Microscopia Óptica

Fundamentos e princípios de formação de imagens

Prof. Marcos A. B. Lima

Área de Microbiologia/ DB-UFRPE
 TIPOS DE MICROSCOPIA

1. Óptica
Medem refração, difração e reflexão da fonte de
radiação e usa luz branca, luz fluorescente ou laser.

2. Eletrônica
Medem refração, difração e reflexão da fonte de
radiação e usa radiação eletromagnética/ feixes de
elétrons.

3. Varredura por sonda (Scanning probe)

A varredura usa uma sonda física para interagir com a
superfície da amostra.
 TIPOS DE MICROSCOPIA

Light Elétrons Probe

O que é luz?

b)
a)
Luz é radiação eletromagnética. O que nós comumente descrevemos como
luz é apenas o espectro visível desta radiação com comprimentos de onda
entre 400nm and 700nm. A partícula elementar que constitue a luz é o
fóton.

Há 3 dimensões básicas da luz:

a) Intensidade (amplitude) – relacionada a percepção de brilho
b) Frequencia (comprimento de onda) - relacionada a percepção de cor
c) Polarization (ângulo de vibração) – Não é perceptível aos humanos
 Vermelho (700 nm)  Violeta (400 nm)

A luz branca pode ser separado pela dispersão em um prisma.

Propriedades da luz

 Refração
 Reflexão
 Difração/Número de Abertura
 Refração

 Mudança na direção da
onda de luz devido a
uma mudança na
velocidade,
 O canudo na imagem
parece dobrado porque
a luz está se curvando
enquanto se move da
água para o ar.
 Índice de Refração

 IR de um material é uma
medida da velocidade da luz
neste material.
 IR é a razão entre a
velocidade da luz no vácuo e
a velocidade da luz no
material especificado.
 O ângulo de incidência (θ1)
está relacionado ao ângulo de
refração (θ2) pela Lei de
Snell.
 n1sin(θ1)=n2sin(θ2)
 Usado no cálculo do poder de
foco das lentes e nas
propriedades de dispersão
dos prismas.
Refração em diferentes materiais
Valores de índices de refração de alguns meios materiais
 Reflexão

 A reflexão é definida
como uma mudança na
direção de uma onda em
uma interface entre dois
meios diferentes, de
modo que a onda retorna
ao meio da qual ela veio.
 Tipos de Reflexão

J. Flammer et al., Basic Sciences in Ophthalmology, DOI 10.1007/978-3-642-32261-7_2, © Springer-

Verlag Berlin Heidelberg 2013
 OUTRAS INTERAÇÕES LUZ – MATÉRIA

J. Flammer et al., Basic Sciences in Ophthalmology, DOI 10.1007/978-3-642-32261-7_2, © Springer-

Verlag Berlin Heidelberg 2013
 Contraste
Contraste é definido como a diferença na intensidade
da luz entre o espécime e o segundo plano (fundo) adjacente
em relação a intensidade do segundo plano (fundo) total.
O microscópio óptico convencional de
campo claro

 Problema: Muitas células são transparentes e

incolores.
◦ Visualizasão de estruturas  Usar corantes
◦ Deve-se preservar  fixar, embeber, cortar (se for
o caso)
 Novos problemas  As ações anteriores
◦ Alteram as moléculas e a estrutura celular
 Microscópio óptico convencional
É um instrumento óptico que possui uma ou mais
lentes que produzem uma imagem aumentada de um objeto.

Focal plane Image plane

Image plane

Objective Tube lens Eyepiece

lens lens

Modern microscope with ICS

(Infinity Colour corrected System)

Microscópio composto clássico

PARTES DO MICROSCÓPIO ÓPTICO
OCULARES

BRAÇO

OBJETIVAS

PINÇA

PARAFUSO
MACROMÉTRICO
PLATINA

PARAFUSO
CONDENSADOR MICROMÉTRICO

LÂMPADA

BASE
SISTEMA DE ILUMINAÇÃO POR TRANSPARENCIA

Specimen

Condenser lens

Aperture diaphragm

Diafragma de campo
Controla a área iluminada.
Diafragma da condensadora
Controla o angulo do cone de luz.

Field diaphragm

Filament
 LIMITE DE RESOLUÇÃO X NÚMERO DE ABERTURA

O limite de resolução corresponde a menor

distancia entre dois pontos em que eles ainda podem ser
distinguidos separadamente. Logo, o poder de resolução
do microscópio corresponde aos menores limites de
resolução possíveis. Assim,

d=Kxλ K é uma constante (0,61), λ é o comprimento

N.A de onda utilizado (luz, eletrons, etc..) e N.A é
o número de abertura da lente objetiva.

O N.A sempre vem especificado

em uma boa objetiva.
 LIMITE DE RESOLUÇÃO X NÚMERO DE ABERTURA

Se vc for comprar um microscópio e estiver em dúvida entre

um que possui a lente objetiva de 100X escrito N.A = 0,75 e
outro com N.A =1,4, qual seria o melhor?
Considerando λ = 550 (região central do espectro visível).
 Número de abertura
 N.A de uma objetiva é uma
medida de sua habilidade de
coletar luz light.
 Quanto mais luz (maior
N.A), melhor o poder de
resolução da lente
 N.A = (n)sin(θ)
◦ n = Índice de refração
◦ θ = ½ do angulo do cone
de luz máximo que pode
entrar na lente objetiva
 Usualmente o N.A de uma
objetiva aumenta com seu
poder de ampliação.
 Número de Abertura e NÃO a
ampliação que determina a resolução!
Resolution of 0.175µ Bead Pair

1.1
1.0
0.9
Normalized Intensity

0.8 1.4 NA
0.7
0.6
0.5
0.4
0.7 NA
0.3
0.2
0.1
0.0
0.07
0.22
0.37
0.51
0.66
0.81
0.96
1.10
-1.10
-0.96
-0.81
-0.66
-0.51
-0.37
-0.22
-0.07

Microns

Aumentando N.A

Uma lente com uma N.A maior será capaz

de visualizar maiores detalhes e também
coletará mais luz e dará uma imagem mais
brilhante do que uma lente com menor N.A.
 EXEMPLO DE LIMITE DE RESOLUÇÃO:
É A MENOR DISTÂNCIA QUE DEVE EXISTIR ENTRE DOIS PONTOS PARA QUE ELES APAREÇAM INDIVIDUALIZADOS.

LEVEDURAS

HEMÁCIAS

CÉLULAS TUBULARES
DO EPITÉLIO RENAL

O QUE DETERMINA, A RIQUEZA DE DETALHES DA IMAGEM

FORNECIDA POR UM SISTEMA ÓPTICO É O SEU LIMITE DE
RESOLUÇÃO, E NÃO O SEU PODER DE AUMENTAR O
TAMANHO DO OBJETO.
 LIMITE DE RESOLUÇÃO X COMPRIMENTO DE ONDA

Quanto menor o comprimento de onda melhor a

resolução. O microscópio eletrônico, que utiliza elétrons
(λ = 0,2 ηm), tem como limite de resolução 0,2 ηm.

Limites de Resolução

Olho humano...........................0,2 mm
Microscópio óptico...................0,2 µm
Microscópio eletrônico.............0,2 ηm
Microsc. Tunelamento..............0,2 Å

O poder de resolução é inversamente proporcional ao

limite de resolução. O melhor microscópio possui o maior
poder de resolução.
 COMPONENTES ÓPTICOS

Oculares
É uma lupa. Há microscópios com uma ou duas
oculares. No seu interior lente de campo, diafragma e ocular
propriamente dita.
 COMPONENTES ÓPTICOS

Objetivas
Constituem a parte mais
importante do microscópio. A
resolução e a maior parte da imagem
final dependem das lentes objetivas.
São formadas internamente por várias
lentes.

Tipos:

Há vários tipos de objetivas que se diferenciam pela

qualidade da imagem, correção de aberrações e preço.
 COMPONENTES ÓPTICOS

Tipos de Objetivas:

1. Acromáticas - São as mais simples e baratas. São

aquelas sem nenhuma sofisticação e que os microscópios
comuns possuem.

2. Semi-Apocromáticas – Também chamadas de Fluorita,

pois este material entra na sua construção, dão alguma
correção de aberrações.

3. Apocromáticas – Possuem correção ampla. Abrangem

todo o espectro.

4. Planacromáticas – São corrigidas para a curvatura de

campo.
 COMPONENTES ÓPTICOS

Tipos de Objetivas:

5. Planapocromáticas – São as melhores objetivas.

Caríssimas. Combinam as correções das planacromáticas
com as apocromáticas.
 ESPECIFICAÇÕES DAS OBJETIVAS E SUAS AMPLIAÇÕES

AMPLIAÇÃO TOTAL
OBJETIVAS
(VER SEMPRE AS
(COM OCULAR DE 10X)
OCULARES)

04 x 40 X

10 x 100 X

40 x 400 X

100 x
1000 X
(Sempre usar com óleo de Imersão)
EFEITO DO ÓLEO DE IMERSÃO
EFEITO DO ÓLEO DE IMERSÃO
 TIPOS DE ABERRAÇÕES MAIS COMUNS

1. Aberração esférica

Os raios luminosos ao atravessarem a lente sofrem desvio

devido a curvatura da lente. Logo, os raios não se
encontrarão em um só ponto que deveria ser o ideal.

A correção é feita combinando diferentes lentes (com

diferentes curvaturas) e materiais.
 1. Aberração esférica

A aberração esférica faz com que os feixes

paralelos, mas afastados do eixo da lente,
sejam focalizados em um local ligeiramente
diferente do que os feixes próximos ao eixo.
Isso se manifesta como um borrão da imagem.
 2. Curvatura de campo

A curvatura de campo é decorrente das lentes que

fornecem imagens curvas de objetos planos. O microscopista
ao observar um objeto plano precisa mudar a focalização ao
passar de um ponto central para outro junto à borda do
campo.
 Obrigado!

mablima33@yahoo.com.br