Small Molecule Inhibitors of Chikungunya Virus Mechanisms of Action and Antiviral Drug Resistance

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com
MINIREVISÃO
cruz
Inibidores de moléculas pequenas do vírus Chikungunya: mecanismos de

ação e resistência a medicamentos antivirais
Cristina Kovacikova,a Martin J. van Hemerta
aDepartamento de Microbiologia Médica, Centro Médico da Universidade de Leiden, Leiden, Holanda
ABSTRATOO vírus Chikungunya (CHIKV) é um alfavírus transmitido por mosquitos que se espalhou
por mais de 60 países em todo o mundo. A infecção por CHIKV leva a uma doença febril conhecida
como febre chikungunya (CHIKF), que é caracterizada por dores articulares e musculares
duradouras e debilitantes. O CHIKV pode causar epidemias em grande escala com altas taxas de
ataque, o que substancia a necessidade de desenvolvimento de terapêutica eficaz e adequada para
a contenção de surtos. Nesta revisão, destacamos as diferentes estratégias utilizadas para o
desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas do CHIKV, desde triagem baseada em células
de alto rendimento atéem sílicotelas e ensaios enzimáticos com proteínas virais purificadas.
Discutimos ainda o status atual das moléculas mais promissoras, incluindoem vitroena Vivofi
descobertas. Em particular, nos concentramos na descrição de alvos hospedeiros e/ou virais, modo
de ação e mecanismos de resistência a medicamentos antivirais e mutações associadas. O
conhecimento dos principais determinantes moleculares da resistência aos medicamentos ajudará
na seleção do(s) agente(s) antiviral(is) mais promissor(es) para uso clínico. Por estas razões, também
resumimos a informação disponível sobre fenótipos resistentes a medicamentos emAedes
mosquitos vetores. A partir desta revisão, é evidente que mais moléculas ativas precisam ser
avaliadas em modelos pré-clínicos e clínicos para abordar a atual falta de tratamento antiviral para
CHIKF.
PALAVRAS-CHAVEantivirais de ação direta, antivirais direcionados ao hospedeiro, resistência a

medicamentos, alvo viral, triagem de alto rendimento, ensaios enzimáticos,em sílicotriagem,na Vivo
validação, vírus chikungunya
Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

C O vírus hikungunya (CHIKV) é um alfavírus transmitido por mosquitos pertencente à
famíliaTogaviridaefamília que pode causar epidemias explosivas de artrite aguda e
crônica em humanos. Os principais vetores responsáveis pela sua transmissão são os
diurnosAedes aegyptieAedes albopictusmosquitos. O CHIKV foi isolado pela primeira vez de
um paciente febril em 1952/1953, onde hoje é a Tanzânia (1). Nos anos seguintes, causou
surtos locais periódicos na África e na Ásia. Em 2004, o CHIKV ressurgiu na costa do Quênia
(2), de onde se espalhou para populações imunologicamente ingênuas na Ilha da Reunião e
nas ilhas vizinhas do Oceano Índico e no Sul da Ásia durante 2005 a 2006. Durante este surto, CitaçãoKovacikova K, van Hemert MJ. 2020. Inibidores
uma nova variante do CHIKV abrigando o aminoácido A226V a substituição ácida na de moléculas pequenas do vírus chikungunya:
mecanismos de ação e resistência a medicamentos
glicoproteína E1 foi isolada (3), e esse isolado foi transmitido de forma mais eficiente pelo
antivirais. Agentes Antimicrobianos Quimioterapia
Aedes albopictusmosquitos que são abundantes nas regiões temperadas das Américas, 64:e01788-20.https://doi.org/10.1128/AAC . 01788-20.
Europa e África do que os isolados anteriores. No final de 2013, o CHIKV causou o primeiro
surto transmitido localmente na ilha caribenha de St Martin (4), resultando em mais de 2,5 direito autoral© 2020 Kovacikova e van Hemert.
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob
milhões de casos na América Central e do Sul no período entre 2014 e 2017 (https://
os termos daLicença Creative Commons Atribuição
www.paho.org/hq/index.php?option-com_topics&view-rdmore& 4.0 Internacional.
cid-5927&Itemid-40931&lang-en). Na Europa, o primeiro surto autóctone foi descrito em Itália Endereço de correspondência para Martijn J. van
Hemert, MJvan_Hemert@lumc.nl .
em 2007 (5) e desde então ocorreu uma nova transmissão de CHIKV em Itália em 2017 (6) e
Manuscrito aceito publicado online14 de
no sul de França em 2010, 2014 e 2017 (7–9).
setembro de 2020
A febre Chikungunya (CHIKF) geralmente começa com um início súbito de febre 3 a 7 dias após a Publicados17 de novembro de 2020
picada de um mosquito infectado, seguido por sintomas como erupção cutânea, mialgia e
Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia aac.asm.org1

Minirevisão Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia
poliartralgia. A poliartralgia é principalmente simétrica e periférica, afetando as pequenas

articulações dos punhos, tornozelos e falanges, bem como as articulações maiores, como joelho e
cotovelo (10). Os pacientes geralmente relatam dor incapacitante que pode durar semanas a meses.
O tratamento da CHIKF tem se concentrado inteiramente no alívio dos sintomas dos pacientes com
analgésicos, antipiréticos e agentes antiinflamatórios. No entanto, alguns destes medicamentos
podem ter efeitos secundários graves após uso prolongado. A atual falta de terapêutica
clinicamente aprovada e de medidas de controle adequadas para CHIKF justifica o desenvolvimento
de uma terapia antiviral segura e eficaz.
Nesta revisão, uma visão abrangente dos inibidores de moléculas pequenas do CHIKV é apresentada
nas Tabelas 1 a 4, agrupados pela abordagem pela qual foram identificados. As Tabelas 1 e 2 listam os
inibidores que foram identificados por triagem baseada em células, a Tabela 3 lista os compostos
identificados porem sílicoabordagens, e a Tabela 4 lista compostos que foram identificados em ensaios
enzimáticos. Observe que os valores apresentados nas Tabelas 1 a 4 não são diretamente comparáveis, pois
os parâmetros/configurações experimentais diferiram entre os estudos, por exemplo, o uso de diferentes
isolados de vírus, multiplicidades de infecção (MOIs), leituras (efeito citopático [CPE] versus títulos versus
PCR quantitativo em tempo real [qRT-PCR]), tempos de colheita e tipos de modelos de camundongos. Como
esta revisão se concentra em inibidores de moléculas pequenas, não incluímos abordagens de
silenciamento de genes mediados por pequenos RNAs interferentes (siRNA).
ESTRATÉGIAS PARA DESCOBERTA E PROJETO DE MEDICAMENTOS ANTI-CHIKV
Considerando a distribuição global do CHIKV e dos seus mosquitos vetores, o potencial de propagação adicional e o
impacto na saúde humana, é imperativo o desenvolvimento de medidas preventivas. Várias abordagens têm sido usadas para
identificação de potenciais inibidores de CHIKV, incluindo campanhas de triagem de alto rendimento (HTS) baseadas em
células, design de medicamentos racionais e baseados em estrutura usando estruturas cristalinas e modelagem de homologia
de proteínas virais. Uma das abordagens convencionais para a descoberta de medicamentos para o CHIKV utiliza triagem
baseada em células com leituras que medem o CPE induzido pelo vírus. As telas do ensaio de redução de CPE podem fornecer
informações sobre a atividade antiviral dos compostos, e sua citotoxicidade pode ser avaliada em paralelo usando células não
infectadas na mesma placa. Tais triagens são frequentemente implementadas para testar medicamentos conhecidos
clinicamente aprovados, em um processo conhecido como reaproveitamento de medicamentos. As vantagens desta via são a
diminuição dos custos relacionados com a aprovação do medicamento e um processo acelerado que conduz ao potencial
licenciamento do composto. Devido ao aumento do poder computacional, o HTS emergiu recentemente como um processo
eficiente para triagem de milhares de compostos de grandes bibliotecas de compostos, incluindo moléculas novas e aprovadas
pela FDA. O surgimento do design de medicamentos auxiliados por computador também contribuiu muito para o

desenvolvimento de inibidores do CHIKV. Essas abordagens são baseadas na estrutura de uma proteína viral para realizar O
HTS surgiu recentemente como um processo eficiente para triagem de milhares de compostos de grandes bibliotecas de
compostos, incluindo moléculas novas e aprovadas pela FDA. O surgimento do design de medicamentos auxiliados por
computador também contribuiu muito para o desenvolvimento de inibidores do CHIKV. Essas abordagens são baseadas na
estrutura de uma proteína viral para realizar O HTS surgiu recentemente como um processo eficiente para triagem de milhares
de compostos de grandes bibliotecas de compostos, incluindo moléculas novas e aprovadas pela FDA. O surgimento do design
de medicamentos auxiliados por computador também contribuiu muito para o desenvolvimento de inibidores do CHIKV. Essas
abordagens são baseadas na estrutura de uma proteína viral para realizarem sílicotelas virtuais. Compostos identificados por
em sílicoa triagem baseada em computador pode ser otimizada ainda mais através da aquisição de uma compreensão da
relação estrutura-atividade do composto (SAR), e derivados melhorados podem ser sintetizados para validação em ensaios
enzimáticos e baseados em células. No entanto, a utilidade do design auxiliado por computador para compostos direcionados à
replicase do CHIKV é limitada porque, até o momento, apenas as estruturas da região N-terminal e da região C-terminal da
proteína não estrutural 2 (nsP2), representando a RNA helicase e a protease domínios, respectivamente, e o macrodomínio N-
terminal do nsP3 foram resolvidos (11–13). Mais oportunidades para estudos de acoplamento molecular surgem a partir de
análises de proteínas estruturais do CHIKV, à medida que as estruturas das proteínas do envelope (E) e da proteína do capsídeo
(C) foram determinadas. Embora as estruturas cristalinas para nsPs completos do CHIKV ainda não estejam disponíveis, os
pesquisadores usaram vários métodos de purificação para obter nsPs recombinantes enzimaticamente ativos para uso em
ensaios livres de células. Validação de compostos originados de em sílicotelas virtuais em ensaios enzimáticos realizados com
proteínas purificadas são especialmente importantes para confirmação da especificidade do alvo. Em ensaios baseados em
células, a seleção de resistência na presença de (concentrações subótimas de) um composto tem sido amplamente utilizada
para identificar o alvo viral de tais compostos. As Tabelas 1 e 2 fornecem uma visão abrangente de todas as mutações de
resistência que foram identificadas até agora,
Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 aac.asm.org2

Minirevisão
TABELA 1Compostos direcionados à entrada e saída do CHIKVa
Dezembro de 2020
Em vitroeficácia Na Vivoeficácia
Viral Resistência CE50(-M) ou outra Cepa CHIKV Rato

Compostob alvo mutação(ões) Cepa CHIKV (genótipo)c leiturad CC50(-M) Linha celular (genótipo) Eficácia modelo Referências)
Volume 64
Obatoclax (R) E1 L369I (SFV) LR2006 OPY1 (genótipo ECSA) 0,03 - 0,01 20,1 - 4,8 BHK-21 - - - 21
Arbidol E2 G82R LR2006 OPY1 (ECSA) 12,2 - 2,2 376 MRC5 - - - 22
Suramina (R) E2 N5R, H18Q CHIKV-LS3 79 - 11,6 1.000 VeroE6 0611aTw, 0810bTw, Carga viral reduzida, C57BL/6 25, 28, 29
Edição 12
0706aTw (asiático) inchaço nos pés e
lesões histopatológicas
Ácido picolínico C - DRDE-07 (ECSA) 60% de inibição com ns Vero - - - 30
Dose de 2 mM
e01788-20
Amantadina 6k - S27 (ECSA) 29,5 200 Vero - - - 32
Cloroquina (R) - - DRDE-06 (ECSA) 7,0 - 1,5 260 Vero - - - 38
Doxiciclina (R) - - ns (ECSA) 10,95 - 2,12 100 Vero 061573 (ECSA) Nenhuma redução significativa RCI 39
em título viral
ou patologia
Curcumina - - LR06-049 (ECSA) 3,89 11.6 HeLa - - - 41
Niclosamida - - S27 (ECSA) 0,95 - 0,22 20 BHK-21 - - - 42
Nitazoxanida - - S27 (ECSA) 2,96 - 0,18 25 BHK-21 - - - 42
Apigenina - - LR2006 OPY1 (ECSA) 70,8 200 BHK-21 - - - 43
FL3 - - Isolado clínico (ECSA) 0,0224 0,119 HEK-293T - - - 44
aCC50, concentração citotóxica de 50%; CE50, concentração eficaz de 50%; ns, não especificado; —, não determinado/não realizado (na Vivoestudos); R, composto reaproveitado. A numeração das mutações que fornecem resistência é
com base na sequência do genoma do CHIKV da cepa indicada na tabela, salvo indicação em contrário.
bSe o estudo descreveu uma família/classe de compostos com atividade antiviral, apenas a atividade antiviral do composto mais potente e/ou mais representativo é relatada.
cApenas estão incluídos compostos para os quais a atividade antiviral foi testada utilizando CHIKV infeccioso; os compostos identificados utilizando apenas sistemas replicon/substitutos para os quais faltavam experiências confirmatórias com CHIKV
infeccioso são excluídos.
dQuando um composto mostrou atividade em múltiplas linhas celulares e contra múltiplas cepas de CHIKV, o valor correspondente à melhor atividade (com a linha celular correspondente) é relatado.
aac.asm.org3
Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia

MESA 2Compostos direcionados à replicação do CHIKVa
Minirevisão
Viral Resistência Cepa CHIKV CE50(-M) ou CC50 Cepa CHIKV
Dezembro de 2020
Compostob alvo mutação(ões) (genótipo)c outra leiturad (-M) Linha celular (genótipo) Eficácia Modelo de rato Referências)
MADTP-314 (N) (DA) nsP1 P34S IO 899 (ECSA) 26 - 11 743 Vero - - - 53–55
CHVB-032 (N) (DA) nsP1 S454G, W456R IO 899 (ECSA) 2.7 75 Vero - - - 56, 57
6=---Fluoro-homoaristeromicina nsP1 G230R, K299E CHIKV-LS3 0,12 - 0,04 250 VeroE6 - - - 58, 59
Volume 64
(N, NA) (DA)
6=-Fluoro-homoneplanocina A nsP1 G230R, K299E CHIKV-LS3 0,18 - 0,11 250 VeroE6 - - - 59
(N, NA) (DA)
Edição 12
Difluorometilornitina (R) nsP1 G230R, V326M LR06-049 3 registro10redução 500 BHK-21 LR06-049 Redução modesta em C57BL/6 60, 61, 121
(HT) (nsP1) (ECSA) em título com (ECSA) Títulos de CHIKV
* 524R (nsP3) 500-Dose M

Ácido micofenólico (R) (HT) nsP1 S23N, V302M DRDE-06 (ECSA) 0,21 - 0,06 30 - 3,1 Vero - - - 62, 63, 65
e01788-20
(SINV)
Ribavirina (NA) (HT/DA) nsP1/ (Q21K), S23N, Ross C347 341,1 30.000 Vero - - - 63, 99, 104
nsP4 V302M (ECSA)
(INVSIN)/C483Y
(CHIKV)
Sofosbuvir (NA) (DA) nsP4 - ns (asiático) 2,7 - 0,5 402 - 32 Huh-7 ns CHIKV reduzido Webster Suíço 94
edema induzido rato
e viral artralgia
replicação modelo
- -D-N4-hidroxicitidina (NA) nsP4 P187S, A189V, LR2006 OPY1 0,2 - 0,1 7.7 Vero - - - 95, 96
(DA) I190T (VEEV) (ECSA)
Favipiravir (NA) (DA) nsP4 K291R IO 899 (ECSA) 25 - 3 636 Vero-A S27 (ECSA) Mortalidade reduzida AG129 letal 97
em 50% e modelo
doença melhorada
resultado
IO 899 (ECSA) Viral reduzido C57BL/6J 98
replicação em
articulações e
extremidades durante
fase aguda
Digoxina (R) (HT) nsP4 V209I SL15649 (ECSA) 0,048 10 U2OS - - - 100
HS-10 (HT) nsP4 - Ross (ECSA) 2 registros10 100 HEK-293T DMERI09/08 Reduzido SvA129 101
redução (ECSA) inflamação e
título com viremia
6,25-Dose M
SNX-2112 (HT) nsP4 - Ross (ECSA) 2 registros10 100 HEK-293T DMERI09/08 Reduzido SvA129 101
redução (ECSA) inflamação e
título com viremia
6,25-Dose M
6-Azauridina (R) (NA) (HT/DA) - - Ross C347 0,8 208 Vero - - - 104
(ECSA)
(Continua na próxima página)
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MESA 2(Contínuo)
Minirevisão
Viral Resistência Cepa CHIKV CE50(-M) ou CC50 Cepa CHIKV
Dezembro de 2020
Compostob alvo mutação(ões) (genótipo)c outra leiturad (-M) Linha celular (genótipo) Eficácia Modelo de rato Referências)
RYL-634 - - ns 0,26 2,5 Vero - - - 105
Atovaquona (R) - - LR06-049 0,75 11h25 Verão - - - 106
(ECSA)
Volume 64
Berberina - - LR2006 OPY1 5 registros10 100 BHK-21 LR2006 OPY1 Reduzido C57BL/6J 107, 109
(ECSA) redução (ECSA) inflamação e
título com 3- inchaço nas articulaçoes
Edição 12
Dose M
Ivermectina (R) - - LR2006 OPY1 4 registros10 37,9 - 7,6 BHK-21 - - - 107
(ECSA) redução
título com 3-
e01788-20
Dose M
Abamectina (R) - - LR2006 OPY1 4 registros10 28,2 - 1,1 BHK-21 - - - 107
(ECSA) redução
título com 3-
Dose M
Harringtonina - - 0708 (ECSA) 0,24 100 BHK-21 - - - 110
Silimarina - - MEU/065/08/ 35 881 Vero - - - 111
FN295485
(ECSA)
Andrographolida - - 0708 (ECSA) 77,39 1.098 Hepatite G2 - - - 115
Micafungina (R) - - S27 (ECSA) 20,6 - 1,7 100 U2OS - - - 116
MBZM-N-IBT - - S27 (ECSA) 38,7 800 Vero - - - 117
Imipramina (R) - - LR2006 OPY1 3 registro10redução 100 HFF1 - - - 112
(ECSA) em título com
75-Dose M
Tomatidina - - LR2006 OPY1 1.3 156 Huh-7 - - - 113
(ECSA)
Silvestrol (HT) - - IO 899 (ECSA) 0,00189 0,03 HEK-293T - - - 114
ans, não especificado; —, não determinado/não realizado (na Vivoestudos); N, romance; NA, análogo de nucleósido; R, composto reaproveitado; VEEV, vírus da encefalite equina venezuelana. A numeração das mutações que fornecem
a resistência é baseada na sequência do genoma do CHIKV da cepa indicada na tabela, salvo indicação em contrário. DA, compostos de ação direta; HT, compostos direcionados ao hospedeiro; HT/DA, compostos direcionados ao hospedeiro e de ação
direta.
bSe o estudo descreveu uma família/classe de compostos com atividade antiviral, apenas a atividade antiviral do composto mais potente e/ou mais representativo é relatada.
cApenas estão incluídos compostos para os quais a atividade antiviral foi testada utilizando CHIKV infeccioso; foram excluídos os compostos identificados utilizando apenas sistemas replicon/substitutos para os quais faltavam experiências
confirmatórias com CHIKV infeccioso.
dQuando um composto mostrou atividade em múltiplas linhas celulares e contra múltiplas cepas de CHIKV, o melhor valor (com a linha celular correspondente) é relatado.
aac.asm.org5

TABELA 3Inibidores do CHIKV identificados porem sílicoabordagens (docking molecular, modelagem de homologia, modelagem de farmacóforo)
Confirmado
Minirevisão
Viral Resistência em enzimático Confirmado em Cepa CHIKV CC50 Cepa CHIKV Rato
Dezembro de 2020
Composto alvo mutação(ões) ensaios? células infectadas? (genótipo) CE50b (-M) Linha celular (genótipo) Eficácia modelo Referência
25 nsP2 - a Não Sim IO 899 (ECSA) 3,2 - 1,8 101 - 50 Vero - - - 78
7 nsP2 - Não Sim LR2006 OPY1 (ECSA) 0,42 100 Vero - - - 79
8 nsP2 - Sim Sim LR2006 OPY1 (ECSA) 1,5 200 BHK-21 - - - 80
Volume 64
3a nsP2 - Não Sim ns 8,76-g/ml ns Vero - - - 81
4b nsP2 - Não Sim ns 8,94-g/ml ns Vero - - - 81
Baicalina nsP3 - Não Sim MEU/065/08/ 5 600 Vero - - - 90
Edição 12
FN295485 (ECSA)
a—, não determinado/não realizado (na Vivoestudos).
bOs dados representam micromoles, salvo indicação em contrário.
e01788-20
TABELA 4Inibidores do CHIKV identificados emem vitroensaio/ensaios bioquímicos com proteína purificadaa
Confirmado
Viral Resistência em infectado Cepa CHIKV Célula Cepa CHIKV Rato
Composto alvo mutação(ões) células? (genótipo) CE50(-M) CC50(-M) linha (genótipo) Eficácia modelo Referência ou fonte
5-Iodotubercidina (NA) nsP1 - Sim Isolado clínico 119067 0,409 50 Vero - - - 66
ácido lobárico nsP1 - Sim LR2006 OPY1 (ECSA) 9,9 - 2,6 76,3 - 2,1 BHK - - - 67
Sinefungina nsP1 - Sim CHIKV LS3 184,9 - 38,4 1.000 VeroE6 - - - 66, 122;
dados não publicadosb
aPara compostos identificados usandoem sílicoabordagens, apenas são relatados os compostos para os quais a atividade antiviral foi demonstrada em cultura de células utilizando CHIKV infeccioso; todos os outros compostos para os quais a atividade
foi reivindicado contra CHIKV deem sílicorastreios, mas para os quais não foi reportada qualquer actividade em ensaios baseados em células, estão excluídos desta tabela. —, não determinado/não realizado (na Vivoestudos).
bK. Kovacikova, MG Gonzalez, J. Reguera, Eric J. Snijder, Gerard JP van Westen e Martijn J. van Hemert, dados não publicados.
aac.asm.org6

informações que – juntamente com estudos de resistência cruzada – podem ajudar na

elucidação do modo de ação de compostos que podem ser identificados em futuros esforços
de triagem. Além do modo de ação do composto, a compreensão dos determinantes
moleculares da resistência pode fornecer informações úteis sobre o ciclo de replicação do
vírus e a patogênese.
COMPOSTOS DIRECIONADOS À ENTRADA E SAÍDA DO CHIKV

O virião do alfavírus é composto por um núcleo de nucleocapsídeo com
simetria icosaédrica T-4 rodeado por uma bicamada lipídica derivada do
hospedeiro que é decorada com 80 pontas triméricas de heterodímeros E1-E2 (14–
16). A proteína E2 medeia a entrada viral através da ligação aos receptores na
superfície celular (17). Este processo é seguido por endocitose mediada por
clatrina, que entrega a partícula viral aos endossomos iniciais (18). O baixo pH no
compartimento endossomal desencadeia alterações conformacionais no
heterodímero E1-E2 e resulta na inserção da proteína de fusão E1 na membrana
endossomal. Mais especificamente, a glicoproteína E1 é convertida de uma forma
não fusogênica em um homotrímero E1 fusogênico altamente estável (19, 20). Em
última análise, este evento cria um poro de fusão e libera o nucleocapsídeo no
citosol.
PROTEÍNA ENVELOPE E1
Descobriu-se que Obatoclax, um composto anticancerígeno, inibe a infecção por CHIKV no
início do ciclo de replicação, neutralizando o ambiente endossomal ácido necessário para a
fusão. A mutação L369I no domínio III da glicoproteína de fusão E1 conferiu resistência pelo
menos parcial ao obatoclax e gerou vírus resistentes com potencial fusogênico aumentado
(21).
PROTEÍNA ENVELOPE E2
Arbidol/umifenovir foi licenciado como agente anti-influenza na Rússia e na China e inibe
uma ampla gama de vírus. O Arbidol inibe os estágios iniciais do ciclo de replicação do CHIKV,
o que foi confirmado pela seleção de uma variante resistente ao arbidol portadora de uma
mutação G407R na poliproteína estrutural (22), que corresponde a uma mutação G82R na
glicoproteína E2. Esta mutação também causou atenuação da cepa 181/25 da vacina CHIKV,
presumivelmente aumentando as interações com glicosaminoglicanos na superfície da célula
hospedeira (23). Derivados de arbidol com potência aumentada e inibição seletiva do CHIKV

foram desenvolvidos, mas o mecanismo preciso de ação desses compostos permanece não
resolvido (24).
A suramina é um medicamento aprovado para o tratamento de infecções parasitárias em
humanos e demonstrou inibir a entrada do CHIKV em três estudos independentes (25–27). O
composto provavelmente influencia a ligação do CHIKV às células e pode prevenir alterações
conformacionais do heterodímero E1/E2 que são necessárias para a fusão viral. A seleção de
variantes resistentes à suramina revelou que as mutações N5R e H18Q na glicoproteína E2 causam
alguma resistência ao composto. O acoplamento molecular com o pico maduro do CHIKV sugeriu
que a suramina interage com a alça N-terminal e o domínio A na glicoproteína E2, uma interação
que afetaria negativamente a ligação do vírion ao receptor (28). O tratamento com suramina de
camundongos C57BL/6 infectados com diferentes isolados clínicos de CHIKV melhorou o inchaço, a
inflamação e os danos à cartilagem do pé induzidos pelo CHIKV (29).
PROTEÍNA CAPSID
Descobriu-se que o ácido picolínico se liga à bolsa hidrofóbica da proteína C, o que pode
inibir a interação da proteína C com o domínio citoplasmático da glicoproteína E2. A atividade
antiviral do ácido picolínico também foi confirmada em células infectadas com CHIKV, embora
a concentração inibitória fosse bastante elevada para aplicações clínicas (30).
6K
A proteína 6K pertence à família das viroporinas ou proteínas formadoras de canais iônicos. É
uma proteína altamente hidrofóbica com propriedades fusogênicas de membrana. Viroporinas

permitem o movimento de pequenas moléculas e íons através das membranas, o que pode ser
importante durante a entrada, replicação e saída viral. O potencial de 6K para servir como alvo
terapêutico é ilustrado pela droga amantadina, um conhecido inibidor da gripe que tem como alvo a
proteína M2 formadora de canais iônicos dos vírus influenza (31). A amantadina inibiu a atividade do
canal iônico e alterou a morfologia das partículas em sistemas biofísicos. Mecanisticamente, o 6K
provavelmente precisa interagir com o E2 para ser entregue à membrana plasmática, onde forma
um canal iônico. O efeito antiviral da amantadina no CHIKV também foi confirmado em células
infectadas (32).
MEDICAMENTOS DIRECIONADOS À ENTRADA DO CHIKV COM MODO DE AÇÃO NÃO

CARACTERIZADO
A cloroquina (CHL) é um medicamento antimalárico antigo com uma ampla gama de atividades
antivirais contra uma variedade de vírus. O CHL foi implantado em ensaios clínicos muito antes de
sua atividade anti-CHIKV ser estabelecida em cultura celular. A justificativa para esta estratégia
incomum foi que o CHL conferiu benefícios na redução da inflamação articular em pacientes com
artrite reumatóide durante ensaios no final da década de 1950 (33). A eficácia do fosfato de CHL foi
investigada pela primeira vez numa pequena coorte de pacientes, o que levou a um alívio dos
sintomas dos pacientes e justificou a sua utilização adicional para o tratamento da artrite associada
ao CHIKV (34). No entanto, os supostos benefícios do CHL para o tratamento da infecção aguda por
CHIKV foram refutados no ensaio “CuraChik” conduzido durante a epidemia de La Reunion de
2005-2006 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00391313). Além disso, os pacientes tratados com
CHL apresentaram queixas mais frequentes de artralgia do que os que receberam placebo (35).
Num ensaio indiano durante a epidemia de CHIKV de 2006, o CHL também não produziu benefícios
no alívio dos sintomas de dor músculo-esquelética e artrite em comparação com o medicamento
anti-inflamatório não esteróide comumente utilizado, meloxicam (36). Estes e outros estudos
apoiaram a hipótese de que o CHL poderia aumentar a replicação viral, o que foi posteriormente
demonstradona Vivoem camundongos BALB/c tratados com CHL infectados com outro alfavírus
artritogênico, o vírus Semliki Forest (37). Nas células infectadas pelo CHIKV, o CHL parece bloquear
ou retardar a internalização do vírus dependendo do tempo de tratamento. É eficaz nos estágios
iniciais da infecção viral, provavelmente por prejudicar as interações da superfície célula-vírus e
bloquear a acidificação endossomal (38).
A doxiciclina é um antibiótico tetraciclina utilizado no tratamento de infecções bacterianas que
também demonstrou atividade anti-CHIKV promissora. Foi postulado que a atividade anti-CHIKV da
doxiciclina é direcionada à entrada viral e não à replicação viral. Estudos de acoplamento com a

cisteína protease nsP2 do CHIKV e a glicoproteína E2 indicaram que o composto poderia se ligar a
ambos os alvos virais. No entanto, ensaios baseados em células confirmaram que a doxiciclina inibe
a entrada viral, provavelmente por prejudicar as alterações conformacionais na glicoproteína E2. O
tratamento de ratos ICR adultos apenas com doxiciclina não resultou num resultado melhorado em
comparação com o tratamento combinado com ribavirina (39).
A curcumina é um extrato vegetal de açafrão que tem sido usado no tratamento de distúrbios
gastrointestinais na Ásia. O efeito antiviral da curcumina no CHIKV foi demonstrado utilizando
partículas virais pseudotipadas (40), e um estudo utilizando CHIKV de tipo selvagem mostrou
posteriormente que a curcumina reduz a infecciosidade das partículas de CHIKV e a sua ligação à
superfície celular (41). Um ensaio de inibição da fusão de células de inseto CHIKV foi usado para
rastrear inibidores de fusão e identificou dois compostos, niclosamida e nitazoxanida, como
possíveis inibidores de CHIKV. Noutros ensaios, foi confirmado que ambos os compostos inibem a
entrada do CHIKV e suprimem a transmissão célula-a-célula (42).
A apigenina, um composto natural com estrutura 5,7-dihidroxiflavona, apresentou atividade
anti-CHIKV moderada. Foi relatado anteriormente que os flavonóides suprimem a via de entrada de
membros de outras famílias de vírus. No entanto, os flavonóides testados contra o CHIKV, entre os
quais a apigenina foi o mais potente, inibiram fortemente os níveis de replicon do CHIKV e não
tiveram efeito num ensaio de entrada do vírus Semliki Forest (SFV) (43), sugerindo que não têm
como alvo a entrada. As flavaglinas sintéticas, como FL3, foram baseadas em uma classe de
compostos vegetais de ocorrência natural com atividade na faixa nanomolar baixa.

faixa. FL3 inibiu a infecção por CHIKV na etapa de entrada, servindo como um ligante de
proibitina e interrompendo a interação entre o CHIKV e o receptor de proibitina (44).
COMPOSTOS DIRECIONADOS À REPLICAÇÃO DE CHIKV

O RNA genômico do alfavírus que chega é traduzido em duas poliproteínas: P123 e P1234. P123
é o mais abundante dos dois, e P1234 surge como resultado da leitura translacional de um códon de
parada opala (com cerca de 10% de eficiência) no final da sequência de codificação nsP3 (45). Estas
poliproteínas são processadas pelo domínio protease de nsp2. Os intermediários de clivagem, bem
como os nsPs virais individuais totalmente clivados, desempenham papéis específicos na síntese de
RNA da cadeia de CHIKV ( ) e ( ). As funções dos nsPs foram amplamente caracterizadas pelo uso de
vírus recombinantes com mutações em nsPs em ensaios bioquímicos e porem sílicoidentificação de
motivos de sequência enzimática. Os inibidores de CHIKV direcionados a nsPs individuais estão
descritos nas Tabelas 2, 3 e 4.
PROTEÍNA NÃO ESTRUTURAL 1 (NSP1)

Alphavirus nsP1 (535 aminoácidos [aa]) é uma enzima de capeamento de mRNA
viral com atividades de guanina-N7-metiltransferase (MTase) e guanililtransferase
(GTase) responsável pelo capeamento das extremidades 5= do mRNA genômico
42S recém-sintetizado e mRNA subgenômico 26S . A MTase catalisa a transferência
do grupo metil da S-adenosilmetionina (SAM) para a posição N7 de uma molécula
de GTP, formando m7GTP e liberação de S-adenosilhomocisteína (SAH) como
subproduto (46). A GTase liga o m7GTP e forma um intermediário covalente, m7
GMP-nsP1, ao mesmo tempo que libera um pirofosfato (PPi) (47). Eles7O GMP é
então transferido para o RNA 5=-difosfato, que é gerado através da atividade da
RNA 5= trifosfatase do nsP2 (48), para criar uma estrutura de capa metilada no
terminal 5=. Esta estrutura cap é essencial para a tradução do mRNA viral e evita a
degradação do mRNA pelas 5=-exonucleases do hospedeiro. A parte intermediária
do nsP1, abrangendo os resíduos de aminoácidos 245 a 264, contém uma hélice
anfipática responsável pela associação do complexo de replicação do alfavírus (RC)
com membranas (49). Especificamente, a presença de hélice anfipática e cisteínas
palmitoiladas 417 a 419 (50) permite que complexos de replicação contendo nsP1
e nsP1 se ancorem em microdomínios de membrana enriquecidos em colesterol
(51). É importante ressaltar que
Nos últimos anos, o número de relatórios que descrevem um efeito inibitório de moléculas que visam especificamente as funções nsP1 aumentou substancialmente (Tabelas 2 e 4). Devido às

suas atividades enzimáticas exclusivamente virais, o nsP1 representa um excelente alvo para compostos antivirais, embora não afete o capeamento de mRNA da célula hospedeira, que ocorre através
de um mecanismo fundamentalmente diferente. Os 3-aril-[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidin-7(6 H)- foram relatados pela primeira vez como uma classe de inibidores potentes e seletivos da replicação do
CHIKV que têm como alvo o nsP1, com MADTP- 314 como o composto protótipo (53, 54). Um procedimento de seleção de resistência realizado com MADTP-314 e subsequente genética reversa indicou
que a substituição de um único aminoácido P34S na parte N-terminal do nsP1 foi responsável pela resistência ao MADTP-314 e vários análogos deste composto (55). Recentemente, os análogos de 2-(4-
[fenilsulfonil]piperazina-1-il)pirimidina conhecidos como série CHVB, com CHVB-032 como composto prototípico, foram identificados como inibidores potentes e seletivos de CHIKV (56). A genética
reversa revelou duas mutações na região C-terminal do nsP1, nomeadamente, S454G e W456R, responsáveis pela resistência ao CHVB-032 e seus análogos. Curiosamente, as duas famílias de
compostos parecem ter como alvo as mesmas funções nsP1, uma vez que o mutante nsP1-P34S resistente a MADTP é resistente cruzadamente a CHVB-032 e ao seu análogo CHVB-066 e, vice-versa, ao
mutante nsp1-S454G W456R resistente a CHVB. tem resistência cruzada com um análogo do MADTP-314, MADTP-372 (57). Ainda outra triagem de compostos fenotípicos identificou 6=- com CHVB-032
como composto prototípico, foram identificados como inibidores potentes e seletivos do CHIKV (56). A genética reversa revelou duas mutações na região C-terminal do nsP1, nomeadamente, S454G e
W456R, responsáveis pela resistência ao CHVB-032 e seus análogos. Curiosamente, as duas famílias de compostos parecem ter como alvo as mesmas funções nsP1, uma vez que o mutante nsP1-P34S
resistente a MADTP é resistente cruzadamente a CHVB-032 e ao seu análogo CHVB-066 e, vice-versa, ao mutante nsp1-S454G W456R resistente a CHVB. tem resistência cruzada com um análogo do
MADTP-314, MADTP-372 (57). Ainda outra triagem de compostos fenotípicos identificou 6=- com CHVB-032 como composto prototípico, foram identificados como inibidores potentes e seletivos do
CHIKV (56). A genética reversa revelou duas mutações na região C-terminal do nsP1, nomeadamente, S454G e W456R, responsáveis pela resistência ao CHVB-032 e seus análogos. Curiosamente, as
duas famílias de compostos parecem ter como alvo as mesmas funções nsP1, uma vez que o mutante nsP1-P34S resistente a MADTP é resistente cruzadamente a CHVB-032 e ao seu análogo CHVB-066
e, vice-versa, ao mutante nsp1-S454G W456R resistente a CHVB. tem resistência cruzada com um análogo do MADTP-314, MADTP-372 (57). Ainda outra triagem de compostos fenotípicos identificou 6=-
Curiosamente, as duas famílias de compostos parecem ter como alvo as mesmas funções nsP1, uma vez que o mutante nsP1-P34S resistente a MADTP é resistente cruzadamente a CHVB-032 e ao seu
análogo CHVB-066 e, vice-versa, ao mutante nsp1-S454G W456R resistente a CHVB. tem resistência cruzada com um análogo do MADTP-314, MADTP-372 (57). Ainda outra triagem de compostos
fenotípicos identificou 6=- Curiosamente, as duas famílias de compostos parecem ter como alvo as mesmas funções nsP1, uma vez que o mutante nsP1-P34S resistente a MADTP é resistente
cruzadamente a CHVB-032 e ao seu análogo CHVB-066 e, vice-versa, ao mutante nsp1-S454G W456R resistente a CHVB. tem resistência cruzada com um análogo do MADTP-314, MADTP-372 (57). Ainda
outra triagem de compostos fenotípicos identificou 6=---fluorohomoaristeromicina (FHA) e 6=-fluoro-homoneplanocina A (FHNA) como potentes inibidores de CHIKV com um índice terapêutico muito
alto (58, 59). As mutações G230R e K299E em nsP1 foram identificadas por seleção de resistência e genética reversa para conferir resistência tanto a FHA quanto a FHNA (59). Difluorometilornitina
(DFMO), um inibidor da ornitina

descarboxilase 1, demonstrou ter um efeito antiviral de amplo espectro em uma variedade de vírus de RNA, incluindo CHIKV (60). Curiosamente, o CHIKV pode superar a depleção de poliaminas
adquirindo mutações no nsP1. A combinação das mutações G230R e V326M no CHIKV nsP1 e *524R no nsP3 foi essencial para conferir resistência ao DFMO (61). Apesar de ser promissorem vitro
efeitos, houve pouca proteção contra a doença induzida por CHIKV em camundongos C57BL/6 que foram alimentados com DFMO na água potável antes da infecção (60). O ácido micofenólico (MPA) é
um agente imunossupressor bem conhecido e a ribavirina é um análogo da guanosina de amplo espectro com propriedades imunomoduladoras. Ambos os compostos têm como alvo a enzima
hospedeira IMP desidrogenase (IMPDH), que é importante para ode novosíntese de GMP e regulação dos níveis intracelulares de GTP. O GTP é crítico para pelo menos dois processos na replicação do
alfavírus: serve como uma molécula aceitadora de metila durante o capeamento de mRNA e como um bloco de construção na síntese de RNA mediada por nsP4, conforme descrito abaixo. Foi
demonstrado que a atividade anti-CHIKV do MPA está associada à depleção do pool de guanosina na cultura celular (62). Da mesma forma que o FHNA, o tratamento com MPA resultou na liberação de
vírions com infecciosidade específica reduzida (PFU por número de cópias do genoma). Estudos anteriores com o vírus Sindbis (SINV) mapearam as mutações responsáveis pelo fenótipo resistente ao
MPA para a região que codifica nsP1. Os vírus com fenótipo resistente ao MPA também foram resistentes à ribavirina (63, 64). Mais tarde, estudos aprofundados de genética reversa com um clone de
cDNA de SINV demonstraram que apenas as mutações S23N e V302M em nsP1 eram essenciais para a resistência ao MPA (65). Até o momento, a estrutura cristalina nsP1 do CHIKV não está disponível,
o que torna difícil apreciar o contexto estrutural das várias mutações resistentes a compostos e compreender os mecanismos moleculares subjacentes à resistência aos medicamentos. Tomando os
dados em conjunto, a maioria dos inibidores nsP1 do CHIKV para os quais os determinantes moleculares de resistência foram estudados requerem uma combinação de duas mutações nsP1 para
resistência específica do composto. Como mutações singulares não causaram resistência na maioria dos casos, a chance de surgimento de variantes de CHIKV resistentes a medicamentos durante o
tratamento parece ser baixa para esses compostos. A estrutura cristalina nsP1 do CHIKV não está disponível, o que torna difícil apreciar o contexto estrutural das várias mutações resistentes aos
compostos e compreender os mecanismos moleculares subjacentes à resistência aos medicamentos. Tomando os dados em conjunto, a maioria dos inibidores nsP1 do CHIKV para os quais os
determinantes moleculares de resistência foram estudados requerem uma combinação de duas mutações nsP1 para resistência específica do composto. Como mutações singulares não causaram
resistência na maioria dos casos, a chance de surgimento de variantes de CHIKV resistentes a medicamentos durante o tratamento parece ser baixa para esses compostos. A estrutura cristalina nsP1
do CHIKV não está disponível, o que torna difícil apreciar o contexto estrutural das várias mutações resistentes aos compostos e compreender os mecanismos moleculares subjacentes à resistência aos
medicamentos. Tomando os dados em conjunto, a maioria dos inibidores nsP1 do CHIKV para os quais os determinantes moleculares de resistência foram estudados requerem uma combinação de
duas mutações nsP1 para resistência específica do composto. Como mutações singulares não causaram resistência na maioria dos casos, a chance de surgimento de variantes de CHIKV resistentes a
medicamentos durante o tratamento parece ser baixa para esses compostos. a maioria dos inibidores nsP1 do CHIKV para os quais os determinantes moleculares de resistência foram estudados
requerem uma combinação de duas mutações nsP1 para resistência específica do composto. Como mutações singulares não causaram resistência na maioria dos casos, a chance de surgimento de
variantes de CHIKV resistentes a medicamentos durante o tratamento parece ser baixa para esses compostos. a maioria dos inibidores nsP1 do CHIKV para os quais os determinantes moleculares de
resistência foram estudados requerem uma combinação de duas mutações nsP1 para resistência específica do composto. Como mutações singulares não causaram resistência na maioria dos casos, a
chance de surgimento de variantes de CHIKV resistentes a medicamentos durante o tratamento parece ser baixa para esses compostos.
Outros inibidores de nsP1 de CHIKV foram identificados usando nsP1 de CHIKV purificado
em ensaios enzimáticos (Tabela 4). A 5-iodotubercidina, um análogo da adenosina, foi
recentemente descoberta por triagem com um novo ensaio baseado em eletroforese capilar
para atividade MTase do CHIKV nsP1. A atividade do composto neste ensaio enzimático foi
validada em cultura celular (66). Este ensaio enzimático desacopla as atividades MTase e
GTase e, portanto, pode ser usado para identificar inibidores específicos de alfavírus nsP1

MTase. Um ensaio baseado em polarização de fluorescência que mede a competição para o
sítio de ligação ao GTP foi usado em uma grande tela HTS que identificou o ácido lobárico
como um potente inibidor de nsP1 do CHIKV, que também foi validado usando vírus vivo em
ensaios baseados em células (67). Como a ligação do GTP é essencial para realizar a etapa
MTase no capeamento de mRNA,

O alfavírus nsP2 (798 aa) é uma proteína multifuncional que possui diversas atividades
enzimáticas, incluindo atividade de nucleosídeo trifosfatase (NTPase) (68, 69), helicase (70) e
RNA 5 = trifosfatase (RTPase) (48) no N-terminal parte da atividade de proteína e protease (71,
72) e um domínio semelhante a metiltransferase de RNA dependente de SAM (semelhante a
SAM MTase) na parte C-terminal de nsP2. As funções NTPase e helicase são importantes para
desenrolar o RNA de fita dupla durante a replicação do CHIKV, e a atividade da RTPase
remove o -fosfato da extremidade 5= do RNA antes da transferência da estrutura cap-0. A
atividade da protease nsP2 é responsável pelo processamento das poliproteínas nsp123 e
nsp1234 (72). No caso dos alfavírus do Velho Mundo, o nsP2 também pode induzir o
desligamento da transcrição do hospedeiro e efeitos citopáticos (73). Durante o desligamento
do host, O nsP2 transloca-se para os núcleos das células de vertebrados para induzir a
poliubiquitinação da subunidade catalítica da RNA polimerase II dependente de DNA, RPB1, e
desta forma subverte a resposta antiviral celular (74, 75). O domínio C-terminal do tipo SAM
MTase desempenha um papel crítico na função nuclear do alfavírus nsP2 (76) e inibe a
resposta do interferon (77).

A estrutura cristalina do domínio da protease nsP2 foi resolvida, e a proteína é agora usada
como um alvo importante para o desenvolvimento antiviral utilizando design de medicamentos
auxiliado por computador (Tabela 3). Uma campanha de triagem virtual analisando uma biblioteca
de compostos comercialmente disponíveis usando um modelo de homologia da protease nsP2 do
CHIKV identificou o composto 1 como um resultado inicial. O composto apresentou atividade anti-
CHIKV em ensaios baseados em células, e estudos de SAR em 25 análogos estruturais produziram o
composto 25, que mostrou eficácia melhorada em comparação e menor citotoxicidade do que o
composto líder 1 (78). Outro estudo relatou cinco derivados de arilalquilideno de 1,3-tiazolidin-4-ona
com atividade anti-CHIKV na faixa micromolar baixa, sendo o composto 7 o mais potente. Usando
docking molecular, demonstrou-se que os compostos interagem parcialmente com a estrutura
cristalina da protease nsP2 (79). Embora os estudos acima mencionados tenham identificado novas
moléculas direcionadas à nsP2, eles não forneceram evidências experimentais, por exemplo, obtidas
por meio de ensaios enzimáticos, para demonstrar que a nsP2 erade fatoo alvo desses compostos.
O projeto de medicamentos auxiliado por computador foi combinado com ensaios livres de células
para validação de alvo de um conjunto de 12 compostos projetados contra a protease nsP2 do
CHIKV usando modelagem baseada em alvo. O composto mais promissor, o composto 8, inibiu
potentemente a replicação do CHIKV em cultura celular e foi moderadamente ativo no ensaio de
protease com nsP2 recombinante do CHIKV (80). Isto ilustra a importância de confirmarem sílico
previsões em ensaios enzimáticos com proteína purificada, pois a ligação virtual nem sempre se
correlaciona com a inibição da atividade enzimáticaem vitro. Outros inibidores direcionados ao nsP2
incluem pequenos peptidomiméticos descobertos usando uma abordagem única de descritores de
ligantes baseados na mecânica quântica. Os compostos com peso molecular mais baixo
apresentaram maior atividade inibitória, provavelmente devido ao acesso superior à bolsa alvo (81).

O papel funcional do alfavírus nsP3 (530 aa) é o menos definido entre todos os nsPs do CHIKV.
Três domínios podem ser distinguidos em nsP3: um macrodomínio N-terminal (13), um domínio
único de alfavírus de ligação a Zn (AUD) (82) e um domínio hipervariável C-terminal (HVD) (83).
Embora a parte N-terminal do nsP3 seja bem conservada, o HVD C-terminal tem uma similaridade
de sequência muito baixa, mesmo entre alfavírus intimamente relacionados. Os alfavírus utilizam os
seus HVDs para recrutar as proteínas de ligação ao ARN normalmente encontradas nos grânulos de
stress, tais como as proteínas G3BP utilizadas pelo CHIKV, para a formação de pré-RCs que
promovem a replicação viral (84). Verificou-se que outras proteínas celulares de diferentes famílias,

específicas para espécies de vírus e tipos de células, interagem com nsP3 HVD (85). Eles funcionam
como os principais determinantes da especificidade celular durante a replicação viral. O
macrodomínio nsP3 afeta vários processos críticos no ciclo de replicação do alfavírus, incluindo
fosforilação de nsP3, () síntese de RNA de fita, desligamento da tradução do hospedeiro e virulência
(86). É importante ressaltar que a ribosilação de ADP de proteínas celulares, uma modificação pós-
tradução envolvida em uma variedade de processos celulares, é regulada pelo macrodomínio nsP3.
O macrodomínio nsP3 possui atividades de ligação a ADP-ribosil e ADPribosilhidrolase, pelas quais
se liga a ADP-ribose e hidrolisa resíduos ADPribosilados em proteínas celulares. A ligação do ADP-
ribosil mediada pelo macrodomínio nsP3 é necessária para iniciar a síntese de nsP e estabelecer
RCs, enquanto a atividade da ADPribosilhidrolase é importante para a amplificação de RCs. Por isso,
a interação do macrodomínio nsP3 com proteínas ribosiladas com ADP é necessária para a
replicação eficiente do alfavírus (86). Além disso, a atividade da ADP-ribosilhidrolase é um
determinante da neurovirulência em camundongos (87). O nsP3 AUD parece ser um domínio
multifuncional que desempenha um papel na replicação do genoma do vírus (88).
Até o momento, apenas alguns inibidores de moléculas pequenas direcionados ao nsP3 do

CHIKV foram relatados, talvez devido ao papel enigmático do nsP3 na replicação viral. No entanto, a
caracterização aprofundada dos domínios funcionais do nsP3 nos últimos anos contribuiu para a
exploração do nsP3 como um potencial alvo de drogas. Dada a sua natureza altamente conservada
e a estrutura cristalina disponível, o macrodomínio representa um local ideal para o
desenvolvimento de antivirais anti-CHIKV específicos. Baicalin é um dos poucos compostos que
demonstraram interagir com nsP3 usando uma abordagem computacional

(89) com atividade anti-CHIKV confirmada em cultura celular (90) (Tabela 3). No entanto, o último
estudo revelou que a baicalina inibiu os estágios iniciais da replicação do CHIKV e possui forte
atividade virucida. Além disso, foi demonstrado que a baicalina interage com a glicoproteína E do
CHIKV usando docking molecular, o que levou à discrepância com o estudo anterior, sugerindo que
o nsP3 é o alvo viral deste composto. Isto ilustra novamente que deveria se tornar norma que a
atividade antiviral e o modo de ação dos inibidores de moléculas pequenas descobertos usando o
desenho de medicamentos auxiliados por computador sejam validados em ensaios baseados em
células.

A proteína nsP4 (611 aa) é a proteína mais conservada na família dos alfavírus
que funciona como uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) responsável
pela replicação do RNA de fita genômica 49S () e pela transcrição do RNA guia
único 26S (sgRNA). Na fase inicial do ciclo de replicação, o nsP4, juntamente com o
P123, faz parte de um complexo de replicação inicial (RC) que é responsável pela
síntese da fita de RNA completa ( ) que serve como modelo para a síntese de
genômico e sgRNA. Após o processamento da poliproteína, o RC tardio que
consiste em nsP1 totalmente clivado em nsP4 medeia a síntese de RNA genômico
e 26S sgRNA (91). A NsP4 também possui uma atividade terminal de
adenililtransferase (TATase) que catalisa a adição de uma cauda poli(A) à
extremidade 3= do genoma (92). Além disso,
Muitos inibidores de RdRp são análogos de nucleosídeos. Como a atividade RdRp está ausente
nas células hospedeiras, ela representa um alvo adequado para o desenvolvimento de agentes
antivirais (Tabela 2). O sofosbuvir é um análogo da uridina clinicamente aprovado para o tratamento
da infecção pelo vírus da hepatite C. É administrado como um pró-fármaco UMP que precisa ser
metabolizado para produzir o composto farmacologicamente ativo trifosfato de sofosbuvir (93). O
nsP4 é o alvo previsto do sofosbuvir em células infectadas pelo CHIKV, com base no acoplamento
molecular do composto no suposto modelo nsP4 do CHIKV. O tratamento de células de hepatoma
com sofosbuvir diminuiu a replicação do CHIKVem vitro, e sua administração a camundongos Swiss
adultos infectados resultou na redução da inflamação da pata relacionada à artralgia (94).
- -D-N4-A hidroxicitidina (NHC) é um análogo de nucleosídeo que inibe a replicação do CHIKV-

após ser convertido em sua forma ativa, o trifosfato NHC. No entanto, uma relação

direta entre o NHC e o seu modo de ação nas células infectadas pelo CHIKV ainda não
foi estabelecida. Foi proposto que o NHC pode interferir na replicação do CHIKV através
da terminação da cadeia ou mutagênese (95). Estudos com o vírus da encefalite equina
venezuelana, um alfavírus do Novo Mundo, demonstraram que a resistência ao NHC se
desenvolve de forma muito ineficiente e é determinada por um efeito sinérgico de
múltiplas mutações no nsP4. Em particular, acredita-se que três mutações específicas
do nsP4, nomeadamente P187S, A189V e I190T, localizadas no domínio do dedo
indicador da estrutura prevista do nsP4, sejam responsáveis pela resistência ao NHC.
Curiosamente, o fenótipo resistente ao NHC pode reverter para o tipo selvagem após a
incorporação da mutação A201V no nsP4,
Inicialmente desenvolvido como um inibidor do vírus influenza, o favipiravir (T-705) é
um análogo de nucleosídeo de amplo espectro que também demonstrou atividade
inibitória contra o CHIKV (97). Todas as variantes resistentes ao favipiravir adquiriram a
mutação única K291R no nsP4, que é um resíduo altamente conservado no motivo F1
dos RdRps dos vírus de RNA de fita () (97). Além disso, o tratamento com favipiravir
reduziu a carga viral no cérebro de camundongos AG129 infectados e os protegeu de
doenças neurológicas graves. O favipiravir também foi testado em camundongos
imunocompetentes C57BL/6J durante as fases aguda e crônica da infecção por CHIKV. O
tratamento com favipiravir durante a fase aguda tornou o RNA viral, os antígenos virais
e as partículas infecciosas indetectáveis. Contudo, tal redução não foi observada com o
tratamento com favipiravir durante a fase crónica (98).

os dados sugerem que o RNA viral pode ser defeituoso e incapaz de formar partículas infecciosas,
corroborando achados anteriores de estudos realizados com material de pacientes.
Conforme discutido acima, a ribavirina pode bloquear a replicação do CHIKV por pelo
menos dois mecanismos diferentes, um dos quais opera através da inibição da RdRp. A
passagem do CHIKV na presença de ribavirina produziu um mutante de alta fidelidade
contendo uma mutação C483Y em nsP4 (99). Curiosamente, este mutante do CHIKV gerou
populações com diversidade genética restrita, o que parece ter resultado de um novo
mecanismo que difere daqueles típicos dos análogos de nucleósidos, tais como terminação
de cadeia ou mutagénese letal. A análise do efeito das mutações de resistência na estrutura
tridimensional (3-D) do nsP4 foi baseada na modelagem de homologia, uma vez que uma
estrutura cristalina do CHIKV RdRp ainda não está disponível.
Apesar da maioria dos compostos direcionados ao nsP4 pertencerem a classes bem conhecidas de
análogos de nucleosídeos, as triagens de compostos identificaram outros potenciais candidatos a
medicamentos. Por exemplo, um HTS de candidatos clínicos avançados identificou a digoxina, um
glicosídeo cardíaco que antagoniza a ATPase sódio-potássio, como um potente inibidor do CHIKV.
Descobriu-se que a mutação V209I no nsP4, situada numa região bem conservada do nsP4, desempenha
um papel fundamental no desenvolvimento da resistência mediada pela digoxina (100). As proteínas
citoplasmáticas envolvidas na replicação do CHIKV também poderiam ser alvo devido à sua interação direta
com as proteínas do CHIKV. As proteínas Hsp90 são proteínas hospedeiras que servem como
acompanhantes moleculares com uma ampla gama de funções. A subunidade citoplasmática HsP90
mostrou ser o parceiro de interação predominante do nsP4 em experimentos de co-imunoprecipitação. As
proteínas Hsp90 parecem desempenhar um papel na estabilização dos RCs durante infecções alfavirais. Os
inibidores de Hsp90 HS-10 e SNX-2112 inibiram a replicação do CHIKV em cultura de células e reduziram o
inchaço das articulações induzido pelo CHIKV e a carga viral em camundongos infectados (101). No entanto,
ainda faltam evidências diretas que levem à identificação do nsP4 como o alvo viral desses compostos.
INIBIDORES DA REPLICAÇÃO DO CHIKV COM ALVO INDEFINIDO

A 6-Azauridina é um análogo de nucleosídeo de amplo espectro que tem sido amplamente
utilizado em pacientes para outras indicações. Seu metabólito 6-azauridina 5=monofosfato foi
previamente relatado como inibindo a replicação de vários vírus de DNA e RNA através do
direcionamento da descarboxilase do ácido orotidílico do hospedeiro (102). Outros
propuseram um mecanismo de ação diferente, baseado na interferência no metabolismo
celular do UTP, levando à chamada catástrofe do “erro” (103). Vários estudos demonstraram

que a 6-azauridina inibe potentemente a replicação do CHIKV, mas o seu alvo viral não foi
determinado (104).
A análise de uma biblioteca química identificou o RYL-634, um novo e potente inibidor de
moléculas pequenas de amplo espectro com atividade antiviral contra muitos vírus patogênicos,
incluindo o CHIKV. A diidroorotato desidrogenase (DHODH) foi validada como a enzima alvo do
RYL-634 usando perfil de proteína baseado em atividade (105).
A atovaquona é um análogo da ubiquinona e um conhecido medicamento antimalárico e
antiparasitário. Estudos anteriores indicaram que pode funcionar através da inibição da função
mitocondrial ou DHODH, sendo este último necessário para ode novosíntese de pirimidina.
Recentemente, descobriu-se que a atovaquona inibe a replicação do CHIKV, mas o mecanismo
subjacente ao seu modo preciso de ação permanece não estudado. Para o vírus Zika, foi
demonstrado que a atovaquona bloqueia o DHODH e, portanto, leva à depleção dos conjuntos de
nucleotídeos intracelulares (106).
Outra campanha HTS identificou a berberina, a ivermectina e a abamectina como fortes
inibidores da replicação do CHIKV. A ivermectina e a abamectina são medicamentos antiparasitários
de amplo espectro utilizados no tratamento de humanos e culturas agrícolas, respectivamente. A
berberina possui propriedades antimicrobianas e foi testada quanto à atividade antiviral contra uma
série de vírus, incluindo o vírus herpes simplex, vírus influenza e citomegalovírus (107). A elucidação
adicional do seu efeito anti-CHIKV mostrou que a berberina prejudica as vias de sinalização da
proteína quinase ativada por mitógeno, embora o alvo molecular específico da berberina
permaneça desconhecido. Outro estudo descobriu que a berberina afeta as etapas pós-replicações
no ciclo de replicação do CHIKV, visando interações

entre o RNA genômico e a proteína C que são necessários para a montagem correta do
nucleocapsídeo (108). Além disso, o tratamento de camundongos C57BL6/J infectados pelo CHIKV
com berberina aliviou os sintomas da doença inflamatória induzida pelo CHIKV (109).
A harringtonina, um alcalóide da cefalotaxina, foi descoberta através da triagem de uma
biblioteca de compostos de produtos naturais e também inibiu potencialmente a replicação
do CHIKV. Este composto atua na fase pós-entrada do ciclo de replicação do CHIKV e interfere
fortemente na síntese da proteína CHIKV. Foi anteriormente postulado que a harringtonina
inibe a maquinaria de tradução da célula hospedeira e, assim, leva à supressão da tradução
de nsPs e proteínas estruturais do CHIKV (110). A silimarina é um flavonóide com atividade
anti-CHIKV que também exerce sua atividade antiviral na fase pós-entrada (111). A
imipramina é um antidepressivo aprovado pela FDA que exerce seus efeitos antivirais em dois
estágios distintos na replicação do CHIKV, a etapa de fusão/entrada e uma etapa de
replicação pós-fusão. Como as reações de fusão ideais e a replicação intracelular dependem
do colesterol, esses processos são altamente suscetíveis à imipramina, que é uma droga
anfifílica catiônica de classe II que tem como alvo a via do tráfico de colesterol (112). A
tomatidina é um alcalóide esteróide natural que interfere nas etapas pós-entrada no ciclo de
replicação do CHIKV (113). Silvestrol é um composto natural que pertence às flavaglinas e é
um inibidor específico do fator de iniciação eucariótica 4A da RNA helicase do hospedeiro
(eIF4A), que faz parte do complexo de iniciação da tradução. O tratamento com Silvestrol de
células infectadas pelo CHIKV atrasou a tradução de proteínas virais e evitou o desligamento
da transcrição do hospedeiro (114). Andrographolide, uma lactona diterpenóide bicíclica
(115); micafungina, um agente antifúngico (116); e MBZM-N-IBT (117) inibem a replicação do
CHIKV, mas o seu mecanismo de ação permanece desconhecido.
OS MUTANTES RESISTENTES A DROGAS SÃO ATENUADOS EM MOSQUITOS?

Em comparação com vírus de RNA de hospedeiro único, o uso alternado de hospedeiros
insetos e mamíferos restringe a adaptação dos arbovírus às pressões ambientais, como o
tratamento com compostos antivirais. A seleção e a adequação de novas variantes são
influenciadas pela competência de replicação em hospedeiros vertebrados e invertebrados.
Até o momento, apenas alguns estudos avaliaram especificamente a aptidão de mutantes
resistentes a medicamentos em mosquitos. Tal informação seria valiosa para a selecção de
um agente antiviral com risco mínimo de induzir e espalhar resistência aos medicamentos no
ambiente. Por exemplo, uma variante de alta fidelidade resistente à ribavirina contendo a
mutação C483Y em nsP4 teve menor aptidão emSim. aegyptimosquitos (99). Da mesma

forma, o mutante resistente ao favipiravir portador da mutação K291R no nsP4 também se
disseminou fracamente nos corpos dosSim. aegyptimosquitos e mostrou menor potencial de
transmissão, enquanto o mutante resistente a MADTP com a mutação P34S em nsP1 mostrou
a mesma eficiência de transmissão que o vírus do tipo selvagem (118). Além disso, um
mutante triplo resistente a DFMO carregando as mutações G230R e V326M em nsP1 e a
mutação nsP3-opal524R replicou-se para títulos mais elevados emSim. albopictus mosquitos
do que o vírus do tipo selvagem (61). Estes estudos indicam que os mutantes resistentes aos
medicamentos podem ter fenótipos bastante diferentes nos mosquitos e enfatizam a
necessidade de determinar o seu potencial de transmissão para os medicamentos antivirais
destinados ao uso clínico.
COMO A ESCOLHA DA LINHA CELULAR NA DESCOBERTA DE MEDICAMENTOS ANTIVIRAIS PARA CHIKV PODE
AFETAR O RESULTADO
Células de vertebrados, como células BHK-21 (rim de hamster bebê) ou células Vero E6 (rim de macaco
verde africano) são as linhagens celulares mais amplamente utilizadas para a triagem de medicamentos
antivirais para CHIKV. Linhas celulares de fibroblastos, como MRC-5 (fibroblastos de pulmão humano) ou
HFF-1 (fibroblastos de prepúcio humano), também foram utilizadas em vários estudos. Linhas celulares
usadas com menos frequência incluem células imortalizadas como HeLa (carcinoma cervical humano),
Huh-7 ou HepG2 (carcinoma hepatocelular humano) e U2OS (osteossarcoma humano). As linhas celulares
geralmente variam em relação à absorção do medicamento e ao metabolismo intracelular. Portanto, prevê-
se que os compostos que primeiro precisam ser metabolizados em sua forma ativa, como os análogos de
nucleosídeos, possam apresentar diferenças dependentes da linhagem celular em sua forma.

perfis de atividade antiviral. Um estudo que avaliou a eficácia anti-CHIKV da ribavirina e do favipiravir, cada
um dos quais precisa ser convertido em sua forma ativa de trifosfato pelas quinases da célula hospedeira,
revelou diferenças na eficácia antiviral que dependiam da linhagem celular utilizada para avaliação (119). Da
mesma forma, para agentes imunomoduladores (não discutidos nesta revisão), a escolha correta da
linhagem celular é especialmente relevante.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A falta de medidas de controlo eficazes, a propagação de novos vectores e o aumento das
viagens humanas e da urbanização contribuíram grandemente para o ressurgimento do CHIKV
entre 2004 e 2020. A origem e a escala de um futuro surto de chikungunya são difíceis de prever, o
que sublinha a importância do desenvolvimento de contramedidas eficazes. . A identificação e o
desenvolvimento de opções de medicamentos antivirais de ação direta e direcionados ao
hospedeiro contra a infecção por CHIKV oferecem uma abordagem promissora para limitar a
replicação e propagação viral.
A principal queixa dos pacientes que sofrem de CHIKF são dores articulares e musculares
debilitantes, que resultam em perda de produtividade e redução da qualidade de vida. O tratamento
antiviral representaria uma medida adequada para prevenir e tratar infecções por CHIKV e reduzir
significativamente o fardo da doença nas áreas afectadas. Uma terapia combinada para CHIKF pode
ser útil para reduzir a probabilidade de desenvolvimento de resistência aos medicamentos, uma vez
que compostos com diferentes alvos virais/hospedeiros podem produzir efeitos sinérgicos. Além
disso, pacientes crônicos com CHIKF com resposta exacerbada do sistema imunológico também
podem ser tratados com agentes imunomoduladores para aliviar a artralgia e a inflamação das
articulações.
A validação de inibidores de moléculas pequenas do CHIKV é atualmente realizada em uma variedade de em vitroena Vivomodelos. Idealmente,na Vivotestes antivirais são realizados em
modelos animais que reproduzem o curso clínico da infecção por CHIKV em humanos. Embora o uso de um modelo agudo imunocomprometido, como camundongos AG129, possa fornecer condições
mais rigorosas para avaliação antiviral, o uso de um modelo de artralgia imunocompetente é mais relevante clinicamente. O efeito benéfico máximo de um composto antiviral para tratamento de
pacientes com CHIKF seria alcançado pela administração precoce durante a fase aguda da infecção, a fim de reduzir a carga viral e diminuir a probabilidade de desenvolver manifestações crónicas.
Estudos clínicos realizados com material de pacientes já indicaram que o material viral residual (RNA/proteína) no tecido articular, em vez de replicar o vírus, provavelmente contribui para a
imunopatologia associada à infecção por CHIKV (120). Consequentemente, o tratamento antiviral tardio, ou seja, durante a fase crônica da infecção por CHIKV, visando funções específicas do CHIKV e
vias do hospedeiro envolvidas na replicação viral seria menos eficaz dada a ausência ou baixas quantidades de RNA viral completo. Isto sublinha a importância de compreender plenamente os aspectos
fundamentais das interações CHIKV-hospedeiro em pacientes com doença aguda e crónica. Em resumo, o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas do CHIKV é justificado tanto para uso
profilático quanto terapêutico. Dada a actual ausência de uma vacina, a disponibilidade de um inibidor de pequenas moléculas do CHIKV clinicamente aprovado seria especialmente vantajosa na
contenção de surtos. Alternativamente, poderia ser prescrito como forma de profilaxia aos cidadãos locais nas áreas afetadas ou aos viajantes em risco. durante a fase crônica da infecção pelo CHIKV, o
direcionamento de funções específicas do CHIKV e das vias do hospedeiro envolvidas na replicação viral seria menos eficaz, dada a ausência ou baixas quantidades de RNA viral completo. Isto sublinha

a importância de compreender plenamente os aspectos fundamentais das interações CHIKV-hospedeiro em pacientes com doença aguda e crónica. Em resumo, o desenvolvimento de inibidores de
pequenas moléculas do CHIKV é justificado tanto para uso profilático quanto terapêutico. Dada a actual ausência de uma vacina, a disponibilidade de um inibidor de pequenas moléculas do CHIKV
clinicamente aprovado seria especialmente vantajosa na contenção de surtos. Alternativamente, poderia ser prescrito como forma de profilaxia aos cidadãos locais nas áreas afetadas ou aos viajantes
em risco. durante a fase crônica da infecção pelo CHIKV, o direcionamento de funções específicas do CHIKV e das vias do hospedeiro envolvidas na replicação viral seria menos eficaz, dada a ausência
ou baixas quantidades de RNA viral completo. Isto sublinha a importância de compreender plenamente os aspectos fundamentais das interações CHIKV-hospedeiro em pacientes com doença aguda e
crónica. Em resumo, o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas do CHIKV é justificado tanto para uso profilático quanto terapêutico. Dada a actual ausência de uma vacina, a
disponibilidade de um inibidor de pequenas moléculas do CHIKV clinicamente aprovado seria especialmente vantajosa na contenção de surtos. Alternativamente, poderia ser prescrito como forma de
profilaxia aos cidadãos locais nas áreas afetadas ou aos viajantes em risco. visando funções específicas do CHIKV e vias do hospedeiro envolvidas na replicação viral seria menos eficaz dada a ausência
ou baixas quantidades de RNA viral completo. Isto sublinha a importância de compreender plenamente os aspectos fundamentais das interações CHIKV-hospedeiro em pacientes com doença aguda e
crónica. Em resumo, o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas do CHIKV é justificado tanto para uso profilático quanto terapêutico. Dada a actual ausência de uma vacina, a disponibilidade de um inibidor de pequenas moléculas do CHIKV clinicamente aprovado seria especialmente vantajosa na contenção de surtos.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Eric Snijder por ler atentamente o manuscrito e fornecer feedback
valioso.
KK foi apoiado pela Rede Europeia de Formação Marie Sklodowska-Curie ETN
“antivirais” (acordo de subvenção da UE 642434).
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Small Molecule Inhibitors of Chikungunya Virus Mechanisms of Action and Antiviral Drug Resistance

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Inibidores de moléculas pequenas do vírus Chikungunya: mecanismos de

Cristina Kovacikova,a Martin J. van Hemerta

aDepartamento de Microbiologia Médica, Centro Médico da Universidade de Leiden, Leiden, Holanda

PALAVRAS-CHAVEantivirais de ação direta, antivirais direcionados ao hospedeiro, resistência a

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia aac.asm.org1

poliartralgia. A poliartralgia é principalmente simétrica e periférica, afetando as pequenas

ESTRATÉGIAS PARA DESCOBERTA E PROJETO DE MEDICAMENTOS ANTI-CHIKV

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

resistência que foram identificadas até agora,

Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 aac.asm.org2

TABELA 1Compostos direcionados à entrada e saída do CHIKVa

Viral Resistência CE50(-M) ou outra Cepa CHIKV Rato

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Viral Resistência Cepa CHIKV CE50(-M) ou CC50 Cepa CHIKV

* 524R (nsP3) 500-Dose M

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Viral Resistência Cepa CHIKV CE50(-M) ou CC50 Cepa CHIKV

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

informações que – juntamente com estudos de resistência cruzada – podem ajudar na

COMPOSTOS DIRECIONADOS À ENTRADA E SAÍDA DO CHIKV

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 aac.asm.org7

MEDICAMENTOS DIRECIONADOS À ENTRADA DO CHIKV COM MODO DE AÇÃO NÃO

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 aac.asm.org8

COMPOSTOS DIRECIONADOS À REPLICAÇÃO DE CHIKV

PROTEÍNA NÃO ESTRUTURAL 1 (NSP1)

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

(DFMO), um inibidor da ornitina

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Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

PROTEÍNA NÃO ESTRUTURAL 2 (NSP2)

Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 aac.asm.org10

PROTEÍNA NÃO ESTRUTURAL 3 (NSP3)

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Até o momento, apenas alguns inibidores de moléculas pequenas direcionados ao nsP3 do

Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 aac.asm.org11

PROTEÍNA NÃO ESTRUTURAL 4 (NSP4)

- -D-N4-A hidroxicitidina (NHC) é um análogo de nucleosídeo que inibe a replicação do CHIKV-

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 aac.asm.org12

INIBIDORES DA REPLICAÇÃO DO CHIKV COM ALVO INDEFINIDO

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Dezembro de 2020 Volume 64 Edição 12 e01788-20 aac.asm.org13

OS MUTANTES RESISTENTES A DROGAS SÃO ATENUADOS EM MOSQUITOS?

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 31 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

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