:4 em uma coluna (coluna) de vidro graduada,
com 200 mm de comprimento e 2,5 mm de diâmetro interno. Preenche-se a coluna até
a marca zero (extremidade superior, exatamente a 200 mm da ponta da pipeta), esta é
deixada apoiada em um suporte na posição vertical por uma hora. A leitura é dada pela
altura da coluna de plasma, no limite de separação com as hemácias sedimentadas. O
resultado é expresso em mm/h, que corresponde à distância do menisco até o topo da
coluna de eritrócitos sedimentados (HACHEM et al., 2010).
O método de Wintrobe utiliza um tubo de hematócrito preenchido com sangue venoso

colhido com oxalato. Os valores normais diferem, pois o tubo apresenta metade do
comprimento e graduações diferentes do utilizado no método de Westergren (SANTOS;
CUNHA; CUNHA, 2000).
Há variações na metodologia utilizando-se sangue total sem diluição, porém estudos

demonstram que esta adaptação pode interferir na sensibilidade do teste e, portanto,
não é preconizado pelo International Committee for Standardization in Hematology
(HACHM et al., 2010). Outra técnica como o Microtest X (Alifax®) foi desenvolvida
com o intuito de automatizar a leitura, a redução do tempo do teste, bem como a
utilização de recursos humanos, trata-se de uma metodologia de fotometria cinética
capilar, em que 150 µL de amostra se sangue com EDTA são aspirados em um tubo
capilar e centrifugados. Um microfotômetro infravermelho (650 nm) realiza mil
leituras no período de 20 segundos para estimativa da densidade óptica e então se pode
observar a microssedimentação eritrocitária a 37oC. Os impulsos elétricos detectados
pelo fotodiodo estão diretamente relacionados à concentração de hemácias presentes
no capilar. A curva de sedimentação é analisada e os dados convertidos em valores
Westergren aplicando-se um modelo de regressão linear (SOARES; SANTOS, 2009) .
A velocidade com que as hemácias sedimentam depende do volume e da forma dos

eritrócitos e das proteínas do plasma. O VHS não mede a viscosidade sanguínea, mas
pode ser influenciado por proteínas plasmáticas, como β-globulinas, α e γ-globulinas
e albumina.
Entre os fatores que podem alterar os valores de VHS estão: jejum, viscosidade do
plasma, concentração de íons hidrogênio, tamanho e forma dos eritrócitos, concentração
de colesterol, conteúdo hemoglobínico, concentração de fibrinogênio e das globulinas do
plasma, bem como idade, sexo e tabagismo (DICKINSON, 1998), e também interferentes
analíticos, como erro na diluição da amostra, inclinação do tubo, demora em se realizar
o teste após a coleta da amostra e temperatura do ambiente. Vale ressaltar que se trata
25
de um teste inespecífico, pois é empregado no diagnóstico de uma ampla variedade de

condições clínicas.
Variações na concentração plasmática de proteínas presentes na fase aguda das

inflamações, principalmente a de fibrinogênio, seguido de globulinas e albuminas,
podem ser detectadas pela VHS. Se houver uma grande quantidade dessas moléculas
citadas anteriormente, ocorrerá uma maior agregação com consequente depósito de
hemácias e, portanto, maior será a distância entre o agregado eritrocitário formado e o
topo da coluna (maior VHS) (COLLARES; VIDIGAL, 2004). A VHS pode estar alterada
e elevar-se em algumas semanas em diferentes situações, como em doenças infecciosas
(exemplo: hepatite aguda, infecções bacterianas, tuberculose), reumatológicas (ex.:
artrite reumatoide, polimialgia reumática, lúpus eritematoso sistêmico), cardíacas (ex.:
doença inflamatória pélvica, gravidez, menstruação), neoplasias (ex.: mieloma múltiplo,
linfoma, leucemias, carcinomas), bem como hipertireoidismo, cirrose, insuficiência
renal entre outras. Estudos sugerem que a proteína C reativa seja um marcador mais
específico de processo inflamatório e encontre-se alterado em questão de dias.
Os valores de referência considerados normais são: VHS primeira hora – mulheres

até 8 mm; homens até 10 mm; VHS segunda hora (não é utilizado com frequência)
– mulheres até 25 mm; homens até 20 mm. A VHS aumenta com a idade em pessoas
normais, considerando-se isto, há uma fórmula para estimar-se o valor máximo de
referência: homens = idade/2; e para mulheres (idade+10)/2. Condições fisiológicas
como menstruação, gravidez e envelhecimento podem elevar o valor de VHS.
Figura 9. A) Pipetas de Westergren sendo preenchidas com sangue a ser analisado. B) Esquema representativo de VHS.
Fonte: A) <http://www.ictsl.net/productos/01d63694a80f7ae0a/pipetawestergrensistemaaquiselp3.html>. B) <http://www.

cromakit.es/product.php?id_product=2219>.
26
HEMOGLOBINA UNIDADE II
Durante o processo de amadurecimento das células que vão originar as

hemácias, ocorre a produção, em seu citoplasma, e a síntese de uma proteína
muito importante, que vai se acumulando em seu interior, a hemoglobina.
O oxigênio é o elemento essencial para sustentar a vida humana, e o seu
transporte no organismo é realizado pela hemoglobina, que tem como
principal função o seu transporte dos pulmões para as células, fornecendo
energia à célula para o desempenho de suas funções. Se a oferta adequada
de oxigênio não circula ao longo do corpo para órgãos e tecidos vitais, há
consequências, como dano cerebral e falência de órgãos, que podem resultar
em morte. A análise dos níveis de hemoglobina indica a capacidade do sangue
em transportar oxigênio.
Mais de dois bilhões de pessoas no mundo todo possuem anemia, sendo a

anemia ferropriva a responsável por pelo menos metade de todos os casos
de anemia, trata-se de uma anemia decorrente da privação de ferro no
organismo que acarreta a diminuição da produção, alterações no tamanho
e teor da hemoglobina nas hemácias. O ferro faz parte do conteúdo da
hemoglobina. Hemoglobinopatias é um termo genérico que agrupa uma
grande variedade de patologias causadas por alterações na hemoglobina.
Essas anormalidades podem ser estruturais devido a alterações sofridas pelos
aminoácidos que compõem a sua cadeia de globina ou podem ter origem
devido a um desbalanço na sua síntese. Há mais de 300 tipos de alterações
estruturais da hemoglobina, sendo a anemia falciforme a mais conhecida. Já
em relação à produção das cadeias da hemoglobina, as mais conhecidas são
as talassemias. Diferentes conseguências devido a alterações na hemoglobina
podem ocorrer:
»» diminuição da afinidade pelo oxigênio, acarretando em deficiência de

oxigênio nos tecidos;
»» aumento da afinidade pelo oxigênio (mais raro de acontecer);
»» formação de meta-hemoglobina, presença do ferro no estado oxidado

ao invés do estado ferroso;
27
UNIDADE II │ HEMOGLOBINA
»» formação de corpúsculos de Heinz;
»» cristalização e falcização.
Devido a tantos problemas à hemoglobina relacionados, torna-se de grande

importância o conhecimento de sua formação, estrutura e funções.
A hemoglobina é uma proteína presente nos glóbulos vermelhos produzida durante a

eritropoiese e está envolvida diretamente no transporte de oxigênio dos pulmões para
os tecidos do corpo e de dióxido de carbono dos tecidos para os pulmões, além disso
participa do transporte de nutrientes a todas as células do corpo e recolhe substâncias
secretadas pelas células. Ela constitui aproximadamente 35% do peso do glóbulo
vermelho. A hemoglobina é de fundamental importância uma vez que o oxigênio é
pouco solúvel em soluções aquosas, não sendo transportado eficientemente para os
tecidos, simplesmente solubilizado no soro sanguíneo2.
Ela é composta pela porção denominada heme, que contém átomos de ferro em sua
estrutura, e a porção proteica, denominada globina. A hemoglobina é um tetrâmero
composto de dois tipos de cadeias, sendo que uma delas contém 141 aminoácidos
(globina α) e a outra 146 aminoácidos (globina β), cada uma das quais ligadas a um
grupamento heme. A ordem desses aminoácidos na cadeia determina a sua estrutura
primária. A sequência que se encontra esses aminoácidos na cadeia de globina faz com
que ela assuma a forma helicoidal (α-hélice), denominada de estrutura secundária.
Quando a estrutura secundária enovela-se em alguns pontos, ocorre a mudança de
aspecto espiral e alongado para a forma globular, denominada de estrutura terciária.
Cada globina tem uma bolsa capaz de acomodar o grupamento heme protegendo o ferro
contra a oxidação.
Cada grupo heme contém uma parte orgânica (protoporfirina) e um átomo de ferro
que pode estar no estado de oxidação ferroso (+2) ou férrico (+3), porém somente o
ferro na forma +2 que se combina reversivelmente com uma molécula de oxigênio.
Além do oxigênio, este componente sanguíneo também transporta H+ e CO2. Dessa
forma cada molécula de hemoglobina pode potencialmente associar-se com quatro
moléculas de oxigênio. A interação da hemoglobina com o oxigênio é dependente dos
níveis de ferro presentes no organismo, a oxi-hemoglobina, formada após a interação
hemoglobina-oxigênio, ao chegar às células do organismo é liberada e o sangue arterial
transforma-se em venoso. A hemoglobina livre pode ser reutilizada para o transporte
de oxigênio.
2 <http://www2.iq.usp.br/docente/mhgdmede/Vet_2012/proteinas_funcao2009.pdf>.
28
HEMOGLOBINA │ UNIDADE II
Figura 10. Hemoglobina.
Fonte: <http://faqbio.blogspot.com.br/2012/06/por-dentro-do-corpo-humano-hemacias.html>.
A hemoglobina é considerada uma proteína alostérica (regulada por modificações não

covalentes) em que a ligação e liberação de oxigênio é controlada por modificações na
sua própria estrutura causadas pela interação entre o O2 e o grupo heme. Quando o
oxigênio se liga ao grupamento heme, ocorrem mudanças nas propriedades eletrônicas
do ferro e isso leva à mudança de coloração. Assim o sangue arterial apresenta-se
com cor vermelho-forte (rico em oxigênio, vai dos pulmões através do coração para
os tecidos periféricos, e a hemoglobina encontra-se 96% saturada com oxigênio) e o
sangue venoso com a cor vermelho-arroxeado (pobre em oxigênio, retorna ao coração e
é somente 64% saturado com oxigênio). Se o ferro, Fe2+ se oxidar a ferro Fe3+, o oxigênio
não se liga ao grupamento heme.
Outros componentes podem se ligar à hemoglobina com uma afinidade superior ao de

ligação do oxigênio, entre eles: CO (monóxido de carbono), NO (óxido nítrico) e H2S
(sulfeto de hidrogênio). A afinidade química do CO é cerca de 250 vezes maior pela
hemoglobina que o O2.
Um pequeno grupo de genes (α e β) codificam as subunidades da hemoglobina, estes são

expressos sequencialmente durante o desenvolvimento. Genes do cluster α localizam-
se no braço curto do cromossomo 16, e os genes β no braço curto do cromossomo
11 (ANTONARAKIS; KAZAZIAN; ORKIN, 1985). No início do desenvolvimento
embrionário, são formadas três tipos de hemoglobinas resultantes da expressão dos
genes localizados próximos a região 5’ dos clusters, essas hemoglobinas são: Gower-1
com duas cadeias ε (cluster β) e duas cadeias ζ (cluster α), Gower-2 (α2ε2)e Portland (ζ
γ ), estas hemoglobinas consideradas embrionárias deixam de ser produzidas no início
2 2
do desenvolvimento embrionário e sua síntese não é mais reativada.
Na fase fetal, a hemoglobina que predomina é a fetal (HbF), acompanhada de pequena

quantidade de hemoglobina adulta (HbA), situação esta que é invertida quando se
29
aproxima o nascimento. Após o nascimento a HbF ainda constitui cerca de 60% do

total, mas a substituição para a HbA se completa entre o terceiro e o sexto mês de
vida. Adultos apresentam pequena quantidade de HbF (menos de 1%). A produção de
HbF pode ser reativada parcialmente em condições como anemia aplástica, leucemias
agudas, após quimioterapia e outros.
No homem adulto normal, há 3 tipos de hemoglobina: a hemoglobina F (do tipo fetal)

em quantidades muito baixas e duas de tipo adulto, as hemoglobinas A (α2β2), tipo
mais comum que corresponde a 95% da hemoglobina total, e A2 (α2δ2), no qual as
cadeias ζ são sintetizadas no último trimestre após o parto e corresponde a 2,5% do
total de hemoglobinas.
30
CAPÍTULO 1
Ferro sérico
O ferro é um elemento essencial para o metabolismo de todo organismo vivo, atuando

na homeostase celular e participando primordialmente de reações de transferência de
elétrons. Sendo um dos elementos do grupamento heme, está envolvido na captação e
no transporte de oxigênio aos tecidos, na composição de coenzimas do ciclo de Krebs,
na formação de peroxidades e citocromo oxidases que protegem as células do dano
oxidativo, na síntese de DNA e proliferação celular (COOK; BAYNES; SKIKNE, 1992.
LIMA et al., 2004). Entretanto, o excesso de ferro no organismo pode ser extremamente
prejudicial, pois quando encontrado na forma livre pode promover a geração de radicais
de oxigênio por meio da catalização na reação de Fenton, na qual o Fe2+ reage com
peróxido de hidrogênio levando à formação de radicais hidroxil e ânions superóxidos.
Tais radicais são altamente reativos, podendo lesar membranas lipídicas, proteínas e
ácidos nucleicos (VERGA FALZACAPPA; MUCKENTHALER, 2005)2005. Este elemento
possui a capacidade de receber e doar elétrons pela interconversão entre o estado ferroso
(Fe2+) e férrico (Fe3+).
A quantidade total de ferro no corpo é em média, de 35 a 45 mg por quilograma de

peso, dos quais cerca de 65% estão presentes na hemoglobina, aproximadamente 1
mg de ferro está presente em 1 mL de concentrado de hemácias. Cerca de 4% estão
presentes na mioglobina, 1% nos diversos compostos hêmicos que promovem a
oxidação celular, 0,1% combinado à proteína transferrina no plasma sanguíneo e
15-30% armazenados, principalmente no fígado, sob a forma de ferritina (PONKA;
BEAUMONT; RICHARDSON, 1998).
No organismo o ferro é dividido em diferentes compartimentos, armazenado em

hemoglobina e mioglobina, participando do metabolismo celular (compartimento
funcional); armazenados na forma de ferritina (hidrossolúvel, encontra-se no interior
da apoferritina) e hemossiderina (compartimento de estoque), quando há um excesso
de ferro absorvido pelo compartimento funcional, e tem como função reposição de
ferro; e por fim o compartimento de transporte, que realiza a ligação entre os dois
compartimentos anteriores, este é composto principalmente de transferrina (BAYNES,
1996; WORWOOD, 1997). O ferro encontra-se armazenado predominantemente na
forma de ferritina no fígado e no baço. A ferritina está presente na maioria das células
e também em fluidos orgânicos, no plasma é encontrada em baixas quantidades. Ela
está correlacionada com o estoque total de ferro no organismo, por isso a sua dosagem
é utilizada como diagnóstico na investigação de distúrbios no metabolismo do ferro.
31
A hemossiderina é uma molécula hidrófoba presente em sua maioria no sistema fagocítico

mononuclear (monócitos, macrófagos da medula óssea, fígado e baço), e a mioglobina
está presente em quase todas as células dos músculos esqueléticos e cardíaco.
O ferro adquirido na dieta apresenta-se principalmente na sua forma inorgânica (forma

não heme-origem vegetal) ou na forma heme (origem animal, forma que apresenta
melhor absorção) (SIAH et al., 2006). Entre alguns estimulantes para a absorção,
temos ácido ascórbico e proteínas da carne; entre os inibidores da absorção de ferro
não heme, temos: fibras, cereias, chá, refrigerante, café, fosfato (leite), Ca, Zn, Co.
O ferro também pode ser obtido a partir de hemácias senescentes. A ingestão diária
recomendada de ferro é de 18 mg, porém somente 30% deste valor será aproveitado,
cerca de 1 a 2 mg de ferro são absorvidos diariamente pelo epitélio do duodeno através
de microvilosidades presentes em sua superfície e jejuno proximal por células chamadas
enterócitos (EDISON; BAJEL; CHANDY, 2008).
O ferro não heme ocorre principalmente na sua forma oxidada (Fe3+), forma esta não
biodisponível, e por isto necessita passar pelo processo de redução à forma Fe2+ para
então ser transportada através do epitélio intestinal (SIAH et al., 2006). A redução de
seu estado férrico (Fe3+) para o estado ferroso (Fe2+) ocorre na superfície dos enterócitos
pela ação de uma ferroredutase (Dcytb) (ANDERSON et al., 2007). Após a redução, o
ferro é absorvido pela ação do transportador de metal divalente (DMT-1). A quantidade
de ferro absorvida é dependente das necessidades do organismo, portanto, em situações
em que há falta de ferro ou aumento da necessidade (hemólise, gravidez), há uma maior
absorção. Para alcançar essa demanda, há maior expressão de proteínas envolvidas
neste processo, como a proteína DMT-1 e a FPT (ferroportina) (GROTTO, 2008).
A internalização do ferro heme é feita principalmente pela proteína transportadora do

heme-1 (HCP-1), localizada na membrana apical das células do duodeno. No interior
da célula, o ferro é liberado da protoforfirina pela heme oxigenase, sendo armazenado
na forma de ferritina ou liberado do enterócito para o sangue (GROTTO, 2008). O
ferro proveniente da dieta é então transportado no plasma combinado à transferrina
(glicoproteína sintetizada principalmente pelo fígado e em menor quantidade pelo
sistema retículo endotelial e glândulas endócrinas como testículos e ovários) (CONRAD;
UMBREIT; MOORE, 1999).
A transferrina, além de agir nos sítios de absorção de ferro no intestino, também age nos
sítios onde ocorre a degradação da hemoglobina, ligando-se ao metal e transportando-o
através da corrente sanguínea para a medula óssea, onde disponibiliza o ferro para os
precursores de células vermelhas. A transferrina também atua transportando o ferro
para estocagem no baço, na medula óssea e no fígado. Após a liberação do ferro, a
transferrina retorna à circulação, onde é então reciclada. Possui meia-vida de 7-8 dias,
32
além do papel no transporte, minimiza os níveis de ferro livre no plasma, a perda através
da urina e previne os efeitos tóxicos de níveis elevados de ferro livre circulante.
Como a transferrina possui alta afinidade pelo ferro na forma Fe2+, este deve ser oxidado
para a forma Fe3+, a hefaestina, uma oxidase, é responsável por essa conversão. Outra
proteína envolvida no metabolismo do ferro é a proteína da hemocromatose (HFE), que está
relacionada com a regulação da absorção intestinal do ferro, ela interage com o receptor da
transferrina (TfR) detectando seu grau de saturação, sinalizando para o enterócito maior ou
menor necessidade de absorção de ferro. No interior da célula, o ferro absorvido liga-se a
ferritina (responsável pelo estoque do ferro) e hemossiderina (armazena o ferro, mas libera de
forma mais lente) dirigindo-se para a membrana basolateral, onde está a ferroportina (presente
em enterócitos, macrófagos e hepatócitos), que é uma proteína necessária para o transporte
do ferro para o plasma (GROTTO, 2008). A concentração sérica de ferritina é diretamente
proporcional às reservas de ferro no organismo. Cada ng de ferritina corresponde a 10 mg de
ferro armazenado.
Figura 11. Enterócito e proteínas envolvidas na absorção de ferro. Dcytb: ferroredutase; DMT-1: transportador de
metal divalente; HCP-1: proteína transportadora do heme-1; Nu: núcleo; HFE: proteína da hemocromatose; TfR:
receptor de transferrina.
Fonte: Grotto, 2008.
As células que utilizam o ferro, como precursores eritroides, hepatócitos, macrófagos

(armazenamento) e enterócitos (absorção), se comunicam para a manutenção do
equilíbrio. Tal comunicação é desempenhada por um hormônio peptídico pertencente
à família das defensinas denominado hepcidina (KRAUSE et al., 2000)2000. A
hepcidina é um regulador sistêmico da homeostase do ferro, coordenando a utilização
33
e o armazenamento deste mineral no organismo, atua inibindo a absorção intestinal

e a liberação de ferro por macrófagos e enterócitos, mediando o ciclo de absorção
de ferro entre o fígado e intestino (ANDERSON et al., 2007). Sua síntese ocorre
homeostaticamente pela anemia e hipóxia (GANZ, 2006), além de ser regulada por
inflamação e estresse oxidativo.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde, anemia nutricional é o estado em que

a concentração de hemoglobina no sangue é anormalmente baixa em consequência da
carência de um ou mais nutrientes essenciais.
A ingestão deficiente de ferro, principalmente na forma heme, ocasionada pelo baixo

consumo de alimentos de origem animal, é a principal causa da anemia ferropriva. Outros
fatores podem ser citados, como: baixo nível socioeconômico, precárias condições de
saneamento e alta prevalência de doenças infecto-parasitárias, principalmente as que
levam a perdas sanguíneas crônicas, também constituem os determinantes desse tipo
de anemia (COSTA; MONTEIRO, 2004). O sangramento agudo não leva à anemia
ferropriva, pois a perda de hemácias será compensada pelo aumento medular da
produção de reticulócitos, e o ferro necessário será requisitados dos compartimentos
armazenadores.
Doenças que aumentam patologicamente a absorção do ferro são: anemia ideroblástica,

talassemia e hemocromatose. Ocorrem defeitos na absorção de ferro em situações
de cirurgias, enteropatias (doença celíaca), gestação, doação de sangue frequente e
parasitoses (Necator americanos, Ancylostoma duodenale, Trichuris trichura).
A dosagem de ferro sérico (no soro) é solicitada quando há a suspeita de carência ou

sobrecarga de ferro no organismo, que ocorre em casos de distúrbios hematológicos,
tais como diferentes tipos de anemias, hemossiderose (deposição de hemossiderina nos
tecidos) e hemacromatose (absorção demasiada e nociva de ferro). Geralmente o ferro
sérico apresenta-se em valores baixos nos casos de anemia ferropriva, infecções crônicas,
hipoproteinemias, glomerulopatias, infestações parasitárias, neoplasias e menstruação e
aumentados em casos de anemias sideroblásticas, perniciosas e hemolíticas, talassemias,
hepatite aguda, necrose hepática, intoxicação crônica por chumbo, após transfusões
sanguíneas ou pela hemólise do sangue coletado.
Para a realização do teste, a coleta do sangue deve ser realizada preferencialmente pela
manhã, respeitando-se o jejum obrigatório e atentando-se ao fato de o paciente ter
administrado suplemento férrico nas 24 horas que antecedem o teste, o que poderia
levar a resultados falsos. A metodologia para determinação de ferro sérico é denominada
de Goodwin modificada, o princípio de ação baseia-se na liberação de ferro a partir da
transferrina em meio ácido, este é então reduzido ao seu estado ferroso pela ação da
34
hidroxilamina. Posteriormente, o Fe2+ reage com Ferrozine – ácido 3-(2-piridil)-5,6-bis

(4-fenilsulfônico)-1,2,4-triazina – levando à formação de um complexo de coloração
violácea, cuja intensidade é proporcional à concentração de ferro presente na amostra
e possui pico de absorção em 565 nm. Realiza-se a leitura em espectrofotômetro antes
(Absorbância 1) e após a adição do Ferrozine (Absorbância 2). O padrão é uma amostra
com concentração definida de ferro. As limitações são: utilização de água contaminada
por ferro (que aumentará a intensidade do branco, alterando os resultados), drogas que
podem elevar os níveis de ferro sérico (cloranfenicol, estrógenos, etanol, metotrexato e
anovulatórios) e drogas que possam diminuir a concentração de ferro sérico (aspirina
em altas doses, alopurinol, cortisona, corticotropina). Os níveis séricos de ferro
considerados normais são: 65 a 170 µg/dL para homens; 50-170 µg/dL para mulheres;
50-120 µg/dL para criança; 100-250 para recém-nascidos.
Figura 12. Determinação de ferro sérico, metodologia de Goodwin.
Fonte: <http://www.bioclin.com.br/sitebioclin/wordpress/wp-content/uploads/arquivos/instrucoes/INSTRUCOES_FERRO_SERICO.pdf>.
Figura 13. Alterações dos níveis de ferro e outros componentes envolvidos no metabolismo do ferro.
Fonte: <http://www.biotecnica.ind.br/sitebio/informes/ferro_ferritina_transferrina.pdf>.
35
CAPÍTULO 2
Capacidade de ligação de ferro
(CTLF ou TIBC)
O ferro é transportado para macrófagos presentes na medula óssea pela transferrina,

proteína transportadora encontrada no plasma. O nível de ferro no soro mede a
quantidade de transferrina ligada ao soro. Já a capacidade de ligação de ferro (CTLF)
ou TIBC (total iron binding capacity) é a medida da quantidade de transferrina
circulante no sangue e disponível para a ligação ao ferro. Geralmente, uma quantidade
suficiente de transferrina é encontrada em 100 mL de soro com capacidade de
ligação a cerca de 250-450 µg de ferro. Uma vez que a concentração de ferro no soro
seja normal, 100µg/dL, a transferrina pode estar saturada em um terço com ferro.
Já em estados de deficiência de ferro, a CTLF é aumentada e o nível de saturação
da transferrina é menor que 16%. CTLF menor que 200µg/dL é característico de
processo inflamatório.
A metodologia para determinar a CTFL é a colorimétrica, denominada de Goodwin

modificada, na qual um padrão de ferro com concentração conhecida (500 µg/dL) é
incubado com o soro em um tampão de pH 8,3. Ocorrerá então a saturação dos sítios
disponíveis para ferro na transferrina. Após a adição de reagente de cor (Ferrozine®),
o excesso de ferro não ligado forma um complexo de coloração violácea, permitindo
a determinação de ligação de ferro na amostra analisada. A leitura é feita em
espectrofotômetro à densidade óptica de 560 nm. Este método mede a quantidade de
ferro total que pode se unir às proteínas plasmáticas, praticamente toda capacidade
de ligação é devido à transferrina. Da mesma maneira que na dosagem de ferro sérico,
realiza-se a leitura da absorbância antes (Absorbância 1) e após (Absorbância 2) a
adição de Ferrozine. Para a sua determinação, é necessário ter realizado a dosagem de
ferro sérico na amostra.
Um aumento na concentração plasmática de transferrina eleva a CTLF, deste modo

são encontrados valores elevados de CTLF na gravidez (3º trimestre), em deficiências
crônicas de ferro (anemia por deficiência de ferro), no uso de contracepticos orais, na
necrose hepática (destruição de células hepáticas) e após hemorragia aguda. Valores
diminuídos de CTLF ocorrem quando há diminuição da produção de transferrina
(infecções, neoplasias, uremia) ou aumento da perda urinária de transferrina (nefrose).
Por meio desta metodologia, juntamente com a dosagem de ferro, pode-se calcular a
CTLF e o índice de saturação da hemoglobina. Os valores de referência são: para adultos
250-450 µg/dL e para crianças 150-400 µg/dL.
36
Figura 14. Cálculos da capacidade de ligação de ferro, metolodia de Goodwin modificada. CLLF= capacidade
latente de ligação de ferro; 500= concentração conhecida de ferro do padrão utilizado; Ap= absorbância do padrão.
Fonte: <http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B48BA2B98-C8D1-49B2-881F-913FB9FDD5E2%7D_CAP_LIGACAO_FERRO.PDF>.
Com os valores obtidos no CFTL, pode-se realizar a determinação do índice de saturação

da transferrina (IST), que é o valor ideal para detecção fenotípica de hemocromatose
hereditária. A saturação da transferrina é calculada a partir da relação entre a
concentração de ferro no soro ou plasma e a capacidade total de ligação de ferro (CTLF
ou TIBC). A concentração de ferro no plasma é influenciada pelo estado dos estoques de
ferro no corpo, ingestão recente por meio da dieta e desordens inflamatórias. O ideal é
que as amostras de sangue sejam obtidas na condição de jejum para prevenir qualquer
influência devido à ingestão de ferro. Uma alternativa é a medida da capacidade de
desligamento do ferro (UIBC), a qual pode ser determinada por métodos considerados
menos trabalhosos do que os requeridos para a CTLF. Os métodos para cálculo da
saturação de transferrina a partir de ambos, TIBC ou UIBC, estão descritos abaixo:
IST é obtido dividindo a concentração de ferro sérico (FS) pela CTLF, e multiplicando-se
por 100%. Então, IST = FS/CTLF x 100%
Os resultados de FS e CTLF são expressos em µg/dL ou µmol/L. O limite máximo

de referência para a saturação da transferrina é de cerca de 50%. Para o cálculo da
saturação a partir de UIBC, utilizamos a seguinte fórmula:
Saturação da transferrina = FS/(FS+UIBC) x 100%
37
CAPÍTULO 3
Determinação de hemoglobina
alcalino-resistente
Hemoglobina álcali-resistente ou fetal (Hb F) é formada por duas cadeias gama e

duas cadeias alfa, é característica do período fetal do desenvolvimento, sendo a sua
síntese diminuída no período pós-natal. Nos recém-nascidos, a Hb F é quase que
completamente substituída pela hemoglobina adulta em aproximadamente seis meses
pós-natal. Em adultos normais, a Hb F representa menos de 1% das hemoglobinas
totais, com porcentagem média de 0,4%. O perfil de hemoglobinas normais no adulto é
de HbA: 96-98% e HbA2: 2,5% -3,5% e de HbF de 0% a 0,1%.
Funcionalmente, a hemoglobina fetal se difere da adulta, já que é capaz de se ligar

ao oxigênio com uma maior afinidade, dando ao feto em desenvolvimento melhor
acesso ao oxigênio da corrente sanguínea da mãe. O valor de p50 (posição na curva de
dissociação de oxigênio-hemoglobina/ou saturação de oxigênio que define maior ou
menor afinidade da hemoglobina pelo oxigênio) para a Hb F é de aproximadamente
19 mmHg, enquanto que a hemoglobina adulta tem um valor de 26,8 mmHg. Como
resultado da curva de saturação de oxigênio, que mostra a porcentagem de saturação
vs. pressão do oxigênio (pO2), quando a p50 é maior que 26,6 mmHg diz-se que houve
um desvio para a direita da curva, pois a hemoglobina ficou saturada em 50% com pO2
mais elevada, indicando liberação mais fácil (menor afinidade), aumentando, portanto,
a oferta de oxigênio aos tecidos. Já quando a p50 é menor que 26,6 mmHg ocorre
desvio para a esquerda da curva, portanto a hemoglobina continua ligada ao oxigênio,
mesmo com baixos níveis de pO2, o que implica na maior afinidade da hemoglobina
pelo oxigênio e menor oferta de oxigênio aos tecidos.
A maior afinidade por oxigênio pode ser explicada pela falta de interação da Hb F com
2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG), produto exclusivo do metabolismo de hemácias, formado
a partir de um dos intermediários da via glicolítica por uma enzima mutase específica,
devido a diferenças estruturais desta hemoglobina (mudança de um aminoácido que
se encontra no domínio de ligação de 2,3-BPG, de histidina para serina). Em células
vermelhas do sangue de adultos, esta substância compete com o oxigênio pela ligação
à hemoglobina. 2,3-DPG é então um regulador alostérico negativo da hemoglobina, ele
também está presente em células vermelhas do sangue fetal, mas interage com menor
eficiência com a Hb F quando comparada a hemoglobina adulta.
A Hb F também é responsável por obter oxigênio para o feto a partir do sangue materno.
Em relação à estrutura das Hb F e adulta, ambas apresentam duas das quatro cadeias
38
de globinas idênticas (cadeia α), mas a hemoglobina adulta apresenta duas cadeias
β, enquanto que a Hb F apresenta duas cadeias γ. As cadeias β normais ligam-se ao
difosfoglicerato, que participa da liberação do oxigênio. As cadeias γ não se ligam da
mesma forma ao difosfoglicerato e, por consequência, têm uma maior afinidade ao
oxigênio. No ambiente pobre em oxigênio, como a placenta, o oxigênio é liberado da
hemoglobina materna e então é captado pela Hb F. Esta diferença em relação à afinidade
é essencial ao transporte de oxigênio da mãe para o feto.
Figura 15. Curva de saturação de Hb F e adulta e diferenças estruturais dessas hemoglobinas.
Fonte: <http://medicina.med.up.pt/bcm/trabalhos/2006/aminhaproteinafavorita/fetal.html>.
Em algumas talassemias do tipo delta e beta (onde há redução na síntese ou ausência

de cadeias delta e beta), a HbF pode permanecer aumentada; nas beta talassemias,
há redução da síntese de cadeias beta com aumento das hemoglobinas A2 e fetal e na
persistência hereditária de Hb F (PHHF), alteração genética caracterizada pela contínua
produção de Hb F na vida adulta (ZAMARO; HIDALGO; BONINI-DOMINGOS, 2003).
Nas talassemias ocorre redução na síntese de uma ou mais cadeias polipeptídicas que
formam o tetrâmero de hemoglobina, o que normalmente resulta no desenvolvimento
de anemia microcítica (eritrócitos menores) e hipocrômica (eritrócitos descorados).
Ocorrem com maior frequência as talassemias do tipo α e β, seguidas das do tipo alfa-
beta, delta-beta, delta e gama-delta. Há ainda outro grupo, mais raro, caracterizado pela
manutenção de Hb F em quantidades aumentadas na vida adulta por PHHF, muitas
vezes considerada uma forma compensada de delta-beta talassemia (MARTINS, 2010).
A síntese da globina gama também pode ser estimulada por fatores externos, como
leucemias, transplantes de medula óssea, induções químicas e outros. Em adultos, a
produção da Hb F pode ser reativada farmacologicamente, sendo útil para o tratamento
de doenças entre elas a anemia falciforme.
39
A determinação de Hb F pode ser realizada por meio da coloração intraeritrocitária.

Esse método é baseado na diferença que existe na capacidade de dissociação das
subunidades entre Hb A e Hb F, em pH abaixo de 4,0. Como a Hb F é ácido-resistente,
ela não é eluída das células, corando-se facilmente com eritrosina ou similar, enquanto
que outros tipos de hemoglobinas por serem eluídas não fixam o corante. Para isto
realizam-se esfregaços finos, com sangue sem anticoagulante e fixação com etanol
80%. Após a lavagem e secagem, as lamínulas são colocadas em contato com tampão
citrato-fosfato pH 3,3 e, após 5 minutos, são lavadas, coradas então com eritrosina
e observadas em microscópio com aumento de 400 X. Os eritrócitos contendo Hb F
aparecerem corados internamente enquanto os outros que não a contêm permanecem
sem coloração interna. A coloração é homogênea quando todos os eritrócitos aparecem
uniformemente corados e podem ser encontrados em sangue de cordão umbilical de
recém-nascidos e de portadores de PHHF. A coloração é heterogênea quando existem
duas populações eritrocitárias distintas, ou seja, uma corada e outra sem coloração, e
esses são os casos principalmente das diferentes formas de beta-talassemias.
Figura 16. A) Teste negativo para Hb F eritrocitária. Técnica de eluição ácida. B) Teste positivo para Hb F
eritrocitária. Distribuição heterogênea de Hb F. 2/3 dos eritrócios apresentam-se corados. Caso de beta-
talassemia maior. Técnica de eluição ácida.
Fonte: A) <http://www.hemoglobinopatias.com.br/dfalciforme/diagnostico.htm>. B) <http://www.hemoglobinopatias.com.br/

dfalciforme/diagnostico.htm>.
40
CAPÍTULO 4
Dosagem de hemoglobina fetal
As metodologias utilizadas são: método de Singer (utilizado para altas concentrações

de Hb F) e método de Kleihauer-Betker (utilizado para baixas concentrações de Hb F).
O teste de Kleihauer-Betker é utilizado na quantificação da hemorragia feto-materna
e consiste na medição da proporção de hemácias contendo hemoglobina fetal em uma
amostra e é baseado na instabilidade que a hemoglobina A (adulta) apresenta em pH
ácido. Nesta metodologia realiza-se a adição de ácido para proporcionar a destruição
de hemoglobina A e, então, a hemoglobina fetal pode ser marcada com solução de
hematoxilina e quantificada, calculando-se a proporção de hemoglobina fetal em cada
10.000 hemácias analisadas microscopicamente (SIMMONET; BROSSARD, 2001).
A hemoglobina fetal é mais resistente à desnaturação por soluções fortemente alcalinas

que outros tipos de hemoglobina. O teste de Singer é realizado adicionando-se uma
determinada quantidade de solução alcalina em uma concentração conhecida de
hemolisado. Após um tempo específico (um minuto), aplica-se sulfato de amônio
para bloquear a desnaturação, diminuindo o pH e precipitando a hemoglobina, agora,
desnaturada. Após um tempo específico (um minuto), adiciona-se sulfato de amônio
saturado.
O sulfato de amônio é adicionado para bloquear a desnaturação, diminuindo o pH e

precipitando a hemoglobina, agora, desnaturada. Realiza-se a filtração em papel de
filtro Whatman no 42 e a quantidade de hemoglobina inalterada (Hb F) é medida em
comprimento de onda de 540 nm, utilizando-se espectrofotômetro. A proporção de
hemoglobina álcali-resistente é então calculada como uma porcentagem da quantidade
total de hemoglobina presente, usando a fórmula: % Hb Fetal= Absorbância Hb Fetal/
Absorbância Hb padrão.
Figura 17. Procedimento de desnaturação alcalina pelo método de Singer para quantificação da Hb Fetal. A:
Tubos com reagentes utilizados na técnica; B: Desnaturação da Hb Fetal (tubo 1); C: Precipitação das Hbs após
adição de sulfato de amônio (tubo 1), tubo 3: diluição da solução total de Hb.
41
D: Filtração da Hb Fetal (tubo F) e rediluição da solução total de Hbs do tubo 3 no tubo P, usado como padrão.
Fonte: Carlos, 2013.
42
CAPÍTULO 5
Eletroforese de hemoglobina
Para a análise de hemoglobinas, a metodologia de eletroforese é utilizada uma vez que

consegue separar quase todas as hemoglobinas, sejam elas normais ou variantes. Essa
separação é possível devido a diferenças de carga elétrica que são ocasionadas pelas
trocas de aminoácidos nas diferentes variações de hemoglobina, porém por essa técnica
nem todas as variantes podem ser observadas, pois algumas das mutações que ocorrem
ocasionam trocas que levam a uma pequena ou nenhuma diferença das cargas elétricas,
como substituições de aminoácidos neutros, o que dificulta ou impossibilita a detecção
dessas variantes.
Além de possibilitar a identificação de hemoglobinas normais e variantes, a eletroforese

consegue distinguir homozigotos e heterozigotos (DAUDT et al., 2002) e também
a identificação de frações de baixa concentração, como, por exemplo, a Hb A2
(BERTHOLO; MOREIRA, 2006). Entre os diferentes tipos de hemoglobina possíveis
de identificação, podemos citar: HbF, HbA, HbC, HbD, HbE, HbM e HbS.
O princípio da técnica requer a dissolução dos eritrócitos para liberação da hemoglobina,

cada tipo de hemoglobina possui diferenças nas cargas elétricas, então as hemoglobinas
encontradas em amostras de sangue podem ser avaliadas devido a diferenças de carga
quando submetidas ao campo eletroforético. Os componentes da hemoglobina vão
se separar, pois migram em diferentes níveis e velocidades. As bandas obtidas na
eletroforese são comparadas a um controle contendo hemoglobina normal.
Existem vários tipos de eletroforese, a alcalina e a ácida. A eletroforese em pH alcalino

permite um resultado diferente da eletroforese em pH ácido, pois modifica a carga da
hemoglobina. A hemoglobina possui cargas negativas em sua superfície e, portanto,
neste pH (alcalino) migrará para o lado positivo (ânodo); esta migração é proporcional
à sua carga negativa. Quando realizada em acetato de celulose, a eletrofore alcalina
permite a visualização de HbH, que está presente em pessoas portadoras de talassemia
do tipo alfa. Valores normais de hemoglobina são: HbA1 – 95 a 98%, HbA2 – 2 a 3%,
HbFetal – 0 a 2%.
Como os diferentes tipos de hemoglobina possuem variações em suas cargas é possível

identificá-las de acordo com a migração. As hemoglobinas com mobilidade eletroforética
maior do que HbA em pH 8,8 são conhecidas como “hemoglobinas rápidas” e estão
incluídas nessa classificação: Hb Barts, HbH, HbI, HbN, e HbJ. A substituição de ácido
glutâmico por uma valina na posição 6 da cadeia beta da HbS causa uma migração mais
43
lenta devido à redução das cargas negativas, e a substituição de ácido glutâmico para
lisina na mesma posição 6 (cargas positivas) na HbC causa uma migração mais lenta do
que para as outras hemoglobinas. A HbD pode ser classificada em tipo Los Angeles, em
que um ácido glutâmico é substituído por glutamina na posição 121 da cadeia beta da
globina, e também tipo D Bushman, em que a substituição é de uma glicina por arginina
na posição 16 da cadeia beta de globina, as HbsD apresentam a mesma mobilidade
eletroforética que a HbS.
Para a HbE a mutação no gene beta da globina é devido à substituição de uma lisina
por ácido glutâmico na posição 26, esta possui mobilidade eletroforética ligeiramente
à frente da HbC, o que pode causar confusão. As hemoglobinas HbN, HbJ, HbG entre
outras (mais de 400 tipos) não possuem consequências patológicas. Apenas HbS e
HbC causam patologia. A HbS leva à falcização do eritrócito e a HbC à cristalização da
hemoglobina.
A eletroforese em pH alcalino (8,6-8,9) pode ser realizada em acetato de celulose

(com tampão Tris) utilizando como amostra sangue hemolisado com saponina a 1%.
É possível identificar as seguintes variantes: HbA, HbF, HbS, HbJ, HbD, HbC, HbH,
HbE e HBO. Há também a eletroforese em ágar ácido em pH 6,9 (tampão de citrato)
que possui o mesmo principio da alcalina, porém algumas variantes de hemoglobina
migram com mobilidades diferentes. A eletroforese ácida é utilizada para complementar
a eletroforese alcalina, podendo diferenciar HbE, HbC e HBO que migram juntas na
alcalina. É importante lembrar que na corrida é aplicada hemolisado normal como
controle e para se comparar.
Figura 18. Ordem de migração eletroforética de algumas hemoglobinas.
Fonte: <www2.ucg.br/cbb/.../39/.../Aula%2010_Anemias%20Hereditarias.ppt>.
44
CAPÍTULO 6
Prova de falcização
A hemoglobina S (HbS) é uma hemoglobina variante, decorrente de mutação pontual

na posição 6 do gene da cadeia da globina beta, em que há a susbtitituição de uma
base nitrogenada do códon GAG para GTG, resultando na troca do ácido glutâmico
(Glu) para valina (Val), com consequente alteração das propriedades físico-químicas
da molécula no estado desoxigenado. A respectiva troca de aminoácidos que resulta na
HbS acomete a estrutura da molécula, na hemoglobina A o ácido glutâmico da posição 6
da globina beta auxilia no afastamento das moléculas desoxigenadas de hemoglobinas.
A entrada de valina nesta posição favorece a polimerização sob condições de baixo teor de
oxigênio. Quando desoxigenada, a HbS apresenta acentuada diminuição na solubilidade
e agrega-se formando polímero, ocorrendo a mudança da morfologia do eritrócito da
forma discoide para a forma de foice ou meia lua (WOITOWICZ et al., 2010). A forma
defeituosa dificulta a passagem dos eritrócitos pelos pequenos vasos, bloqueando a
circulação de sangue, provocando dor e danos aos tecidos da região afetada.
O processo de falcização pode ser resumido em três fases de modificação:
1. quando a desoxigenação da hemoglobina é iniciada a célula deixa de ser

discoide e se alonga gradualmente;
2. nesta fase, se o eritrócito receber oxigênio ele “desfalciza”; e finalmente
3. os polímeros de HbS se longam longitudinalmente e o eritrócito adquire a

forma de foice. Nesta fase a falcização se torna irreversível, ou seja, mesmo
que haja oxigênio disponível, as moléculas de HbS estão estruturalmente
comprometidas em agregados polimerizados que não captam o oxigênio.
Figura 19. Mutação que leva à formação da hemoglobina S. Substituição da base timina por adenina, que faz
com que o RNA mensageiro (mRNA) e consequentemente a proteína formada seja diferente.
Fonte: <https://waggner7.wordpress.com/2010/07/05/anemia-falciforme-2/>.
45
O termo anemia falciforme é utilizado para determinar a doença que acomete indivíduos
homozigotos (HbSS). O gene da HbS pode se combinar com outras anormalidades
hereditárias da hemoglobina como hemoglobina C, D, beta-talassemia, entre outros,
gerando combinações que também são sintomáticas, denominadas, respectivamente,
hemoglobinopatia SC, hemoglobinopatia SD e S/beta-talassemia. No conjunto, todas
essas formas sintomáticas do gene HbS, em homozigoze ou em combinação, são
conhecidas como doenças falciformes (MANFREDINI et al., 2007).
Quando o indivíduo é heterozigoto para o gene da hemoglobina S, diz-se que ele

apresenta o traço falciforme, e trata-se de uma das formas clínicas da doença falciforme,
esta condição é comum e benigna do ponto de vista clínico, neste indivíduo ocorre a
herança do gene A de um dos pais e o gene S do outro.
O heterozigoto falcêmico contém uma maior quantidade de HbA (normal, dominante),

60% e HbS (recessiva), 40%. Pessoas que apresentam o traço falciforme geralmente
são assintomáticos, não apresentam anormalidade física e possuem expectativa de vida
semelhante ao da população em geral (MURAO; FERRAZ, 2007). Indivíduos com traço
falciforme não apresentam anemia, os níveis de hemoglobina são normais, 13 a 15 g/
dL e VCM de 80 a 90 fL. As hemácias de portadores de traço falciforme apresentam
meia-vida normal e a falcização in vivo só ocorre em condições como: anestesia geral,
infecções, voo em avião não pressurizado, exposição à regiões de grande altitudes
ou excesso de esforço físico (BRANDÃO, 2008). O diagnóstico é dependente de um
conjunto de exames, como: interpretação de hemograma, eletroforese de hemoglobina,
do teste de falcização e de provas de solubilidade (precipitação da hemoglobina em
meio redutor) para a hemoglobina anormal.
A homozigoze da hemoglobina S, denominada de anemia falciforme, é a forma

predominante entre as doenças falciformes, com maior gravidade clínica e hematológica.
Como se trata de uma anormalidade da cadeia de globina beta, as observações clínicas
somente são perceptíveis depois que ocorre estabilização na síntese de globinas, o que
ocorre após o sexto mês de vida. A OMS estima que no Brasil todo ano nasçam cerca de
2.500 crianças com doença falciforme, das quais 1.900 com anemia falciforme.
Os efeitos fisiopatológicas da deoxi-HbS são desencadeados pelos polímeros de HbS

formados, degradação oxidativa da HbS com a precipitação de corpos de Heinz e geração
de radicais livres oxidantes. Esses tipos de agressão intraeritrocitárias comprometem a
estrutura e o funcionamento fisiológico da membrana do eritrócito falcêmico, gerando
lesões e perda da maleabilidade. A alteração da membrana eritrocitária faz com que
os eritrócitos apresentem maior possibilidade de aderirem ao endotélio vascular,
o que leva à estase venosa, desencadeando hipóxia tecidual, exacerbando a situação
circulatória que já está desfavorável, lesando tecidos presentes entre esses capilares.
46
Ocasionalmente pode ocorrer o entupimento de capilares desencadeando trombose

e ativação de mecanismos de coagulação. Os tecidos acometidos sofrem infartos com
necrose e formação de fibrose, provocando lesões teciduais agudas, com crises de dores
e lesões crônicas de órgãos (NAOUM, 2000).
Figura 20. AA: sem alterações; AS: traço falciforme; SS: anemia falciforme.
Fonte: <http://www.drashirleydecampos.com.br/noticias/13963>.
O teste de falcização é um método qualitativo que determina a presença ou ausência

de HbS nos eritrócitos. O princípio se baseia na indução de falcização por meio de
desoxigenação da hemoglobina com o uso de metabissulfito de sódio no ambiente
formado entre lâmina e lamínula. Para isto adiciona-se em uma lâminca 50 μL de
sangue total e 100 µL de metabissulfito de sódio a 2%, coloca-se a lamínula e então as
margens são seladas (para propiciar um ambiente com baixa tensão de oxigênio) com
esmalte e a lâmina colocada em placa Petri úmida e deixados por no mínimo 1 hora.
Os eritrócitos, após a desoxigenação, são observados em microscópio. Os eritrócitos
contendo hemoglobina S tomam a característica forma de foice.
Figura 21. Teste de falcização demonstrando hemácias em forma de foice nas setas.
Fonte: <http://plugbr.cdnfacil.com.br/wp-content/uploads/2010/02/anemia-falciforme.gif>.
47
Já o teste de solubilidade (teste da mancha), baseia-se no decréscimo da solubilidade

da forma deoxi-HbS. A HbS é insolúvel e precipita-se quando adicionado soluções de
alta molaridade formando polímeros insolúveis que impossibilita a absorção, sendo
retido em papel de filtro.
Figura 22. Prova de falcização pelo teste de solubilidade. Exemplos de resultado positivo e negativo.
Fonte: http:<//www.sabinonline.com.br/GERENCIADOR/ba/arquivos/comparabilidade_entre_o_teste_da_falcizacao_e_teste_
da_mancha.pdf>.
48
COAGULOGRAMA UNIDADE III
No organismo, o conjunto de mecanismos responsáveis por manter constante

a circulação do sangue pelos vasos sanguíneos, minimizando possíveis perdas
sanguíneas, é denominado hemostasia. Quando ocorre a quebra desse equilíbrio,
processos como trombose ou hemorragias podem ocorrer. O coagulograma
compreende diferentes exames com o intuito de averiguar a hemostasia, entre
eles tempo de sangramento, tempo de ativação de protrombina, tempo de
ativação parcial da protrombina, tempo de coagulação e prova de fragilidade
capilar. Os exames podem avaliar a hemostasia primária, na qual participam
vasos sanguíneos e plaquetas, e hemostasia secundária, que avalia os diferentes
fatores de coagulação.
Tais exames são de grande importância no pré-operatório antes de o paciente

ser submetido a uma cirurgia, para verificar a hemostasia, ou de ser submetido
a algum tipo de tratamento que possa desencadear sangramento, doenças que
alteram a coagulação (púrpuras e doenças autoimunes que destroem plaquetas),
monitoria de pacientes que fazem a administração de antia-agregantes
plaquetários ou anticoagulantes (prevenção de problemas cardíacos).
A hemostasia é o conjunto de fenômenos biológicos que ocorre imediatamente em

resposta à lesão de um vaso sanguíneo com o intuito de deter a hemorragia, permitindo
o equilíbrio do sistema circulatório. O sangue permanece fluido no interior de vasos,
interrompendo fisiologicamente uma hemorragia, fazendo com que o sangue no
interior dos vasos não coagule (trombose) nem extravase (hemorragia), prevenindo
hemorragias espontâneas ou sangramentos traumáticos. A fluidez do sangue mostra o
equilíbrio entre fatores coagulantes e anticoagulantes.
Durante esse equilíbrio ocorrem interações entre vasos sanguíneos, plaquetas,

proteínas da coagulação e sistema fibrinolítico, que levam à formação do coágulo
sanguíneo seguida de sua dissolução depois do reparo celular (RODRIGUES et al.,
2012). Três etapas fazem parte da manutenção da hemostasia: hemostasia primária,
coagulação (hemostasia secundária) e fibrinólise, que são interdependentes. Tais
processos promovem a fluidez necessária para o sangue circular sem que ocorra
49
UNIDADE III │ COAGULOGRAMA
extravasamento pelos vasos ou obstrução do fluxo pela presença de trombos

(CAGNOLATI et al., 2012).
O endotélio é constituído por um único estrato contínuo de células na forma de

fuso que reveste a superfície luminal de todos os vasos sanguíneos; em condições
fisiológicas, mantém o tônus vascular e a homeostase intravascular (BAHIA et al.,
2006), possui função anticoagulante (impede que os fatores de coagulação sejam
ativados e formem coágulos), o que favorece a dilatação vascular, contribuindo
para a manutenção da fluidez do sangue. As células do endotélio produzem
substâncias que desempenham papel de reguladores do fluxo sanguíneo e inibem
a ativação e agregação de plaquetas, entre essas substâncias, temos: óxido nítrico,
glicosaminoglicanas, prostaciclina, prostaglandina (PGI2) e ectonuleotidases. Quando
essas substâncias são liberadas, ocorre a manutenção do fluxo sanguíneo, impedindo
a formação de aterosclerose. O endotélio também atua evitando a ativação excessiva
da cascata de coagulação e obstrução vascular mediante diferentes proteínas por
ele sintetizadas, como: proteína inibidora do fator tecidual, proteína C, heparina,
anexina V e trombomodulina. A heparina interage com a antitrombina inibindo a
ação da trombina sobre o fibrinogênio, impedindo a transformação de fibrinogênio
em fibrina.
As plaquetas são formadas na medula óssea, apresentam-se na forma de pequenos

fragmentos citoplasmáticos anucleados com forma discoide achatada formados a partir
de fragmentação do citoplasma de glóbulos brancos, chamados megacariócitos, e se
encontram em estado de repouso quando o vaso sanguíneo apresenta-se intacto. Os
valores normais de circulação no sangue periférico são 130.000 a 400.000 unidades/
mL, circulando neste por 7 a 10 dias.
Em circunstâncias normais, as plaquetas não aderem ao endotélio, porém, quando

ocorre o rompimento da camada de células endoteliais que reveste a parede vascular
diante de uma consequência fisiológica ou lesão tissular, há a exposição da matriz
subendotelial. Essa exposição recruta plaquetas para o local e então ocorre a sua
ativação, passando do estado não adesivo (repouso) para a condição adesiva. Este
contato induz mudanças conformacionais nas plaquetas, que passam da sua forma
discoide para uma forma mais esférica pela emissão de pseudópodes (processo de
sharpe change). Essa mudança estimula a adesão crescente de mais plaquetas que
se espalham pela matriz subendotelial pela interação com outras proteínas adesivas,
como: colágeno e fator de Von Willebrand (Fvw). Adicionalmente, ocorre a liberação
do conteúdo dos grânulos citoplasmáticos que contêm adenosina-difosfato e ativam
outras plaquetas, serotonina e tromboxane A2 (TXA2), estas juntas auxiliam na
formação do coágulo.
50
COAGULOGRAMA │ UNIDADE III
Figura 23. Participação das plaquetas no processo de hemostasia durante a formação de tampão. A) processo
de injúria (lesão) com exposição de agonistas plaquetários. B) adesão das plaquetas ao subendotélio. C)
mudança de forma da plaqueta com secreção de grânulos. D) ligação plaqueta/plaqueta. E) depósito de fibrina
sobre o tampão plaquetário.
Fonte: (CASTRO et al., 2006).
A hemostasia primária é a etapa inicial da coagulação e é estimulada pela lesão vascular

envolvendo a interação de plaquetas com componentes do endotélio e proteínas
citoplasmáticas, como o fator de Von Willebrand. São desencadeados mecanismos locais
que levam a: vasoconstrição, alteração da permeabilidade vascular com produção de
edema, vasodilatação de vasos na região em que ocorreu a lesão e adesão de plaquetas.
Teoricamente é dividida em quatro etapas: vasoconstrição, adesão, ativação e agregação
plaquetária. A vasoconstrição limita o aporte sanguíneo para o local da adesão, retardando
a perda sanguínea extravascular. Os testes relacionados à hemostasia primária são: tempo
de sangramento, contagem de plaquetas e avaliação da função plaquetária.
Já a hemostasia secundária envolve várias reações enzimáticas envolvendo fatores

de coagulação que se iniciam com a formação da tromboplastina pela ação de fatores
presentes no plasma, nas plaquetas ou em tecidos. Quando na presença de íons de cálcio
e outros fatores citoplasmáticos, a tromboplastina converte a protrombina em trombina,
que, por sua vez, converte o fibrinogênio em fibrina, proteína esta insolúvel que se
precipitará formando uma rede de filamentos. Este depósito de filamentos no local da
lesão do vaso atuará na retenção das células sanguíneas, formando o que denominamos
de trombo, responsável por conter o sangramento. Essa cascata de coagulação envolve
fatores que são numerados de I a XII, juntos convergem para a ativação do fator X na
via comum, que leva à formação de fibrina. A cascata é dividida em duas vias: a via
intrínseca, que se inicia quando o sangue entra em contato com a superfície lesada, e a
via extrínseca, quando a lesão do vaso resulta na liberação de extratos teciduais.
51
Pela via extrínseca, o contato do sangue com tecidos extravasculares possibilita a

liberação de tromboplastina tecidual, substância ativadora de protrombina, e envolve
os seguintes eventos: ativação do fator VII pelo fator tecidual, que então ativa o fator
X, uma vez traumatizado o tecido ocorre a liberação de vários fatores denominados
fator tecidual ou tromboplastina tecidual; o fator III, o cálcio e fator VII formam um
complexo que age enzimaticamente na conversão do fator X para Xa.
A via intrínseca envolve uma série de reações enzimáticas para a produção do coágulo.
Estão envolvidos os fatores XII e XI, pré-calicreína, cininogênio. Tanto o fator XII como
a pré-calicreína necessitam do cininogênio para efetuar a fixação à superfície ao qual
se encontra o fator XIIa; quando estes elementos interagem, ocorre a ativação do fator
XI, que transforma o fator IX em IXa. Uma vez formado o fator IXa, ele interage com o
fator VIIa estimulando a conversão do fator X para Xa.
A partir da ativação do fator X pelas duas vias anteriores, este então passa a atuar na
via comum, pela combinação de fator III, cálcio, fator VII e fosfolipídios teciduais na
via extrínseca e também fator IX e VII na via intrínseca. O fator X uma vez ativado
interage com fosfolipídeos e fator V gerando o complexo ativador de protrombina, o
qual é convertido à trombina que atua transformando o fibronogênio em fibrina.
52
CAPÍTULO 1
Teste de sangramento
Quando os vasos sanguíneos são cortados ou lesionados, as plaquetas aderem e então

expõem o colágeno e, em seguida, as plaquetas aderem umas às outras formando
agregados denominados de “tampões hemostáticos” primários, estes tampões fazem
com que o sangramento seja interrompido. O tempo de sangramento (TS) é um teste
que avalia a funcionalidade de plaquetas e os distúrbios vasculares, avaliando, portanto,
defeitos relacionados à hemostasia primária.
A utilidade clínica desse teste tem suas limitações devido à dificuldade na padronização
da metodologia. O teste de sangramento (TS), que avalia a função plaquetária, foi
descrito primeiramente por Duke em 1910, em que vasos sanguíneos do lóbulo da
orelha são excisados para a realização do teste, porém o método de Duke apresenta
apenas valor histórico, devido à dificuldade de padronização e obtenção de resultados
reprodutíveis. Na técnica de Duke realiza-se a assepsia do lóbulo da orelha (pode-se
usar também a polpa digital) e com o auxílio de uma lanceta específica faz-se uma
incisão local, com cerca de 2 mm de profundidade, o cronômetro é disparado e a cada
30 segundos uma gota de sangue é recolhida em papel de filtro (tendo o cuidado de que
o papel não toque o lóbulo ou a polpa), isto é feito até que a última gota deixe apenas
um sinal puntiforme no papel de filtro, avalia-se o tempo decorrido entre a primeira e a
última gota de sangue recolhidas. O valor normal para o tempo de Duke é 1 a 3 minutos.
Posteriormente, foi realizada a modificação do teste anterior por Ivy e colaboradores

(1935), aumentando a sensibilidade do teste mediante a aplicação de uma pressão
constante de 40 mmHg com o uso de um esfigmomanômetro (para manter constante
a pressão venosa); acima do local da excisão, que é feita no antebraço, utiliza-se duas
punções feitas com lancetas, separadas de 5 a 10 cm, algumas vezes o ferimento se fecha
antes de cessar o sangramento, sendo preferível o método Template.
O método de Mielke ou Template é semelhante ao teste de Ivy, porém utiliza-se para

a excisão um dispositivo automatizado descartável – exemplo: Triplett (Helena),
Surgicutt (ITC), Simplate (Organon Teknika). O procedimento basicamente consiste
em introduzir uma lâmina nova no dispositivo (template), aplica-se a pressão com
auxílio de esfigmomanômetro no braço do paciente no qual nenhuma veia tenha sido
puncionada. Seleciona-se uma região do antebraço para realizar o teste, abaixo do sulco
do cotovelo, limpa-se a região e uma pressão constante de 40 mmHg é aplicada durante
todo o teste. Rapidamente é feita a excisão no local preparado, em ângulo reto com o
eixo longitudinal do antebraço, e aciona-se o cronômetro. A cada 30 segundos absorve-
53
se o sangue com papel de filtro, sem esfregar o corte. Quando o papel não apresentar
mais nenhuma mancha de sangue, o cronômetro é parado. O tempo é contado a partir
do número de manchas no papel de filtro multiplicado por 30 segundos. Valores de
referência para este teste quando as plaquetas estão acima de 100.000 por µL: até 5
meses – 1 a 2 minutos; de 5 meses a 13 anos – 1,5 a 9 minutos; acima de 13 anos – 1,5 a
8 minutos. Para plaquetas dentro da faixa de 10.000 a 100.000/µL, o TS médio é feito
por meio da fórmula: TSm = 30,5-(Plaq/3.850), em que TSm é o tempo de sangramento
médio em minuto e plaq o número de plaquetas por microlitro.
Figura 24. Tempo de sangramento. Equipamento e procedimentos.
Fonte: <http://pt.scribd.com/doc/3151668/Tempo-de-Sangria-ou-Tempo-de-Sangramento#scribd>.
O TS avalia o tempo necessário para que a hemorragia provocada por um lâmina de bisturi
ou dispositivo automático em vasos de pequeno calibre seja estancada pela formação
do tampão hemostático. A prova avalia a reação dos capilares à lesão, reação esta que
depende das plaquetas, de fatores plasmáticos, do endotélio e da contratilidade capilar.
O tamanho do corte e a sua profundidade devem ser padronizados. Pode ser indicativo
de distúrbios plaquetários (em relação ao número e funcionalidade das plaquetas) e de
alterações de integridade vascular. As alterações mais evidentes são encontradas nas
púrpuras trombocitopênicas ou tromboplásticas. TS prolongado pode ser resultante de
diminuição do número de trombócitos ou vasos sanguíneos com deficiência, porém deve-
se ficar atento a erros gerados por diferenças na profundidade da punção ou excisão.
Valor normal de TS está entre 1-3 minutos, porém varia de acordo com a metodologia
54
utilizada. Valor de TS aumentado pode ser indicativo de: plaquetopenia, doença de Von
Willebrand, uso de aspirina, mieloma múltiplo, uremia, insuficiência hepática.
O tempo de sangramento é feito quando há suspeita de distúrbio da função plaquetária

devido a indícios da história clínica. Entre as causas congênitas, a doença de Von
Willebrand é a causa mais comum de distúrbio congênito da coagulação e está
frequentemente associada a histórico pessoal ou familiar de facilidade na formação
de hematomas, sangramentos nasais, ou pós-operatórios. Causas comuns de
disfunção plaquetária adquirida incluem as hepatopatias, as nefropatias e os efeitos
de medicamentos, especialmente aspirina ou anti-inflamatórios não esteroidais, exceto
o trissalicilato de colina e magnésio. Um grande número de outras drogas, alimentos
e vitaminas podem afetar a função plaquetária, incluindo álcool, antibióticos beta-
lactâmicos, cebola e vitaminas A e E.
Este teste não é recomendado como teste de triagem para o potencial de sangramento
cirúrgico devido ao alto índice de resultados falso-positivos entre a população normal.
Pacientes com distúrbios cutâneos e pele frágil podem ser predispostos a resultados
falsamente positivos. A realização do TS em pacientes que usam aspirina e serão
submetidos a cirurgias deve ser desencorajada, uma vez que deficiências na função
plaquetária persistem por 7 a 10 dias, mesmo em face de um TS normal. Portanto, um
resultado normal neste caso resultaria em uma falsa sensação de segurança.
55
CAPÍTULO 2
Tempo de coagulação
O tempo de coagulação (TC) corresponde ao tempo gasto para o sangue coagular quando
retirado do organismo. Fornece dados relativos ao sistema de coagulação do sangue. É
um teste que apresenta inúmeras variáveis e atualmente vem sendo substituído pelo
tempo de tromboplastina parcial, mais facilmente controlada e reprodutível.
A coagulação é um mecanismo natural de defesa do organismo contra as perdas

sanguíneas. Normalmente, um coágulo se forma dentro de 5 minutos após a lesão.
Sempre que um vaso sanguíneo é lesionado, ocorre o recrutamento e o acúmulo de
plaquetas no local para preenchimento do espaço lesionado e assim o sangramento
parar. A coagulação é iniciada por meio de duas vias: via intrínseca e extrínseca.
Existem diversos métodos para a determinação do tempo de coagulação, sendo o método

do tubo de capilar o mais comum. O TC é afetado pelo nível de cálcio e muitas doenças.
No tempo de coagulação pelo método de Lee-White, realiza-se a punção venosa de cerca

de 2 mL de sangue com auxílio de uma seringa, este sangue é descartado para prevenir
a presença de tromboplastina tecidual, coleta-se então cerca de 5 mL de sangue que
são distribuídos em alíquotas de 1 mL em três tubos de ensaio (iniciando-se pelo tubo
3, seguido dos tubos 2 e 1), o cronômetro é disparado assim que se começa a adicionar
o sangue no tubo 3 (alguns laboratórios iniciam a contagem do tempo assim que o
sangue começa a entrar na seringa). Todos os tubos são incubados a 37oC. Inclina-se
suavemente o tubo 3 (em um ângulo de 45 graus) a cada 30 segundos. Trinta segundos
após a formação do coágulo no tubo 3, inicia-se o mesmo procedimento para o tubo 2
e, após a formação do coágulo neste, realiza-se o mesmo com o último tubo. Todos os
tempos são anotados, e o TC é o tempo necessário para a formação de coágulo no último
tubo. O valor normal para o TC, tempo transcorrido desde a coleta até a formação do
coágulo, está entre 4 e 9 minutos.
As seguintes variáveis tendem a diminuir o tempo de coagulação: manipulação

grosseira do sangue, presença de fluidos dos tecidos (punção venosa traumática),
inclinação frequente do tubo, utilização de tubos não estéreis. Entre os fatores que
podem aumentar o tempo de coagulação, temos: aumento extremo de temperatura,
variação de pH, realização do teste à temperatura ambiente. Sua utilização como
procedimento de triagem é limitada devido a sua baixa sensibilidade, este teste não
é sensível a alteração de plaquetas. O tempo de coagulação é afetado principalmente
por defeitos nos fatores da via intrínseca e por defeitos de fibrina e fibrinogênio. O TC
56
prolongado indica imediatamente coagulação deficiente, mas um tempo de coagulação

normal não exclui muitos defeitos de coagulação graves. Uma desvantagem deste teste
é a falta de reprodutibilidade.
Um resultado anormal demonstra a existência de defeito hemostático sério de um dos

fatores de coagulação, exceto o fator VII. O tempo de coagulação prolongado quase
sempre significa (exceto nos casos de administração de heparina) hemofilias A e B
severas, presença de anticoagulante circulante inespecífico ou específico (inibidor
de fator XII, anticoagulante lúpico) ou deficiência do fator XII. Porém cerca de 1/3
dos hemofílicos apresentam este teste normal. Já o TC diminuído pode ser indicativo
de hipercoagulação, viscosidade sanguínea, agregação plaquetária, adesividade
plaquetária, dislipidemia, lesões do endotélio.
Figura 25. Tempo de coagulação. Procedimentos e melhor posição dos tubos para se observar a formação
do coágulo.
Fonte: <http://www.ufrgs.br/lacvet/coagulacao.htm>.
57
CAPÍTULO 3
Retração do coágulo
A retração do coágulo representa o volume do soro obtido após coagulação e retração

do coágulo em uma quantidade determinada de sangue. O coágulo inicial contém todos
os elementos do sangue. Após sua retração, o soro é expulso da malha de fibrina, que
se retrai pela ação das plaquetas. Fornece dados relativos à atividade plaquetária. Uma
retração pequena corresponde a um número de plaquetas abaixo de 100.000 por ml
de sangue. Nas deficiências funcionais das plaquetas, a prova pode estar alterada em
presença de número normal ou aumento de plaquetas.
O método de Mac-Farlane tem o princípio de que, após a coagulação do sangue, o

coágulo formado retrai-se ou, mais precisamente, retrai-se a rede de fibrina, retendo os
elementos figurados do sangue e liberando a parte líquida, o soro. Nesta técnica, colhe-
se o sangue (pouco mais de 5 mL, sem anticoagulante), adiciona-o em tubo cônico
graduado, fecha-se o tubo com uma rolha provida de um fio de arame (cobre) espiralado
em uma das extremidades e o espiral de arame fica imerso no sangue. O tubo é colocado
em banho-maria a 37oC durante pelo menos uma hora. O volume total (coágulo e soro)
é lido. Com o auxílio do fio de arame, deve-se retirar cuidadosamente o coágulo retraído
aderido a ele, deixar escorrer o líquido existente no coágulo por um a dois minutos e ler
o volume final de soro. A retração do coágulo é diretamente proporcional ao volume de
soro formado. Valores normais estão entre 45-55%.
Figura 26. Cálculo do tempo de retração do coágulo.
Fonte: <http://pt.slideshare.net/nelcivone/plaquetas-fisiologia-e-avaliacao-laboratorial>.
Atualmente os laboratórios adaptaram uma nova técnica para a leitura da retração

do coágulo por meio do aproveitamento do tubo utilizado no tempo de coagulação. É
58
marcada uma hora após a realização do teste de coagulação com o tubo a 37oC. Após este
período, utilizando-se uma pipeta volumétrica de 1 mL, todo o soro do tubo é aspirado.
O volume de soro aspirado do volume total é considerado o valor de retração do coágulo.
Por exemplo, se foram aspirados 0,5 mL de soro, então a retração do coágulo tem como
resultado 50%.
Este teste pode estar alterado em volume na presença de plaquetopenia e nas anemias.
A avaliação da retração tem sua maior utilidade na avaliação de deficiências funcionais
das plaquetas. É quando a retração se encontra diminuída, mesmo na presença de um
número normal de plaquetas. Pode ser influenciado pela quantidade de trombina e de
fibrinogênio e por valores alterados do hematócrito.
59
CAPÍTULO 4
Prova do laço ou Rumpel-Leede
Distúrbios hemorrágicos que apresentam tendência ao sangramento fácil podem ser

resultantes de defeitos em vasos sanguíneos ou de anormalidades do sangue em si
(como anormalidades de fatores de coagulação ou das plaquetas)3.
A fragilidade capilar é uma denominação geral para pequenos extravasamentos de

sangue que ocorrem sob a pele e que geralmente são resultados de pequenas alterações
em capilares. A equimose é uma infiltração de sangue na malha de tecidos do organismo
devido à ruptura de capilares; cada vez que os pequenos vasos se rompem, um pouco
de sangue extravasa produzindo pequenos pontos avermelhados na pele (petéquias)
e manchas azul violáceas (púrpura). Ela geralmente está associada a traumas, a
distúrbios de coagulação ou efeitos colaterais de alguns medicamentos. As equimoses
espontâneas estão relacionadas a distúrbios sanguíneos ou transtornos vasculares. Elas
apresentam distribuição simétrica no corpo e são acompanhadas por outros sinais de
transtornos hematológicos.
A prova do laço ou prova de Rumel-Leede determina a fragilidade das paredes de capilares

e estima a tendência à hemorragia, auxiliando no reconhecimento de trombocitopenias.
As pressões arteriais, sistólica e diastólica são averiguadas com o paciente deitado ou

sentado para a determinação da pressão arterial média (pressão arterial sistólica +
pressão arterial diastólica dividido por 2). A seguir o manguito de um esfigmomanômetro
é insuflado até o valor médio calculado. Em adultos aguarda-se 5 minutos e em crianças,
3 minutos com o manguito insuflado, após este período seu ar é liberado. Um quadrado
de aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm de área é desenhado no antebraço do paciente,
onde então se realiza a contagem do número de petéquias ou equimoses pequenas
formadas neste local. Em adultos, a prova do laço é considerada positiva se forem
contadas 20 ou mais petéquias dentro do quadrado; em crianças, 10 petéquias.
A prova do laço positiva não é patognômica de FHD (febre hemorrágica da dengue)

ou SCD (síndrome do choque pela dengue) e pode ocorrer em outras situações
clínicas que cursam com alteração da permeabilidade capilar ou trombocitopenia. A
prova do laço é importante para a triagem de pacientes com potencial alteração da
permeabilidade vascular.
Na dengue, ao final do período febril, eventualmente surgem manifestações hematológicas

como o rompimento de vasos superficiais da pele (petéquias), além de outros.
3 <http://leococitos.blogspot.com.br/2012/06/disturbios-hemorragicos.html>.
60
Valores aumentados podem indicar coagulação intravascular disseminada, diminuição

do fibrinogênio, diminuição da protrombina, deficiência de fator VII, trombocitopenia,
tromboastenia, doença de Von Willebrand e deficiência de vitamina K. Pode estar
associado a doenças não relacionadas com as patologias da coagulação, como:
escarlatina, hipertensão, diabetes, gripe, sarampo, escorbuto, no pré-diagnóstico de
casos suspeitos de dengue, porém exames adicionais são necessários para a confirmação
do quadro clínico.
Figura 27. Prova do Laço.
Fonte: <http://www.blogenfermagem.com/2010/06/como-fazer-realizar-prova-do-laço.html> e <http://dengueaedesaegypti.

blogspot.com.br/2011/11/prova-de-laco_22.html>.
61
CAPÍTULO 5
Tempo de protrombina (TP)
O tempo de protrombina avalia a via extrínseca (fatores teciduais) de coagulação. O

fator tecidual III é uma proteína transmembrana amplamente expressa em células de
origem não vasculares, e ele ativa o fator VII no início da via extrínseca da cascata de
coagulação. A ativação desta cascata de coagulação resulta na formação de fibrina e,
consequentemente, coágulo.
O tempo de protrombina descrito por Quick, em 1935, quantifica a protrombina e

avalia os fatores II, V, VII e X da coagulação (via extrínseca). A RNI foi instituída pela
OMS visando a padronizar os resultados do teste de tempo de ativação da protrombina
devido a variações que podem ocorrer por causa do método utilizado, levando em
consideração a sensibilidade do reagente utilizado (tromboplastina). O cálculo do RNI
somente é utilizado para pacientes com tempo de protrombina alterada pelo uso de
anticoagulantes orais. O TP é um teste de coagulação mundialmente utilizado e reflete
problemas relacionados aos fatores de coagulação que ocorrem em diversas doenças,
como a disfunção hepática e a coagulação intravascular disseminada (CID).
O equilíbrio entre os fatores pró-coagulantes e anticoagulantes são determinantes

na hemostasia. O rompimento deste equilíbrio ocorre em situações como uso de
medicamentos antivitamina K ou anticoagulantes orais, que normalmente são
administrados com o intuito de prevenção de fenômenos tromboembólicos. Nestas
situações, para que o tratamento não seja realizado com uma superdosagem dos
medicamentos, a dose deve ser ajustada e monitorada, o que pode ser feito pela
determinação do tempo de protrombina e da relação normatizada internacional (RNI).
62
Figura 28. Cascata de coagulação. Fatores que influenciam na determinação do tempo de protrombina estão
destacados em verde.
Fonte: <http://www.pathology.vcu.edu/clinical/coag/PT%20INR.pdf>.
A amostra utilizada para o teste é o plasma. A qualidade da amostra é o passo crítico para
a acurácia da realização do TP. O sangue deve ser colhido de maneira não traumática
por punção venosa evitando hemólise, garroteamento prolongado, formação de bolha
ou aspiração de líquido tissular, para evitar contaminação com tromboplastina tecidual
O sangue coletado deve ser misturado ao anticoagulante apropriado (citrato de sódio),
seguido da centrifugação e remoção do plasma sem pipetar células vermelhas ou
camada amarela. As amostras devem ser testadas dentro de poucas horas (3h), porém,
se o teste não puder ser realizado neste período, o plasma pode ser congelado por no
máximo uma semana a -20oC.
As amostras são alíquotadas e pré-aquecidas a 37oC por 2 minutos em banho-maria ou

blocos térmicos, adiciona-se então o reagente também pré-aquecido contendo fosfolipídeos
e extratos de tecidos (tromboplastina). As amostras são novamente incubadas a 37oC sob
leve agitação, e observa-se o tempo para a formação do coágulo. O resultado pode ser
63
reportado em segundos (tempo de protrombina) ou como um percentual de atividade

comparando-se com algum controle (pool de plasmas normais) do laboratório. Valores
de referência variam entre os laboratórios devido ao tipo de reagente utilizado, para o
tempo de protrombina estão entre 10 a 14 segundos (podendo variar de acordo com o
teste); para o percentual de atividade, 70 a 100%; e para o RNI, 1,0 a 1,08 em pessoas
sadias e 2,0 a 3,5 para pacientes que fazem o uso de anticoagulantes orais.
Figura 29. Tempo de protrombina.
Fonte: <http://www.pathology.vcu.edu/clinical/coag/PT%20INR.pdf>.
O TP é criticamente dependente das características da tromboplastina utilizada no

teste. A tromboplastina é composta de fator tecidual e fosfolipídeos, ambos necessários
para a ativação do fator X pelo fator VII. Diferentes preparações de tromboplastina
variam consideravelmente com a habilidade de se iniciar a coagulação na presença ou
ausência dos fatores de coagulação. O resultado do TP pode ser afetado por fatores como
qualidade da amostra; uso de alguns medicamentos: anticoagulantes (como heparina
e varfarina), contraceptivos orais, etanol, tetraciclina, corticoides (aumentam o TP); e
também vitamina K, anti-histamínicos, cafeína, fenobarbital (reduzem TP).
Uma vez que existe uma relação linear entre os logaritmos dos níveis de PT obtidos
com diferentes extratos teciduais de humanos e cérebro de coelho, foi desenvolvido
o sistema de calibração para relacionar o valor obtido de PT e os valores padrões da
OMS. Para isto, um lote muito sensível de amostras de cérebro humano foi designado
como a primeira preparação de referência internacional (IRP) e o fator de correção –
64
Índice de Sensibilidade Internacional (ISI) – foi então desenvolvido para correlacionar

a sensibilidade da tromboplastina obtida comercialmente e a IRP. Por definição, o ISI
do primeiro IRP foi de 1,0. Um termo adicional foi introduzido, RNI, para comparar a
medição de um dado tempo de protrombina com o IRP. Assim, o RNI representa o tempo
de protrombina que teria sido obtido se o IRP tivesse sido utilizado como reagente no
ensaio. Tromboplastinas mais sensíveis possuem menor ISIs e produzem maior tempo
de protrombina. Um baixo valor de ISI é uma propriedade desejável para o reagente
utilizado, pois aumenta a precisão analítica do tempo de protrombina, ocorrendo uma
melhor discriminação de pacientes normais e tratados com anticoagulantes, permitindo
também um ajuste mais fino na dosagem do anticoagulante utilizado. Normalmente o
valor de ISI fica entre 1,0 e 1,4. O valor de ISI é fornecido em cada lote de reagentes
comercialmente produzidos. Sabendo-se o ISI, o RNI é facilmente calculado pela fórmula:
Figura 30. Cálculo do RNI.
Fonte: <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=s1676-24442005000400006&script=sci_arttext>.
65
CAPÍTULO 6
Tempo de protrombina parcial ativada
(TTPA)
O TTPA (ou tempo de cefalina) recebe a denominação de tempo de protrombina parcial

devido ao uso da cefalina, a qual faz parte da tromboplastina e é obtida após a extração
por meio de clorofórmio. Este teste avalia a via intrínseca de coagulação (fatores
XII, XI, IX, VIII, precalicreína, quininogênio), identificando deficiências adquiridas
ou congênitas em relação a estes fatores, podendo também identificar deficiência de
outros fatores, exceto III e VII. A ativação desta via é iniciada pela interação do fator
XII com uma superfície carregada negativamente. Os mecanismos desta cascata levam
à formação de fibrina e formação do coágulo.
Este teste é comumente utilizado para o monitoramento da terapia com heparina

não fracionada, administrada para a prevenção de coagulação sanguínea. A heparina
age acelerando a ação da antitrombina, a qual é responsável por inibir a ação da
trombina. A antitrombina inibe a função do fator X, bem como dos fatores IX e XII da
via intrínseca, o que explica o porquê de o TTPA ser mais sensível à heparina do que
o tempo de protrombina. A heparina é comumente dada seguida da administração
do fator IV em condições de trombose aguda, como no infarto do miocárdio ou no
tromboembolismo venoso.
Outros processos patológicos que inibem a coagulação sanguínea podem ser detectados
pelo TTPA, o mais comum deles é a presença de lúpus anticoagulante (LA), sendo
utilizado para avaliar a terapia de reposição de alguns fatores da cogulação.
O TTPA é o tempo que o plasma citratado leva para formar coágulo de fibrina após
a adição de uma mistura contendo fosfolipídeos pró-coagulantes de origem humana,
animal ou vegetal, como a cefalina (tromboplastina parcial), o ativador (caolim, ácido
elágico, sílica micronizada, entres outros, que ativa o fator XII) e cálcio (LOPES;
BIONDO; SANTOS, 2007). A cefalina é um substituto do fator plaquetário. O TTPA
estimula a agregação plaquetária por meio da superfície do fosfolipídeo (que apresenta
superfície carregada negativamente) onde ocorrerão as reações enzimáticas.
Assim como para o tempo de protrombina, o sangue deve ser colhido de maneira
não traumática por punção venosa evitando hemólise, garroteamento prolongado,
formação de bolha ou aspiração de líquido tissular, para evitar contaminação com
tromboplastina tecidual, ele deve ser então misturado ao anticoagulante apropriado
(citrato de sódio, na proporção 9:1, sangue:anticoagulante), em seguida realiza-se a
66
centrifugação para separação do plasma. Com o plasma realiza-se o TTPA pelo método
de formação de coágulo. O método resulta da coagulação das proteínas hemostáticas
ao entrarem em contato com a cefalina, uma proteína plaquetária capaz de iniciar
o mecanismo intrínseco de coagulação. Os valores de referência estão entre 28 a 35
segundos, podendo variar de acordo com os reagentes utilizados no teste.
Figura 31. Princípio do tempo de protrombina parcial ativada.
Fonte: <www.austincc.edu/mlt/coag/Lab4_PTT_F12.doc>.
O TTPA prolongado indica um defeito significativo de pelo menos um dos pró-

coagulantes do plasma. Quando o TTPA é realizado em combinação com o TP, muitas
desordens relacionadas à coagulação podem ser identificadas. O TTPA está alterado
em deficiências dos fatores XII, XI, IX, precalicreína e quininogênio (via intrínseca) e
fatores X, V, II e I (via comum).
Figura 32. Interpretações de TP e TTPa.
Fonte: <http://www.blogbiotecnica.ind.br/blog/2012/07/fisiologia-da-coagulacao>.
67
CAPÍTULO 7
Tempo de trombina
O tempo de trombina (TT) é um teste que verifica anormalidades na conversão de

fibrinogênio a fibrina (passo este pertencente à última etapa da cascata de coagulação), é
conhecido também por tempo de coagulação da trombina. O TT é principalmente utilizado
para avaliar amostras de plasma que apresentaram TTPA prolongado e, em menor
grau, PT prolongado para heparina ou outros inibidores de trombina. O teste é também
utilizado para detectar anormalidades qualitativas e quantitativas de fibrinogênio.
Critérios importantes para a seleção dos reagentes do TT são de grande importância para
a sensibilidade do teste frente à terapia com heparina e para a precisão aceitável.
O princípio do método consiste na clivagem do fibrinogênio (solúvel) pela trombina,

por meio da ativação do fator II que leva à formação de fibrina (insolúvel), o qual
se polimeriza formando o coágulo; também estimula a agregação de plaquetas,
ativa os fatores V e VIII liberando o ativador de plasminogênio que leva à formação
de plasmina, por sua vez a plasmina faz a clivagem da fibrina gerando produtos
de degradação.
O teste é realizado com o plasma. A solução contendo trombina (normalmente de

origem bovina) é adicionada, e o tempo para a formação do coágulo é então observada.
O coágulo pode ser transparente ou opaco. A concentração da trombina é ajustada para
alcançar o valor de 15 segundos para o plasma normal (controle), se uma concentração
maior de trombina é utilizada, defeitos leves do fibrinogênio podem não ser detectados.
O teste é feito em duplicata, observando-se se há diferenças de tempo entre o teste e o
“normal” (controle). O TT considerado normal pode variar de ±2 segundos em relação
ao tempo do controle.
Para amostras de sangue contendo heparina, a trombina pode ser substituída pela
baltroxobina (substância derivada de veneno de cobra que possui ação semelhante à
trombina) que não é inibida pela heparina, o contrário da trombina.
O valor encontra-se prolongado quando ocorre uma queda em torno de 70-100 mg/dL
do fibrinogênio. Os níveis de outros fatores da coagulação não afetam o TT.
As causas do prolongamento do TT podem ser: defeitos quantitativos – hipofibrinogenemia

ou afibrinogenemia – e ocasionalmente qualitativos – disfibrinogenemia e a presença
de inibidores da reação fibrinogênio-fibrina, como heparina, hirudina, produtos de
degradação da fibrina e paraproteínas.
68
»» Hipofibrinogenemia – diminuição da taxa de fibrinogênio no sangue;

afibrinogenemia – ausência total de fibrinogênio.
»» Disfibrinogemia – presença de fibrinogênio funcionalmente alterado

devido a uma mutação em um dos genes que codificam as cadeias de
fibrinogênio (genes das cadeias alfa, beta ou gama).
69
CAPÍTULO 8
Prova de agregação plaquetária
Hemorragia e trombose são eventos dependentes da adesão e agregação plaquetária nas

paredes de vasos sanguíneos. Quando ocorre a hiperagregação plaquetária (agregação
excessiva), pode-se ocasionar a formação de um trombo com posterior oclusão de vasos
sanguíneos, levando à isquemia. Esta condição é responsável por doenças isquêmicas
cardiovasculares, como angina pectoris e aterosclerose, bem como outras formas de
isquemia, como o acidente vascular cerebral. Realiza-se a terapia antiplaquetária com
ácido acetilsalicílico (AAS), que reduz em até 25% o risco de infartos do miocárdio, AVCs,
entre outras.
Todos os agonistas plaquetários têm um efeito final similar que é a indução da

agregação. Estes agonistas determinam um aumento do cálcio intracelular e ativação
da proteína quinase C, ou seja, ocorre uma ativação na superfície do receptor GPIIb/
IIIa. Todos estes mecanismos levam a uma mudança de forma da plaqueta de discoide
para múltiplas projeções citoplasmáticas e expressam uma alta afinidade da plaqueta
ao fibrinogênio (FITZGERALD, 2001).
Figura 33. Representação das etapas que levam à agregação plaquetária. Receptores dos principais agentes
antiagregantes plaquetários: TXA2R (receptor de tromboxano A2); PAR-1 (receptor de protease ativada 1; P2Y12
(receptor de ADP) e GPIIb/IIIa (glicoproteína IIb/IIIa (receptor de fibrinogênio/fibronectina.
Fonte: Mackman, 2008.
70
Há várias metodologias para verificar a agregação plaquetária, entre elas agregação

plaquetária por turbidimetria ou em plasma rico em plaquetas (PRP) e agregação por
sistema de impedância ou sangue total, vejamos.
»» Agregação plaquetária por turbidimetria ou em plasma rico

em plaquetas (PRP) é o método mais clássico. Nesta metodologia
realiza-se a estimulação com agonistas plaquetários exógenos, como
ácido araquidônico, adenosina difosfato (ADP), adrenalina e colágeno,
e o resultado da agregação é medido em densidade óptica por meio da
transmitância de luz.
O plasma rico em plaquetas, caracteristicamente turvo, é obtido após a

centrifugação do sangue e tem a concentração de plaquetas ajustadas para
250.000 plaquetas/mL; por meio da contagem em câmara de Neubauer,
mede-se então a densidade óptica (transmitância basal) e em seguida
adicionam-se os agonistas.
A leitura é feita em agregômetro (espectrofotômetro com comprimento

de onda fixa) acoplado a um fotômetro conectado a um registrador
(calibrado com PRP e PPP – plasma pobre em plaquetas) a 540 nm
com agitação constante com bastão magnético. A turvação do PRP,
devido à presença das plaquetas em suspensão, representa 0% de
transmissão luminosa, pois não permite a passagem do feixe de luz. À
medida que as plaquetas se agregam (após a adição do agonista), ocorre
o clareamento do PRP, o que leva a um aumento da transmitância,
que é representada pela deflexão na linha vertical da curva e medida
espectrofotometricamente através da passagem de luz pela suspensão
de plaquetas e registrada em forma de curva que expressa a quantidade
de agregação.
A quantidade e a velocidade da diminuição da densidade óptica são

altamente relacionados e dependentes da reatividade das plaquetas.
O plasma pobre em plaquetas (PPP) representa 100% de transmissão
luminosa. Os valores de referência variam de acordo com o agonista
utilizado. Cada agonista faz a avaliação específica de um componente da
cascata de coagulação.
71
Figura 34. Teste de agregação plaquetária por turbidimetria utilizando agregômetro (A) e exemplo de registro
experimental (B). A: plaquetas normais (acima), deficientes ou tratadas com antagonistas plaquetários (abaixo)
são testadas com agonistas como ADP, ácido aracdônico, resultando em diferentes registros; B: registro de ensaio
utilizando plaquetas normais, mostrando o início do experimento (1), após a adição do agonista, quando ocorre a
mudança da forma da plaqueta com posterior secreção de grânulos (2) e, finalmente, a agregação plaquetária (3).
Fonte: Castro et al., 2006.
Um exemplo é o ADP, agonista fraco quando comparado com colágeno ou trombina,

no PRP, baixas concentrações deste agente levam a formação de uma pequena onda
transiente de agregação. Em concentrações de 1 a 3 Μm, a agregação primária é irreversível
e seguida por uma segunda onda altamente dependente da formação de TXA2 (SILVA,
2010). Fármacos como o AAS inibem a formação de TXA2, prevenindo a formação da
segunda onda induzida por ADP. Já o ácido araquidônico, outro agonista, é essencial
para a formação de TXA2, portanto drogas que inibam a COX-1 impedem a transformação
desse ácido em TXA2 não ocorrendo a agregação plaquetária (SILVA, 2010).
Figura 35. Exemplo de onda característica de uma agregação plaquetária por turbidimetria.
Fonte: Silva, 2010.
72
»» Agregação por sistema de impedância ou sangue total, é um

método alternativo em que se adiciona eletrodos ao tubo contendo
a amostra, que neste caso é o sangue total citratado diluído (1:1) com
solução salina que atua como adjuvante na passagem da corrente elétrica.
As amostras são aquecidas a 37oC por alguns minutos em cubetas
apropriadas, em seguida são adicionados os eletrodos e os agonistas
citados anteriormente e, então, se aplica uma corrente elétrica; a passagem
desta corrente leva à formação de uma camada de plaquetas no eletrodo
devido às cargas elétricas negativas de suas membranas, essa voltagem
é aplicada até a interação entre os eletrodos e as plaquetas estabilizarem
e a impedância se tornar constante (baseline). A resistência elétrica
(impedância) é registrada em aparelho específico.
Após a estabilização é adicionado o agonista para a ativação das plaquetas,

que começam a agregar ainda mais, formando uma cobertura maior e
mais rígida de plaquetas sobre os fios, o que aumenta a impedância.
A amostra diluída em solução salina (eletrólitos) passa através de uma

abertura que conecta as duas câmaras. As células passam através do orifício,
o que causa um aumento momentâneo na resistência elétrica, gerando um
pulso. O pulso representa a célula, e a intensidade do pulso é proporcional
ao tamanho da célula. Após as células serem discriminadas de acordo com
o volume, gera-se o histograma. A resistência elétrica é proporcional ao
recrutamento de outras plaquetas. A vantagem desta metodologia é que
permite a análise de amostras hemolisadas, lipêmicas e plaquetopênicas.
Os valores são expressos em ohms (Ω). As vantagens são ausência de

centrifugação, o que previne a ativação das plaquetas, tempo reduzido,
inclusão de plaquetas gigantes (presentes em algumas plaquetopenias) e
pequeno volume de sangue.
Figura 36. Sistema de impedância em sangue total.
Fonte: <http://www.einstein.br/Ensino/eventos/Documents/dia19-TaniaRubia.pdf>.
73
GRUPOS SANGUÍNEOS UNIDADE IV
A descoberta dos grupos sanguíneos iniciou-se a partir de tentativas falhas de

realização de transfusão sanguínea entre espécies diferentes e posteriormente
entre humanos. Os grupos sanguíneos são classificados de acordo com a
presença ou ausência de antígenos herdados de um ou ambos os pais, estes
antígenos estão presentes na superfície das hemácias, mas também podem
estar presentes em outras células, tecidos e fluidos. Estes antígenos podem
variar em relação à sua imunogenicidade e podem ser proteínas, carboidratos,
glicoproteínas ou glicolipídios, dependendo do grupo sanguíneo em questão.
Os grupos sanguíneos mais importantes são: grupos sanguíneos do sistema
ABO, que determina quatro tipos sanguíneos, A, B, AB ou O, e do sistema Rh, que
determina os grupos sanguíneocs Rh- ou Rh+.
O conhecimento de grupos sanguíneos possibilita o sucesso nas reações

transfusionais, sendo de vital execução tanto para o doador como para o
receptor, uma vez que transfusões sanguíneas podem gerar aglutinação do
sangue e possibilidade de morte. Além disso, a determinação dos grupos
sanguíneos também é importante para verificar incompatibilidade sanguínea
entre mãe e feto, prevendo dessa maneira uma possível isoimunização, que é a
causa da doença hemolítica do recém-nascido.
Os grupos sanguíneos foram descobertos por Karl Landsteiner, no começo do século XX

(1900-1901), que se dedicou a comprovar que havia diferenças no sangue de diversos
indivíduos. Este cientista coletou amostras de sangue de diferentes pessoas, isolou as
hemácias e realizou diferentes combinações entre plasma e hemácias, o que resultou na
formação de aglutinação entre plasma e hemácias em alguns casos e em outros não se
observou o mesmo (BEIGUELMAN, 2003). A observação possibilitou a classificação de
três grupos sanguíneos: grupo A, no qual o soro aglutinava as hemácias do grupo B, mas
não aglutinava as hemácias do grupo A; o grupo B, no qual o soro aglutinava hemácias
do grupo A, mas não as do grupo B; e grupo O, no qual o soro aglutinava as hemácias
dos grupo A e B, mas cujas hemácias não eram aglutinadas por nenhum dos soros.
Posteriormente se descreveu outro grupo, AB, onde o soro não era capaz de aglutinar
as hemácias de nenhum outro grupo, mas suas hemácias podiam ser aglutinadas pelos
soros dos demais grupos.
74
GRUPOS SANGUÍNEOS │ UNIDADE IV
A descoberta dos grupos sanguíneos viria a explicar o porquê da morte de algumas

pessoas após a transfusão sanguínea. Na espécie humana, cerca de 20 sistemas de
classificação sanguínea existem, sendo os principais o sistema ABO, Rh e MN, estes três
sistemas são transmitidos independentemente, pois os alelos estão em cromossomos
não homólogos. Cada sistema de grupo sanguíneo consiste em um ou mais antígenos
que são codificados por um único locus gênico ou por dois ou mais genes homólogos
ligados de tal forma que entre eles não ocorra recombinação homóloga. Os grupos
sanguíneos são geneticamente distintos e isto pode ser explicado pela ocorrência de
segregação dos genes ou pela localização desses genes em cromossomos distintos ou
em locais distintos em um mesmo cromossomo.
Antígeno é qualquer agente que possui a capacidade de desencadear uma

resposta imune, que se inicia pela ação do reconhecimento por linfócitos e
produção de anticorpo específico.
Anticorpos são proteínas produzidas pelo organismo que são recrutadas pelo
sistema imune para identificar e neutralizar qualquer agente que seja estranho
ao organismo.
Os antígenos dos diferentes sistemas podem ser produtos diretos da expressão dos
respectivos genes do sistema ou podem ser carboidratos e, neste caso, os genes codificam
enzimas com atividade transferase, que são responsáveis pela biossíntese dos antígenos.
O que diferencia os diferentes grupos sanguíneos é a constituição antigênica presente

na superfície de hemácias que é resultante da variabilidade genética herdada dos pais
e que ocorre nos componentes da membrana celular, as quais podem ser proteínas,
glicoproteínas ou glicolipídeos. O antígeno quando presente é devido à herança do gene
de um ou ambos os pais e pode ser transmitido às próximas gerações.
Os anticorpos que reconhecerão os antígenos de grupos sanguíneos ocorrem naturalmente

e se devem à estimulação por antígenos promíscuos presentes no ambiente ou à
aloimunização em decorrência de transfusão sanguínea ou gravidez.
O que diferencia os grupos sanguíneos que apresentam antígenos na forma de

carboidratos são as estruturas dos oligossacarídeos, a especificidade de cada um ocorre
devido à ação de glicosiltransferases que são capazes de adicionar moléculas de açúcar
a um substrato. Este substrato é um paraglobosídeo, um tetrassacarídeo cujo resíduo
terminal é uma D-galactose. Quando ocorre a adição de uma L-fucose à D-galactose
terminal do paraglobosídeo, tem-se a sua conversão ao carboidrato conhecido como
antígeno H. O antígeno H é produzido pela ação da enzima α-2-L-fucosiltransferase
codificada pelo gene H no locus FUT1 do cromossomo 9, sendo, portanto, geneticamente
75
UNIDADE IV │ GRUPOS SANGUÍNEOS
independente do locus ABO. O alelo H (forma ativa) apresenta alta frequência na

população, determinando a presença do antígeno H nas hemácias da maioria dos
indivíduos. O alelo H (bastante raro na população) não é capaz de produzir transferase
ativa e, portanto, indivíduos homozigotos (hh) não possuem o antígeno H em suas
hemácias nem expressam qualquer antígeno do sistema ABO, fenótipo este conhecido
como Bombaim (VIELE; DONEGAN; BOSSON, 2000).
Os paraglobosídeos podem ser classificados em tipos 1 e 2, dependendo do tipo de ligação

que ocorre da galactose a este substrato. Quando a ligação é β(1-3), o paraglobosídeo é
do tipo 1, sendo este encontrado nas secreções, enquanto que se a ligação for β(1-4), o
paraglobosídeo é do tipo 2, este encontrado em hemácias.
O sistema de grupo sanguíneo ABO foi o primeiro dos grupos sanguíneos a serem
descobertos no século XX por Landsteiner e até hoje é considerado o mais importante
sistema de grupos sanguíneos na Medicina Clínica Transfusional. Este grupo sanguíneo,
juntamente com o grupo Hh, constituem-se de antígenos do tipo carboidratos.
O sistema ABO caracteriza-se pela presença ou ausência de antígenos A e B

(aglutinogênios). As denominações A, B, O e AB referem-se aos fenótipos, enquanto
que as designações AA ou AO, BB ou BO, OO e AB referem-se aos genótipos (a espécie
humana é diploide e, portanto, dois alelos podem fornecem seis genótipos), porém os
alelos A e B são codominantes entre si e dominantes em relação ao alelo O, resultando
em quatro genótipos: A, AB, B, O. Os fenótipos são manifestados por três alelos, IA, IB,
i (o I deve-se à palavra isoaglutinação) presentes no braço longo do cromossomo 9. O
alelo i só consegue manifestar fenótipo quando está em dose dupla, pois é recessivo em
relação a IA e IB. O grupo O é homozigoto recessivo. Porém, quando os alelos IA e IB estão
juntos, ocorre um caso de codominância e o indivíduo será AB.
A heterogeneidade fenotípica do sistema sanguíneo ABO é devido às pequenas

diferenças dos aminoácidos localizados próximos ao sítio de ligação da enzima
transferase com seu respectivo açúcar. As glicosiltransferases, enzimas que catalisam
as reações de transglicolização entre o substrato aceptor e o açúcar receptor, codificadas
pelos genes A e B, são responsáveis pela transferência de resíduos específicos de açúcar,
N-acetil-galactosamina (açúcar transferido pela transferase codificada pelo alelo A) ou
N-galactosil (açúcar transferido pela transferase codificada pelo alelo B), à galactose
terminal do carboidrato precursor, antígeno H, que os convertem ao antígeno A ou
B respectivamente. O antígeno O é um alelo nulo, ou seja, não codifica transferase
modificadora do substrato H; os indivíduos do grupo O apresentam apenas o antígeno
H em grande quantidade em suas hemácias. Para uma pessoa ser do grupo sanguíneo
AB, por exemplo, necessita dos alelos A, B e H, apresentando a atividade das duas
transferases (A e B) (FRAGA; OLIVEIRA, 2011).
76
Os genes ABO não são os codificadores dos antígenos ABO; eles apenas codificam as
enzimas que acrescentam na estrutura da molécula H carboidratos específicos em
resposta a enzimas transferases também específicas. Isto é, os antígenos A, B e H
são formados a partir de um mesmo material, uma glicoproteína que funciona como
uma substância precursora à qual são fixados carboidratos específicos. Deste modo,
a ação do gene H está diretamente relacionada com a formação dos antígenos ABO
(PSCHISKY, 2003).
A descoberta do sistema sanguíneo ABO iniciou-se quando se percebeu que alguns

indivíduos portadores do alelo A apresentavam diferenças em seu soro, que aglutinava
hemácias do grupo O, sugerindo que estas últimas teriam um antígeno, que então foi
denominado de H. Tal antígeno, portanto, é aglutinado por soro contendo anti-H. A
descoberta do raro fenótipo de Bombaim ajudou a esclarecer esse fato.
Os antígenos do sistema ABO não estão presentes apenas na membrana dos eritrócitos,
também podem ser encontrados em outras células, como linfócitos, plaquetas,
endotélio capilar venular e arterial, células sinusoidais do baço, medula óssea, mucosa
gástrica, além de secreções e outros fluidos como saliva, urina e leite (BATISSOCO;
NOVARETTI, 2003).
Figura 37. A) Paraglobosídeo. Carboidrato presente na superfície de hemácias.
B) Formação do antígeno H.
77
C) Fenótipo Bombay. Situação em que não ocorre a ligação de fucose ao paraglobosídeo.
D) Grupo sanguíneo A. Ligação N-acetil-galactosamina ao antígeno H.
E) Grupo sanguíneo B. Ligação de galoctose ao antígeno H.
F) Grupo sanguíneo AB. Ligação de N_acetil-galactosamina e galactose ao antígeno H.
Fonte: <http://www.lahem.com.br/wp-content/uploads/2013/10/grupos-sangu%C3%ADneos-ABO.pdf>.
78
A determinação do sistema de grupos sanguíneos ABO permitiu transfusões sanguíneas

bem-sucedidas em grande parte dos casos, mas uma parte destas transfusões continuou
a resultar em mortalidade, sem se saber a causa até 1937, quando as transfusões ainda
eram feitas baseadas na compatibilidade dos grupos sanguíneos ABO.
Uma menor produção dos antígenos A ou B pode ocorrer quando há variações fenotípicas
dos genes responsáveis por codificar o sistema ABO, e isto resulta na formação dos
subgrupos pertencentes a este sistema. Tal heterogenicidade dos alelos A e B se refletem
em dificuldades nos testes imunohematológicos. Os principais subgrupos gerados
dessas variações são os grupos A1 e A2, que são distintos entre si quantitativamente
e qualitativamente, o que pode resultar em discrepâncias na tipagem sanguínea ABO.
Outros antígenos estão presentes nas hemácias humanas, entre eles os antígenos M
e N. Em estudo realizado com o sangue de diferentes pessoas, constatou-se que em
algumas existia apenas o antígeno M, em outras, somente o N e, adicionalmente, várias
pessoas possuíam ambos os antígenos, sugerindo a existência de três grupos nesse
sistema: M, N e MN. Os genes responsáveis pela síntese desses antígenos são apenas
dois: LM e LN (a letra L é a inicial do descobridor, Landsteiner). O sistema sanguíneo
MN segue a herança mendeliana simples (transmissão hereditária), assim como para
o sistema ABO. O genótipo LMLM condiciona a produção do antígeno M, e LNLN a do
antígeno N. Entre LM e LN há codominância, de modo que estas pessoas com genótipo
LMLN produzem os dois tipos de antígenos.
Codominância é a relação existente entre alelos de um gene, onde o filho

não possui a mesma característica do pai, ou seja, não existe relação
de dominância. Este processo ocorre quando alelos se expressam no
heterozigoto, sendo o fenótipo distinto em relação aos dois homozigotos
(PEZZI; GOWDAK; MATTOS, 2012).
O sistema Rh sanguíneo foi inicialmente descoberto por Levine e Stetson, em 1939,

um ano antes de Wiener e Landsteiner realizarem um estudo a respeito da evolução
dos aglutinogênios M e N em gorilas, chimpanzés e pequenos macacos. Alguns
estudiosos afirmavam a presença do antígeno M nas hemácias de macacos do gênero
Rhesus e outros relataram a ausência deste antígeno nesses animais. Para esclarecer
essa questão, Wiener e Landsteiner, baseados em demonstrações das propriedades
dos aglutinogênios M no sangue de macacos, empenharam-se na tentativa de produzir
soro anti-M pela imunização de coelhos com sangue de macaco Rhesus e com isso
conseguiram a obtenção de um soro imune anti-M, percebendo então que com isto
era possível a obtenção de soros imunes específicos contra fatores sanguíneos ainda
desconhecidos. Estes cientistas obtiveram o soro imune anti-rhesus injetando hemácias
de macaco Rhesus em coelhos. Uma vez obtido o soro com corpos imunes, os anticorpos
79
M e N foram adquiridos por meio deste soro e colocados em contato com hemácias
de macaco Rhesus, esperando-se que nenhuma reação ocorresse, já que os anticorpos
que desencadeariam as reações (anti-M) não estariam presentes no soro. Porém, de
forma inesperada, quando os soros obtidos de coelhos foram colocados em contato com
hemácias humanas, observou-se a aglutinação independente do grupo ABO avaliado e
dos fatores M e N em 85% das hemácias avaliadas. Estes indivíduos foram chamados de
Rh+ e os que não apresentaram aglutinação Rh-, demonstrando que o Rh positivo era
herdado como um caráter dominante. A característica das hemácias que determinava
a aglutinação das células foi denominada de fator Rh, ou aglutinogênio Rh, devido
à maneira como foi descoberto, ou seja, utilização de hemácias de macacos Rhesus
(BATISTETI et al., 2007).
O sistema Rh é considerado o segundo mais importante após o sistema ABO. Após a

descoberta do sistema Rh foi possível esclarecer, por exemplo, que os anticorpos anti-
Rh são a causa principal da doença hemolítica do recém-nascido ou eritroblastose fetal
e que tais anticorpos podem também desenvolver reações transfusionais hemolíticas
tardias (VIELE; DONEGAN; BOSSON, 2000).
O sistema Rh é um complexo de antígenos proteicos que podem estar ou não presentes

na superfície de glóbulos vermelhos. Se houver a presença desse complexo de antígenos,
o indivíduo é Rh+, caso não possua, é considerado Rh-.
O sistema Rh é muito variável e atualmente são conhecidos mais de 49 antígenos,

sendo o antígeno RhD (ou D), junto com outros quatro antígenos os principais deste
sistema e responsáveis por 99% dos problemas associados ao sistema Rh. Entre os
outros antígenos principais, temos dois pares de antígenos: C/c e E/e. O antígeno RhD
é o antígeno eritrocitário não ABO mais importante, vem sendo envolvido na etiologia
de reações transfusionais hemolíticas e é considerado altamente imunogênico. Os
antígenos “C” e “e” são menos imunogênicos que “E” e “c” (LIU, 2012).
O antígeno RhD possui vários epítopos, sendo assim, alterações de aminoácidos desse
antígeno podem modificar a expressão dos epítopos originais ou levar a uma expressão
de novos epítopos, consequentemente, variações na expressão dos antígenos RhD na
membrana eritrocitária podem ocorrer. Os indivíduos que são RhD positivos podem
ser classificados em RhD positivo, RhD fraco e RhD parcial.
Hemácias que apresentam o fenótipo conhecido como RhD fraco possuem menor
expressão da proteína RhD na membrana eritrocitária, devido a alterações na porção
intramembranar, e portanto, pessoas com este fenótipo não produzem anticorpos
anti-D. Estima-se que a frequência de RhD fraco na população seja inferior a 1%
(GIRELLO, 2002).
80
As hemácias RhD parciais apresentam ausência de um ou mais epítopos do antígeno

Rh devido a mutações ou rearranjos gênicos, o que leva à modificação qualitativa da
proteína RhD, indivíduos com este fenótipo podem produzir aloanticorpos caso entrem
em contato com hemácias RhD positivas (BARROS et al., 2006), o que torna importante
a identificação para a clínica, já que este fenótipo é capaz de produzir anticorpos.
A partir dessas considerações/discussões em relação a diferenças de reatividade

dos regentes utilizados na detecção dos fenótipos RhD, ocorrem com o intuito de se
elaborar o melhor teste para doadores de sangue, pacientes e receptores. Por exemplo,
a identificação do fenótipo Rh-D parcial (que é raro) ocorre somente com o uso de
anticorpos monoclonais específicos ou por metodologias de biologia molecular, uma
vez que sorologicamente este fenótipo se comporta como Rh-D fraco e como positivo.
Os indivíduos que apresentam o fenótipo Bombaim desenvolvem naturalmente

anticorpos contra os antígenos A, B e H, portanto pessoas com este fenótipo devem
receber transfusões de indivíduos de sangue do mesmo genótipo, ou seja “hh”, visto
que este sangue é incompatível com todos os grupos sanguíneos ABO. Além disso, uma
pessoa com este genótipo pode possuir o alelo A, B ou AB do sistema ABO e transmitir
este alelo à descendência. Isto explica o caso de pessoas pretensamente do tipo O que
possuem, por exemplo, filhos AB (RAPAPORT, 1990). A ocorrência do genótipo hh é
comumente presente em crianças de casamentos consanguíneos. Caso seja realizada a
tipagem de sangue com o anti-A e o anti-B, o fenótipo Bombaim será determinado como
grupo sanguíneo O, no entanto a transfusão normal do grupo sanguíneo O provocaria a
hemólise imediata pela quantidade de anti-H presente num indivíduo com este fenótipo
(HARMENING-PITTIGLIO; CARLSON, 1992).
81
CAPÍTULO 1
Determinação dos grupos sanguíneos
do sistema ABO
Para a determinação do fenótipo, são utilizados reagentes imuno-hematológicos

capazes de reconhecer os açúcares específicos dos glóbulos vermelhos, pela presença
ou ausência das substâncias A, B e H no soro e/ou na saliva e também pelas técnicas
de adsorção e eluição (Batissoco e Novaretti, 2003). Na prática transfusional, a
compatibilidade para o sistema ABO e para o antígeno D do sistema Rh é fundamental
na prevenção de reações hemolíticas.
A expressão de antígenos A ou B nos eritrócitos pode variar, gerando os subgrupos de

A ou B, de acordo com o nível de aglutinação dos eritrócitos com os reagentes anti-A,
anti-B, anti-AB, anti-A1 e anti-H.
A reatividade do reagente anti-H com as hemácias dos diferentes grupos sanguíneos

ABO tende a ser: O>A2>B>A2B>A1>A1B (BATISSOCO; NOVARETTI, 2003). Os
subgrupos de A, A1 e A2, podem ser diferenciados pelo reagente lectina anti-A1, o termo
lecitina (presente em sementes de Dolichos biflorus) se refere a uma classe de proteínas
de origem não imunológica que pode aglutinar hemácias graças à sua propriedade de
se ligar reversivelmente a carboidratos. Já o fenótipo A2, é detectado pela habilidade
desses eritrócitos se aglutinarem na presença do soro anti-A e de não se aglutinarem
na presença do soro anti-A1, o que não ocorre para fenótipo A1 cujas hemácias são
aglutinadas na presença desse reagente (LIU, 2012).
Figura 38. Demonstração do sistema ABO.
Fonte: <http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfuy8AG/grupos-sanguineos>.
Dentro de um hemonúcleo, a tipagem sanguínea faz parte da rotina, assim como exames
imuno-hematológicos adicionais para a correta identificação do doador a fim de evitar
problemas relacionados à futura doação.
82
Originalmente, a determinação do grupo ABO era realizada fazendo-se reagir hemácias

do paciente com soros anti-A e anti-B em lâminas limpas de microscopia. Porém, no
Brasil, determinou-se em legislação que as provas de aglutinação não deveriam ser
feitas em lâminas, e sim por métodos mais precisos, podendo ser utilizados os métodos
em microplacas escavadas e/ou tubos de ensaio ou gel-centrifugação, mais recente, o
mesmo se aplica ao fator Rh.
Cada técnica apresenta vantagens e desvantagens, sendo, portanto, a técnica de

tipagem em lâmina menos vantajosa, apresentando menor sensibilidade do que a
realizada em tubo de ensaio, levando a uma grande quantidade de falsos-positivos
em decorrência da rapidez com que a mistura da reação seca favorece a agregação
das células, além disso, as reações são mais fracas e apresentam maior dificuldade na
interpretação. Esta técnica, portanto, não é recomendada para a utilização rotineira,
mas pode ser utilizada em tipagens sanguíneas emergenciais, devendo sempre ser
conciliada por alguma outra técnica.
Com maior sensibilidade, a técnica em tubo apresenta vantagens, como a incubação por
longos tempos, a secagem da mistura da reação é evitada, a leitura é de fácil execução e
a classificação dos resultados é mais limpa e higiênica.
Para a tipagem ABO, existem as provas direta e reversa. Na prova direta, realiza-se
a pesquisa de antígenos do sistema ABO, presentes na superfície das hemácias do
indivíduo avaliado. Nesta prova, reagem-se amostras de sangue com soros contendo
anticorpos anti-A, anti-B e anti-AB (porém, quando se utiliza anticorpos monoclonais,
a utilização do anti-AB deixa de ser obrigatória). Quando há reatividade com o soro
anti-A, as hemácias são denominadas do grupo A e, quando reagem com o soro anti-B,
pertencem ao grupo B. Há reatividade com ambos os anticorpos quando as hemácias
são do grupo AB, já as hemácias do grupo O não apresentam reatividade com nenhum
dos anticorpos. O soro divalente anti-AB é usado como confirmatório e somente não
reagirá com hemácias do grupo O.
Realiza-se procedimento oposto na prova reversa (obrigatoriamente realizada) e nesta a

pesquisa é da presença de anticorpos anti-sistema ABO encontrados no soro ou plasma
do indivíduo. Nesta prova faz-se o soro do qual se pretende realizar a tipagem, ele é
reagido com hemácias conhecidas dos grupos A e B. Nesta prova, o soro de indivíduos
que pertencerem ao grupo O reagirá com ambas as hemácias utilizadas (pois possuem
ambos os anticorpos); o soro de indivíduo pertencente ao grupo A, reagirá apenas com
hemácias do grupo B e o soro do grupo B, apenas com hemácias do grupo A. O soro do
grupo AB não reagirá com nenhuma das hemácias. Esta prova pode ser contemplada
pelo uso de hemácias conhecidas A1 e A2, que auxilia na diferenciação destes dois
subgrupos e na solução das principais discrepâncias ABO (BEIGUELMAN, 2003). A
83
presença de anticorpos no soro constitui uma barreira para transfusões sanguíneas ou

transplante de órgãos ABO incompatíveis.
Casos as provas direta e reversa apresentem resultados contraditórios, deverão ser

realizadas investigações adicionais, não sendo o hemocomponente liberado até que
a discrepância tenha sido resolvida. Recomenda-se que seja realizada a investigação
dos subgrupos de A quando houver resultados discrepantes entre as provas direta e
reversa ou na busca de concentrado de hemácias de subgrupo A2 para pacientes que
apresentam anticorpo anti-A1 clinicamente significante (PORTARIA MS nº 1.353/2011,
MINISTÉRIO DA SAÚDE).
São identificados vários tubos que vão conter 50 μL dos anticorpos: anti-AB, anti-A,
anti-B, Anti-D, CRh (controle Rh) e as hemácias A1 e B. Adiciona-se então 100 μL de soro
(obtido após a decantação do sangue total por centrifugação) nos tubos correspondentes
às tipagens com hemácias (prova reversa). Para a tipagem direta, aspiram-se as
hemácias contidas no fundo do tubo e realiza-se uma diluição em salina (5%); adiciona-
se então 50 μL dessas hemácias diluídas nos tubos contendo os anticorpos. Pipeta-se
50 μL das hemácias A1 e B nos seus respectivos tubos, que já receberam previamente
o soro do paciente; os tubos são centrifugados e observa-se então a presença ou não de
aglutinação. Resumindo:
»» PROVA DIRETA = GLOBULAR à reagentes padrão (anticorpos) +

hemácias do paciente;
»» PROVA REVERSA = SÉRICA à hemácias padrão + soro do paciente.
Figura 39. Padrão das reações de tipagem sanguínea do sistema ABO.
Qualquer reação diferente da expressa nesse quadro configura-se como discrepância.
Na tipagem do sistema Rh, utiliza-se o reagente anti-Rh(D) para a pesquisa de antígeno

D nas hemácias do paciente. A interpretação do resultado é:
»» Rh positivo à presença de aglutinação;
»» Rh negativo à ausência de aglutinação.
84
Para o reagente utilizado nesta identificação, apesar de ser do tipo monoclonal, indica-
se a realização da pesquisa da variante D-fraco quando o teste anterior é Rh negativo.
Para a detecção do D-fraco, realiza-se a lavagem (três vezes) das hemácias do paciente
que apresentou Rh negativo na reação com o anti-D e faz-se uma suspensão a 5% em
solução salina. Adiciona-se 50 μL das hemácias lavadas e diluídas a tubos contendo
anticorpo anti-D e controle Rh. Os tubos são centrifugados e observa-se então a presença
ou não de aglutinação. Caso o resultado continue negativo, é realizada a incubação dos
tubos à 37oC por 30 minutos, seguida de nova centrifugação. Se houver aglutinação no
tubo anti-D, o paciente é classificado como Rh positivo e finaliza-se então o teste. Caso
não ocorra aglutinação no tubo anti-D, dá-se continuidade ao teste. As hemácias após
a lavagem com salina são decantadas e então adiciona-se 100 μL do soro antiglobulina
humana (poliespecífico); os tubos são homogeneizados e centrifugados. Se houver
ausência de aglutinação nos dois tubos (anti-D e controle Rh), pode-se classificar esse
paciente como Rh negativo. Se ocorrer a aglutinação no tubo correspondente ao anti-D,
o paciente é classificado como Rh positivo (D-fraco). Se houver aglutinação em ambos
os tubos, não considerar o paciente como Rh positivo, neste caso considera-se o paciente
como tendo teste de Coombs Direto Positivo, provavelmente por sensibilização de suas
hemácias por auto ou aloanticorpos, caso não tenha tempo para realizar estudos mais
aprofundados e seja necessária a transfusão sanguínea, escolher sangue Rh negativo.
Figura 40. Tipagem sanguínea sistema ABO e Rh em lamínula.
Fonte: <http://www.joseferreira.com.br/blogs/biologia/2012/junho/fotos-da-aula-pratica-de-tipagem-sanguinea-2a-serie-do-
ensino-medio/>, com modificações.
85
CAPÍTULO 2
Teste de Coombs
As imunoglobulinas são proteínas presentes em grande concentração no plasma

humano. São os vetores da imunidade humoral, tendo como função principal
unir-se aos antígenos estranhos ao indivíduo, de modo a neutralizá-los (ANVISA).
As imunoglobulinas apresentam capacidades imunogênicas no caso de um indivíduo

de espécie diferente ser imunizado com elas. As anti-imunoglobulinas, que são
formadas na condição citada, são capazes de reconhecer regiões conservadas de todos
os anticorpos da mesma classe. Robin Coombs foi o primeiro a desenvolver anticorpos
anti-imunoglobulinas com o intuito de pesquisar a anemia hemolítica do recém-nascido
e o teste para a mesma doença é denominado de teste de Coombs.
A doença hemolítica do recém-nascido (DHRN), uma variedade de anemia, é uma

patologia imunológica resultante da passagem pela placenta de anticorpos maternos
específicos da classse IgG para o antígeno de origem paterna presente nas hemácias
fetais, diminuindo o tempo de vida dessas hemácias.
A doença hemolítica pelo sistema Rh é o modelo clássico de aloimunização materna

por antígenos de hemácias que não pertencem ao sistema ABO. Quase 98% desses
casos de aloimunização materna por antígenos eritrocitários não ABO (doença
hemolítica perinatal, DHPN) são derivados ao fator RhD e o restante por antígenos
não tão comuns, como fatores Kell, E ou C (BOWMAN, 1997). Normalmente, os
problemas surgem quando a mãe é Rh-negativo e o feto tem Rh-positivo herdado de
um pai Rh-positivo.
O antígeno D é encontrado unicamente nas hemácias e, junto com outros antígenos,

como Cc e Ee (que também possuem propriedades hemolíticas), compõem o sistema
Rh, porém o D é 50 vezes mais imunogênico que os outros antígenos do sistema Rh
(JUNQUEIRA, 1991; MOLLISON et al., 1997; URBANIAK & GREISS, 2000). A
presença do antígeno D é frequentemente empregada como sinônimo de positividade
para o fator Rh (SÁ, 2006).
Os anticorpos maternos são formados por meio de isoimunização quando esta entra em
contato com antígenos estranhos. Tal contato com o sangue fetal pode ocorrer a uma
transfusão fisiológica entre o feto e a mãe na gestação. A frequência com que isto ocorre
aumenta com os meses de gestação por causa do aumento da superfície placentária,
ocorrendo maior risco de transporte de eritrócitos fetais para a circulação da mãe. A
86
frequência de acordo com o mês de gestação é de 7%, 16% e 29% respectivamente no

primeiro, segundo e terceiro trimestre (CIANCIARULLO; CECCON; VAZ, 2003).
Qualquer que seja a causa da imunização (aborto espontâneo, gravidez ectópica,

descolamento placentário, césarea anterior, transfusão de hemoderivados, entre outros),
na gravidez seguinte os anticorpos maternos anti-D atravessam a placenta a partir da
12a semana, e destroem (hemólise) as hemácias fetais D positivas (Rh+). Raramente a
hemólise ocorre na primeira gestação (pois não há contato significativo entre o sangue
da mãe e do feto até o momento do parto) sendo mais frequente ocorrer a imunização
na primeira gestação e hemólise nas gestações posteriores; a cada gravidez posterior a
mãe fica mais sensibilizada perante o sangue Rh-positivo produzindo anticorpos cada
vez com maior antecipação.
A hemólise ocasionada leva a um quadro clínico denominado de eritroblastose fetal

(hemólise nas hemácias do feto) e eritroblastose neonatal (hemólise nas hemácias
do recém-nascido). A destruição dos eritrócitos pode causar anemia, trazendo
consequências negativas para o feto e recém-nascido. A anemia poderá ter vários graus,
de acordo com a intensidade da hemólise, determinando mecanismos compensatórios,
desde o aumento da eritropoiese medular, seguido do recrutamento de vários sítios
extramedulares, como fígado, baço, rins e suprarrenais, até que ocorra congestão
hepática, obstrução do sistema porta, redução da pressão oncótica e, finalmente, se
instale a insuficiência cardíaca e hidropisia fetal. A DHRN pode ocasionar o aumento
da produção de bilirrubina no sangue, um produto residual proveniente da destruição
dos eritrócitos, caso este valor esteja muito elevado o risco para o feto é grande, uma vez
que esta substância pode impregnar-se em estruturas cerebrais. Por isso a necessidade
de um acompanhamento pré-natal bem-feito em gestantes Rh-negativo (BAIOCHI;
NARDOZZA, 2009).
O principal exame a ser realizado no pré-natal é a pesquisa de anticorpos anti-D na

gestante, esse exame é chamado de Coombs e é realizado na primeira visita pré-natal,
sendo repetido na 28a semana de gestação para detectar o aparecimento de anticorpos
durante a gestação.
O teste de Coombs direto é utilizado para o diagnóstico de anemias hemolíticas

autoimunes, anemias causadas por drogas, assim como a doença hemolítica perinatal
decorrente de incompatibilidade materno-fetal entre antígenos dos sistemas de grupos
sanguíneos, principalmente o Rh (FLEURY, MANUAL DE EXAMES). No método
direto, pesquisa-se anticorpos maternos que possam ter atravessado a placenta e se
ligado às hemácias Rh-positivas do feto. Para isto, coleta-se hemácias do feto, realiza-se
a lavagem para retirada de anticorpos que não estejam ligados e realiza-se a incubação
com anti-imunoglobulina humana (soro de Coombs). A denominação do teste, direto,
87
provém da aglutinação que ocorrerá se houver anticorpos anti-Rh ligados nas hemácias
do bebê.
Outra variação do teste de Coombs é a metodologia indireta, neste detecta-se a presença

de anticorpos anti-Rh não aglutinantes no soro de indivíduos Rh negativos. Neste teste
o soro é inicialmente incubado com hemácias do tipo O-Rh positivas, que se ligarão
caso os anticorpos anti-D estejam presentes. São utilizadas hemácias do tipo O para
evitar possíveis ligações cruzadas de antígenos A ou B cujos anticorpos também podem
estar presentes no soro avaliado (por exemplo, quando o indivíduo é Rh-negativo do
tipo O). Após esta incubação, as hemácias são lavadas para retirar anticorpos que não
se ligaram e em seguida as hemácias são incubadas com anti-imunoglobulina. Caso
ocorra a aglutinação, o ensaio é positivo.
Figura 41. Representação do teste de Coombs direto e indireto.
Fonte: <http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAfxIAC/teste-coombs-direto-indireto>, com modificações.
88
CAPÍTULO 3
Provas de compatibilidade transfusional
Jean-Baptiste Denis, no século XVII, foi a primeira pessoa a tentar realizar uma
transfusão sanguínea, a tentativa, falha, foi realizada pela infusão de sangue de ovelha
em um ser humano. O sucesso na terapia de transfusão sanguínea somente ocorreu
após a descoberta dos grupos sanguíneos e compatibilidade sanguínea4.
Com o intuito de selecionar os doadores visando à segurança do receptor, uma vez

que o sangue pode ser veículo de inúmeros agentes biológicos e na transfusão existe
a possibilidade de reações adversas, bem como problemas relacionados ao próprio
doador, como portadores de condições clínicas ou doenças que poderiam se agravar
com a doação, uma triagem rigorosa dos candidatos deve ser realizada.
Consituem testes imuno-hematológicos obrigatórios em um hemonúcleo: tipagem

ABO/Rh, pesquisa de anticorpos irregulares (PAI), prova de compatibilidade e
reclassificação ABO/Rh do doador e receptor.
É importante a identificação do sistema ABO devido às gravidades tranfusionais

hemolíticas que podem ocorrer caso o plasma do receptor apresente anticorpos contra
os antígenos A e B. Estes anticorpos podem causar hemólise predominantemente
intravascular, podendo levar à morte.
A doença hemolítica perinatal, transfusões sanguíneas com reações de hemólise e

anemias hemolíticas autoimunes estão relacionadas com o sistema Rh, maior e mais
complexo sistema de grupos sanguíneos e por isto o grande interesse clínico neste.
As ações dos anticorpos que propiciam proteção são as mesmas que geram muitas vezes
reações adversas na hemoterapia, em doenças hemolíticas autoimunes, na doença
hemolítica do recém-nascido e em reações a tecidos transplantados (OLIVEIRA;
RIBEIRO; VIZZONI, 2013).
A presença de aloanticorpos antieritrocitários secundários à gravidez, transfusão

sanguínea ou transplante de órgãos pode comprometer transfusões sanguíneas
subsequentes e, em algumas situações, até uma futura gravidez. Esses anticorpos são
chamados de aloanticorpos.
4 <http://www.saude.mt.gov.br/hemocentro/pagina/74/transfusao-de-sangue>.
89
Aloanticorpo é o nome dado a qualquer anticorpo formado por sensibilização

contra antígenos reconhecidos como não próprios ao indivíduo (GIRELLO, 2002).
Autoanticorpos são formados contra antígenos próprios ao indivíduo (autoimunes).
Os aloanticorpos referentes aos grupos sanguíneos podem ser divididos em duas

categorias: naturais e imunes. Os naturais estão presentes em baixas concentrações
no plasma de uma pessoa saudável e ocorrem devido à expressão de moléculas
por bactérias e que apresentam grande semelhança com os antígenos dos grupos
sanguíneos, isto ocorre por meio de uma estimulação espontânea. Quando a criança
nasce, suas hemácias contêm as moléculas grupo-específicas às quais seu sistema
imune é tolerante por lhe serem próprias. Porém, o soro do recém-nascido não
apresenta aglutininas de síntese própria para o sistema ABO (OLIVEIRA; RIBEIRO;
VIZZONI, 2013).
Pesquisa de P.A.I. também chamado de Coombs Indireto (ou teste da antiglobulina)

tem como objetivo avaliar a presença de anticorpos irregulares no soro do paciente seja
ele doador ou receptor.
Os anticorpos que apresentam importância na hemoterapia são aqueles direcionados

contra antígenos eritrocitários (principalmente contra os sistemas Rh, Kell, Duffy,
Kidd, Lewis, MNSs), e estão associados com a diminuição da sobrevida de hemácias
transfundidas5.
Quando se tem um P.A.I. positivo isto será indicativo da presença de anticorpo

irregular no plasma deste paciente ou doador de sangue, o que nos levará à realização
de um outro teste denominado identificação de anticorpos irregulares (I.A.I.), em que
será determinada a especificidade desse anticorpo, ou seja, contra qual aglutinógeno
específico esse anticorpo é voltado.
A denominação anticorpos regulares é usualmente utilizada para se referir a

iso-hematoaglutininas direcionadas contra antígenos do sistema ABO e são do tipo IgM.
Já os anticorpos irregulares, direcionados a antígenos dos outros grupos sanguíneos,
comumente são do tipo IgG.
Coombs e colaboradores foram os primeiros a utilizarem antiglobulina humana

(denominada de soro de Coombs) para detectar in vivo a ocorrência de sensibilização
das hemácias por anticorpos, sendo de extrema importância para o diagnóstico da
doença hemolítica perinatal. Com este teste também foi possível a identificação de
diferentes anticorpos IgG e seus respectivos antígenos, possibilitando a identificação
de muitos sistemas de grupos sanguíneos. O teste pode ser utilizado para detectar
5 <http://www.hemocentro.unicamp.br/pdfs/manualtecnicotransfusional-2010.pdf>.
90
hemácias sensibilizadas por anticorpos IgG, autoanticorpos IgG ou componentes do

complemento. A sensibilização pode ocorrer in vivo ou in vitro6.
O teste de Coombs baseia-se no conhecimento de que antiglobulinas humanas obtidas

de outras espécies imunizadas podem se ligar a globulinas humanas, como IgG livres
no soro ou fixas a antígenos de hemácias. Os anticorpos do tipo IgG não possuem
capacidade aglutinante, pois apresentam estrutura monômera muito pequena, porém
são capazes de sensibilizar hemácias que tenham antígenos correspondentes, mas sem
promover a aglutinação diretamente. As hemácias sensibilizadas por anticorpos IgG
necessitam da adição do soro antiglobulina humana para aglutinarem.
Os anticorpos irregulares são formados pela imunização por meio de transfusões

sanguíneas, gestações ou administração constante de material imunogênico de classe
IgM ou IgG. Em testes pré-transfusionais, além da determinação ABO e Rh e prova
de compatibilidade, é obrigatória também a realização da pesquisa de anticorpos
irregulares em receptores de hemocomponentes (RDC nº 153, de 14/6/2004)
(FORTES, 2011).
O screening de anticorpos irregulares é um exemplo de teste de antiglobulina indireta,

no qual se utiliza o soro ou o plasma do paciente, que é testado contra uma suspensão
de hemácias do tipo O, que possui antígenos conhecidos, a ocorrência natural de
anti-A ou anti-B não interfere na detecção. Um antigrama (painel contendo antígenos
específicos) contendo a relação da composição antigênica de cada hemácia utilizada
serve para definir qual anticorpo está presente.
Há diferentes metodologias para realização do P.A.I., entre elas o método em tubo é o

mais utilizado.
Para sua realização, é necessário um conjunto de hemácias comerciais em suspensão

5%, contendo perfil antigênico conhecido e capaz de detectar a maioria dos anticorpos
de importância clínica. Adiciona-se o soro a ser investigado com a suspensão de
hemácias comerciais. O período de incubação à 37oC pode variar de acordo com
instruções do fabricante. Após o período de incubação, realiza-se uma lavagem com
salina e, então, adiciona-se o reagente contendo antiglobulina humana. Observa-se a
presença ou não de aglutinação. Ao resultado negativo é preciso realizar a validação
da reação com controle de Coombs: se o controle de Coombs for positivo, o resultado
negativo é validado para P.A.I. Caso o controle de Coombs seja negativo, invalida a
reação e indica que o resultado da P.A.I. é falso-negativo, sendo necessária a repetição
do teste.
6 <http://www.controllab.com.br/pdf/201110_quest_ih_TXT_complementar.pdf>.
91
Figura 42. Representação do teste indireto da antiglobulina (P.A.I.).
Fonte: <http://www.ebah.com.br/content/ABAAABKQUAI/testes-antiglobulina-direto-indireto>.
A prova de compatibilidade (reação cruzada) pré-transfusional é realizada com o

intuito de confirmar se o sangue a ser transfundido é realmente compatível com o do
receptor. Consiste em misturar o soro do receptor com as hemácias do doador com a
finalidade de investigar no soro ou plasma do receptor a presença de anticorpos contra
antígenos de grupos sanguíneos presentes nas hemácias do doador. É importante
92
a sua realização para a detecção de erros nas tipagens ABO do doador e receptor,
presença de anticorpos irregulares clinicamente significantes não detectados no P.A.I.
do receptor e anticorpos contra antígenos de baixa frequência presentes nas hemácias
do doador. Porém, vale ressaltar que essa prova não acusa todos os erros de tipagem,
determinações errôneas na tipagem ABO resultarão em prova cruzada incompatível
devido às isoaglutininas naturais (A e B), mas quando se trata do sistema Rh isto
naturalmente não ocorre. Por isso, quando o sangue de um doador for Rh positivo,
tipado erroneamente como Rh negativo, ele será “compatível” com um paciente Rh
negativo resultando em aloimunização ao antígeno d, devido a sua alta antigenicidade7.
A prova é dividida em duas etapas, na primeira etapa (Major Crossmatch), uma

pequena quantidade do sangue total ou suspensão de hemácias do doador é misturada
com uma pequena quantidade de soro do receptor. O resultado positivo é dado a
partir da observação de grupos (macroscopicamente) e a aglutinação de eritrócitos
(microscopicamente). Na segunda etapa (Minor Crossmatch), uma pequena quantidade
de sangue total ou hemácias do receptor é misturada com o soro do doador e, do mesmo
modo, pesquisa-se a formação de grupos de hemácias. A ausência de grumos nas duas
etapas da prova cruzada significa que a transfusão pode ser realizada (GONZÁLEZ;
SILVA, 2008).
»» Técnica em tubo: 0,5 a 1 ml de sangue do doador são adicionados em

dois frascos (um com EDTA e outro sem anticoagulantes), o mesmo é
feito com o sangue do receptor. Os tubos sem anticoagulante do doador
e receptor são centrifugados para a separação dos eritrócitos do soro.
O plasma e as células do doador e receptor são separadas utilizando-se
pipetas diferentes. Os eritrócitos são lavados em solução salina. Prepara-
se uma solução 4% do receptor e doador (concentrado de eritrócitos +
solução salina). Identifica-se 4 tubos: controle doador (eritrócitos do
doador + soro/plasma do doador), Major Crossmatch – doador x receptor
(eritrócitos do doador + soro/plasma do receptor), Minor Crossmatch
– receptor x doador (eritrócitos do receptor + soro/ plasma doador) e
controle receptor (eritrócitos do receptor + soro/plasma do receptor). A
cada tubo são adicionadas duas gotas do soro/plasma e duas gotas da
suspensão de eritrócitos, homogeneíza-se por agitação da parte inferior
do tubo, seguida da centrifugação em baixa velocidade, o suficiente para
concentrar as células, mas sem sedimentá-las totalmente. Homogeneíza-
se mais uma vez os tubos para ressuspender as células e, então, observa-
se a presença de aglutinação e/ou hemólise. Confirmar a aglutinação
microscopicamente. Caso não seja observada aglutinação, os tubos são
7 <http://www.hemocentro.unicamp.br/pdfs/manualtecnicotransfusional-2010.pdf>.
93
incubados a 37oC por 30 minutos antes de centrifugá-los e reavaliá-los

novamente8.
Figura 43. Exemplo de reação positiva em tubo na prova cruzada (aglutinação intensa).
Fonte: <http://www.ufrgs.br/lacvet/prova_cruzada.htm>.
»» Técnica rápida em lamínula: realizam-se os mesmos procedimentos

da técnica em tubo, porém as amostras são colocadas em lâminas de
microscopia e misturadas com espátula/pipeta e inclinação da lâmina,
observa-se a ocorrência de aglutinação dentro de 2 minutos. Coloca-
se uma lamínula e observa-se se ocorreu aglutinação microscópica
(objetivas de 40X a 100X) dentro de 5 minutos. Se houver aglutinação o
teste é positivo.
Figura 44. A) Rouleaux – reação negativa. B) Aglutinação microscópica intensa – reação positiva.
Fontes: <flickar.com. http://www.ufrgs.br/lacvet/prova_cruzada.htm>.
8 <http://www.ufrgs.br/lacvet/prova_cruzada.htm>.
94
OUTROS
PROCEDIMENTOS UNIDADE V
HEMATOLÓGICOS
CAPÍTULO 1
Células LE
Para a detecção do Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES), o primeiro teste desenvolvido

foi a pesquisa de células LE, elaborado por Hargraves, que demonstrou a presença de
material nuclear fagocitado em sangue de pacientes com LES. Tratava-se de anticorpos
da classe IgG com reatividade contra desoxirribonucleoproteínas. Essa observação deu
origem ao ensaio laboratorial de pesquisa de células LE (MAKRAKIS et al., 2013).
O lúpus eritematoso sistêmico é uma doença crônica inflamatória,

multissistêmica, de causa desconhecida e de natureza autoimune
caracterizada pela presença de diversos autoanticorpos. O
desenvolvimento da doença está ligado a predisposição genética e fatores
ambientais como luz ultravioleta e alguns medicamentos. Caracteriza-
se por promover quadros inflamatórios em todos os órgãos, o que
determina uma apresentação clínica polimórfica (COSTA; MAFFRA;
SCHMALTZ, 2010).
Uma das características do sistema imune normal é a sua habilidade em reagir a uma
grande quantidade de microrganismos, mas normalmente não contra cada antígeno
próprio do indivíduo. Os linfócitos que reconhecem esses antígenos próprios são
produzidos constantemente pela maturação de linfócitos, porém existem mecanismos
para prevenir a resposta imune aos antígenos próprios, e estes são os grandes responsáveis
por discriminar entre antígenos próprios e não próprios. Quando esses mecanismos
falham, pode ser desencadeada uma agressão a células e tecidos do próprio indivíduo
pelo sistema imune, tais reações são chamadas de autoimunes, e as doenças que elas
causam de doenças autoimunes (ABBAS; LICHTMAN, 2009. LIMA; SILVA, 2012).
Os anticorpos autorreativos encontrados no LES reagem preferencialmente com

componentes nucleares como DNA ribonucleoproteínas, histonas e antígenos
presentes nos nucléolos. Essa interação resulta na formação de complexos que não são
95
UNIDADE V │ OUTROS PROCEDIMENTOS HEMATOLÓGICOS
removidos da circulação sanguínea e que podem se depositar nos glomérulos renais,

nas articulações, na pelee nos vasos sanguíneos, o que leva ao processo inflamatório
local (BALISTIERI, 2006).
As células LE surgem por meio da sensibilização do núcleo pelo fator antinuclear

(anticorpo antinuclear, geralmente classe IgG), após esta sensibilização, o núcleo é
fagocitado por leucócitos, especialmente neutrófilos e monócitos, dando origem à
célula LE. A pesquisa de células LE é um teste citomorfológico, uma forma indireta
de avaliar a presença de anticorpos antinucleares. A positividade do teste se dá pelo
aparecimento de leucócitos com inclusões homogêneas, violáceas e amorfas. É um
fenômeno inespecífico que ocorre em 60 a 80% dos casos de LES, mas que pode ser
encontrado em algumas colagenoses e em reações ao uso de diversos medicamentos. O
material é processado após a coleta, sendo utilizado parte do coágulo para a confecção
dos esfregaços que são corados e visualizados em microscópio9.
Entretanto, um dos maiores empecilhos desta técnica é a baixa sensibilidade, além de

ser trabalhosa, de difícil padronização e interpretação. Posteriormente outras técnicas
mais sensíveis surgiram como a pesquisa de anticorpos antinucleares.
Figura 45. Exemplo de células LE.
Fontes: <https://raulcalasanz.wordpress.com/2012/09/10/ud1-fisiologia-leucocitaria-leucopoyesis-y-alteraciones-de-la-serie-
blanca/> e <http://www.adeluna.asociacionespamplona.es/presentacio3_1/_5G1ICS7tAW6N7Thu04UuRmISE9GTTKrQgg-
czrsNm2oGTysrjz96Fg>.
9 <http://laboratoriobiolider.com.br/media/images/195.pdf>.
96
CAPÍTULO 2
Anticorpos antinucleares (ANA)
Inicialmente, a classificação do LES era realizada por meio da pesquisa de células LE,
mas esta apresenta empecilhos, como alta complexidade e dificuldade na interpretação
dos resultados assim como falta de reprodutibilidade e baixa especificidade, sendo,
portanto, abolido como um dos critérios para a classificação do LES. Posteriormente
outros testes foram desenvolvidos tendo vantagens, como execução metodológica mais
simples, reprodutiva e com maior sensibilidade.
A pesquisa de anticorpos antinucleares (ANA) para o diagnóstico do LES passou

a ter grande importância em meados da década de 1950 e pode ser realizada por
imunofluorescência indireta (IFI), sendo chamada também de FAN. Nesta metodologia,
um substrato antigênico contendo células epiteliais humanas (células HEp-2) é utilizado,
em poucos laboratórios a pesquisa de anticorpos antinucleares é feita pelo método de
ELISA. Essa técnica, a ANA, ao contrário da pesquisa de células LE, possui grande
sensibilidade e especificidade para o diagnóstico do LES, assim, uma vez negativo o
teste ANA, praticamente se exclui a presença da doença, a não ser quando se tem alta
suspeita clínica.
Por esta metodologia, é possível a pesquisa de anticorpos contra todos os constituintes

celulares: antígenos do núcleo, membrana celular, nucléolo, citoplasma e aparelho
mitótico, e não apenas anticorpos antinucleares, como a denominação do teste sugere.
A ANA é indicada para diagnóstico de pacientes que possuem quadro clínico sugestivo
de doenças autoimunes, como LES, esclerose sistêmica, síndrome CREST, doença mista
do tecido conjuntivo, síndrome de Sjögren, poliomiosite/dermatomiosite e cirrose biliar
primária. Distintos perfis de autoanticorpos são observados nas diferentes doenças.
Considerações que devem ser feitas:
»» a positividade do ANA é variável de acordo com a doença em questão:

é positivo em 98% dos pacientes com LES, 20% dos pacientes com
síndrome CREST, 80% dos pacientes com esclerose sistêmica, 40 a
80% dos pacientes com dermatopolimiosite e 50% dos pacientes com
síndrome de Sjögren;
»» apresenta alta sensibilidade para a pesquisa de autoanticorpos, entretanto

baixo valor preditivo positivo (probabilidade de um indivíduo com o teste
positivo ter a doença) devido à ocorrência de reações positivas na ausência
97
UNIDADE V │ OUTROS PROCEDIMENTOS HEMATOLÓGICOS
de doenças autoimunes. Reações positivas podem estar associadas a

processos inflamatórios inespecíficos e específicos, infecções agudas, uso
de medicamentos e neoplasias10.
No ANA a fluorescência observada equivale à distribuição dos locais onde estão presentes
os antígenos ao longo do ciclo celular e que são reconhecidos pelos autoanticorpos,
em determinado soro e da diluição seriada desse soro avaliado. O complexo antígeno-
anticorpo formado é revelado pela adição de anticorpos contra gamaglobulina humana
marcada com fluorocromo (DELLAVANCE; ANDRADE, 2007).
Figura 46. Exemplo de marcações nucleares encontrados no teste ANA-IFI.
Fonte: Dellavance & Andrade, 2007.
Somente com o teste ANA-IFI não é possível especificar o antígeno reconhecido, servindo
apenas para o rastreamento da presença de autoanticorpos. Para a especificação, outros
testes são realizados, como: imunodifusão dupla de Outcherlony (IDD) – identificação dos
antígenos: SS-A/Ro, SS-B/La, Sm, U1RNP, Jo-1, Scl-70, PM/Scl – e a imunofluorescência
indireta com substrato específico, como Crithidia luciliae para detecção de anticorpos
anti-DNA nativo. Mais recentemente têm sido desenvolvidos kits comerciais baseados
nas técnicas de ELISA e hemaglutinação (DELLAVANCE; ANDRADE, 2007).
Os padrões encontrados auxiliam no direcionamento da pesquisa de autoanticorpos

específicos. Por exemplo, quando o padrão nuclear apresenta-se homogêneo, este
10 <http://www.lustosa.com.br/files/informations/Texto%20FAN%20GLC%202008%20II.pdf>.
98
OUTROS PROCEDIMENTOS HEMATOLÓGICOS │ UNIDADE V
achado está fortemente relacionado à presença de autoanticorpos anti-DNA presentes

em pessoas com nefrite lúpica; já o padrão nuclear grosso pontilhado está associado
à presença de autoanticorpos anti-Sm presentes em pacientes com LES; os padrões
centroméricos e Scl-70 têm forte associação com a presença de autoanticorpos
anticentrômero e anti-DNA topoisomerase, respectivamente, presentes em pessoas em
esclerose múltipla; o padrão nuclear pontilhado fino denso é indicativo da presença de
autoanticorpos contra a proteína LEDGF e raramente está presente em indivíduos com
doenças autoimunes sistêmicas; o padrão citoplasmático pontilhado fino denso pode
ser decorrente do reconhecimento da proteína P ribossomal e podem estar presente em
pacientes com LES (ANDRADE, 2014).
Informações referentes aos títulos de anticorpos também são importantes, pois títulos
baixos (1/80) são frequentemente encontrados em indivíduos hígidos ou sem doenças
autoimunes, e títulos altos (≥ 1/640) e moderados (1/160 e 1/320) possuem maior
relação com a presença de doença autoimune.
Para o teste ANA-IFI critérios como condições do cultivo das células HEp-2 (densidade
celular, número de mitoses, expressão de antígenos relevantes para os autoanticorpos,
manutenção da morfologia). Em relação ao protocolo, pode variar de acordo com o kit
utilizado, mas basicamente consiste em incubar a camada de células HEp-2 formada
em lâminas com os soros diluídos em diferentes titulações à temperatura ambiente por
um determinado tempo (30 min.), após esse período são adicionados os anticorpos
secundários anti-IgG humana conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) em
câmara escura à temperatura ambiente. Após esta incubação, as lâminas são lavadas
em tampão PBS e montadas com glicerina tamponada e lamínula. A leitura é feita em
microscópio de imunofluorescência observando-se os padrões de marcação nuclear.
Figura 47. Estágios da imunofluorescência para a detecção de anticorpos anti-nucleares. As células HEp-2
são permeabilizadas (1) e então incubadas com o soro do paciente (2), caso o soro do paciente contenha
os anticorpos eles se ligarão aos antígenos contidos nos núcleos das células HEp-2. Esses anticorpos podem
então ser visualizados pela adição seguida da incubação com anticorpos anti-IgG humana conjugados com
fluorocromo (3).
Fonte: <http://en.wikipedia.org/wiki/Anti-nuclear_antibody#mediaviewer/File:ANA_Immunofluorescence.png>.
99
Para (não) finalizar
Neste texto é abordada a Hematologia com outra aplicação, realizar o estudo do sangue
com o objetivo de colher prova criminal, o que é conhecido como Hematologia forense,
que não foi abordada nos capítulos deste Caderno de Estudos, porém, apresenta grande
importância para apontar vestígios e supostos criminosos.
A presença de uma mancha de sangue no local de algum crime constitui a prova de

maior importância. O primeiro teste, quando uma mancha de sangue chega a um
laboratório forense, é a determinação de ser realmente sangue ou não, geralmente
envolve o emprego de peróxido de hidrogênio (agente oxidante) e um indicador que
muda de dor (luminescente), que identificará se houve a oxidação catalisada pela
hemoglobina. Isto porque a hemoglobina comporta-se como uma peroxidase. Outros
testes realizados são: determinação de grupo sanguíneo de suspeitos criminosos, de
cadáveres e manchas de sangue, determinação de enzimas e proteínas nessas manchas
de sangue e exames de DNA.
Figura 48. Demonstração do uso do luminol no ambiente de um crime. À esquerda exemplo de ambiente sem e
com luminol e marcas de um calçado realçadas pelo reagente.
Fonte: HowStuffWorks.
Abaixo segue texto publicado no Portal da Educação, por Péricles Freitas Avelino Filho,
referente à Hematologia Forense.
O texto está disponível em: <https://www.portaleducacao.com.br/biologia/

artigos/55586/Hematologia-forense-o-que-o-sangue-revela>.
Hematologia Forense: O que o sangue revela

“O sangue é um tecido conjuntivo fluido que tem a função principal de
distribuir o oxigênio e os nutrientes aos demais tecidos vivos. Sendo
um fluido, escorre se encontra uma saída que lhe der vazão. Manchas
100
PARA (NÃO) FINALIZAR
de sangue são muito presentes em locais de crimes onde envolve

violência contra a pessoa, arrombamentos e ocultação de cadáver. É um
elemento valioso que já ajudou a elucidar e estabelecer a dinâmica dos
atos executórios de diversos crimes”.
“A área das Ciências Forenses que se ocupa em estudar as manchas de

sangue é a Hematologia Forense. Que se subdivide em Hematologia
Forense Reconstrutora e Hematologia Forense Analítica (FRANCEZ &
SILVA -2012)”
“Hematologia Forense Reconstrutora: A forma como as manchas de

sangue estão dispostas no local do crime ajuda a reconstruir as ações
da vítima e do algoz e por vezes, até suas motivações. O olhar atento
sobre essas manchas revela a posição da vítima e do agressor, o trajeto
de ocultação do cadáver ou de fuga, a arma e a intensidade e distancia
que ela foi utilizada e até incluir e excluir suspeitos. Como exemplo,
podemos ver as manchas de sangue por gotejamento, cujo formato
pode revelar se o indivíduo estava em pé ou agachado. Já as manchas de
sangue por contato podem revelar o trajeto do indivíduo após a injúria
e podem conter até impressões digitais”.
“Por vezes, na tentativa de ocultar o crime ou simular uma dinâmica

diferente, as manchas de sangue são lavadas ou encontram-se ocultas
à primeira observação. Existem métodos que empregam corantes e
luzes especiais para revelar manchas de sangue latentes. O conhecido
luminol causa uma reação quimioluminescente em contato com
a mancha de sangue e exposto a luz ultravioleta. Essa reação ocorre
devido a afinidade entre as moléculas de ferro presente na hemoglobina
e o luminol. As manchas de sangue são fotografadas e amostras são
coletadas e enviadas ao laboratório”.
Hematologia Forense Analítica: O sangue é o principal meio de transporte de

substancias do organismo. Não é à toa que muitos diagnósticos de saúde são baseados
em hemogramas e outros exames de sangue. Dada essa grande fonte de informações
bioquímicas, as amostras de sangue forense são ricas em detalhes que podem ter
motivado o crime e que podem identificar os participantes do fato ocorrido.
O plasma (elemento fluido do tecido sanguíneo, composto de água e proteínas)

pode conter traços de substancias que dirão em que condições encontravam-se os
participantes no momento do delito. Se estavam sob efeito de álcool ou drogas se houve
envenenamento, entorpecimento e outras condições. O primeiro exame identifica
se aquela amostra de material similar a sangue é realmente sangue ou não. Em caso
101
PARA (NÃO) FINALIZAR
positivo, procedem-se os exames imunológicos que revelarão se a amostra trata-se de

sangue humano ou não.
A saber, o Teste de Coombs emprega anticorpos específicos para o sangue humano.

Tratando-se de sangue humano, procedem-se os exames analíticos. Se preciso, é
possível identificar o indivíduo geneticamente usando a amostra sanguínea, dado que
os glóbulos brancos são células nucleadas, portanto, fonte de DNA.
Visto a quantidade de informações que o sangue fornece ao perito criminal, é

indispensável sua análise. Mais uma vez, os conhecimentos biológicos estão a serviço
da justiça através da Hematologia Forense.
102
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Caroline Maria Marcos

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ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA..................................................................... 6

PARA (NÃO) FINALIZAR.................................................................................................................... 100

A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se

Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos

Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo

Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em

Sugestão de estudo complementar

Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo,

Sugestão de atividades, no decorrer das leituras, com o objetivo didático de fortalecer

Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a

Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões

Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o

Questionário com 10 questões objetivas, baseadas nos objetivos do curso,

Para (não) finalizar

Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem

Sejam bem-vindos ao Caderno de Hematologia Laboratorial, neste módulo iremos

»» Fornecer conhecimentos básicos sobre a formação das células sanguíneas;

Por isso, o conhecimento dos vários exames sanguíneos, cada um com

Fonte: Giovanny Rebouças. Material didático. Disponível em: <http://www.cenapro.com.br/images/documentos/03-

A hematopoese, ou também hemocitopoese ou hematopoiese, é o processo

A produção de glóbulos vermelhos e da maioria das células sanguíneas após o nascimento

No período intrauterino, as primeiras células sanguíneas do embrião são geradas

As hemácias, também conhecidas como eritrócitos, são os glóbulos vermelhos do

Sua produção ocorre na medula óssea pela maturação de eritroblastos em um fenômemo

Na eritropoiese uma célula dita progenitora mieloide (stem-cell, pluripotencial) se divide

A linhagem eritroide-megacariocítica origina a série eritroide, sendo os proeritroblastos

Figura 2. Representação da eritropoiese. Em ordem: proeritroblasto, eritroblasto basófilo, eritroblasto policromático,

As hemácias contêm hemoglobina e, portanto, realizam o transporte de gases, como

O equilíbrio na quantidade de hemácias em um organismo ocorre devido ao balanço

Fonte: A - <http://vidaemfoco-bio.blogspot.com.br/2012_03_18_archive.html>. B - (THRALL et al., 2004).

O nível de hematócrito mede basicamente o número ou a concentração de eritrócitos

O hematócrito (ou Ht ou Htc), ou volume globular, permite mensurar o volume

Antigamente utilizava-se o método de hematócrito em que se obtinha a porcentagem

O micro-hematócrito consiste basicamente em coletar a amostra de sangue em um tubo

Através desta técnica é possível diagnosticar e monitorar prováveis anemias resultantes

O hematócrito baixo pode representar anemia, sangramento, desnutrição, falta ou

Os valores de referência do hematócrito variam interlaboratorialmente, mas geralmente

Figura 4. Esquema representativo da técnica de micro-hematócrito.

Fontes: <http://adamogama.blogspot.com.br/2011/08/microhematocrito_12.html>, <http://www.ugr.es/~jhuertas/

A eritrocitose é definida como um aumento proporcional de glóbulos vermelhos

A determinação de um paciente com eritrocitose deve ser cuidadosa para permitir um

Caso os níveis de hematócrito permaneçam elevados, o indivíduo apresentará maiores

A hemoglobina é uma proteína complexa, consistindo de uma unidade heme (que

Para a determinação da hemoglobina, podemos utilizar diferentes métodos de

Neste método, coleta-se 0,02 mL de sangue em tubos de ensaio contendo 5 mL do

à temperatura ambiente e, após este período, realiza-se a leitura em espectrofotômetro,

Figura 5. Demonstração da determinação de hemoglobina pelo método de cianometa-hemoglobina.

Método azida meta-hemoglobina

A fragilidade osmótica eritrocitária (F.O.E.) avalia a resistência osmótica das células

As hemácias podem se romper quando em contato com soluções hipotônicas, como a

Figura 6. Mudança morfológica de hemácias de acordo com a hipotonicidade do meio.

O esferócito é uma hemácia que apresenta defeito em sua membrana, que

A resistência depende da forma, do volume, do tamanho, do conteúdo da hemoglobina

Influenciam a fragilidade osmótica dos eritrócitos: forma, volume e tamanho do

A F.O.E. é um teste útil no auxílio da caracterização de diferentes anemias que

A curva apresentar-se-á aumentada em: anemia esferocítica eritrocitária, anemia

A anemia ferropriva corresponde a uma das anemias mais comuns por

A interação entre as formas α+ e α0 resulta na doença da HbH. Os portadores dessa forma

A outra forma é a homozigose da talassemia α0, denominada de hidropsia fetal, e é a

Na talassemia maior ocorre grave anemia hemolítica, microcítica e hipocrômica