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PeerJ
Enviado e m junho de 2019
Aceito em 25 de agosto de 2019
Publicado em 2ii fevereiro de
2019
Autor correspondente
Sarana Rose Sommano,
sarana.sFcinu.ac.th
Editora acadêmica
Claudia Colesie
Informações adicionais e
declarações podem ser
encontradas na página 14
DOI 10.7717/peerj.7751
Direitos autorais
2019 Janpen ct a1.
Distribuído em
Creative Commons CC-BY 4.0
ACESSO
ABERTO
Respostas fisiológicas da hortelã
japonesa cultivada em hidroponia sob
deficiência de nutrientes
Chananchida Janpen''2 , Naruemon Kanthawang'", Chaiartid Inkham",
Fui Ying Tsan' e Sarana Rose Sommano 12
Departamento de Ciências das Plantas e do Solo, Faculdade de Agricultura, Universidade de Chiang Mai,
Universidade de Chiang Mai, Chiang Mai, Tailândia
2 Laboratório de compostos bioativos de plantas (BAC), Faculdade de Agricultura, Universidade de Chiang Mai,
Universidade de Chiang Mai, Chiang Mai, Tailândia
Instituto de Pesquisa em Ciência e Tecnologia, Universidade de Chiang Mai, Universidade de Chiang Mai,
Chiang Mai, Tailândia
Faculdade de Plantação e Agrotecnologia, Universiti Teknologi Mara, Universiti Teknologi Mara, Shah Alam,
Malásia
RESUMO
Esta pesquisa tem como objetivo determinar os padrões de crescimento e deficiência,
bem como os potenciais antioxidantes da hortelã japonesa (Mentha arvensis) cultivada
hidroponicamente sob a limitação de macronutrientes e micronutrientes. O
experimento foi conduzido por 60 dias após o transplante em uma estufa evaporativa
(temperatura média = 25-30 °C, 60-65% UR), usando a técnica de cultivo em águas
profundas. As plantas foram cultivadas em solução nutritiva composta por solução
completa de Hoagland (CTRL) e soluções nutritivas com falta de um dos seguintes
macronutrientes e micronutrientes: nitrogênio (-N), fósforo (-P), potássio (-K), ferro
(-Fe), manganês (-Mn) e cobre (-Cu). Os sintomas de deficiência, os padrões de
crescimento e o mecanismo de resposta ao estresse foram acompanhados. Todos os
tratamentos, exceto o CTRL, induziram sintomas de deficiência e alterações
fisiológicas. A privação de macronutrientes reduziu o crescimento determinado pelos
parâmetros morfológicos, enquanto a omissão de micronutrientes não teve efeito,
exceto no tratamento sem ferro. Os resultados mostraram que as deficiências de
potássio e ferro tiveram o maior efeito negativo sobre o crescimento da hortelã
japonesa. Sob condições de estresse de nutrientes, a planta só apresentou respostas
antioxidantes às deficiências de fósforo e potássio. No entanto, a relação negativa entre
planta e estresse foi encontrada para o tratamento sem ferro, indicando o modo de
desintoxicação da planta para a falta de micronutrientes.
Disciplinas Ciências Agrícolas, Ciências Vegetais
Palavras-chave Estresse abiótico, Mecanismo antioxidante, Mentha arvensis, Estresse de nutrientes,
Sintomas visuais
INTRODUÇÃO
A hortelã japonesa (Mentha arvensis) é uma planta herbácea com óleo essencial
pertencente à família Lamiaceae. As partes ariais (folhas, caules jovens e partes da
inflorescência) são compostas p o r tricomas glandulares que contêm óleo essencial,
conhecido principalmente como hortelã
óleo com alta demanda de mercado nos setores cosmético, farmacêutico, alimentício e de
aromas
(Cershenzon, M'Con key Crotenu, 2000). A produção mundial atual dessa hortelã
Como citar este artigo Janpen C, Kanthawang N, Inkham C, Tsan FY, St 'mman'i SR. 2019. Physi'th'gica1 respi irises ' 'f hydri Apr'nically-
grown Ja[4anese mint under nutrient cleficiency. PeerJ 7:e7731 lit t 'i.i'rg/ 10.7717/[accrj.77a1
PeerJ

de óleo atingiu quase 48.000 toneladas por ano (totalmente, JOi 7). Ultimamente, tem
havido muita preocupação com a deterioração do solo e as condições climáticas
desfavoráveis devido às mudanças climáticas. Esses fatores, como consequência, afetaram
amplamente o volume de produção e a qualidade da hortelã japonesa (Klinledianct ul.,
2017, -TanejaCli 'indra, 2012). Para superar esses problemas, os
agricultores urbanos estão começando a explorar formas alternativas de cultivar plantas.
A hidroponia é uma técnica de produção de plantas em que o sistema radicular entra em
contato direto com a solução, na qual todos os elementos nutritivos estão em uma forma
prontamente disponível para as plantas absorverem e utilizarem (Schwarz, 1995). Esse
sistema oferece uma lista de vantagens, incluindo o aumento do rendimento, a
minimização do tempo de produção e, o que é mais importante, é sustentável para o
ambiente urbano (Jones,

Os macronutrientes e micronutrientes são essenciais para o crescimento e o

desenvolvimento das plantas, pois participam de vários processos fisiológicos e são
cofatores necessários para várias enzimas do metabolismo primário e secundário (N1D1
"s'"hner, 20i2). A ausência desses elementos pode causar crescimento anormal da planta e
sintomas antagônicos que são específicos para cada elemento nutriente e espécie de
planta. Ela também pode induzir alterações na biossíntese de compostos primários e
secundários (her Shek/a,2t) IS). Esse
estresse abiótico também pode levar à produção excessiva de espécies reativas de
oxigênio (ROS), que causam efeito tóxico oxidativo em lipídios, proteínas e ácidos
nucleicos das células vegetais. Por meio do processo biológico, com ou sem estresse, as
plantas produzem ROS em várias formas, incluindo peróxido de hidrogênio (HzO2),
ânion superóxido ( z'*) e oxigênio singlete ('Oz), que são produzidos nas organelas, como
cloroplasto, peroxissomos e mitocôndrias (Gi//I Tutejn, 2010). No entanto, as plantas têm
o sistema de se proteger contra as ROS por meio de sistemas defensivos antioxidantes e
do acúmulo de compostos secundários enzimáticos e não enzimáticos para desintoxicar o
efeito prejudicial das ROS (OpelHirt , 20 )4,-Bill C- Tuteja,
2010). O acúmulo desses compostos é benéfico, especialmente para as plantas com
propriedades medicinais e aromáticas (Prndhnn cr u/., JO7 7).
As ameaças ambientais levaram a uma demanda crescente por práticas agrícolas
urbanas para o cultivo de alimentos, com uma intenção cada vez maior de cultivar
culturas de alto valor, como plantas medicinais como a hortelã japonesa. Para isso, há
informações inadequadas sobre o manejo de nutrientes, os sintomas de deficiência e as
respostas antioxidantes da hortelã cultivada hidroponicamente sob condições de
deficiência de nutrientes. Para fornecer essas informações, o objetivo deste estudo é
definir os sintomas de deficiência, os efeitos sobre o crescimento e o mecanismo de
defesa antioxidante da hortelã japonesa.

MATERIAIS E MÉTODOS
Material vegetal
As mudas de hortelã japonesa com oito semanas de idade (S-cm de altura), mantidas nas
condições padrão de propagação do protocolo do Thai Royal Project (estufa com 80*/o de
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PeerJ
umidade e irrigação diária uma vez por dia), foram adquiridas do Khun Pae Royal
Project, Chom Thong, Chiang Mai, Tailândia. As mudas foram cultivadas em pó de coco
por 2 meses antes de serem transferidas para o sistema hidropônico de cultivo em águas
profundas.

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Tratamentos e condições de crescimento

A solução nutritiva padrão de Hoagland foi preparada nesse experimento (Hou¿land
A mon, 195 1) com a adição de 7 soluções nutritivas diferentes, como segue: (i) uma
solução completa (CTRL) consistindo em 210 mg de N, 30 mg de P, 234 mg de K, 200
mg de Ca, 64 mg de S, 48 mg de Mg, 0,5 mg de B, 5 mg de Fe, 0,5 mg de Mn, 0,02 mg
de Cu, 0,05 mg de Zn e 0,01 md de Mo por
L. Os outros seis tratamentos foram idênticos ao CTRL sem (ii) N (-N), (iii) P (-P),
(iv) K (-K), (v) Fe (-Fe), (vi) Mn (-Mn) e (vii) Cu (-Cu). Os tratamentos foram dispostos
em um projeto de blocos completos aleatórios (RCBD) em três réplicas. As mudas foram
lavadas e depois transferidas para cada tratamento. Um suprimento contínuo de oxigênio
foi adicionado por meio de uma bomba de ar e uma pedra de ar. O pH de todos os
tratamentos foi mantido em 6,5-7,0 e a condutividade elétrica (CE) em 1.900-2.000
qS/cm. O experimento foi conduzido no período de 60 dias, conforme sugerido como
tempo de colheita comercial para essa cultura específica (Tnne/u fi Chandi a, 2012). As
plantas foram cultivadas em uma estufa com sistema de resfriamento evaporativo no Mae-
Hia Agricultural Research, Demonstrative and Training Centre, Faculty of Agriculture,
Chiang Mai University. Durante o experimento, a temperatura da estufa variou de 25 a
30 °C, com 30% de penetração de luz e umidade relativa de 60-65*/".

Parâmetros morfológicos
A cada período de 15 dias, foram observados os sintomas visuais de deficiência das
plantas de hortelã japonesa cultivadas em cada tratamento. A altura da planta (cm) e o
peso seco total (g) foram registrados. A área foliar (cm2 ) foi medida com o medidor de
área foliar LI-3100 (LI-COR, EUA). O sistema radicular e a parte aérea foram separados
e, em seguida, secos em estufa a 40 °C por 45 h. O peso seco de cada parte foi usado
para calcular a proporção entre broto e raiz (Bessa et al., 2013; Ericsson, 19P5).

Mecanismo de estresse da planta

Estimativa de clorofila
A estimativa não destrutiva de clorofila foi determinada como valor SPAD do primeiro
par de folhas totalmente expandidas (jovens) e do último par de folhas (velhas) usando
um medidor de clorofila portátil SPAD-502 Plus (Konica Minolta, Japão).

Determinação do vazamento de eletrólitos

O vazamento de eletrólitos foi determinado conforme descrito porGarcia-Mata
Lamattina(2001)
com pequenas modificações. As amostras de folhas (pedaços de 15 cm) foram
2

submersas em 10 mL de água deionizada e mantidas em temperatura ambiente por 2 h.

Após a incubação, a condutividade elétrica inicial da solução de banho (ECi) foi medida
usando o medidor de condutividade Eutech CON 700 (Eutech Instruments Pte Ltd,
Cingapura). Em seguida, as amostras foram aquecidas a 80 °C por 2 h para liberar todos
os eletrólitos, e a condutividade elétrica da solução de banho aquecida (ECt) foi medida
novamente. A porcentagem de vazamento de eletrólitos foi calculada usando a seguinte
equação;

Vazamento de eletrólito (%) = (£Ci/DCI) x 100.

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 4/19
PeerJ

Extração de compostos antioxidantes

A parte aérea seca foi pulverizada com um moedor manual (Philips, Holanda) no nível de
velocidade 1. O pó da amostra (0,05 g) foi extraído com 500 qL de metanol 95% (v/v) duas
vezes. Após a centrifugação, os sobrenadantes foram combinados e usados para as análises
de fenólicos totais, conteúdo total de flavonoides e atividades de eliminação de radicais.

Determinação do conteúdo renólico total

O conteúdo fenólico total foi determinado espectrofotometricamente de acordo com o
método colorimétrico de Folin
CiocalteuCfirmr/rr Sfi'r'nn, 2o07,- Sooimnriu, 20? ñ),
calibrando com os padrões de ácido gálico. Resumidamente, 30 JL do extrato
metanólico foram misturados com 60 JL de reagente Folin-Ciocalteu a 10% (v/v).
Depois disso, dentro de um minuto, foram adicionados (210 JL) de NaHCOs a 6*/" (p/v).
A solução foi misturada e incubada no escuro em temperatura ambiente por 30 minutos. A
absorbância foi medida a 725 nm usando o leitor de microplacas SPECTROstar Nano
(BMG LABTECH, Ortenberg, Alemanha). Os resultados foram expressos como mg de
equivalente de ácido gálico por g de peso seco da amostra (mg GAE/ g DW).

Determinação do conteúdo total de flavonoides

O conteúdo total de flavonoides foi determinado pelo método colorimétrico de cloreto de
alumínio (Wo/c, ,2005). A combinação do extrato de metanol (25 qL), água
destilada (125 qL) e 5*/" (p/v). NaNO2 (7,5 qL) foi completamente misturada. Após 5
minutos, 15 qL de AlCls foram adicionados e a mistura foi incubada em temperatura
ambiente por 6 minutos. Depois disso, NaOH (50 qL) e água destilada (27,5 qL) foram
adicionados e misturados. A absorbância dessa solução foi medida a 510 nm usando o
leitor de microplacas e comparada com uma curva padrão de soluções de catequina. O
teor de flavonoides foi expresso como mg de equivalente de catequina por g de peso seco
da amostra (mg CE/g DW).

Determinação da atividade de eliminação do radical DPPH

A atividade de eliminação do radical 2, 2-difenil-1-picril-hidrazila1 (DPPH) foi medida
usando o método de Mo/riri, De Meacher (2009). O extrato de metanol (25 qL) foi
reagido com
Solução de DPPH-metanol 0,2 mM (250 qL). A mistura foi incubada no escuro, em
temperatura ambiente, por 30 minutos. A absorbância foi medida em 517 nm. A
porcentagem da atividade de eliminação do radical DPPH foi calculada usando a seguinte
equação;

Atividade de eliminação do radical DPPH (*/o) [(Aqontrole Asampl¿)/A%

i] x 100
onde; A2ontrqé a absorbância do controle [usando metanol 95% (v/v) em vez da amostra].
AST p}p é a absorbância da mistura do extrato da amostra e da solução de DPPH-metanol
0,2 mM.

Determinação da atividade de eliminação do radical ABTS

A atividade de eliminação do cátion radical 2, 2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazina-6-sulfonato)

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 5/19

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(ABTS) foi medida usando o método de ensaio de descoloração do cátion radical ABTS
(Pe et al., 1999). Para preparar a solução de estoque de ABTS 7 mM, o ABTS foi
dissolvido em uma concentração de 7 mM e misturado com uma solução de persulfato de
potássio 2,45 mM na proporção de 1:1 (v/v). A solução de estoque foi mantida no escuro
em temperatura ambiente por 16 horas. O

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A solução de trabalho de ABTS foi diluída com solução tampão de fosfato (2,4 mM, pH
7,4) até que fosse obtida uma absorbância de 0,7 - 0,02 a 734 nm. Dez pL do extrato de
metanol foram reagidos com 200 pL da solução de trabalho de ABTS. A solução
misturada foi incubada em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. As leituras
de absorbância foram registradas a 734 nm. A porcentagem da atividade de eliminação
do radical ABTS foi calculada usando a seguinte equação;
Atividade de eliminação do radical ABTS ('/o) [(A%ontrole ASqmp1e) Acontro X
100
onde; Acontrola a absorbância do padrão de trabalho ABTS.
AsampIieS a absorbância da mistura do extrato da amostra e da solução de trabalho ABTS.

Análise estatística
O experimento foi montado em um projeto de blocos completos aleatórios, com sete
tratamentos e três réplicas. Quinze plantas foram usadas em cada réplica de um único
tratamento. As extrações de fitoquímicos e as análises foram feitas em três lotes
separados de amostras. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e a
comparação entre os valores médios do tratamento foi confirmada pelo teste de diferença
significativa honesta (HSD) de Tukey no nível de significância de 95*/o. Os coeficientes
de correlação de Pearson foram calculados para diversas variáveis.

RESULTADOS
Efeitos da deficiência de macronutrientes individuais no crescimento de
japoneses
hortelã
Deficiência de nitrogênio
Os sintomas iniciais da hortelã japonesa com deficiência de nitrogênio foram observados
aos 15 dias após o transplante. As plantas cultivadas no tratamento com -N apresentaram
crescimento atrofiado e sintoma de deficiência na folhagem verde-amarelada. Os
sintomas apareceram primeiro nas folhas velhas, que eram clorose em toda a folha e
necrose na margem da folha (Fig. I B). Em termos de produtividade da planta, a
deficiência de nitrogênio reduziu a área foliar, o peso seco total e a relação broto/raiz aos
30 dias após o transplante em comparação com as plantas cultivadas no CTRL (Figs. 2B-
2D), enquanto a altura da planta não foi afetada (Fig. 2A).

Deficiência de fósforo
Os sintomas de deficiência de fósforo foram claramente perceptíveis aos 60 dias do
transplante. A lâmina foliar tornou-se verde-escura, com a cor roxa emergente na margem
das folhas. As folhas velhas mostraram clorose a partir da borda das folhas com necrose
progressiva (Figura 1C). Os limites de fósforo tiveram efeitos negativos em todos os
parâmetros de crescimento, inclusive altura da planta, área foliar, peso seco total e
relação broto/raiz após 30 dias de transplante (File.
2A-2D).

Deficiência de potássio
Os sintomas de deficiência de potássio foram aparentes após 30 dias de transplante para a
solução nutritiva sem potássio (-K). As plantas apresentaram crescimento atrofiado e

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ficaram murchas com manchas amarelas distribuídas na lâmina das folhas velhas durante
60 dias de experimento (Fiji. lD). Os limites de potássio também tiveram um efeito
negativo adverso na altura da planta, na folha

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 8/19

PeerJ

Figura l Crescimento e sintomas visuais em folhas velhas de hortelã japonesa cultivada sob deficiência
de macronutrientes por 60 dias após o transplante para a solução nutritiva sem macronutriente
individual. (B) nitrogênio (-N); (C) fósforo (-P); (D) potássio (-K) em comparação com plantas
cultivadas em (A) solução nutritiva completa (CTRL).
tamanho de shopping o Ou: 10.i i
l7/pccrj.77s 1/fit-1

Figura 2 Parâmetros morfológicos da hortelã japonesa cultivada em solução nutritiva com deficiências
individuais de macronutrientes [(-N), (-P) e (-K)] após o transplante por 60 dias. (A) altura da planta;
(B) área foliar; (C) peso seco total; e (D) proporção entre broto e raiz. Os dados são as médias das
amostras replicadas. As barras representam o erro padrão.
F "li -si DoI: 10." /p "rj.77s I hid-2

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 9/19

PeerJ

Figura 3 Crescimento e sintomas visuais em folhas jovens de hortelã japonesa cultivadas sob deficiência
de micronutrientes por 60 dias após o transplante para a solução nutritiva sem micronutriente
individual.
(B) ferro (-Fe); (C) manganês (-Mn); (D) cobre (-Cu) em comparação com plantas cultivadas em (A) solução
nutritiva completa (CTRL).
tamanho de shopping o Ou: 10.i i
l7/pccrj.77s 1/fit-s

área e peso seco total (arquivos 2A-2C) após 30 dias de transplante, em comparação
com as plantas cultivadas no CTRL. A proporção entre brotos e raízes diminuiu aos 45
dias após o transplante (ver 2D).

Efeitos da deficiência individual de micronutrientes no crescimento de

japoneses
hortelã
Deficiência de ferro
Os sintomas de deficiência de ferro foram notados aos 7 dias após o transplante para o
tratamento com -Fe. As folhas jovens apresentaram clorose que começou na base do
pecíolo e se expandiu em direção às folhas (Fig. 3B). Esse sintoma foi progressivo para
as folhas mais velhas, ilustrando a clorose interveinal até 60 dias após o transplante. Os
limites de ferro retardaram a altura da planta e a área foliar após 15 dias de transplante
(figs. 4A-4fi). Além disso, a relação broto/raiz das plantas com deficiência de ferro
diminuiu após 30 dias e o peso seco total diminuiu aos 45 dias após o transplante (figs.
4C-4D).

Deficiência de manganês
Os sintomas visuais da deficiência de manganês ocorreram aos 30 dias após o transplante.
O ápice do broto apresentou distorção e necrose (Fig. 3C). As folhas jovens totalmente
expandidas apresentaram clorose a partir da base do pecíolo e progredindo em direção a o
meio das folhas. Além disso, as folhas mais velhas também apresentavam clorose na
margem da folha. Em termos de produtividade, a deficiência de manganês não teve efeito
sobre a altura da planta, a área foliar e o peso seco total (figs. 4A-4C), ao passo que a
proporção entre brotos e raízes diminuiu após 45 dias de transplante (fig. 4D) em
comparação com o CTRL. No entanto, a hortelã japonesa com deficiência de manganês
parecia ter um crescimento normal.

Deficiência de cobre

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 10/1

9
PeerJ

Os sintomas de deficiência de cobre foram mostrados 45 dias após o transplante. A ponta do

broto apresentava cor cinza-clara com necrose e as folhas jovens totalmente expandidas
apresentavam clorose (Fig. 3D).

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PeerJ

Figura 4 Parâmetros morfológicos da hortelã japonesa cultivada em solução nutritiva com

deficiências individuais de micronutrientes [(-Fe), (-Mn) e (-Cu)] após o transplante por 60 dias. (A)
altura da planta; (B) área foliar; (C) peso seco total; e (D) proporção entre broto e raiz. Os dados são as
médias das amostras replicadas. As barras representam o erro padrão.
tamanho médio DOI: lo." l /t-"rj.
"s1/fib-i

Além disso, a clorose progressiva em folhas velhas começou na borda da folha. Os

limites de cobre não tiveram efeito sobre a altura da planta, a área foliar e o peso seco
total (Figs. 4AWC), mas reduziram a proporção entre brotos e raízes após 45 dias de
transplante (Fig. 4D).

Mecanismo de defesa contra a deficiência de macro e micronutrientes

Os resultados da Fig. 5 indicaram que a falta de macro e microelementos aumentou o
vazamento de eletrólitos a partir de 15 dias após o transplante, exceto os limites no
tratamento com fósforo em comparação com o controle. Para os tratamentos com
omissão de macronutrientes, a limitação de nitrogênio e potássio teve um impacto
negativo na integridade da membrana celular, resultando no aumento do vazamento de
eletrólitos (Fig. SA). A deficiência de nitrogênio também teve efeito adverso sobre o
conteúdo de clorofila, conforme observado pela redução do valor SPAD em ambos os
tipos de folhas (Fig. SB e SC). Para os limites nos tratamentos com micronutrientes, o
vazamento de eletrólitos aumentou após 45 dias de transplante (Fig. SU). A deficiência
de ferro e manganês teve um impacto negativo sobre a estabilidade da membrana celular,
resultando no alto aumento do vazamento de eletrólitos e na redução dos valores SPAD.
(Arquivos 5D e SF).
Os resultados apresentados no Talale 1 mostraram que a quantidade de fenólicos totais,
flavonoides e capacidade antioxidante da hortelã japonesa foi influenciada pela falta de
macronutrientes em comparação com as cultivadas na solução nutritiva completa. As
deficiências de nitrogênio e fósforo não tiveram efeitos significativos no conteúdo fenólico

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 12/19

PeerJ
total, enquanto a deficiência de potássio proporcionou a quantidade significativamente mais
alta de fenólicos totais (4,68 - 0,39 mg GAE/g DW).
Além disso, as deficiências de nitrogênio e fósforo aumentaram significativamente o total de
flavonoides

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 13/19

PeerJ

Figura S Vazamento de eletrólitos e leituras de clorofila SPAD de folhas jovens e velhas de hortelã
japonesa cultivadas em solução com deficiência individual de macro e micronutrientes após o
transplante por 60 dias. (A, D) Vazamento de eletrólitos; (B, E) Leitura de clorofila SPAD de folhas
jovens; (C, F) Leitura de clorofila SPAD defolhas velhas. Os dados são as médias das amostras
replicadas.valores são médias .E. As barras
representam o erro padrão.
mall-si" DOI: If). "1 /t "rj. "s1/fib-5

(4,37 -i- 0,49 e 4,65 - 0,25 mg CE/g DW). las também tiveram um aumentosignificativo
na atividade de eliminação do radical DPPH (37,53 ,39% e 42,77 ,66%) em
comparaçãocom a CTRL (28,08 A0,30*/o), enquanto que a atividade foi
significativamente reduzida em plantas com deficiência de fósforo (23,91 - 0,96%).
Entretanto, a omissão da deficiência de macronutrientes não teve efeito significativo na
atividade de eliminação do radical ABTS. O cultivo da hortelã japonesa no sistema
hidropônico com limites de micronutrientes (Fe, Mn e Cu) por 60 dias após o transplante
não teve efeito sobre o conteúdo fenólico total e a atividade de eliminação do radical
ABTS, mas aumentou significativamente o conteúdo total de flavonoides (0,0051,
0,0062 e 0,0053 g CE/g DW, respectivamente). Além disso, a atividade de eliminação do
radical DPPH foi menor nas plantas com deficiência de ferro (20,34 -1- 0,36%) e maior
nas plantas com deficiência de cobre (32,71 - 0,95%) em comparação com
Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 14/19
PeerJ

Tabela 1 Teores totais de fenólicos, flavonoides e atividades de eliminação de radicais da hortelã japonesa cultivada sob o limite de um macro e
micronutrientes aos 60 dias após o transplante.

Tratamentos Fenólicos totais Flavonoides totais Radical DPPH Radical ABTS

conteúdo conteúdo limpeza limpeza
(mg GAE/g DW) (mg CE/g DW) atividade (%) atividade (%)
CTRL 3.20 - 0.21 ' 2.33 -I- 0.29' 28.08 -I- 0.30' 84.19 -I- 1.31""
Macronutrientes
-N 3.31 -1- 0.01" 4.37 -I- 0.49" 37.53 -I- 0.39' 88.79 -I- 0.55"
-P 2.77 A 0.41" 4.65 -I- 0.25'" 23.91 A 0.96*" 81.72 A 2.95""
-K 4.68 A 0.16" 3.75 -I- 0.15" 42.77 A 0.88' 90.06 A 0.21"
Micronutrientes
-Fe 2.40 - 0.04 ' 5.09 -I- 0.06" 20.34 -I- 0.36" 80.94 -I- 0.68"
-Mn 3.09 -L- 0.02' 6.19 -1- 0.19' 27.16 -1- 0.20'" S7.65 -1- 0.20'b
-Cu 2.50 - 0.21" 5.35 -I- 0.26" 32.71 0.95" 85.92 1.20""
Observações.
Os resultados são médias -i- S.E. de três réplicas. Letras maiúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas de acordo com o teste HSD de Tukey no nível de
0,03. DW, peso do chip; GAE, ec{tiiva1entes de ácido gálico; CE, equivalente de catequina; DPPH, atividade de eliminação do radical rac4ico 2, 2-difenil1- 1 -picrilhidrazil;
ABTS, atividade de eliminação do radical catiônico 2, 2'-aziiao-his-(fi- etilbenzotiazina-6-su1fonato).

aos do CTRL. Entretanto, a deficiência de manganês não teve efeito sobre a atividade de
eliminação do radical DPPH.
Nossos resultados encontraram a relação entre as respostas ao estresse (vazamento de
eletrólitos e danos ao aparelho de clorofila, conforme determinado pela leitura de clorofila
SPAD) e o mecanismo antioxidante [conteúdo fenólico total e flavonoide total e potenciais
antioxidantes (via ensaio DPPH e ABTS)], conforme mostrado na Tabela 2. Entre os
macronutrientes
A deficiência de ferro, fósforo e potássio apresentou correlação negativa entre a leitura de
clorofila SPAD e as atividades antioxidantes, o que indica um mecanismo de resposta
antioxidante ao estresse. No entanto, a deficiência de micronutrientes revelou a tendência
oposta ao ilustrar a correlação negativa entre o vazamento de eletrólitos e o potencial de
eliminação de radicais ABTS da hortelã sob estresse de ferro.

DISCUSSÕES
Efeitos da deficiência de macronutrientes individuais no crescimento de
japoneses
hortelã
A deficiência de nitrogênio geralmente afetava o crescimento da planta com sintomas de
clorose inicialmente nas folhas velhas em direção às folhas jovens. Mai's' finer (2012)
descreveu que o incidente foi devido à alta mobilidade do nutriente através do floema.
Esses resultados eram esperados, pois o nitrogênio desempenha um papel importante no
crescimento das plantas no que diz respeito à síntese dos principais
moléculas, incluindo proteínas, ácidos nucleicos, hormônios e clorofila (Hopkins fi miner,
2004). Além disso, os átomos de nitrogênio também fazem p a r t e do anel de porfirina n a
molécula de clorofila, que é quelada ao íon magnésio. A limitação de N é, portanto,
sintomatizada pela falta de verde,
basicamente devido à estrutura incompleta das clorofilas (6ur#erPilheutn , 2007).
Nossos resultados estão de acordo com BOllSs ldia ct al. (20 10) e Lily ct al. (2014), a maior
Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 15/19
PeerJ
redução no crescimento da planta com base na matéria seca também foi observada em
azeitona deficiente em nitrogênio e hortelã-pimenta jovem (Mentha piperita) em comparação
com o nutriente completo

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 16/19

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Tabela 2 Correlação entre as respostas ao estresse e o mecanismo antioxidativo da hortelã japonesa cultivada sob uma deficiência individual de
macro e micronutrientes aos 60 dias após o transplante.

Respostas ao
estresse
Antioxidante Vazamento de Leitura de clorofila SPAD
eletrólitos
respostas
Macronutrientes
-N -P -K -N -P -K
TPC r = -0.334 r - -0.327 r = -0.576 r = 0.629 r = 0.h54 r = -0.401
TFC r = -0.613 r = -0. 191 r = -0.315 r = 0,3 lñ r = - 1.000' r = -0.594
DPPH r = 0.645 r -- 0.463 r = -0. 117 r = -0.354 r=0904 r = - 1.000'
ABTS r = 0.969 r = -0.633 r = 0.491 r = -0.885 r=0622 r = 0.823
Micronutrientes
- Fe - Mn - Cu - Fe - Mn - Cu
TPC r = -0.969 r -- -0.828 r = 0.519 r = -0.624 r = -0.369 r = -0.969
TFC r = 0.67* r -- -0.934 r = 0.995 r = -0.399 r = -0.570 r = -0.641
DPPH r = -0.993 r -- 0.991 r = 0.877 r = -0.299 r = 0.743 r = -0.963
ABTS r = -0.999* r = -0.674 r = 0.098 r = 0.446 r = -0.973 r = -0.767
Observações.
r, coeficiente de correlação
*Correlação significativa no nível de 0,05.
TPC, teor de fenólicos totais; TFC, teor de flavonoides totais; DPPH, atividade de eliminação do radical 2, 2-diFheiiy1-1-picril-hidrazil; ABTS, atividade de eliminação do radical
catiônico 2, 2'-azino-his-(3-ethy1berizothiazo1ine- 6-sulfonate).

solução. Hârtensteiner-Feller (2002) descreveu que a inanição contínua de nitrogênio

causou a quebra dos ácidos nucléicos e das proteínas das folhas, que geralmente estão
associados à senescência das folhas.
Para a deficiência de fósforo, sintomas semelhantes aos mostrados em nossos resultados
também foram aparentes no manjericão doce e na lavanda, nos quais os limites de fósforo
afetaram negativamente o rendimento de matéria seca das folhas quando comparados
com as plantas cultivadas hidroponicamente na solução nutritiva completa (Borge5 €t nl.,
2016,' Chry'argyris, PanayiotouTzortznkis , 2016). Nessa mesma
pesquisa, os sintomas visuais também foram caracterizados por um verde mais escuro
nas folhas velhas e distribuídos para as folhas mais jovens devido à maior mobilidade dos
nutrientes. TDlZZei@er (2002) descreveu que esse incidente de coloração verde intensa
estava associado ao acúmulo de outros pigmentos. A diminuição da proporção entre
broto e raiz também foi observada em mudas de soja e bétula prateada (Betula pendular)
sob condições de limitação de fósforo (EriCSSON19,95, Fretleen, Rao H Tetn-y, 79S9). Os
pesquisadores insistiram que o menor rendimento de produção (relação broto-raiz) se
deveu ao aumento da partição de carboidratos para as raízes, indicado por um forte
aumento, particularmente na concentração de sacarose das raízes. Além disso, Mollies
fr/lrriri (1999) explicaram que a deficiência de fósforo no milho interrompeu o
crescimento dos brotos, levando a uma menor demanda por carboidratos, portanto, mais
carboidratos estão disponíveis para os sumidouros das raízes.
A redução no crescimento da hortelã japonesa e os sintomas de deficiência de potássio
foram semelhantes à observação em yarrow (Achillea millefolium L.), que limitou o
crescimento da planta com restrição de potássio por meio da diminuição da matéria seca

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total. Além disso, essa planta demonstrou pouco vigor e apresentou clorose nas bordas das
folhas velhas, seguida de sardas

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O potássio é um elemento importante na regulação do potencial osmótico nas células, o que é

evidente nos processos fisiológicos das plantas, como o transporte de soluto impulsionado
pela pressão no xilema e no floema e a abertura e o fechamento de solutos no xilema e no
floema. Assim, o potássio tem o papel principal na regulação do potencial osmótico nas
células, o que é evidente nos processos fisiológicos das plantas, como o transporte de soluto
impulsionado pela pressão no xilema e no floema e a abertura e o fechamento das células-
guarda do estômato. A quantidade de íons de potássio induz as mudanças no volume da
célula-guarda e na pressão osmótica que estão associadas à abertura do estômato (Humble H
Rascli ke, 1971, Ma itltttis, 2000). Entretanto, essa tendência não é comum. Em outro estudo,
a deficiência de potássio impede o transporte de açúcares para as raízes, o que normalmente
leva ao aumento da proporção entre broto e raiz (Calmat,Hen,!eler Marschner,I 994-,
Eri''son, I 995-, Gerordeuux ct al., 2009).

Efeitos da deficiência individual de micronutrientes no crescimento de

japoneses
hortelã
Nosso achado no tratamento de privação de ferro está de acordo com Was/i ct a/. (2018), que
observou um efeito depressivo na altura do broto, no peso seco e na taxa de crescimento
relativo do endro (Anethum graveolens L.) com deficiência de ferro cultivado em sistema
hidropônico em comparação com aqueles cultivados em solução nutritiva completa.
Marschner (2012) descreveu que a clorose interveinal das folhas jovens é o sintoma visível
mais óbvio da deficiência de ferro. Os sintomas de deficiência que aparecem primeiro nas
folhas jovens podem ser devidos à formação de compostos insolúveis de ferro com menor
mobilidade. O ferro é necessário para a integridade estrutural e funcional das membranas
dos tilacóides (Platt-Aloin, Thomson Terry, 1983),
bem como para a ferredoxina e a biossíntese da clorofila. A falta de Fe também foi explicada
pela sensibilidade do cloroplasto e d o tilacoide, o que resultou em uma clorose severa nas
plantas (6ur#cr/°i/firom , 2007).
O manganês é um micronutriente essencial com função de catalisador no complexo
de evolução do oxigênio do fotossistema II na fotossíntese (S''fimidr, |ensenHusted ,
2fi16). As plantas com deficiência de manganês apresentaram clorose interveinal,
refletindo o distúrbio da fotossíntese, que só é visível quando a planta está severamente
estressada. Nosso resultado,
A hortelã japonesa pareceu ter um crescimento normal, o que está de acordo com os
resultados deNeves, 19c Sri beC ii valho (2004), que também avaliaram a deficiência de
manganês em mudas de umbuzeiro (Spondias tuberosa L.).
O resultado da deficiência de cobre contrastou com o resultado da pesquisa em yarrow
com deficiência de cobre, a matéria seca total não foi afetada, enquanto o conteúdo total
de clorofila foi reduzido (Alvai engg ct al., 2fi75). De acordo com Toiz U Zeiger (2002),
o cobre faz parte de enzimas como a plastocianina, que está envolvida na transferência
de elétrons durante as reações de luz da fotossíntese. A distorção das folhas jovens, a
clorose e a necrose que começam no meristema apical e se estendem até as margens da
folha, o branqueamento das folhas jovens são sintomas visuais típicos da deficiência de
cobre (. ominer, 1945).

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 19/19

PeerJ
Mecanismo de defesa contra a deficiência de macro e micronutrientes
As plantas precisam de um equilíbrio rigoroso de absorção, utilização e armazenamento de
elementos minerais para a homeostase iônica adequada. As atividades de resposta biológica
nas plantas ocorrem nas membranas celulares durante ambientes desfavoráveis, o u seja,
estresse por seca, estresse por sal e estresse por nutrientes (Sfi bn/n, 2fi7 Z). Esses estresses
induzem ROS, levando a danos oxidativos de

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 20/19

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biomoléculas (lipídios, proteínas e DNA), perda da integridade da membrana celular e

ativação da morte celular programada (Apel H Hirl, 2004,-Das Roy'houdhurl, 2fi14).
Além disso, a reação da luz na fotossíntese, que compreende tanto a transferência de energia
quanto o transporte de elétrons, também é acompanhada pela formação de ROS. O
fotossistema II atua como um centro de reação altamente oxidante quando absorve a energia
da luz que as plantas acessam na fotólise para ganhar elétrons de volta das moléculas de água,
fornecendo assim oxigênio como subproduto (Cokmat fi KirkfiJ, 2008, - doctor, Reichheld
Foher, 2018). Em circunstâncias normais, a planta estabelece um
sistema de eliminação para desintoxicar essas ROS (Foyer c*- 8higcoka, 2017). No entanto,
durante condições de estresse severo, o sistema normal de eliminação é insuficiente para
eliminar a formação de ROS em excesso, o que pode causar danos oxidativos aos ácidos
graxos poliinsaturados n o envelope do cloroplasto e no complexo de proteínas
fotossintéticas (Bill-Tuteja , 2010; V#auna- Chopt a, 2012). Portanto, a extensão do estresse
pode ser justificada pelo grau de estabilidade da membrana, que pode ser avaliada pelo
vazamento de eletrólitos das células (Blokhina, Virolainen H Fa¿erstcdt, 200,5 -, Cliatttrvedi,
5inch Bahadur,2012-, Levitt, 19â0) ou danos
ao aparato de clorofila, conforme descrito pela redução do conteúdo total de clorofila
(Posp/'i/, 2016,- Swaptia H $ hylaraj, 20 7).
A leitura de clorofila SPAD foi sugerida como uma avaliação rápida do conteúdo de
clorofila, bem como um indicador de estresse durante o crescimento da planta (izinSrew
'irr, 2001, -Minolt'i, 1989°, Netto et al., 2003). As leituras SPAD fi25
indicaram a diminuição da fotossíntese das folhas em plantas arbóreas como o bordo
sicômoro (Acer pseudoplatanus), o carvalho (Queries robur) e a faia (Fagus sylvatica)
(Perrivu/, WearyMovies , 2008). No entanto, Netto et al. (200c") informaram que os valores
SPAD <40 estavam correlacionados com a redução da eficiência fotossintética em folhas de
café. Roosta, £'tajiNiknam (201 S) informaram que a privação de ferro foi mais destrutiva
para o aparato fotossintético do que a de zinco e manganês em alface de diferentes cultivares.
O vazamento excessivo de eletrólitos também sugeriu danos à membrana e morte celular
programada em folhas de Arabidopsis com deficiência de ferro (Msilini et al., 2009).
Foi demonstrado que muitas formas de estresse ambiental aumentam os níveis de
ROS nas células vegetais. Para proteger as células contra o efeito tóxico das ROS, as plantas
têm mecanismos antioxidantes complexos que envolvem compostos antioxidantes
enzimáticos e não enzimáticos (Nlittlei', 2002). Os fenilpropanóides e os flavonóides
desempenham papéis importantes nas plantas, associados a várias funções relacionadas
ao estresse, incluindo a eliminação de ROS reativas (Dixon Paivn, 1995, - uzuki ct nl.,
2012). Os compostos fenólicos são acumulados por meio do metabolismo
fenilpropanoide pela fenilalanina amonialiase (PAL), a principal enzima induzida por
vários estresses abióticos (Soleckn, 1997). Para determinar a atividade antioxidante, os
métodos de ABTS '+ e DPPH são os mais comumente usados. Ambos são
caracterizados pela excelente reprodutibilidade em determinadas condições de ensaio
(WordRio, Oszminñski Czeinerys, 2007). A hortelã japonesa deficiente em
macronutrientes não teve efeito sobre o mecanismo antioxidativo detectado pelo ensaio de
eliminação do radical ABTS. Resultados semelhantes foram observados por Nguyen,
Kwec Niemcher ) em manjericão cultivado com limites no tratamento de

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potássio (nível de 1,0 mM de K) em cultura de areia.
Os micronutrientes desempenham um papel importante como cofatores de enzimas
metabólicas. Esses cofatores são reativos redox, o que é a base para sua ocorrência como
cofatores cataliticamente ativos em muitas metaloenzimas (H'dnsch-Mendel , 20fiP).
Em outro estudo, o ferro é necessário para

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muitas enzimas antioxidantes, pois é um importante catalisador de reações de

transferência de elétrons (f'orih rr a/., i 955; fas/i rr u/., 20i S). Foi encontrada uma
correlação negativa entre a resposta ao estresse e o mecanismo antioxidativo para a
hortelã japonesa com deficiência de ferro. Para essa explicação, estimamos que na época
da colheita comercial (60 dias), a planta estressada pode passar por desintoxicação ou
recuperação por inanição (foyer fi Sfii,qeokn, 2fi7 1; hon, die,2fi79).

CONCLUSÕES
O presente estudo demonstrou que as deficiências de macro e micronutrientes n a
hortelã japonesa cultivada em hidroponia se manifestaram como sintomas visuais de
deficiência. Os elementos mais limitantes de macro e micronutrientes são o potássio e o
ferro, que apresentaram uma redução adversa dos padrões de crescimento das plantas em
comparação com as plantas cultivadas com a solução nutritiva completa. A omissão de P,
K e Fe também pode induzir a uma condição de estresse oxidativo que prejudica a
estabilidade da membrana celular e o aparato de clorofila. O acúmulo de compostos
antioxidantes não enzimáticos, fenólicos e flavonoides, foi aprimorado juntamente com o
aumento da atividade de eliminação do radical DPPH. Isso mostrou o mecanismo de
defesa da planta em condições de deficiência de nutrientes. As descobertas aqui relatadas
serão valiosas para apoiar o cultivo ideal da hortelã japonesa no sistema hidropônico.
Pesquisas futuras se concentrarão nesses macro e micronutrientes específicos com a
biossíntese de terpenoides (mentol) de alta demanda comercial.

AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer ao Khun Pae Royal Project, Chiang Mai, e ao Mae-Hia
Agricultural Research, Demonstrative and Training Centre, Faculty of Agriculture, Chiang
Mai University, por seu gentil apoio.

INFORMAÇÕES E D E C L A R A Ç Õ E S ADICIONAIS

Financiamento
Esta pesquisa recebeu apoio financeiro da Universidade de Chiang Mai e da Escola de
Pós-Graduação da Universidade de Chiang Mai para a bolsa de pesquisa de Chananchida
Janpen. Os financiadores não tiveram nenhuma participação na concepção do estudo, na
coleta e análise de dados, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito.

Divulgação de subsídios
As seguintes informações sobre subsídios foram divulgadas pelos
autores: Universidade e Escola de Pós-Graduação de Chiang Mai.
Universidade de Chiang Mai para bolsa de pesquisa.

Interesses conflitantes
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Janpen et al. (2019), PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7751 23/19

PeerJ

Contribuições dos autores

• Chananchida Janpen realizou o s experimentos, analisou os dados, preparou as figuras
e/ou tabelas, escreveu ou revisou os rascunhos do artigo, aprovou o rascunho final.
• Naruemon Kanthawang realizou os experimentos.
• Chaiartid Inkham concebeu e projetou os experimentos, foi o autor ou revisou os
rascunhos do artigo.
• Fui Ying Tsan foi o autor ou revisou as versões preliminares do artigo.
• Sarana Rose Sommano concebeu e projetou os experimentos, contribuiu com
reagentes/materiais/ferramentas de análise, escreveu ou revisou os rascunhos do artigo,
aprovou o rascunho final.

Disponibilidade de dados
As seguintes informações foram fornecidas com relação à disponibilidade de dados:
Os dados de medição estão disponíveis no figshare: Janpen, Chananchida (2019):
Physiological responses of hydroponically-grown Japanese Mint under nutrient deficiency
(Respostas fisiológicas da hortelã japonesa cultivada hidroponicamente sob deficiência de
nutrientes). figshare.
Conjunto de dados. lattps://doi.ord/10.ti084/m9.figshare.9199913.v1.

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