CINOMOSE

O des a f i o d o d i agnóstico

Cinomose IgM Dot-ELISA

A sorologia fornece informações ao clínico a respeito do estado
imune do paciente, seja decorrente de uma vacinação anterior ou infecção.
A resposta humoral é composta em grande parte por duas classes
de anticorpos, IgM e IgG.
O método Dot ELISA é baseado no princípio ELISA de fase sólida. Ele
fornece resultados que medem os níveis de anticorpos no sangue ou
soro para agentes de doenças específicas (por exemplo, vírus,
micoplasma, rickettsia).
A pesquisa de anticorpos IgM é tida como um diagnóstico definitivo de
infecção, porém, sendo uma sorologia que pesquisa anticorpos, os
resultados refletem a resposta imune do paciente frente a uma
exposição ao agente, mesmo sendo anticorpos IgM.

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Dot ELISA - IgM
O método utilizado para o teste de detecção de
anticorpos IgM é o ELISA em fase sólida, conhecido
como Dot ELISA (dot = ponto), ou Imunodot.
A técnica é baseada na sensibilização de membranas
de nitrocelulose com antígeno, e posterior adição de um
anticorpo marcado com peroxidase, para ocorrência de
reação e revelação com formação de cor. O principio é
semelhante ao ELISA, no entanto, não requer
aparelhagem sofisticada.
Os antígenos do vírus da cinomose são aplicados nos
pontos (daí o nome Dot ELISA) de teste na base sólida.

Anticorpos IgM e IgG

A sorologia para pesquisa
de anticorpos tem aplicação
após o período necessário
para a soroconversão,
geralmente após 5 dias do
contato com o agente no
caso da IgM, e 10 a 14 dias
no caso da IgG (existe
variação individual).

Apesar da soroconversão precoce da IgM, o teste em geral necessita

de um tempo variável (7 a 10 dias) para conseguir detectar um nível de
anticorpos igual ou acima do ponto de corte (Score 2 ou 1:50), nível
este considerado compatível com o nível de anticorpos de um cão
infectado ou vacinado recentemente.
Considerando que o nível de IgM declina consideravelmente após 20
dias do início da resposta, animais vacinados há mais de 30 dias não
devem ter níveis acima do ponto de corte neste teste.
A sorologia IgM isoladamente demonstra que o paciente entrou em
contato com o vírus da cinomose, naturalmente ou pela vacinação, há
menos de 30 dias. Não existe uma precisão matemática, pois as
respostas são individuais.
O kit da marca mais utilizada no mercado informa Especificidade: 95,5% e
Sensibilidade: 93,1%
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 Finalidade do teste
O teste Dot ELISA que pesquisa IgM tem a
finalidade de avaliar os níveis de anticorpos IgM
anti-cinomose. Do ponto de vista clínico
qualquer título mensurável de IgM pode ser
considerado como evidência específica de
exposição ao vírus pesquisado.

A avaliação de anticorpos é uma informação

importante quando aliada a outros parâmetros
clínicos e laboratoriais de casos suspeitos.
Os níveis de anticorpos IgM podem auxiliar na
avaliação do tempo de exposição ao agente ou
a resposta inicial à vacinação.
Animais com sintomas inespecíficos que têm
histórico de contactantes recentes podem ser
avaliados quanto aos níveis de IgM.

Para auxílio ao diagnóstico os resultados

necessitam de interpretação clínica, e não
devem ser utilizado como único critério no
diagnóstico da infecção pelo vírus da cinomose.

Limitações do teste
O teste, isoladamente, não consegue diferenciar anticorpos
decorrentes de uma exposição recente, de resposta à vacinação
inicial, ou da doença em curso agudo. Assim, o teste pode ter
resultado positivo e não corresponder à doença.

A interpretação do resultado deve considerar dados da anamnese

(histórico de sintomas, contactante diagnosticado com cinomose,
vacinação recente) e exames complementares (leucopenia,
linfopenia, hipoglobulinemia).

Um resultado reagente não pode ser interpretado isoladamente como

doença apenas por se tratar de uma pesquisa por anticorpos IgM.
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O teste na suspeita da doença
Sangue total (EDTA) ou soro são as amostras que podem ser utilizadas.
Anticorpos IgM são detectáveis nos primeiros 5 a 7dias após a
exposição/ infecção ou vacinação (inicial).
Os anticorpos IgM por exposição/infecção declinam após 14 a 20 dias
(títulos < 1:250), enquanto os níveis de IgG aumentam substancialmente
neste período. Em cães que são capazes de uma resposta imune, os
níveis elevados de IgM podem indicar infecção recente.

Fase Aguda Fase Crônica

O teste não consegue detectar
anticorpos antes da soroconversão.
A utilização na fase subaguda e
crônica da doença servem apenas
para demonstrar a evolução da
doença (declínio de IgM).
Comumente os níveis de
anticorpos IgM são muito baixos
na fase crônica da doença, abaixo
do ponto de corte ou mesmo
indetectáveis.

Falso-negativo
Um aspecto que favorece falso-negativo neste teste é a ação do vírus,
causando imunossupressão, o que reduz a soroconversão inicial.
Testar pacientes quando IgM declinou também leva a falso-negativo.

Resultados em "títulos"?
Como em outros Dot ELISA os resultados são semi-
quantitativos, uma vez que há um limite de detecção
definido pelo fabricante.
Os testes baseados no método ELISA identificam a
presença dos anticorpos a partir de uma reação de cor.
O nível dos anticorpos pode então ser estimado a partir
da intensidade de cor gerada na reação.
Neste teste a intensidade de cor é quantificada com
base em uma escala fornecida com o kit.
O título de um teste diz qual é a diluição máxima em
que um soro é capaz de reagir naquele teste.
Sendo um Dot ELISA (reação de cor, e não diluição), o
resultado não fornece títulos propriamente.

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 Seguindo a escala
Para facilitar a interpretação, foi desenvolvido um sistema
de comparação entre os resultado obtidos no Dot ELISA e
os resultados obtidos pelo método de imunofluorescência
indireta (IFI ou RIFI), método considerado o padrão ouro
para a detecção de anticorpos IgM anti-cinomose.
A partir da escala os resultados são então correlacionados
a títulos de RIFI pré-definidos, onde S 2 (score 2) é o ponto
de corte (ou cut-off).

<1:10 1:50 1:250 1:1250 1:6250 >1:6250

S1 S2 S3 S4 S5 S6

Qual é a relevância disso?

A relevância disso é que tanto em score (S) quanto em
título o intervalo de leitura entre os pontos é relativamente
grande. Expresso em título, de um ponto para o seguinte o
valor "pula 5 vezes". Como o Dot ELISA reflete o nível de
anticorpos pela variação de cor, a leitura na escala limita a
possibilidade de acompanhar pequenas variações no nível
de anticorpos.
Outro aspecto é que a variação de cor do ponto pode ser
sutil, interferindo na classificação da leitura num score ou
título mais alto ou mais baixo, o que afeta o resultado de
testes pareados, ainda mais quando a leitura é visual.
Por isso é necessário aguardar um intervalo suficiente para
que haja aumento de anticorpos suficiente para o teste
detectar a variação (às vezes 7 a 14 dias).
Também por isso ocorrem resultados "atípicos", onde uma
mesma amostra tem um resultado < 1:10 e outro 1:50.
É a variação de cor prevista na técnica, não é "erro" do
laboratório.

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No Vetinlab a leitura dos testes Dot ELISA é automatizada,

eliminando a interferência subjetiva do técnico. Contudo, as
variações de cor são uma característica da técnica Dot ELISA.
Particularidades da
IgM
A IgM é a primeira classe de
anticorpos produzida pelo organismo
em uma resposta primária, tendo
meia-vida curta e respondendo por
um percentual pequeno do total de
imunoglobulinas no plasma.
Verifica-se que em uma primeira exposição, a resposta predominante
está relacionada a IgM, embora quantidades menores de IgG também
sejam produzidas.
Títulos elevados de IgM são esperados após infecção natural ou
vacinação recente (em especial a primovacinação).

Fase aguda e IgM

negativo?
Alguns cães que já foram expostos ao
vírus naturalmente e desenvolveram
uma resposta inicial, na segunda
exposição terão IgG como anticorpo
predominante. A pesquisa de IgG em
testes pareados pode ser melhor
evidência de doença que a IgM.
Outro ponto relevante a ser mencionado é que a quantidade total de
anticorpos produzidos (IgM+IgG) é maior na resposta secundária. Tais
fatos possuem uma implicação clínica importante na interpretação de
exames para doenças infecciosas, em particular para animais
vacinados.

Fase neurológica
A maioria dos animais desenvolve
sintomas neurológicos nos
estágios mais avançados da
doença, por isso o nível de IgM
nesta fase costuma ser baixo, até
indetectável, contraindicando este
teste.

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 Pontos importantes ao
utilizar este teste para
diagnóstico.
Anticorpos maternos não interferem com este teste.
Resultados reagentes em filhotes (mesmo < 4
meses) sugerem exposição, vacinação ou infecção.
Embora soros hiperimunes sejam fonte de IgG, não
há estudos sobre a possibilidade de interferência
neste teste, mas existe a possibilidade de reação
com frações de IgM presentes no soro.
Há relatos de IgM em cães com cinomose por 5
semanas a 3 meses, dependendo da cepa do vírus
e da resposta do hospedeiro.
A ausência de anticorpos IgM com um elevado título
de IgG sugere que a exposição ao vírus ocorreu há
mais tempo (mais de 20 dias). Elevados níveis de
IgG são tipicamente encontrados em cães que
eliminaram o vírus após exposição, sobreviveram à
fase aguda da infecção, ou após a vacinação (mais
de 25 dias).
Animais na fase neurológica da cinomose poderão
não apresentar títulos IgM, sendo indicada a
pesquisa de anticorpos IgG em testes pareados.
A pesquisa de antígenos do vírus da cinomose em
amostras da conjuntiva é indicada para diagnóstico
precoce (até 5 dias do contágio) em filhotes e
animais imunossuprimidos.

Os níveis de anticorpos IgM e a vacinação.

Anticorpos IgM vacinais atingem seu pico entre 12 e 20
dias após, sendo indetectáveis por este teste após 35 a
40 dias da vacinação. Alguns artigos sugerem que
anticorpos IgM em cães vacinados duram em torno de
três semanas.
Um ano após a imunização inicial, o estímulo após a
segunda vacinação será somente da classe IgG.

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Títulos elevados de IgM são esperados após infecção natural

ou vacinação recente (em especial a primovacinação).
Dúvidas frequentes
Qual o melhor exame para um filhote não vacinado
com sintomas ocular e respiratório leves?
Pesquisa de antígeno em swab ocular, sorologia IgM Dot-ELISA ou
PCR em swab ocular (opcional POOL de swab/sangue EDTA e urina).
Qual o melhor exame para um filhote vacinado com sintomas
ocular e respiratório leves?
Pesquisa de antígeno em swab ocular. A sorologia IgM Dot-ELISA
depende do tempo desde a vacinação. A partir de 7 dias o teste
pode detectar a resposta vacinal, e por até 30 dias (baixo).
IgG pode ser detectável após 9 dias da vacinação.
PCR em swab ocular (opcional POOL de swab/sangue EDTA e urina).
Qual o melhor exame para um adulto não vacinado com
sintomas ocular e respiratório leves?
Pesquisa de antígeno em swab ocular, sorologia IgM Dot-ELISA ou
PCR em swab ocular (opcional POOL de swab/sangue EDTA e urina).
Animal jovem vacinado há 10 meses, não completou as
vacinas. Apresentou convulsão ontem.
PCR em swab ocular e urina.
Qual seria a melhor opção de sorologia pra cinomose
num filhote com sinais neurológicos, tendo tomado uma
dose de vacina multipla ética?
Nenhuma sorologia se aplica a esse caso. Vacinado (mesmo com
vacina não-ética) elimina o uso de IgG, e sintomas neurológicos
elimina o uso de IgM ou antígenos. PCR em urina é a melhor opção.

Iniciou mioclonia e ataxia há três meses atrás, qual seria a

melhor opção de sorologia pra cinomose? Não é vacinado.
O tempo de apresentação dos sintomas neurológicos elimina o uso de
IgM. Pesquisar IgG pode determinar a presença de anticorpos, e o
diagnóstico clínico pode ser confirmado. IgG isoladamente não pode
definir que é cinomose quando os sintomas neurológicos são
genéricos (nesse caso "mioclonia" é um sinal muito indicativo).
PCR em urina é a melhor opção para identificar o vírus.

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Principais referências:

BIAZZONO, L.; HAGIWARA, M. K.; CORRÊA, A. R. Avaliação da resposta

imune humoral em cães jovens imunizados contra a cinomose com vacina de
vírus atenuado. Braz. J. vet. Res. anim. Sci. São Paulo, v. 38, n. 5, p. 245-250,
2001.

Day,M.J.; Horzinek,M.C.; Schultz, R. D. e Squires,R. A. Diretrizes para

a Vacinação de Cães e Gatos Compiladas Pelo Grupo de Diretrizes de
Vacinação (VGG) da Associação Veterinária Mundial de Pequenos Animais
(WSAVA) Journal of Small Animal Practice • Vol 57 • January 2016 • © 2016
WSAVA.

Del Puerto, Helen L., Vasconcelos, Anilton C., Moro, Luciana, Alves, Fabiana,
Braz, Gissandra F., & Martins, Almir S .. (2010). Detecção do vírus da cinomose
canina em cães assintomáticos e não vacinados. Pesquisa Veterinária
Brasileira , 30 (2), 132-138.

Hartmann,T.L.S.Anticorpos neutralizantes contra os vírus da cinomose e da

parainfluenza caninos em cães e felinos silvestres em cativeiro.Dissertação de
mestrado. Faculdade de Veterinária. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias - UFRGS - Porto Alegre -2006.

Martins, D. B.; Lopes, S.T.L.; França, R.T CINOMOSE CANINA – REVISÃO DE

LITERATURA Acta Veterinaria Brasilica, v.3, n.2, p.68-76, 2009

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Waner T, Mazar S, Nachmias E, Keren-Kornblatt E, Harrus S. Evaluation of a

dot ELISA kit for measuring immunoglobulin M antibodies to canine parvovirus
and distemper virus. Vet Rec. 2003;152(19):588-591. doi:10.1136/vr.152.19.588

Zoetis - Como os anticorpos maternos interferem com a imunização? Vanguard

Shot Ano 2 Nº 8 2016

Zoetis - Cinomose: considerações sobre o diagnóstico Vanguard Shot Ano 3 Nº

14 2017

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