UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

LUCINDO JOSÉ QUINTANS JÚNIOR

Orientador

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-

INFLAMATÓRIA DO FITOL EM MODELO DE DOR
CRÔNICA INFLAMATÓRIA

SÃO CRISTÓVÃO
2019
 LUCINDO JOSÉ QUINTANS JÚNIOR

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-

INFLAMATÓRIA DO FITOL EM MODELO DE DOR
CRÔNICA INFLAMATÓRIA

SÃO CRISTÓVÃO
2019
 RESUMO

A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica, que acomete a

membrana sinovial, podendo levar à destruição óssea e cartilaginosa. Os fármacos atuais para
seu tratamento proporcionam efeito paliativo, pois a cura da doença permanece indefinida e
ainda não possui tratamento eficaz. Sendo assim, a busca de novos fármacos para o
tratamento dos sintomas da artrite tem sido alvo de estudo de muitos pesquisadores,
principalmente substâncias com efeito analgésico e anti-inflamatório. Nesse contexto surgem
os produtos naturais, sobretudo os diterpenos. O fitol (FI) é um diterpeno alcoólico insaturado
de cadeia ramificada, constituinte da molécula de clorofila e, portanto, abundantemente
presente na natureza. Ele apresenta potencial anti-inflamatório e antinociceptivo, Ademais,
estudos têm mostrado que o fitol apresenta atividade ansiolítica e tem potencial para ser usado
na terapia anti-esquistossoma. Porém, relatos sobre o potencial anti-inflamatório em modelos
crônicos, como na artrite são escassos na literatura. Desta forma, objetiva-se avaliar a possível
ação do FI em modelo experimental de dor inflamatória crônica. Para isso, serão utilizados
camundongos Swiss fêmeas (25-40 g, 2 a 3 meses). Os animais serão submetidos ao modelo
de monoartrite (M.AR) e tratados com veículo (Salina 0,9% + tween 80 0,2%, v.o.), FI (50
mg/kg), v.o.) ou não tratados e não submetidos ao modelo (Sham). A ação do FI (50mg / kg)
será avaliado sobre a hiperalgesia mecânica, edema de joelho, força muscular e níveis
citocinas inflamatórias (fator de necrose tumoral-alfa e interleucina-6) induzidas por 10µl de
CFA (1 mg / mL). Os resultados serão expressos como média ± E.P.M. Para comparações
múltiplas, os dados serão analisados por ANOVA de uma ou duas vias, seguido e pelo pós-
teste de Tukey ou Teste de Bonferroni, conforme o caso. Valores de p < 0,05 serão
considerados estatisticamente significantes.

Palvras-chave:. Inflamação, Fitol, Terpeno, Artrite, Dor, Citocinas.

 ABSTRACT

Arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease that affects the synovial membrane,
which can lead to bone and cartilaginous destruction. The current drugs for its treatment
provide palliative effect, since the cure of the disease remains undefined and still does not
have effective treatment. Therefore, the search for new drugs for the treatment of the
symptoms of arthritis has been the object of study of many researchers, mainly substances
with analgesic and anti-inflammatory effect. Natural products, especially diterpenes, appear in
this context. Phytol (FI) is an unsaturated, branched chain alcoholic diterpene, constituent of
the chlorophyll molecule and therefore abundantly present in nature. It has anti-inflammatory
and antinociceptive potential. In addition, studies have shown that phytol exhibits anxiolytic
activity and has potential to be used in anti-schistosome therapy. However, reports on the
anti-inflammatory potential in chronic models, such as in arthritis, are scarce in the literature.
In this way, the objective is to evaluate the possible action of IF in an experimental model of
chronic inflammatory pain. For this, female Swiss mice (25-40 g, 2 to 3 months) will be used.
The animals will be submitted to the monoarthritis model (M.AR) and treated with vehicle
(Saline 0.9% + tween 80 0.2%, vol), IF (50 mg / kg), or untreated and untreated to the model
(Sham). The action of IF (50mg / kg) will be evaluated on mechanical hyperalgesia, knee
edema, muscle strength and inflammatory cytokine levels (tumor necrosis factor-alpha and
interleukin-6) induced by 10μl CFA (1mg / mL). The results will be expressed as mean ±
S.P.M. For multiple comparisons, the data will be analyzed by one-way or two-way ANOVA,
followed by the Tukey post-test or Bonferroni test, as the case may be. Values of p <0.05 will
be considered statistically significant.

Keywords: Inflammation, phytol, terpene, arthritis, pain, cytokine.

 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ........................................................................... 6

2 OBJETIVOS.................................................................................................................... 8
2.1 Objetivo geral................................................................................................................ 8
2.2 Objetivos específicos..................................................................................................... 8
3 REVISÃO TEÓRICA..................................................................................................... 8
3.1 Inflamação ..................................................................................................................... 8
3.2 Fitol ............................................................................................................................... 10
4 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................ 11
4.1 Substâncias....................................................................................................................... 11
4.2 Grupos experimentais ...................................................................................................... 12
4.3 Animais............................................................................................................................ 12
4.4 Protocolos experimentais.................................................................................................. 13
4.4.1 Artrite induzida por adjuvante completo de Freund ...................................................... 13
4.4.2 Avaliação da força muscular ......................................................................................... 13
4.4.3 Avaliação da Hiperalgesia Mecânica ............................................................................ 13
4.4.4 Avaliação do edema de joelho ....................................................................................... 14
4.4.5 Dosagem de citocinas .................................................................................................... 14
4.5 Descarte............................................................................................................................. 14
4.6 Análise estatística............................................................................................................. 15
5 ORÇAMENTO E EXEQUIBILIDADE.......................................................................... 15
6 CRONOGRAMA.............................................................................................................. 16
7 REFERÊNCIAS................................................................................................................ 16
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1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

O termo artrite define um grupo de doenças que afeta as articulações e

principalmente a membrana sinovial, cartilagem e ossos. Essa patologia acomete pessoas de
todas as idades, sexos e raças, mas tem sua incidência aumentada em mulheres mais velhas.
Trata-se de uma condição frequente (0,5 a 1% da população mundial, podendo chegar a 5%
dependendo do grupo e da faixa etária estudados) (MOTA et al., 2010). Mais de 50 milhões
de adultos e 300.00 crianças tem alguma forma de artrite (HAZES and LUIME, 2011),
tornando essa classe de doenças uma das principais causas de problemas de saúde pública que
causam atividades restritas e comorbidades que afetam a qualidade de vida.
A artrite é uma doença crônica inflamatória das articulações que apresenta infiltração
das células imunes, hiperplasia e edema dos joelhos e destruição das cartilagens e ossos
(FIRESTEIN, 2003). Todos essas características conduzem a incapacidade funcional e física
dos membros e fadiga (SCHAIBLE, 2004; SCHAIBLE et al., 2002; XU et al., 2010). O
sintoma mais debilitante da artrite é a dor (MALFAIT and SCHNITZER, 2013; NEOGI,
2013).
Segundo a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), “a dor é uma
experiência sensorial e emocional desagradável que é associada a lesões reais ou potenciais,
ou descrita em termos que sugerem tal lesão” (MERSKEY et al., 1979). A dor pode ser
classificada como aguda, quando caracterizada por uma resposta orgânica protetora, pois
alerta o indivíduo para uma lesão iminente ou real dos tecidos, induzindo ao surgimento de
respostas reflexas com o intuito de manter o dano tecidual o mais controlado possível
(WOOLF et al., 1999) (TEIXEIRA et al., 2001), e como crônica, quando a dor passa a se
repetir ou manter-se por período prolongado, deixa de apresentar vantagens biológicas e passa
a causar sofrimento (MELZACK et al., 1999).

Atualmente a abordagem para o manejo da AR enfoca o alívio dos sintomas, uma

vez que a cura da doença ainda permanece indefinida. O principal objetivo do tratamento é
reduzir a dor, diminuir a inflamação e melhorar a qualidade de vida dos pacientes. Os anti-
inflamatórios não-esteroidais e esteroides são usados para aliviar as dores inflamatórias, mas
sua administração prolongada é afetada por vários efeitos colaterais. Além disso, os
medicamentos anti-reumáticos modificadores da doença também têm eficácia clínica limitada
e efeitos adversos sérios. Portanto, há uma necessidade de procurar agentes alternativos para o
tratamento da doença.
 6

Desde tempos mais remotos as plantas são utilizadas para tratamento de

enfermidades, seja como infusão, chás, ou extratos etanólicos (partes da planta são imersas
em álcool e posteriormente utilizadas na pele). Associada ou não a pobreza e ao difícil acesso
a medicamentos farmacêuticos, estima-se que 80% da população mundial, principalmente em
países subdesenvolvidos, faz uso de plantas medicinais para fins profiláticos ou terapêuticos
(Petrovska, 2012). No entanto, apenas 10% das 250 mil espécies de plantas do mundo foram
estudadas para avaliar seu potencial como novas propostas terapêuticas (NOGUEIRA,
CERQUEIRA, SOARES, 2010).
Neste sentido, as plantas medicinais são fontes mundialmente valiosas na obtenção
de novas drogas, especialmente nos países desenvolvidos como Estados Unidos, que atingem
cerca de 20 bilhões de dólares no mercado global com essa classe de medicamentos (Chen et
al., 2016). Assim, a combinação de biodiversidade com uma medicina tradicional rica coloca
o Brasil em uma posição estratégica e privilegiada para programas de descoberta de drogas
(NOGUEIRA, CERQUEIRA, SOARES, 2010). Essa imensa biodiversidade, escassa nos
países desenvolvidos, tem valor econômico inestimável em várias atividades, mas é no campo
do desenvolvimento de novos medicamentos onde reside sua maior potencialidade
(CALIXTO, 2003; PIMENTEL et al., 2015).
Os produtos naturais oriundos de plantas, incluindo seus metabólitos secundários
constituem 25% dos 40% de novas drogas desenvolvidas a partir de produtos naturais.
Embora apenas cerca de 10% da biodiversidade mundial tenha sido estudada, 140 mil
metabólitos secundários, oriundos, sobretudo de plantas superiores e de microrganismos,
foram isolados e caracterizados, mas ainda não foram avaliados biologicamente (KABERA et
al., 2014). Os metabólitos secundários das plantas são divididos em três grandes grupos: os
terpenos, compostos fenólicos e alcaloides. Dentre os terpenos com atividade biológica
promissora têm-se o fitol. O fitol (FI) é um diterpeno alcoólico insaturado de cadeia
ramificada, constituinte da molécula de clorofila e, portanto, abundantemente presente na
natureza (COSTA et al., 2014; ISLAM et al., 2017). Ele apresenta potencial anti-inflamatório
e antinociceptivo (COSTA et al., 2014a; SANTOS et al., 2013). Ademais, estudos têm
mostrado que o fitol apresenta atividade ansiolítica (COSTA et al., 2014b) e tem potencial
para ser usado na terapia anti-esquistossoma (DE MORAES et al., 2014). Porém, relatos
sobre o potencial anti-inflamatório em modelos crônicos, como na artrite são escassos na
literatura.
 7

Sabendo da imensa disponibilidade do FI na natureza, considerando as atividades

biológicas demonstradas em estudos anteriores, e a escassez de estudos sobre a atividade do
mesmo na supressão da inflamação em modelos crônicos, principalmente na artrite, torna-se
relevante estudar o efeito anti-inflamatório do FI na supressão da inflamação em modelo de
monoartrite (M.AR), podendo este composto se tornar uma molécula promissora no
desenvolvimento de novas propostas terapêuticas.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o possível efeito do fitol (FI) em modelo experimental de artrite em
camundongos.

2.2 Objetivos Específicos

 Verificar o efeito da administração de FI na hiperalgesia mecânica;
 Avaliar o efeito do FI sobre a coordenação motora;
 Avaliar o efeito do FI sobre o edema de pata induzido por AR;
 Avaliar o efeito do FI sobre os níveis de citocinas TNF-α e IL-6;

3 REVISÃO TEÓRICA

3.1 INFLAMAÇÃO

A inflamação é uma resposta biológica a estímulos nocivos, como patógenos, células

danificadas, irradiação entre outros (BARROS, 2004). É uma tentativa de proteção do
organismo que remove estímulos prejudiciais e inicia um processo de reparo e cicatrização
(WEISS, 2008). Caracteriza-se por dor, rubor, calor, edema e distúrbios ou perda da função
normal do membro ou órgão acometido. A reação inflamatória representa um dos
componentes mais importantes da execução das respostas imunitárias inata e adaptativa e,
embora faça parte dos mecanismos defensivos contra inúmeras agressões, em muitos casos
 8

pode também causar danos (FALLIS, 2013; KUMAR, ABBAS e ASTER, 2015).
Clinicamente, encontra-se dividida em aguda e crônica.
A inflamação aguda é uma resposta rápida que geralmente resulta em cura: os
leucócitos infiltram a região danificada, removendo o estímulo reparando o tecido.
Contrariamente, a inflamação crônica é uma resposta prolongada, desregulada e inadaptada
que envolve inflamação ativa, destruição de tecido e tentativas de reparo tecidual. Essa
inflamação persistente está associada a doenças crônicas, incluindo alergia, aterosclerose,
câncer, artrite e doenças autoimunes (LAI, TANG e LEUNG, 2007; PEARLMAN, 1999).
A resposta do organismo aos estímulos que promovem a inflamação é dividida em
cinco fases: irritativa, vascular, exudativa, degenerativa-necrótica e reparativa. Estas
envolvem reconhecimento da causa ou agentes flogísticos, recrutamento celular, aumento da
permeabilidade vascular e liberação de mediadores inflamatórios como citocinas,
prostanoides entre outros (BARROS, 2004; MEDZHITOV, 2008).
A fase irritativa da inflamação corresponde ao reconhecimento do agente flogística
(que promove inflamação) e modificações morfológicas e funcionais nos tecidos agredidos
promovendo a liberação de mediadores químicos, que são responsáveis pela progressão das
demais fases inflamatórias (KUMAR, ABBAS e ASTER, 2015). Este reconhecimento inicial
é mediado por macrófagos e mastócitos, levando à produção de uma variedade de mediadores
inflamatórios, incluindo quimiocinas, citocinas, aminas vasoativas, eicosanoides e produtos
de cascatas proteolíticas. O efeito principal e mais imediato desses mediadores é provocar um
exsudato inflamatório local: proteínas plasmáticas e leucócitos (principalmente neutrófilos) no
local de infecção (ou lesão) (MEDZHITOV, 2008).
A fase exudativa ou vascular da inflamação consiste em mudanças no fluxo de
sangue e na permeabilidade dos vasos, ambos destinados a maximizar o movimento das
proteínas plasmáticas e leucócitos fora da circulação e para o local de infecção ou lesão. O
extravasamento de fluidos, proteínas e células sanguíneas do sistema vascular para os tecidos
intersticiais ou cavidades corporais é conhecido como exsudação. Sua presença implica que
há um aumento na permeabilidade de pequenos vasos sanguíneos, tipicamente durante uma
reação inflamatória. Este aumento da permeabilidade dos vasos é devido a ação de histamina,
bradicinina, leucotrienos e outros mediadores químicos liberados pelas células imunes
residentes no tecido (NATHAN et al., 2016).
Em resposta às alterações vasculares, o fluxo sanguíneo nos capilares do local
inflamado fica lento (estase sanguínea), consequentemente, leucócitos são marginalizados.
Assim detectam e reagem às alterações no endotélio. A identificação do agente agressor, ativa
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as células endoteliais, por meio de citocinas e quimiocinas, expressarem moléculas de adesão

na sua superfície (selectinas e integrinas) a quais os leucócitos se ligam frouxamente. Assim,
inicia-se o processo chamado rolamento, que compreende o reconhecimento dessas moléculas
e a aproximação dos leucócitos a parede do vaso (COOK-MILLS, 2004; POBER e SESSA,
2007; RAO et al., 2007).
Depois de ancorados à superfície endotelial, os leucócitos migram através da parede
do vaso, atravessando as junções intercelulares. Este extravasamento de leucócitos, chamado
transmigração ou diapedese, ocorre principalmente em veias de pequeno calibre (MICHIELS,
2003). Esta migração se deve a interação entre as selectinas das células endoteliais e
receptores de quimiocinas em leucócitos. No tecido, os leucócitos são direcionados ao local
da lesão por meio de quimioatraentes (quimiocinas) secretadas pelas células no local da
injúria. Desta forma, quando atingem o local do tecido lesado, os neutrófilos se tornam
ativados, seja por contato direto com agentes patogênicos ou através das ações de citocinas
segregadas por células residentes nos tecidos, atacando assim o agente agressor (RAO et al.,
2007; SERHAN, SAVILL, 2005).
Após a ativação dos leucócitos, eles fagocitam e degradam os micróbios usando
proteases, peptídeos antimicrobianos, espécies reativas de oxigênio e espécies reativo de
nitrogênio que acabam lesando o tecido inflamado. Como o tempo de vida dos leucócitos fora
do lúmen venoso é curto, eles entram em apoptose e são fagocitados por macrófagos.
Consequentemente há uma diminuição da liberação de mediadores inflamatórios e
quimiocinas, diminuindo o recrutamento celular e consequentemente o processo inflamatório.
Além disso, com a diminuição dos estímulos pró-inflamatórios, a ação de moléculas anti-
inflamatórias se exacerba culminando na resolução do processo inflamatório. (BARTON,
2008; SERHAN e SAVILL, 2005).
Posteriormente, tem-se início a reparação de tecidos danificados que ocorre por dois
tipos de reações: regeneração por proliferação de células residuais (não feridas) e
amadurecimento de células-tronco de tecido e deposição de tecido conjuntivo para formar
uma cicatriz.

3.2 FITOL

Os terpenóides representam uma das maiores e mais variadas classes de metabólitos

secundários de origem natural, com mais de 55.000 membros já isolados. Assim, representam
 10

a família mais extensa e estruturalmente diferente dentre os produtos naturais, derivados de

unidades de isopreno (C5), formados da junção cabeça-cauda, como o fitol, que consiste em
quatro unidades de isopreno (COSTA, 2012).
O fitol, (3,7,11,15-tetrametilhexadec-2-en-l-ol), é um diterpeno pertencente ao grupo
dos álcoois acíclicos insaturados de cadeia longa (C20H40O) e ramificada. Encontrado em
estado líquido a temperatura ambiente e com densidade de 0,00327 mg/L -1, este diterpeno
compõem a molécula de clorofila-A, sendo assim bastante abundante. Há na literatura
científica várias citações ao potencial terapêutico do fitol, dentre eles pode-se citar o bloqueio
do potencial teratogênico do retinol, atividade antimicrobiana contra micobactérias, potencial
anti-inflamatório e antinociceptivo (COSTA et al., 2014; SANTOS et al., 2013), além do seu
uso como adjuvante em vacinas (GHOSH e CHOWDHURY, 2013). Porém, relatos sobre o
potencial anti-inflamatório em modelos crônicos, como na artrite, e sobre seu desempenho
quando complexado a moléculas de β-Ciclodextrina são escassos na literatura.
Com o intuito de se descobrir novas drogas, elucidar seus possíveis mecanismos de
ação, bem como novas técnicas e procedimentos a serem implantados na clínica, utiliza-se o
estudo pré-clínico, de natureza molecular ou celular da doença, seja ele in vitro ou com
animais de laboratório. Tais estudos são essenciais para o avanço nas práticas e conhecimento
em saúde, pois são realizados inicialmente em animais de pequeno porte, seguidos de animais
de médio e grande porte para, por fim, a aplicabilidade em humanos, evitando maiores danos
a estes, caso a triagem inicial na pesquisa pré-clínica não fosse realizada. Os ratos e
camundongos são as espécies mais utilizadas para o desenvolvimento de drogas por terem um
ciclo de vida relativamente curto, o que permite avaliar a progressão da doença, com ou sem a
intervenção terapêutica (SHAH; AGNIHOTRI, 2011; SUZUKI; YEUNG; IKENO, 2008).
Desta forma, para a execução do presente trabalho serão utilizados testes envolvendo
animais, o que, a depender dos resultados obtidos, podem tornar o FI uma possível droga
utilizada como fonte de novos fármacos voltados à analgesia.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Substâncias

Phytol, 97%, mixture of isomers (Sigma Aldrich); Freund´s Complete Adjuvants

(Sigma Aldrich); Kit de ELISA, PBS 1x (fosfato de sódio monobásico e bibásico, cloreto de
potássio, cloreto de sódio)
 11

4.2 Grupos experimentais

Neste estudo, será utilizado um modelo animal que gera processos inflamatórios,
sendo ele a artrite induzida por CFA em camundongos. Os animais serão randomizados em
três grupos para a realização dos protocolos experimentais:
 Grupo Sham: constituído por animais submetidos à administração da solução salina
estéril e e tratados com o veículo (solução salina + Tween 80 0,2%) por via oral.
 Grupo controle negativo (veículo): constituído por animais submetidos ao modelo
experimental descrito acima e tratados com o veículo (solução salina + Tween 80
0,2%) por via oral;
 Grupo experimental tratado com FITOL: constituído por animais submetidos ao
modelo experimental descrito acima e tratados com 50 mg/kg de fitol por via oral. A
concentração foi determinada levando em consideração dados da literatura que
mostram atividade biológicas in vivo (SANTOS et al., 2013; SILVA et al., 2014)

4.3 Animais

Serão utilizados 48 camundongos fêmeas Swiss, albinos com peso entre 25 a 40

gramas, com 2 a 3 meses de idade, oriundos do Biotério Setorial do Departamento de
Fisiologia da UFS. Os animais serão mantidos em ciclo claro escuro de 12:00h/12:00h (claro:
6 às 18 h; escuro: 18 às 6 h), à temperatura de 22 ± 2, com dieta balanceada com ração do tipo
“pallet” e acesso livre à água. Os animais serão divididos em grupos de 5 e mantidos em
gaiolas com dimensões 30cm x 20cm x 13cm (C x L x A) no Biotério do Laboratório de
Neurociências e Ensaios Farmacológicos, localizado no Departamento de Fisiologia
(LANEF/DFS), na UFS por, no mínimo, uma semana de ambientação e até obterem peso e
idade adequados para experimentação. Para execução do seguinte estudo serão respeitados os
princípios éticos estabelecidos pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animal de
Laboratório (SBCAL) e todos os procedimentos experimentais foram analisados e aprovados
pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFS (Protocolo: 10/2018).
Como mencionado no subitem 4.2, os animais serão divididos em 03 grupos (n=8),
dessa forma utilizar-se-á 48 animais distribuídos conforme a Tabela 1.
 12

Tabela 1- Distribuição dos animais utilizados nesta pesquisa segundo o teste a ser realizado.

Experimento Espécie no de grupos n/grupo N total

Hiperalgesia mecânica, avaliação da Camundongos
3 8 24
força muscular e edema de joelho Swiss

Camundongos
Citocinas (IL-6 e TNF-α) 3 8 24
Swiss

Total geral: 48

4.4 Protocolos experimentais

4.4.1 Artrite induzida por adjuvante completo de Freund

Os animais serão anestesiados com cetamina (80 mg/ml) e xilasina (8 mg/kg). Após
detectar a perda de consciência do animal, os animais receberão (via i.art.) injeção de 10µl de
CFA (1 mg/ml de Mycobacterium Tuberculosis morta por calor seco, em óleo de parafina e de
monoleato manida) (OMOROGBE et al., 2018; PEARSON e WOOD, 1959).

4.4.2 Avaliação da força muscular

A avaliação da força de tração muscular das patas dianteiras e traseiras será realizada
pelo adaptação do método descrito por (BURNES et al., 2008) onde será utilizado o Grip
Strenght Meter (Modelo EFF 305, Insight Ltda., Ribeirão Preto, Brasil).
.
4.4.3 Avaliação da Hiperalgesia Mecânica

Os animais serão divididos em grupos de 3 (n=8) e induzidos conforme descrito no

item 4.2. A hiperalgesia mecânica será testada conforme relatado por (CUNHA et al., 2004).
Consistirá em mensurar o limiar de retirada da pata do animal utilizando um analgesímetro
digital (Modelo EFF 301, Insight Ltda., Ribeirão Preto, Brasil). Um basal será realizado antes
e 24h após a indução. Os animais receberão tratamento 24h após a indução e serão avaliados
60 min após o tratamento. O experimento terá duração de 14 dias e os animais tratados
diariamente, porém as avaliações serão realizadas em intervalos de 48h.
 13

4.4.4 Avaliação do edema de joelho

O diâmetro da articulação do joelho será aferido utilizando um paquímetro digital

(Paquimetro Digital Stainless Hardened). Será mensurada o edema de joelho nas posições
ântero-posterior (AP) e látero-lateral (LL) do joelho ipsilateral e contralateral. Será calculada

a área por meio da equação: , onde o raio será a média de AP e LL dividido por

2. Para calcular a porcentagem de inibição do edema, utilizaremos a equação:

Os animais serão divididos em 2 grupos, sendo cada grupo composto por 8 animais.
A indução seguirá o exposto no item 4.3, porém no joelho esquerdo será injetado 10uL de
solução salina estéril. As avaliações ocorrerão durante 14 dias.

4.4.5 Dosagem de citocinas

Para esta técnica os animais serão divididos em 3 grupos (n=8) e induzidos conforme
o item 2 e após 3 dias da indução os animais serão eutanasiados. A cápsula articular dos
animais será exposta e lavada com 10uL de solução tamponada e inibidor de protease duas
vezes. Logo, para a dosagem das citocinas IL-6 e TNF-α, a técnica de ELISA será utilizada.
Resumindo, amostras ou o padrão serão adicionados ao poço contendo o anticorpo de captura
previamente imobilizado. O sanduíche é formado pela adição de um segundo anticorpo que se
liga ao alvo em outro epítopo. Posteriormente será adicionado o anticorpo secundário ligado a
uma enzima de detecção. Após a incubação e várias lavagens, a revelação será realizada
através da adição do substrato da enzima que produzira um sinal proporcional à quantidade de
analito.

4.5 Descartes

Após o teste comportamental, os animais serão eutanasiados e a as carcaças serão

depositadas em sacos plásticos apropriados e armazenadas no freezer de coleta de material
biológico do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia da UFS para recolhimento
 14

durante a coleta de lixo hospitalar. Os resíduos perfurocortantes serão armazenados em caixas

adequadas e levados até o hospital universitário.

4.6 Análise estatística

Os resultados serão expressos como média ± E.P.M. Para comparações múltiplas, os

dados serão analisados por ANOVA de uma ou duas vias, seguido e pelo pós-teste de Tukey
ou Teste de Bonferroni, conforme o caso. Valores de p < 0,05 serão considerados
estatisticamente significantes.

5 ORÇAMENTO E EXEQUIBILIDADE

O Laboratório de Neurociências e Ensaios Farmacológicos, lotado no Departamento

de Fisiologia da Universidade Federal de Sergipe (LANEF/DFS/UFS), dispõe de toda a
infraestrutura e um corpo docente qualificado capaz de realizar tanto os testes especificados
no presente projeto, bem como, a montagem de outras técnicas farmacológicas que possam
ser sugeridas. Adicionalmente, o LANEF possui parcerias com outras instituições de ensino
superior de nível nacional e internacional (Universidade Federal do Ceará, Universidade
Federal do Piauí, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Universidade Federal da
Paraíba, Universidade Federal de Alagoas, Universidade Federal de São Paulo, Universidade
de São Paulo - USP - Ribeirão Preto e Universidade de Iowa - EUA) que, caso seja
necessário, podem contribuir em alguma etapa da execução do projeto.

Tabela 2: Orçamento
MATERIAIS VALOR (R$)

Material de consumo

CFA 1000,00

Kits ELISA 3.000,00

Outros reagentes 1.000,00

Total 5.000,00
 15

6 CRONOGRAMA

2019 – 2020
ATIVIDADE Meses
8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7
Levantamento Bibliográfico e Revisão da
X X X X X X X X X X X X
Literatura
Realização dos protocolos experimentais X X X X X X X X X X
Análise dos dados X X X X X X X X X

Elaboração de relatórios X X X X
Reuniões periódicas com orientador e
X X X X X X X X X X X X
grupo de pesquisa

7 REFERÊNCIAS

BARROS, S. B. DE M. Robbins basic pathology. Revista Brasileira de Ciências

Farmacêuticas, v. 40, n. 3, p. 444–444, 2004.

BARTON, G. M. A calculated response: Control of inflammation by the innate immune

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