Espectrofotometria

Fundamentos
1
Componentes básicos de um sistema para
espectrofotometria

2
Fontes de luz utilizadas na espectrofotometria

Luz policromática
• Lâmpada de deutério ou hidrogênio
• Lâmpada de tungstênio

deutério tungstênio

3
Espectro de emissão de lâmpadas
Absorção de luz

I0: luz incidente

I: luz emergente 5

l: caminho ótico
Fatores que interferem na absorção
de luz

• Concentração das moléculas que absorvem luz na solução

• Caminho ótico (l) 6
Absorção de luz pela matéria

7
Absorção de luz pela matéria

8
Espectro de absorção de diferentes
pigmentos

9
Leis que regem a espectrofotometria

• 1879 - Lambert • 1852 – Beer

• "A intensidade da luz
emitida decresce
exponencialmente à
medida que a espessura do
meio absorvente aumenta
aritmeticamente".
I = Io . 10-x1
• "A intensidade de um feixe
de luz monocromático
decresce
exponencialmente à
medida que a
concentração da
substância absorvente
aumenta
aritmeticamente".

I = Io . 10-kc
10
Leis que regem a espectrofotometria

• 1852 – Beer
• "A intensidade de um feixe
de luz monocromático
decresce
exponencialmente à
medida que a
concentração da
substância absorvente
aumenta
aritmeticamente".
Concentração mol/L
I = Io . 10-kc
11
Absorvância e transmitância

Lâmpada Prisma Amostra

Absorvância Transmitância

Absorvância Transmitância

Absorvância Transmitância
12
 Leis de Lambert-Beer
A quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma determinada
solução depende da concentração do soluto e da espessura da solução.

Concentração mol/L Concentração mol/L

13
 Como encontrar a concentração de uma
substância em solução por meio da
espectrofotometria?????

• 1. Através da curva padrão:

14
 Como é feita uma curva padrão?????
Preparo dos tubos:
Tubo KMnO4 H2O (mL) Concentração
(vol tot 1,0 mL) 10% (mL) (mg/%)
Br ---- 10 0
P1 0,075 9,925 0,75
P2 0,150 9,850 1,50
P3 0,225 9,775 2,25
P4 0,300 9,700 3,00
P5 0,450 9,550 4,50

15
Como é feita uma curva padrão?????
Determinação das absorvâncias

Tubo Concentração Absorvâncias

(mg/%)

Br 0 0

P1 0,75 0,02

P2 1,50 0,04

P3 2,25 0,07

P4 3,00 0,09

P5 4,50 0,14
16
Informações obtidas a partir da curva padrão:

• Equação da reta e R2

Curva Padrão
0,12

0,1 y = 0,0045x - 0,0316

0,08 R² = 0,9972
0,06

Médias
0,04
Linear (Médias)

0,02

0
0 5 10 15 20 25 30
-0,02 17
-0,04 y=Absorbância e x=concentração
 Como encontrar a concentração de uma
substância em solução através da
espectrofotometria?????

• 2. Comparando-se a absorvância (Abs.) da

amostra com a de uma solução padrão

Abs. Padrão --------------- Conc. Padrão

Abs Amostra ------------- Conc.Amostra?????

Conc. amostra = Abs. amostra x Conc. Padrão

Abs. Padrão 18
Bibliografia
• Cisternas Jr, Monte O, Montor WR. Fundamentos Teóricos e
Práticas em Bioquímica. 1ª edição, Editora Atheneu, 2011.
• Nepomuceno MF. Bioquímica experimental. Editora Unimep,
1998.
• http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/#

19