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com

AGENTES ANTIVIRAIS

cruz

Nova classe de inibidores de moléculas pequenas do vírus Chikungunya que

tem como alvo o maquinário de proteção viral

Rana Abdelnabi,aCristina Kovacikova,bJúlia Moesslacher,cKim Donckers,aVerena Battisti,dPieter Leyssen,aThierry Langer,d

Gerhard Puerstinger,cGilles Querat,eChangqing Li,fÉtienne Decroly,fAli Tas,bArnaud Marchand,gPatrick Chaltin,g
Bruno Coutard,eMartin van Hemert,bJohan Neyts,aLeen Delanga

a KU Leuven, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Transplante, Instituto Rega de Pesquisa Médica, Laboratório de Virologia e Quimioterapia, Leuven,
Bélgica
bLaboratório de Virologia Molecular, Departamento de Microbiologia Médica, Centro Médico da Universidade de Leiden, Leiden, Holanda

c Departamento de Química Farmacêutica, Universidade de Innsbruck, Innsbruck, Áustria

d Universidade de Viena, Departamento de Química Farmacêutica, Viena, Áustria

e Unité des Virus Emergents (UVE: Aix-Marseille University –IRD 190 –Inserm 1207–IHU Méditerranée Infection), Marselha, França

f Universidade Aix de Marselha, CNRS, AFMB UMR7257, Marselha, França

g Centro de Design e Descoberta de Medicamentos, KU Leuven, Leuven, Bélgica

Rana Abdelnabi e Kristina Kovacikova contribuíram igualmente para este trabalho. A ordem dos autores foi determinada em ordem alfabética. Johan Neyts e Leen Delang contribuíram igualmente para este trabalho.

ABSTRATOApesar do ressurgimento mundial do vírus chikungunya (CHIKV) e da elevada morbidade

associada às infecções por CHIKV, não existe nenhuma vacina aprovada ou tratamento antiviral
disponível. Aqui, pretendemos identificar o alvo de uma nova classe de inibidores do CHIKV, ou seja,
a série CHVB. Os compostos CHVB inibem oem vitroreplicação de isolados de CHIKV com
concentrações efetivas de 50% na faixa micromolar baixa. Uma variante resistente ao CHVB (CHVB
resolução) foi selecionado que carregava duas mutações no gene que codifica nsP1 (responsável pelo
capeamento de RNA viral), uma mutação em nsP2 e uma mutação em nsP3. Estudos de genética
reversa demonstraram que ambas as mutações nsP1 eram necessárias e suficientes para atingir
uma resistência de -18 vezes, sugerindo que o CHVB tem como alvo o capeamento de mRNA viral.
Curiosamente, CHVBresoluçãoapresentou resistência cruzada aos inibidores de capeamento do CHIKV

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 30 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

descritos anteriormente da série MADTP, sugerindo que eles compartilham um mecanismo de ação
semelhante. Em ensaios enzimáticos, o CHVB inibiu as atividades de metiltransferase e
guanililtransferase das proteínas nsP1 do alfavírus. Para concluir, identificamos uma classe de
inibidores do CHIKV que tem como alvo a maquinaria de capeamento viral. A potente atividade anti-
CHIKV torna esta estrutura química um candidato potencial para o desenvolvimento de
medicamentos para CHIKV.
CitaçãoAbdelnabi R, Kovacikova K, Moesslacher J,
Donckers K, Battisti V, Leyssen P, Langer T, Puerstinger
PALAVRAS-CHAVEvírus chikungunya, antivirais, proteína não estrutural 1, capping, MADTP, G, Quérat G, Li C, Decroly E, Tas A, Marchand A, Chaltin
P, Coutard B, van Hemert M, Neyts J, Delang L. 2020.
CHIKV, nsP1
Nova classe de inibidores de moléculas pequenas do
vírus chikungunya que tem como alvo a maquinaria de

C
capeamento viral. Agentes Antimicrobianos
O vírus hikungunya (CHIKV) é um vírus transmitido por artrópodes que pertence ao Quimioterapia 64:e00649-20. https://doi.org/10.1128/
gênero AlfavírusdoTogaviridaefamília (1, 2). Após duas décadas de surtos esporádicos em AAC.00649-20.

África e na Ásia, o CHIKV ressurgiu no Quénia em 2004, após o que foram notificadas grandes direito autoral© 2020 Sociedade Americana de

Microbiologia.Todos os direitos reservados.

epidemias de infecções por CHIKV em várias ilhas do Oceano Índico e países do Sudeste
Endereço de correspondência para Leen Delang,
Asiático (3). No final de 2013, ocorreu a primeira transmissão local do CHIKV nas Américas.
Leen.Delang@kuleuven.be .
Desde então, milhões de casos de CHIKV foram notificados na região do Caribe, bem como Recebido3 de abril de 2020

em vários países da América Central e do Sul (4). Mais recentemente, em 2018, o CHIKV Devolvido para modificação18 de abril de 2020

causou surtos no Brasil, Índia, Sudão e Tailândia (5). Devido ao elevado impacto Aceitaram23 de abril de 2020

Manuscrito aceito publicado online27 de

socioeconómico das infecções por CHIKV, o vírus é agora considerado uma ameaça iminente
abril de 2020
à saúde em áreas tropicais e temperadas colonizadas porAedesmosquitos. Publicados23 de junho de 2020

As infecções agudas por CHIKV são caracterizadas por febre, artralgia e, em muitos casos,

Julho de 2020 Volume 64 Edição 7 e00649-20 Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia aac.asm.org1

Abdelnabi et al. Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia

FIGURA 1Estruturas químicas do acerto inicial e análogos selecionados da série CHVB.

erupção maculopapular (6). Embora uma infecção por CHIKV raramente seja fatal, 15 a 60%
dos pacientes sofrem de poliartrite crónica debilitante que pode durar semanas até anos
após a infecção aguda (1, 6). Recentemente, complicações neurológicas graves, como a
síndrome de Guillain-Barré e meningoencefalite, também foram relatadas durante infecções
por CHIKV (1, 7). Outras complicações associadas às infecções por CHIKV incluem miocardite,
pancreatite e insuficiência renal (8).
Apesar da propagação mundial e da elevada taxa de morbilidade das infecções por CHIKV, não
existe vacina licenciada ou tratamento antiviral disponível. O tratamento atual é apenas sintomático
(2). Foi relatado que diversas classes de compostos antivirais direcionados a um fator viral ou
hospedeiro inibem a replicação do CHIKV em ensaios baseados em células (9, 10), mas nenhum
deles progrediu para ensaios clínicos.
Nós relatamos anteriormente a primeira classe de inibidores ([1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidin-7(6-H)-onas,
a série MADTP) que bloqueiam o capeamento dos genomas de RNA do CHIKV. Os compostos MADTP têm
como alvo principal a atividade da guanililtransferase do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) nsP1
(11). Esta classe de compostos apresenta baixa barreira à resistência, uma vez que apenas uma única
mutação no nsP1 do CHIKV (prolina-34-serina) resultou em alta resistência aos compostos (11). Idealmente,
os medicamentos antivirais deveriam ter uma elevada barreira à resistência para evitar o rápido surgimento
de variantes resistentes aos medicamentos.
Em uma campanha de triagem anti-CHIKV baseada em efeito citopático em larga
escala (CPE) (33.000 moléculas), identificamos CHVB-00 [N-etil-2-(4-((4-fluorofenil)
sulfonil) piperazin-1-il)-6-metilpirimidin-4-amina] como uma molécula que foi capaz de
inibir completamente a replicação do CHIKV em concentrações não tóxicas (50%
concentração eficaz [CE50] valor de 8,7 0,5-M, concentração citotóxica de 50% [CC50] de

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 30 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

122 24-M) (Fig. 1). A otimização inicial do acerto resultou na síntese e avaliação biológica
de 67 análogos. Destes análogos, 24 moléculas eram mais potentes do que o composto
original. A síntese desta classe de moléculas e a relação estrutura-atividade serão
publicadas em outro lugar (29). Aqui, relatamos as características particulares da
atividade anti-CHIKV desta classe de compostos e o mecanismo molecular subjacente à
atividade antiviral.

RESULTADOS

Moléculas da série CHVB inibem a replicação de vários isolados de CHIKV em

cultura celular.A eficácia antiviral de CHVB-032 e CHVB-066 contra o CHIKV-899
cepa foi avaliada em um ensaio de redução de CPE em células Vero. Ambas as moléculas exerceram
inibição potente da CPE induzida por vírus, com CE50valores de 2,7-M e 0,45-M, respectivamente (Fig.
2A). Ao avaliar os potenciais efeitos adversos dos compostos nas células Vero (por leitura
colorimétrica usando MTS/PMS), o CHVB-032 foi menos citotóxico que o CHVB-066 (CC50valores de
75-M e 15-M, respectivamente) (Fig. 2A). A atividade anti-CHIKV foi ainda confirmada em um ensaio
de rendimento de vírus no qual o tratamento com ambos os compostos de CHVB resultou em uma
redução acentuada, dependente da dose, da replicação do RNA viral e da produção de progênie de
vírus infeccioso, com uma pronunciada redução de 4 log10redução nas concentrações mais altas
testadas (Fig. 2B e C).
A atividade antiviral do CHVB-032 foi avaliada posteriormente contra vários isolados
de CHIKV (Venturini [Itália 2008], St Martin 20235 P2, St Martin 20236 P3, EFS-1 P3
Martinica e Congo 95 [2011]). CHVB-032 reduziu o rendimento de RNA viral de todos os

Julho de 2020 Volume 64 Edição 7 e00649-20 aac.asm.org2

Novos inibidores do capeamento de RNA do vírus Chikungunya Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia

FIGURA 2Os compostos CHVB são inibidores seletivos da replicação do CHIKV. (a) Efeito dose-resposta de CHVB-032 e CHVB-066 no efeito citopático induzido por
CHIKV899 (CPE) (quadrados preenchidos e triângulos preenchidos, respectivamente) (MOI 0,01) e viabilidade celular (quadrados abertos e triângulos abertos,
respectivamente), conforme quantificado em células Vero pelo método MTS/PMS. Os dados são valores médios, desvios padrão (DP) de pelo menos três
experimentos independentes. O efeito de diferentes concentrações de CHVB-032 (b) e CHVB-066 (c) na liberação de partículas de CHIKV por células Vero infectadas
com CHIV899 (MOI, 0,01) foi quantificado por qRT-PCR em tempo real (para RNA viral; colunas pretas) e ensaio de titulação de ponto final (para partículas de vírus de
progênie infecciosa; colunas cinza) às 48 h pi Os dados mostrados são valores médios SD de pelo menos dois experimentos independentes.tteste (*, P0,05;***,P
0,005). TCID, dose infecciosa em cultura de tecidos; VC, controle de vírus (sem tratamento).

isolados testados de CHIKV, com CE50valores na faixa de 1,2 a 7,3-M (Tabela 1). Contudo, o
composto era desprovido de actividade antiviral contra outros alfavírus, isto é, vírus O'Nyong
Nyong, estirpe de vírus Mayaro TC625, estirpe de vírus Barmah Forest BH2193 e vírus Ross
River 5281v (dados não mostrados).
Os compostos de CHVB inibem uma etapa pós-entrada no ciclo de replicação do CHIKV.Um
ensaio de atraso de tratamento foi realizado para estimar o estágio do ciclo de replicação do CHIKV
inibido pela série CHVB. A cloroquina foi utilizada neste ensaio como composto de referência para a
inibição em fase inicial, uma vez que esta molécula é conhecida por interferir na entrada do vírus
(12). MADTP-0372 (inibe o capping de RNA viral) e T-705 (inibe a síntese de RNA viral) foram
utilizados como moléculas de referência para inibição do estágio de replicação (11, 13). Semelhante
ao perfil de inibição do composto MADTP-0372, CHVB-032 e CHVB-066 reduziram o RNA viral (Fig.
3A) e as cargas de vírus infecciosos (Fig. 3B) quando adicionados às células infectadas até 4 horas
após a infecção (pi) , sugerindo que os compostos da série CHVB têm como alvo uma etapa pós-
entrada no ciclo de replicação do CHIKV.

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 30 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

Para confirmar a ausência de efeito na entrada do vírus, foi realizado um ensaio de entrada do
CHIKV utilizando pseudopartículas de CHIKV (CHIKVpp), conforme descrito anteriormente (14). Em
contraste com a cloroquina, os compostos CHVB não inibiram a entrada do CHIKVpp nas células
BGM (Fig. 3C), demonstrando que os compostos CHVB actuam numa fase pós-entrada do ciclo de
replicação do CHIKV.
Variantes resistentes ao CHVB carregam mutações nas proteínas nsP1, nsP2 e nsP3 do
CHIKV.Para identificar o alvo viral da série CHVB, foi realizado um procedimento de seleção de
resistência (11) utilizando CHVB-032 para gerar variantes de vírus resistentes a compostos. Em

TABELA 1Atividade antiviral do composto CHVB-032 contra diferentes isolados do vírus

chikungunya

CHVB-032

Cepa CHIKV CE50(-M) CE90(-M)

899 (laboratório) 2,7 0,4a 5,5 0,2a
OPY1 (La Reunião) 1,24 0,3b 6,7 0,5b
Venturini (Itália) 2,1 0,4b 2,6 0,4b
Congo (Congo) 1 0,15b 1,2 0,1b
St Martin 20235 P2 St 1,7 0,4b 5 0,3b
Martin 20236 P3 4,1 0,6b 17 8b
EFS-1 P3 Martinica 7,3 2,3b 13 3b
aRedução do CPE.
bRedução de RNA viral.

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FIGURA 3Os compostos de CHVB inibem uma etapa pós-entrada no ciclo de replicação do CHIKV. O atraso do efeito do tratamento de CHVB-032 (20-M; colunas cinza claro) e CHVB-066 (5-M;
colunas brancas) na replicação viral em células Vero infectadas com CHIKV899 (MOI de 1) foi determinada às 12 h pi por qRT-PCR em tempo real (a) e ensaio de titulação de ponto final (b).
Cloroquina (50-M, colunas tracejadas) serviu como composto de referência para inibição em estágio inicial, enquanto MADTP-0372 (50-M, colunas cinza escuro) e T-705 (200-M, colunas pretas)
serviram como referência para a inibição do estágio pós-entrada. Os dados são valores médios SD de pelo menos dois experimentos independentes. Diferenças significativas em relação ao
controle de vírus não tratado foram analisadas por teste de Student bicaudaltteste (*,P0,05;**,P0,01). (c) O efeito de CHVB-032 (quadrados preenchidos) e CHVB-066 (triângulos preenchidos) na
entrada de CHIKV usando pseudopartículas de CHIKV (CHIKVpp). A cloroquina (círculos preenchidos) serviu como composto de referência para a inibição em estágio inicial. As células BGM foram
tratadas com diluições em série de cada composto e depois foram infectadas com CHIKVpp. No dia 3 pi, as células foram lavadas e depois lisadas para determinar a atividade da luciferase. Os
dados são apresentados como percentagem de unidades relativas de luz (RLU) do controlo não tratado, e os valores traçados são valores médios SD de pelo menos três experiências
independentes. TCID, dose infecciosa em cultura de tecidos; VC, controle de vírus (sem tratamento).

no total, foram obtidas quatro variantes independentes e supostas de vírus

resistentes ao CHVB. Os ensaios de redução de CPE mostraram que apenas a
estirpe 4 do vírus resistente era marcadamente menos susceptível aos compostos
de CHVB, apresentando uma resistência de 19 vezes ao CHVB-066 (Tabela 2). A
variante resistente 4 também foi resistente a outros análogos de CHVB (Tabela 3).
O sequenciamento do genoma completo dos vírus resistentes revelou que todas
as variantes carregavam uma mutação S454G em nsP1 e uma mutação M703T no
domínio semelhante à metiltransferase de nsP2 (Tabela 4). O vírus resistente 4
adquiriu duas mutações adicionais, W456R em nsP1 e L494P no domínio
altamente variável de nsP3, enquanto o vírus resistente 3 teve uma mutação
adicional, H280Q, no domínio único de alfavírus (AUD) de nsP3 (Tabela 4).
Para determinar quais das mutações identificadas contribuíram para a resistência
fenotípica contra o composto, estas mutações foram introduzidas no clone de cDNA de CHIKV
LS3 utilizando mutagénese dirigida ao local, como descrito anteriormente (11). A
suscetibilidade das variantes recombinantes do CHIKV à atividade antiviral dos compostos

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 30 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

CHVB foi determinada num ensaio de redução de CPE (Fig. 4). Apesar da presença de
mutações S454G e M703T em todos os clones resistentes, os mutantes únicos rCHIKV S454G
e rCHIKV M703T não foram resistentes a CHVB-032 ou CHVB-066 (Fig. 4). Com CE50valores de
0,38-M e 0,31-M, respectivamente, estas variantes foram ainda mais sensíveis ao efeito
antiviral do CHVB-066 do que o vírus wt (Tabela 5). Um fenótipo mais sensível também foi
encontrado para CHVB-032. A combinação das mutações S454G e M703T no rCHIKV S454G
M703T também não produziu um fenótipo resistente ao composto, mas sim um fenótipo com
suscetibilidade aumentada, como um EC50valor de 0,32-M foi determinado (Tabela 5). As
outras mutações presentes no vírus resistente 4 foram então introduzidas no clone infeccioso
do CHIKV em várias combinações. O rCHIKV W456R recombinante foi tão suscetível ao
CHVB-066 (EC50de 0,76-M) como o vírus wt, e era ainda mais suscetível a

MESA 2Fenótipo de supostos clones resistentes ao CHVB

CHVB-066

Cepa CHIKV CE50(-M) Resistência à dobraa

peso 0,55 0,01 1

Vírus resistente 1 1,6 0,3 2.9
Vírus resistente 2 0,94 0,05 1.7
Vírus resistente 3 0,63 0,4 1.1
Vírus resistente 4 13 0,4 19
aA resistência à dobra é CE50variante/CE50peso.

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Novos inibidores do capeamento de RNA do vírus Chikungunya Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia

TABELA 3Fenótipo do vírus 4 resistente contra diferentes análogos do CHVB

CE50(-M)
Composto peso Vírus resistente 4 Resistência à dobraa

CHVB-023 1.2 7,5 6,5

CHVB-057 0,86 17.3 20
CHVB-032 2.7 100 37
aA resistência à dobra é CE50variante/CE50peso.

CHVB-032 (CE50de 1,76-M) do que o vírus wt. Curiosamente, foi especificamente a

combinação das duas mutações nsP1 S454G e W456R que aumentou a resistência
ao CHVB-066 8 vezes (EC50de 5,4-M) e para CHVB-032 mais de 18 vezes (EC50de
100-M) (Tabela 5). As mutações S454G e W456R em nsP1 proporcionaram ao vírus o mesmo
nível de resistência contra CHVB-032 que a variante resistente 4 originalmente isolada e,
portanto, foram suficientes para resultar no fenótipo resistente a CHVB-032. A introdução da
mutação nsP2-M703T na variante com as mutações nsP1-S454G e -W456R (rCHIKV S454G
W456R M703T) não aumentou ainda mais a resistência a ambos os compostos (EC50de 2,6-M
para CHVB-066 e CE50de 81-M para CHVB-032) (Tabela 5). Este aminoácido na posição 703 está
localizado no domínio tipo MTase de nsP2, sugerindo uma interação deste domínio com nsP1
durante o capeamento do RNA viral. É importante ressaltar que a presença de todas as
quatro mutações que foram identificadas no vírus resistente 4 no vírus de engenharia reversa
resultou em um fenótipo resistente a CHVB-066 comparável ao do vírus 4 originalmente
isolado (EC50de 12-M) (Fig. 4). Este vírus de engenharia reversa, rCHIKV S454G W456 M703T
L494P, também foi totalmente resistente ao CHVB-032 (EC50de
100-M). Em resumo, as mutações S454G e W456R no nsP1 do CHIKV são suficientes e
necessárias para a resistência ao CHVB-032 e um alto nível de resistência ao CHVB-066. A
resistência máxima ao CHVB-066 exigiu duas mutações adicionais em nsP2 e nsP3, sugerindo
que o CHVB-066 tem uma barreira à resistência mais elevada do que o CHVB-032.
Para excluir que a resistência observada se deva ao aumento da replicação, investigou-se a
cinética de crescimento das três variantes com os valores mais elevados de resistência à dobragem.
Todas as variantes recombinantes replicaram com cinética muito semelhante às do rCHIKV wt. Às 6
horas após a infecção, os vírus de engenharia reversa com a substituição M703T em nsP2
produziram títulos visivelmente mais elevados do que os outros vírus, mas em momentos
posteriores não houve diferenças (Fig. 5).

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 30 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

As variantes resistentes ao CHVB são resistentes cruzadamente a outros inibidores nsP1 do
CHIKV. Estudos de resistência cruzada foram realizados com favipiravir e MADTP-0372. O favipiravir
foi capaz de proteger as células contra a CPE induzida pelo CHIKV para todos os vírus recombinantes
testados, com EC50valores na faixa de 90 a 142-M, comparável ao peso (Tabela 6). Curiosamente, o
mutante resistente a CHVB com duas mutações em nsP1 e o mutante resistente a CHVB com quatro
mutações provaram ser totalmente resistentes cruzadamente a MADTP-0372 (EC50
de 25-M). Da mesma forma, o mutante resistente a MADTP (portando a mutação nsP1-P34S)
foi totalmente resistente a CHVB-066 (EC50de 12,5-M), sugerindo que os modos de ação das
séries CHVB e MADTP são semelhantes (Tabela 6).
Os compostos CHVB inibem as funções enzimáticas de VEEV e SFV nsP1.O alfavírus
nsP1 possui atividades MTase e GTase, que são necessárias para o capeamento do RNA viral
(15). Como os mutantes resistentes ao CHVB apresentaram clara

TABELA 4Variantes resistentes ao CHVB carregam mutações nos genes nsP1 a nsP3 do CHIKV

Proteína peso Vírus resistente 1 Vírus resistente 2 Vírus resistente 3 Vírus resistente 4 % conservada em CHIKV
nsP1 S454 S454G S454G S454G S454G 82
W456 W456R 97,9

nsP2 M703 M703T M703T M703T M703T 99,3

nsP3 H280 H280Q 99,8

L494 L494P 99,3

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FIGURA 4Resistência fenotípica de mutantes resistentes a CHVB submetidos a engenharia reversa em comparação
com o vírus resistente 4 e rCHIKV wt. Cepas de CHIKV de tipo selvagem (círculos preenchidos) e recombinantes com
mutações individuais ou combinadas que foram identificadas no isolado 4 resistente a CHVB (triângulos abertos)
foram avaliadas em um ensaio de redução de CPE com doses crescentes de CHVB-066 (A) e CHVB -032 (B). Células
Vero E6 foram tratadas com 0 a 12,5-M CHVB-066 ou 0 a 100-M CHVB-032 e infectado com rCHIKV LS3 wt ou os
mutantes recombinantes de CHIKV em um MOI de 0,05. Quatro dias após a infecção, a viabilidade celular foi
determinada pelo método MTS/PMS. Os dados representam as médias SD de pelo menos dois experimentos
independentes realizados em quadruplicado (n8). CPE, efeito citopático; tipo selvagem.

resistência à série MADTP, avaliamos o efeito de CHVB-032 e CHVB-066 nas atividades

enzimáticas de nsP1 recombinante purificado. Como as tentativas de purificar a nsP1
recombinante do CHIKV a partir deEscherichia colinão conseguiu obter proteína
enzimaticamente ativa,em vitroforam utilizados ensaios com nsP1 purificado de VEEV (15) e
vírus Semliki Forest (SFV) (16). Oem vitroA atividade GTase do VEEV nsP1 foi quantificada
medindo a formação do m7Complexo GMP-nsP1 por Western blotting, usando m7GTP como
substrato e anti-m3G/m7Anticorpo Gp para detecção. A atividade MTase do VEEV nsP1 foi
quantificada por um ensaio baseado em filtro usando3H-S-adenosilmetionina (SAM).
CHVB-066 inibiu a atividade GTase de VEEV nsP1 de maneira dependente da concentração

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 30 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

com uma concentração inibitória de 50% (IC5050) de 0,5-M, mais potentemente que o
conhecido inibidor sinefungina (Fig. 6A). A atividade MTase do VEEV nsP1 também foi inibida,
mas o efeito foi menos pronunciado (IC50de 1,9-M) (Fig. 6B). Como o VEEV pertence a um
sorocomplexo diferente do CHIKV, queríamos confirmar a inibição do m7Formação do
complexo GMP-nsP1 usando a proteína nsP1 do SFV, que é geneticamente mais relacionada
ao CHIKV (17). A leitura do ensaio SFV nsP1 é a formação do covalente

TABELA 5Resistência fenotípica de mutantes resistentes a CHVB em comparação com aqueles do vírus
resistente original 4 e rCHIKV wt

CHVB-066 CHVB-032

Cepa CHIKV CE50(-M) Resistência à dobraa CE50(-M) Resistência à dobra

peso 0,65 0,002 1 5,45 1,64 1

S454G 0,38 0,09 1 4,10 0,16 1
W456R 0,76 0,1 1.2 1,76 0,27 1
M703T 0,31 0,01 1 4,53 0,02 1
S454G M703T 0,32 0,01 1 DEb DE
S454G W456R 5,4 0,2 8.3 100 18
S454G W456R M703T 2,6 0,3 4.1 81 10 15
S454G W456R M703T L494P 12 3.7 18,5 100 18
Vírus resistente 4 13 0,4 20 100 18
aA resistência à dobra é CE50variante/CE50peso.
bND, não determinado.

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Figura 5Cinética de crescimento de mutantes resistentes a CHVB-066 versus rCHIKV wt. Células Vero E6 foram
infectadas com CHIKV LS3 wt (círculos preenchidos) e os mutantes duplos (quadrados preenchidos), triplos
(triângulos preenchidos) e quádruplos (triângulos preenchidos) de engenharia reversa em um MOI de 0,1 por 1 h a
37 ° C. Após a infecção, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato quente e o
meio foi substituído por meio essencial mínimo de Eagle – 2% de soro fetal de vitelo. Em intervalos de 6 horas,
amostras do meio foram colhidas e armazenadas a –80°C. 1 h após a infecção, uma amostra foi coletada para
determinar quanto vírus do inóculo permaneceu após a lavagem. Os títulos de vírus nas amostras foram
determinados por ensaio de placas. O experimento representa médias SD de duas infecções independentes tituladas
em duplicata (n4). PFU, unidades formadoras de placas; peso, tipo selvagem; rCHIKV, CHIKV recombinante.

32 M marcado com P7Complexo GMP-nsP1 usando [-32-P]GTP e SAM como substratos de

reação, medindo assim as atividades combinadas da MTase e GTase. Um mutante de sítio
ativo com a substituição D64A foi incluído como controle negativo, uma vez que este mutante
não possui atividade MTase e GTase (18). CHVB-066 e CHVB-032 inibiram completamente a
atividade da proteína wt SFV nsP1 em todas as doses testadas (50-M a 1 mM) (Fig. 7). Estes
dados demonstram que os compostos de CHVB inibem diretamente a atividade enzimática do
nsP1, particularmente a atividade da MTase.

DISCUSSÃO
O limite do mRNA viral é uma modificação pós-transcricional essencial que influencia o
processamento subsequente, a tradução, a exportação nuclear e a estabilidade do mRNA. Os
vírus desenvolveram diferentes estratégias para limitar seus genomas e, assim, imitar a
estrutura da célula hospedeira. Os caps de RNA viral podem ser adquiridos por um
mecanismo de captura de cap (ortomixovírus), ou os vírus podem anexar covalentemente um
peptídeo (picornavírus) ou uma porção cap às suas extremidades 5= (como alfavírus) (19, 20).

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 30 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

As proteínas nsP1 e nsP2 do alfavírus contêm as funções de RNA metiltransferase,
guanililtransferase e trifosfatase que são necessárias para a via de capeamento do RNA viral.
Este mecanismo de limitação de alfavírus é único e prossegue numa sequência que difere do
mecanismo de limitação na célula hospedeira. Primeiro, uma molécula de GTP é metilada
usando SAM como doador de metila e produzindo SAH como subproduto da reação. Na
segunda etapa, o GTP metilado (m7GTP) é transferido para nsP1, liberando pirofosfato e
formando o m7Intermediário covalente GMP-nsP1 (21). Na terceira etapa, o m7O GMP está
ligado ao primeiro nucleotídeo do RNA viral, que foi modificado pela atividade da RNA
trifosfatase do nsP2 para remover o -fosfato (22). Os inibidores que visam esta via única de
capeamento podem ter um efeito limitado no capeamento celular e nas MTases do
hospedeiro (23).
Demonstramos anteriormente, pela primeira vez, que inibidores de pequenas moléculas do

TABELA 6Resistência cruzada de mutantes resistentes ao CHVB contra favipiravir e MADTP-372

Favipiravir MADTP-372

Cepa CHIKV CE50(-M) Resistência à dobraa CE50(-M) Resistência à dobra

peso 115 5.4 1 1,2 0,06 1

S454G W456R 136 7,5 1,2 25 20
S454G W456R M703T 90 8.6 1 DE DE
S454G W456R M703T L494P 142 25 1.2 25 20
aA resistência à dobra é CE50variante/CE50peso.

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FIGURA 6Efeito do CHVB-066 nas atividades enzimáticas do VEEV nsP1. (a) Efeito dose-resposta de CHVB-066 (quadrados preenchidos) noem vitro
guanililação de VEEV nsP1. A sinefungina (círculos preenchidos) foi incluída no ensaio como composto de referência. A formação do complexo m7GMP-
nsP1 foi detectada por Western blotting utilizando um anticorpo anti-metil3/7Gp. (b) Efeito dose-resposta do CHVB-066 (quadrados preenchidos) na
atividade da metiltransferase do VEEV nsP1. O produto nsP1-MTase (3H-metil)GIDP foi medido por um contador de cintilação. Os dados apresentados são
os valores médios SD de dois experimentos independentes.

A maquinaria de capeamento de alfavírus poderia inibir de forma eficiente e completa a replicação

do CHIKV em cultura de células (11). Esta série de compostos com uma estrutura de
triazolopirimidinona, conhecida como série MADTP, inibe a atividade GTase do VEEV nsP1 em umem
vitroensaio. Recentemente, também foi demonstrado que 6=-fluoro-homoaristeromicina e 6=-
fluoro-homoneplanocina A inibem potencialmente a replicação do CHIKV, visando nsP1 (16). Estes
compostos afetaram a atividade MTase do SFV nsP1 em ensaios enzimáticos. Outros relatórios
sobre o CHIKV nsP1 como alvo antiviral foram seguidos, usando métodos de triagem baseados em
alvos. Uma tela de competição nsP1-GTP resultou na identificação de várias moléculas pequenas
capazes de competir com o GTP pelo sítio de ligação nsP1-GTP do CHIKV (24). Em contraste, um

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 30 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

ensaio imunoenzimático para identificar inibidores de CHIKV nsP1 por medida

FIGURA 7Efeito de CHVB-032 e CHVB-066 nas atividades enzimáticas de SFV nsP1. O SFV nsP1 wt purificado foi
incubado por 30 min a 30°C com doses crescentes (50-M a 1 mM) de CHVB-032 ou CHVB-066, a concentração de
solvente presente na dose mais alta do composto, ou seja, 5% de dimetilsulfóxido (VC), ou deixada sem tratamento
(0). O mutante D64A foi utilizado como controle negativo (pista da esquerda). As amostras foram resolvidas em gel
SDS-PAGE a 10% e o covalente [32PM7O produto da reação GMP-nsP1 foi detectado por autorradiografia após
exposição durante a noite. VC, controle de vírus (sem tratamento).

Julho de 2020 Volume 64 Edição 7 e00649-20 aac.asm.org8

Novos inibidores do capeamento de RNA do vírus Chikungunya Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia

garantindo a formação do m7O complexo GMP-nsP1 não resultou na identificação de novos

inibidores (25). Um ensaio semelhante utilizando VEEV nsP1, por outro lado, resultou na
identificação de uma série de moléculas que inibiram a atividade da GTase (em 80%), e
estudos de resistência cruzada indicaram que o seu mecanismo diferia daquele da série
MADTP (23 ). Descrevemos agora uma terceira série de compostos direcionados ao nsP1 do
CHIKV com ainda outra estrutura química, mas com o mesmo alvo da série MADTP, uma vez
que os vírus resistentes ao CHVB eram resistentes cruzadamente ao MADTP-0372 e vice-
versa. O vírus resistente a MADTP descrito transportava a mutação P34S em nsP1, enquanto
os vírus resistentes a CHVB aqui descritos requerem pelo menos duas mutações, S454G e
W456R, em nsP1 para conferir resistência. Curiosamente, durante nossas tentativas iniciais
de produzir estoques de vírus de mutantes recombinantes do CHIKV, notamos o surgimento
da mutação P34S em vírus com a mutação W456R. Como vários mutantes, em particular
aqueles contendo a mutação W456R, exibiram a tendência de reverter para o tipo selvagem
(wt), começamos a cultivar nossos estoques de vírus na presença de compostos para reter
mutações. Sob esta pressão de seleção, a mutação P34S não foi mais identificada pelo
sequenciamento Sanger. Isto pode explicar porque é que a mutação não apareceu durante o
procedimento de selecção de resistência para os compostos CHVB, uma vez que estas
condições podem ter favorecido a presença da mutação W456R em relação à mutação P34S.
Embora uma estrutura cristalina do CHIKV nsP1 não esteja atualmente disponível para apoiar
a nossa hipótese, sugerimos que o resíduo P34 na região N-terminal da proteína está
próximo de W456 na região C-terminal da proteína.
Semelhante à série MADTP, a série CHVB também é específica para CHIKV, com
atividade antiviral nula ou modesta contra outros alfavírus em ensaios baseados
em células. Como a região enzimaticamente ativa do alfavírus nsP1 é bem
conservada, é intrigante que nenhuma das séries seja inativa contra outros
alfavírus. Foi recentemente demonstrado que o vírus Sindbis gera uma grande
quantidade de genomas virais não encapsulados, mais especificamente durante a
fase inicial do ciclo de replicação (26). Não se sabe se o mesmo se aplica ao CHIKV.
Uma possível explicação para a suscetibilidade diferencial dos alfavírus às 2 séries
de compostos é que o CHIKV é muito suscetível a inibidores de capeamento
porque gera mais genomas virais capeados do que outros alfavírus.

Em contraste com a série MADTP, que exigia apenas uma substituição de

aminoácido na posição 34 (P34S) no nsP1 para desenvolver resistência total, a

Baixado de https://journals.asm.org/journal/aac em 30 de agosto de 2023 por 179.183.182.38.

resistência ao CHVB-032 exigia a presença de duas mutações no nsP1, e a
resistência total ao CHVB-066 exigia até mesmo duas mutações adicionais em
nsP2 e nsP3. Além disso, na segunda etapa do protocolo de seleção de resistência,
17% dos poços de cultura apresentaram CPE completo induzido por CHIKV para a
série MADTP (24 poços de 144) versus apenas 2,5% (4 poços de 162) no caso do
Série CHVB. Estes dados sugerem que a barreira à resistência é maior para a série
CHVB e que o desenvolvimento de resistência em contexto clínico é menos
provável de ocorrer, uma vez que são necessárias duas mutações. Além disso, nas
variantes de engenharia reversa,
Em conclusão, relatamos uma nova classe de inibidores de pequenas moléculas da maquinaria de
capeamento do CHIKV. Vários outros inibidores do CHIKV que têm como alvo o capeamento foram
relatados, indicando que o mecanismo de capeamento do vírus é um alvo interessante para o
desenvolvimento de medicamentos antivirais.

MATERIAIS E MÉTODOS
Células, vírus e compostos.Células renais de macaco verde africano (células Vero [ATCC CCL-81], células Vero E6
[ATCC CRL-1586] e células de rim de hamster bebê [BHK-21]) foram mantidas como descrito anteriormente (11).

CHIKV e outras cepas de alfavírus são mencionadas anteriormente (11). CHIKV LS3 (número de acesso GenBank.
KC149888), que foi utilizado para estudos de genética reversa, é derivado de um clone completo de cDNA
pertencente à coleção do Centro Médico da Universidade de Leiden, na Holanda (27).
CHVB-032 e CHVB-066 (Fig. 1) foram sintetizados no laboratório de G. Pürstinger (Universidade de
Innsbruck, Áustria) e T. Langer (Universidade de Viena, Áustria). MADTP-0372 foi sintetizado por MJ

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Pérez-Pérez (Conselho Nacional de Investigação Espanhol [CSIC]) (11). O T-705 (favipiravir) foi adquirido como um
produto de síntese personalizado da BOC Sciences. A cloroquina foi adquirida da Sigma.
Ensaio de redução de CPE.As células Vero foram semeadas a uma densidade de 2,5 - 104em placas de 96 poços
(BD Falcon) e foram deixadas aderir durante a noite. No dia seguinte, as células foram tratadas com uma série de
diluições dos compostos, após o que as culturas foram infectadas com CHIKV-899 (multiplicidade de infecção [MOI]
de 0,01). No dia 5 pós-infecção, a inibição do CPE foi quantificada utilizando MTS/PMS conforme descrito pelo
fabricante (Promega). As células foram verificadas por microscópio quanto a pequenos sinais de CPE induzido por
vírus ou efeitos adversos induzidos por compostos na morfologia da monocamada celular. A concentração eficaz de
50% (CE50), que é definida como a concentração de composto necessária para inibir a morte celular induzida por vírus
em 50%, foi determinada utilizando interpolação logarítmica.
Ensaio de produção de vírusAs células Vero foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 - 104células/
poço. No dia seguinte, as células foram tratadas com diluições em série do composto e depois infectadas com CHIKV-899 (MOI
de 0,01). Duas horas após a infecção, as células foram lavadas para remover o vírus não adsorvido, seguido de incubação com
as mesmas diluições seriadas de compostos. Após 48 h de incubação, os sobrenadantes foram coletados e o RNA viral foi
quantificado por RT-PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), enquanto a quantidade de vírus de progênie infecciosa foi
determinada por ensaio de titulação (dose infecciosa de 50% de cultura celular [CCID50]/ml) conforme descrito anteriormente
(28).
Atraso no ensaio de tratamento.As células Vero foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5
- 104células/poço. No dia seguinte, as células foram infectadas com CHIKV 899 (MOI de 1) durante 1 h a 37°C, após o
que o inóculo viral foi removido e as células foram lavadas 3 vezes com o meio de ensaio. Os compostos
selecionados (20-M CHVB-032, 5-M CHVB-066, 50-M MADTP-0372, 200-M T-705 e 50-M cloroquina) foram adicionados
às células às 0, 2, 4, 6, 8 e 10 horas após a infecção. Às 12 horas após a incubação (isto é, um ciclo de replicação viral),
os sobrenadantes da cultura foram coletados para quantificação da carga de RNA viral extracelular (por qRT-PCR) e
da progênie do vírus infeccioso (por titulação final).
Seleção de isolados de vírus resistentes a compostos.Um protocolo de seleção de resistência clonal de 5
etapas foi utilizado para isolar variantes de vírus resistentes a CHVB como descrito anteriormente (13). Na primeira
etapa, as células Vero foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 2,5 - 104células/poço e foram
deixadas aderir durante a noite. Posteriormente, os ensaios antivirais foram realizados em formato xadrez usando
diluições seriadas de CHVB-032 e diferentes quantidades de CHIKV-899 (variando de 10 a 1.000 CCID50). Após 5 dias
de incubação, todos os poços de ensaio foram verificados microscopicamente. Com base nestes dados, foram
selecionadas a menor concentração de composto e a maior entrada de vírus nas quais foi observada inibição
completa e reprodutível da CPE induzida por vírus. Na segunda etapa, três placas de 96 poços contendo células Vero
aderentes foram tratadas com a concentração selecionada de CHVB-032 de 29-M e depois foram infectados com a
quantidade ideal de vírus (50 CCID50). Após 5 dias, 7 poços de ensaio (de 162) apresentaram sinais de CPE induzido
por vírus, com apenas 4 deles apresentando CPE completo. Os sobrenadantes destes 4 poços foram coletados e
semipurificados 6 vezes por titulação (série de diluições 1:5) na presença de 29-M CHVB-032. Foram selecionados
quatro isolados de vírus (um de cada amostra original) que produziram os sinais mais pronunciados de CPE na
presença de CHVB-032 com a menor entrada de vírus possível. Posteriormente, o fenótipo resistente dos isolados de
vírus selecionados foi determinado em comparação com o vírus do tipo selvagem em ensaios de redução de CPE.
Paralelamente, o genótipo foi determinado pelo sequenciamento completo do genoma.
Ensaios para atividade enzimática do alfavírus nsP1.A sequência de DNA que codifica SFV nsP1 (aminoácidos
1 a 537) com um marcador hexahistidina (6-His) C-terminal foi clonada no vetor pET34. O mutante D64A
recombinante de tipo selvagem e de sítio ativo foi expresso emE. coliCélulas Rosetta (Novagen) após indução

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durante a noite com 0,5 mM de isopropil- -D-tiogalactopiranósido (IPTG) a 19°C. As proteínas recombinantes foram
purificadas em lote por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) usando esferas Talon (Cobalto)
(TaKaRa), e a proteína eluída foi concentrada e usada no m covalente.7Ensaio de formação do complexo GMP-nsP1
(16). Este ensaio foi realizado em um ambiente de 30-l mistura contendo HEPES 25 mM, pH 7,5, ditiotreitol 5 mM, KCl
10 mM, MgCl2 2 mM2, 10-MS-adenosilmetionina (SAM), 0,75 mCi de [-32-P]GTP (3.000 Ci/mmol) e 0,5-M SFV nsP1 wt ou
mutante D64A. A mistura de reação foi incubada a 30°C por 30 min e interrompida pela adição de 3-l de 10% SDS. A
mistura de reação inativada foi misturada com 4-LSB (tampão de amostra Laemmli) e 10--As amostras foram
resolvidas em gel SDS-PAGE a 10%. O gel foi seco e uma tela PhosphorImager foi colocada por cima. Após exposição
durante a noite, o32Covalente marcado com P m7Os produtos intermediários GMP-nsP1 foram visualizados com um
Typhoon Imager (Amersham).
Os protocolos para ensaios de atividade enzimática VEEV nsP1 foram previamente descritos (11). Análise estatística.A
representação gráfica e a análise estatística foram realizadas utilizando o software Prism8 (Graph-Pad).

AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Caroline Collard, Tom Bellon e Nick Verstraeten pela excelente
assistência técnica na aquisição dos dados antivirais.
Este trabalho foi apoiado pelo Programa FP7 da União Europeia sob o acordo de subvenção
SILVER no. 260644 e o acordo de subvenção Marie Curie ITN “EUVIRNA” no. 264286, bem como o
programa de investigação e inovação Horizonte 2020 ao abrigo do acordo de subvenção Marie
Sklodowska-Curie n.º 2020. 642434, Marie Curie ITN “Antivirais”. RA foi financiado por uma bolsa de
pós-doutorado PDM da KU Leuven (PDM 17/178). A fonte de financiamento não teve nenhum papel
na concepção, implementação, análise, interpretação ou decisão de publicação deste estudo.

Não temos conflitos de interesse a declarar.

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Novos inibidores do capeamento de RNA do vírus Chikungunya
LD, JN, MVH e GP supervisionaram o projeto; RA, KK, JM, GQ, BC, LD e
MVH projetou pesquisa; RA, KK, JM, KD, AT, CL e ED realizaram experimentos;
RA, KK, KD, CL, ED, BC e GQ coletaram e analisaram dados; AM, PC, JM, VB,
TL e GP forneceram compostos; RA, KK, JN, MVH e LD escreveram o manuscrito; e AM,
PC, TL e PL prestaram aconselhamento conceptual.
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