R EVIEW

Tecnologia de Processo de Vacina

Jessica O. Josefsberg, 1 Barry Buckland 2
1 BioEdge Consulting, LLC, 100 Jefferson Avenue, Miami Beach, Flórida

2 Departamento de Engenharia Bioquímica, University College London, Torrington Place, Londres,

Reino Unido; telefone: 646-3692034; fax 305-675-2713; e-mail: buckland@biologicb.com

Recebido em 2 de dezembro de 2011; revisão recebida em 24 de fevereiro de 2012; aceito em 27 de fevereiro de 2012

Publicado online em 30 de março de 2012 na Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI 10.1002 / bit.24493

longe da injeção intramuscular tradicional por abordagem de

ABSTRATO: A evolução das vacinas (por exemplo, atenuada ao vivo, seringa.
recombinante) e os métodos de produção de vacinas (por exemplo, in ovo, Biotechnol. Bioeng. 2012; 109: 1443–1460.
cultura de células) estão intimamente ligados uns aos outros. Conforme a 2012 Wiley Periodicals, Inc.
tecnologia da vacina avançou, os métodos para produzir a vacina avançaram
e novas oportunidades de vacinas foram criadas. Essas tecnologias
PALAVRAS-CHAVE: tecnologia de processo de vacinas; fermentação;
continuarão a evoluir à medida que nos empenhamos por vacinas mais
cultura de células; purificação; formulação; manufatura
seguras e imunogênicas e à medida que nossa compreensão da biologia
melhora. A evolução da tecnologia do processo de vacinas ocorreu em
paralelo ao notável crescimento no desenvolvimento de proteínas
terapêuticas como produtos; portanto, as recentes inovações em vacinas
podem alavancar o progresso feito na indústria de biotecnologia mais
ampla. Numerosas vacinas legadas importantes ainda estão em uso hoje,
Introdução
apesar de seus processos de fabricação tradicionais, com desenvolvimento
As primeiras vacinas eram relativamente rudimentares e consistiam em vírus vivo
adicional com foco na melhoria da estabilidade (por exemplo, novos
atenuado parcialmente purificado (por exemplo, varíola, raiva) ou bactérias
excipientes) e na atualização da formulação (por exemplo, vacinas
combinadas) e métodos de aplicação (por exemplo, adesivos para a pele). O inativadas (por exemplo, coqueluche). Com o tempo, métodos mais refinados foram

desenvolvimento de vacinas modernas está atualmente explorando uma
ampla gama de novas tecnologias para criar vacinas mais seguras e eficazes,
incluindo: vetores virais produzidos em células animais, partículas
semelhantes a vírus produzidas em leveduras ou células de insetos,
conjugação de polissacarídeos a proteínas transportadoras, plasmídeos de
DNA produzidos em E. coli, e vacinas terapêuticas contra o câncer criadas por
introduzidos, como o tratamento químico de uma toxina de proteína para formar um
toxóide (por exemplo, tétano, difteria), desenvolvimento de um vírus purificado e
inativado (por exemplo, hepatite A), desenvolvimento de partículas semelhantes a
vírus (por exemplo, , hepatite B, papilomavírus humano) e uso de polissacarídeos
purificados (por exemplo, vacinas pneumocócicas). As vacinas geralmente podem ser

ativação in vitro de leucócitos de pacientes. Os avanços na purificação (por
exemplo, adsorção por membrana, precipitação) estão aumentando a
eficiência, enquanto métodos analíticos inovadores (por exemplo, ensaios
multiplex baseados em microesferas, microarranjos de RNA) estão
melhorando a compreensão do processo. Novos adjuvantes, como o
monofosforil lipídeo A, que atua nos receptores semelhantes a células
classificadas como organismo inteiro, macromoléculas purificadas, antígenos
combinados, vetores recombinantes, peptídeos sintéticos ou DNA, e foram
historicamente introduzidas aproximadamente nesta ordem. À medida que esses
tipos de vacina evoluíram, os processos de produção para produzi-los também
tiveram que evoluir.

apresentadoras de antígenos, estão expandindo a lista anteriormente

conservadora de adjuvantes de vacinas amplamente aceitos. Como em
outras áreas da biotecnologia, a caracterização do processo por análises
sofisticadas é crítica não apenas para melhorar os rendimentos, mas
também para determinar a qualidade final do produto. De uma perspectiva
regulatória, Quality by Design (QbD) e Process Analytical Technology (PAT)
são iniciativas importantes que podem ser aplicadas de forma eficaz a
muitos tipos de processos de vacinas. A demanda universal por vacinas
exige que o fabricante planeje fornecer dezenas e às vezes centenas de
milhões de doses por ano a baixo custo. Para permitir um uso mais amplo,
há um grande interesse em melhorar a estabilidade da temperatura para
permitir excursões de uma rede de frio rígida, especialmente no ponto de
vacinação. Finalmente, há progresso em novas rotas de entrega para mover
especialmente no ponto de vacinação. Finalmente, há progresso em novas
rotas de entrega para mover especialmente no ponto de vacinação.
Finalmente, há progresso em novas rotas de entrega para mover
Correspondência para: B. Buckland
As primeiras vacinas usaram vírus vivos inteiros e transferência
de humano para humano ou animal para humano, como a
inoculação de pus de varíola bovina (vaccinia) de Edward Jenner em
1796, com o objetivo de imunizar contra a varíola mais patogênica
em humanos. Na verdade, a palavra vacinação (latim: vaccinus ¼ vaca)
originou-se desta primeira vacina, uma vez que foi derivada de um
vírus que afeta vacas (Dekleva, 1999). Os métodos de produção
avançaram então para vacinas de vírus vivos atenuados produzidas
in vivo ou in ovo.
As vacinas bacterianas foram criadas por Louis Pasteur na década de
1880, incluindo vacinas para cólera de frango e antraz usando culturas
bacterianas enfraquecidas. A vacina Bacille CalmetteGuerin (BCG) para
tuberculose (TB) foi desenvolvida na mesma época (Bae et al., 2009). A
vacina contra coqueluche contra coqueluche, licenciada em 1918, foi a
primeira

2012 Wiley Periodicals, Inc. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, nº 6, junho de 2012 1443
Tabela I. Um resumo das classificações dos produtos vacinais.

Classificação do produto Vacinas licenciadas Adjuvante

Vírus atenuado vivo Varíola, poliomielite, sarampo, caxumba, rubéola, catapora, rotavírus, Não
herpes zoster, gripe e febre amarela
Vírus purificado inativado Pólio inativada, encefalite japonesa, hepatite A, gripe As vezes
(sazonal e pandêmica), e raiva,
Bactéria viva atenuada tuberculose e febre tifóide Não
Bactéria inteira inativada Coqueluche de célula inteira As vezes
Proteína purificada Tosse convulsa acelular sim
Toxóide de proteína purificada Tétano, antraz e difteria Hepatite B e As vezes
Polissacarídeo purificado de partículas papilomavírus humano Pneumocócica sim
semelhantes a vírus (VLPs) para adultos e febre tifóide Não
Polissacarídeo conjugado com proteína transportadora de Pneumocócica para bebês, hemófilo tipo B e meningite bacteriana em As vezes
DNA de plasmídeo desenvolvimento sim
Entrega de DNA de adenovírus Em desenvolvimento Não

vacina bacteriana inativada de células inteiras. Ele foi
subsequentemente combinado com os toxóides diftérico e tetânico
para fazer a vacina combinada contra difteria, tétano e coqueluche
de células inteiras (DTwP) e está cada vez mais sendo substituído
por uma vacina de subunidade acelular (DTaP) consistindo de
proteínas bacterianas individuais (Rappuoli, 1990). As vacinas de
subunidades proteicas e toxóides surgiram na década de 1930 com
as vacinas contra difteria e tétano, que consistiam em toxinas
bacterianas inativadas com formalina.
O primeiro cultivo in vitro de uma vacina viral foi o vírus da
poliomielite em células humanas não neurais por Enders em 1949,
seguido pela vacina inativada contra poliomielite de Salk em células
primárias de rim de macaco em 1955. Isso marcou o início da moderna
indústria baseada em cultura de células (Aunins et al., 2000). Vacinas de
vírus inteiros, como a vacina anti-rábica atenuada, requerem instalações
(por exemplo, ProQuad 1 ¼ Varicela º MMR) ou para melhorar a
estabilidade do produto (por exemplo, novos excipientes) (Lightfoot
e Moscariello, 2004). Esses produtos geralmente não são protegidos
por patentes, mas a complexidade da manufatura e dos principais
resultados analíticos em uma grande barreira à entrada de novos
concorrentes. Para outras vacinas tradicionais, novas abordagens
de processo estão sendo aplicadas a fim de reduzir ainda mais os
custos. Por exemplo, uma nova vacina de pólio inativada à base de
Sabin está sendo desenvolvida para se mover das cepas de tipo
selvagem Salk para as cepas atenuadas mais seguras de Sabin,
permitindo a otimização do processo, incluindo a aplicação de
métodos modernos de purificação (Bakker et al., 2011). Noutro
Tabela II. Evolução dos processos tradicionais de produção de vacinas e eventos

especializadas para propagação e preenchimento e finalização do vírus relacionados a vacinas.

para garantir a segurança humana. Devido aos riscos de segurança

Ano Evento histórico de vacina
associados às vacinas de células inteiras e de vírus inteiros, os cientistas
1796 Vacina usando inoculação de varíola bovina de animal para humano
começaram a criar vacinas com base em antígenos de patógenos
(varíola)
individuais. Essas vacinas de subunidade são potencialmente mais
1879 Vacina bacteriana viva atenuada (cólera de frango) Vacina viral
seguras, mas geralmente são menos imunogênicas devido à ausência de 1884 atenuada viva cultivada em tecido cerebral (raiva) Vacina preparada a
outros componentes virais e celulares. As vacinas de polissacarídeos 1897 partir de soro de cavalo (peste bubônica) Vacina bacteriana inativada
normalmente contêm polissacarídeos da superfície de um capsídeo 1918 de célula inteira (coqueluche convulsa
tosse)
bacteriano,
1923 Vacina toxóide preparada a partir de toxinas bacterianas inativadas
(difteria)
1931 Vacina liofilizada aprovada pelo FDA (varíola) Vacina
Historicamente, as vacinas foram desenvolvidas usando esses 1949 combinada (difteria, tétano, célula inteira
métodos convencionais que seguem o paradigma de isolar, às vezes pertussis e DTwP)
1949 Vacina viral produzida in vitro com células humanas não neurais
inativar e injetar o patógeno causador da doença ou componente
por Enders (poliomielite)
do patógeno (Tabela II). Alguns desses métodos ainda são usados
1954 O processo de liofilização para vacina contra varíola melhorou muito por
hoje para vacinas administradas a pessoas em todo o mundo Collier para permitir distribuição global
(Aunins et al., 2011). Por exemplo, o processo usado para fazer 1955 Vacina viral inativada produzida in vitro com
vacinas contra difteria ou tétano modernas, com base em toxóides células de rim de macaco (poliomielite)
1962 Linha celular diplóide humana (WI-38) estabelecida por Hay
bacterianos, é uma versão refinada daquele desenvolvido na
1977 ick Último caso de varíola fora do laboratório
década de 1930 e o processo usado para fazer a vacina contra
1986 Vacina de partícula semelhante a vírus recombinante produzida em levedura
sarampo, caxumba e rubéola (MMR) de hoje foi desenvolvido mais (hepatite B)
de 30 anos atrás. Para algumas dessas vacinas importantes, o 1987 Vacina de polissacarídeo-proteína conjugada ( Haemophilus
desenvolvimento do processo adicional concentra-se na solução de gripe b)
1998 Vacina clássica altamente purificada usando purificação biotecnológica
quaisquer problemas de fabricação, bem como no trabalho de
abordagem (hepatite A)
formulação para combinar com outras vacinas

1444 Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, nº 6, junho de 2012

Por exemplo, os processos usados para vacinas contra a
poliomielite evoluíram para a produção em maior escala, com uma
aplicação inicial interessante de microtransportadores em escala
industrial (Montagnon et al., 1984).
É uma história diferente para novas vacinas; existem grandes
incentivos para que novas vacinas sejam mais definidas. Devido ao
desejo global de evitar a exposição a organismos causadores de
doenças, tanto por parte dos pacientes quanto dos fabricantes, a
expressão recombinante de proteínas e vetores virais é o método
de desenvolvimento de vacinas moderno de escolha para remover
patógenos do sistema. As vantagens das vacinas de subunidade e
recombinantes incluem: eliminação virtual dos riscos de segurança,
viabilidade da vacina mesmo com um vírus difícil de cultivar,
componentes de processo definidos, bioprocessos mais controlados
e um processo de produção mais curto (por exemplo, cultura de
células vs. ovo) que é crítico para a resposta à pandemia (Buckland,
2005; Eisenstein, 2011). Um exemplo é Recombivax HB 1, uma vacina
contra hepatite B que foi a primeira vacina de DNA recombinante
licenciada. A vacina original foi feita purificando as partículas de
vírus do sangue infectado; foi revolucionário ser capaz de substituir
isso com a abordagem recombinante inerentemente segura de
expressar o antígeno de superfície da hepatite B em
Saccharomyces cerevisiae.
Várias novas abordagens de desenvolvimento de vacinas
passaram a ocupar o primeiro plano na última década. A
vacinologia reversa é uma abordagem que usa a análise do genoma
para identificar o repertório completo de antígenos que são
expostos à superfície e altamente conservados antigenicamente em
várias cepas. Os epítopos mais imunogênicos, uma vez
sequenciados, são tipicamente patenteados e avaliados quanto à
adequação em várias formulações de vacinas. Um exemplo são as
vacinas contra a gripe em desenvolvimento, baseadas em antígenos
da proteína hemaglutinina recombinante, em vez de vírus vivo
atenuado. A biologia de sistemas é outra abordagem que integra
vários campos de estudo para explorar as interações entre
diferentes sistemas biológicos. Usando modelos matemáticos para
avaliar os dados coletados em vários campos, como
transcriptômica, metabolômica e proteômica, os cientistas podem
começar a elucidar as causas e efeitos nas redes biológicas. Isso
pode levar a uma maior compreensão de como os antígenos da
vacina interagem com os diferentes componentes do sistema
imunológico. Usando as abordagens científicas acima, vacinas
racionalmente projetadas são criadas, geralmente no nível da
sequência de aminoácidos, para apresentar antígenos por meio de
vias intracelulares específicas.
Usando técnicas semelhantes, foram desenvolvidas vacinas
inovadoras de partículas semelhantes a vírus (VLP), como o
Gardasil 1 e Cervarix 1, eficaz contra o vírus do papiloma humano
(HPV) e câncer cervical associado. Apesar dessas inovações,
muitas outras doenças continuam a iludir os cientistas de
vacinas. Patógenos com alta variabilidade antigênica que
podem exigir imunidade dependente de células T, como os da
malária, TB e HIV, continuam a causar sofrimento humano. O
desenvolvimento de vacinas eficazes e duradouras para
doenças como essas continuará a exigir novas abordagens para
o projeto e a produção de vacinas (Rinaudo et al., 2009). Este
artigo enfoca a produção, purificação, análise,
formulação e entrega de inovações no campo de vacinas
que surgiram na última década.
Vacinas baseadas em vírus e vetores virais
Muitas vacinas virais foram originalmente produzidas em linhas de
células primárias, que são células obtidas diretamente de órgãos e
tecidos de animais. As células diplóides são derivadas de culturas
primárias e podem ser passadas em série, embora mantenham sua
dependência de ancoragem e expectativa de vida limitada (40-60
passagens) (Sureau, 1987). Essas características tornam difícil
manter uma alta densidade celular por um período de tempo
prolongado, o que leva a desafios no projeto do biorreator, como
foi o caso do desenvolvimento da vacina VAQTA contra hepatite A
com células diplóides MRC-5 em frascos rolantes (Armstrong et al.,
1993).
As linhas celulares contínuas se originam de células diplóides
que sofreram uma transformação cromossômica para permitir que
se dividam indefinidamente. Aqueles que podem ser usados para a
produção de vacinas virais se enquadram em duas categorias. A
primeira são as linhas celulares convencionais, como células Vero
derivadas de rim de macaco verde africano, células Madin-Darby
Canine Kidney (MDCK) ou células PBS-1 (HepaLife Technologies,
Boston, MA) que são cultivadas de forma aderente em garrafas
giratórias, NUNC fábricas de células (Thermo Scienti fi c, Roskilde,
Dinamarca), ou em microtransportadores, ou em culturas em
suspensão em biorreatores de tanque agitado ou biorreatores de
ondas descartáveis. A segunda categoria são as linhas de células
humanas proprietárias, como PER.C6 1 ( Johnson & Johnson, Leiden,
Holanda), AGE1.CR 1 ( ProBiogen, Berlim, Alemanha) e EB14 1
(Vivalis, Nantes, França) que são normalmente cultivados em
culturas de suspensão em meio sem soro (Genzel e Reichl,
2009).
A linha celular Vero foi a primeira linha celular contínua de
mamífero, estabelecida a partir de macacos verdes africanos
em 1962, e é atualmente a mais amplamente aceita por
autoridades regulatórias para o desenvolvimento de vacinas
devido ao fato de que vacinas humanas derivadas de Vero estão
em uso há quase 30 anos. Eles podem ser cultivados e
infectados em grânulos de microtransportadores em
fermentadores de grande escala (6.000 L relatados) e em meio
sem soro sem perda de produtividade (Barrett et al., 2009).
Várias vacinas inovadoras produzidas em células Vero foram
licenciadas, incluindo a vacina contra varíola ACAM2000 1 ( Sano fi
Pasteur, Lyon, França) e as vacinas pediátricas contra rotavírus
Rotateq 1 ( Merck, Whitehouse Station, NJ) e Rotarix 1 ( GSK,
Brentford, Middlesex, UK), todos os quais são vacinas de vírus
atenuados vivos. Também produzida a partir de células Vero
está a vacina contra a gripe pandêmica H5N1 Pre fl ucel 1 ( Baxter,
Deerfield, IL) e a vacina contra encefalite japonesa Ixiaro 1 ( Intercell,
Vienna, Austria), ambos produzidos a partir de vírus inativados.
Os vetores virais permitem a expressão simultânea de vários
determinantes antigênicos, evitando os riscos de segurança associados
ao uso de todo o vírus patogênico (Liniger et al., 2007). Os vetores virais
de DNA que foram usados em sistemas de distribuição antigênica
incluem poxvírus,
Josefsberg e Buckland: Tecnologia de Processo de Vacina 1445
Biotecnologia e Bioengenharia
herpesvírus e adenovírus, enquanto vetores virais de RNA,
como retrovírus e avivírus, também foram estudados (Geels e
Ye, 2010). Os vetores virais têm a vantagem de serem capazes
de induzir imunidade mediada por anticorpos e células T na
ausência de um adjuvante, não requerem desenvolvimento de
purificação complexa, podem ser capazes de gerar antígenos
com conformação nativa e podem ser capazes de entregar mais
do que um gene (por exemplo, vários antígenos de diferentes
estágios da vida do parasita que poderiam induzir uma ampla
imunidade protetora) (Li et al., 2007).
Os vetores de adenovírus são um dos vetores de entrega de
genes mais promissores para vacinas porque são eficientes na
entrega de DNA às células-alvo, têm grande capacidade de
incorporação de cassetes de expressão de cDNA e têm baixo
potencial para oncogênese porque não inserem seu genoma
em o DNA do hospedeiro (Subramanian et al., 2007).
Adenovírus foram produzidos em PER.C6 1, HEK293 e linhas
celulares A549, embora PER.C6 1 é o mais comum, apesar de seu
número limitado de gerações. PER.C6 1 as células podem ser
cultivadas de forma aderente ou em cultura em suspensão, a
última tendo padrões de crescimento semelhantes em grandes
biorreatores às células de ovário de hamster chinês (CHO), com
a complicação adicional de uma etapa de infecção durante a
fase de crescimento exponencial. O desafio de cultivar um vírus
que foi projetado para ser incapaz de replicação foi resolvido
usando uma abordagem de engenharia metabólica envolvendo Figura 1. Processo de produção de adenovírus desenvolvido pela Merck envolvendo a
a exclusão da região E1 necessária do vírus e a subsequente infecção de PER.C6 1 células de mamíferos com vetores virais rAd5 contendo o HIV-1 p55

inserção na linha celular hospedeira (Maranga et al., 2005;
Singh e Kostarelos , 2009). O resultado é que o adenovírus
recombinante se replica bem na célula hospedeira específica,
mas não se replica após a injeção no paciente.
Uma cultura de células em grande escala e um processo de
infecção foram desenvolvidos na Merck para um vetor de
adenovírus recombinante tipo 5 (rAd5) que expressa o HIV-1 mordaça
gene em suspensão PER.C6 1 células, conforme mostrado na Figura 1
(Xie et al., 2003). Este processo foi dimensionado para 250 L nas
condições de pior caso de pulverização projetadas para a escala de
10.000 L, que era a escala projetada para implementação se esta
vacina contra o HIV proposta (p55 mordaça transgene) foi
comercializado. O processo inclui uma etapa para a remoção do
surfactante polissorbato-80 e a adição de Pluronic F-68, um
polímero não iônico que reduz o dano celular ocorrido durante a
pulverização. Em 2007, a mesma equipe desenvolveu um processo
diferente para produção de vetores rAd5 em PER.C6 1 células que
contornam as etapas demoradas de clonagem e passagem de vírus.
Este processo envolve a transfecção de células PER.C6 aderentes
com plasmídeo de adenovírus clonado por bactérias usando
coprecipitação de fosfato de cálcio (Subramanian et al., 2007). As
células foram cultivadas e transfectadas em fábricas de células
NUNC com um nível de produção de> 5 10 10 VP por bandeja NUNC,
obtido 1 mês a partir do momento da construção do plasmídeo.
Poucos candidatos a vacinas preventivas contra o HIV chegaram
aos testes de Fase III e nem todos conseguiram provar uma eficácia
satisfatória. O primeiro se chamava AIDSVAX. A VaxGen começou os
testes da AIDSVAX B / E na Tailândia em combinação com a vacina
Aventis Pasteur, ALVAC-HIV, que usava elementos genéticos de
várias cepas de HIV diferentes encapsuladas em um
mordaça transgene. [A figura colorida pode ser vista na versão online deste artigo, disponível em
http://wileyonlinelibrary.com/bit]
vetor inofensivo do vírus da varíola dos canários. A eficácia variou de
26,1% a 31,4%, muito baixo para ser considerado bem-sucedido,
mas os resultados são considerados um marco importante. A
segunda vacina candidata de Fase III foi a vacina baseada em rAd5
desenvolvida pela Merck. Nos ensaios STEP e Phambili HIV, a vacina
falhou em proteger indivíduos soronegativos para Ad5 contra a
infecção e ambos os ensaios foram interrompidos em setembro de
2007 (Iaccino et al., 2008).
A precipitação do polietilenoglicol (PEG) e a extração por
solvente já existem há algum tempo e ainda são
componentes-chave na purificação de muitas vacinas virais.
Por exemplo, ambos são usados na purificação da vacina
VAQTA (Merck) da hepatite A inativada por formalina
altamente purificada, onde a cromatografia e a precipitação
de PEG concentram o vírus, com subsequente extração com
clorofórmio causando desnaturação irreversível de
proteínas contaminantes na interface, retendo vírus da
hepatite A viável na fase aquosa (Hagen et al.,
1997). Durante o desenvolvimento do VAQTA, a etapa de precipitação do
PEG foi considerada sensível a pequenas mudanças nas condições de
crescimento e colheita. O trabalho de desenvolvimento adicional indicou
que os ácidos nucléicos estavam agregando durante a etapa de
concentração na membrana e estavam coprecipitando com o vírus. Essas
quantidades variáveis de ácidos nucléicos levaram à recuperação
inconsistente do vírus e à pureza do produto. O uso de nuclease no
lisado bruto diminuiu o tamanho molecular de

1446 Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, nº 6, junho de 2012

os ácidos nucléicos e reduziu sua coprecipitação com o vírus.
Após a etapa de adição de nuclease com cromatografia de troca
aniônica (AEX), foi possível otimizar ainda mais o rendimento e
a pureza, bem como a reprodutibilidade do processo
aprimorada (Hagen et al., 1996).
Vacinas contra a gripe - Evolução dos processos
de produção de vacinas
A primeira vacina contra a gripe foi desenvolvida em 1937 como uma vacina de vírus
inteiro inativada. Desde então, progrediu para vacinas vivas atenuadas contra a gripe
(LAIV) e vacinas divididas purificadas, seguidas por uma vacina com antígeno de
superfície purificada, todas produzidas em ovos fertilizados. A vacina da gripe desde
então evoluiu deste processo in ovo que envolve um longo tempo de produção e
capacidade limitada, para processos de cultura de células que são de baixo
rendimento e intensivos em capital, para novas tecnologias, como antígenos
recombinantes, VLPs e o uso de adjuvantes avançados como os agonistas do
receptor Toll-Like (TLR) (Price, 2011). Essa evolução continua a ser impulsionada pelo
risco de uma pandemia de influenza, especialmente com os tipos H5N1 e H1N1, e a
demanda geral por vacina praticamente dobrou desde 2009 (Gregersen et al., 2011).
As estimativas atuais indicam que a disseminação global pode ocorrer em 6 meses,
que é aproximadamente o período necessário para a produção da vacina in ovo e os
breves estudos clínicos necessários na Europa (Hoare et al., 2005). Muitos países sem
capacidade de vacinas baseadas em vírus não podiam se dar ao luxo de instalar
instalações de produção apenas para uma possível pandemia. As novas tecnologias
de vacinas recombinantes com prazos de produção mais curtos e / ou baseadas em
tecnologias de plataforma podem ser usadas para resolver problemas de capacidade
em todo o mundo.
As proteínas de superfície da gripe e os peptídeos de maior
interesse atual, mostrados na Figura 2A, incluem os domínios
hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), matriz central 1 (M1) e
matriz central 2 (M2) (Amorij et al., 2008 ) Os anticorpos
neutralizantes e bloqueadores do receptor contra HA são os
principais meios de proteção, enquanto os anticorpos contra NA
parecem desempenhar um papel secundário. As vacinas sazonais
contra a gripe humana atualmente licenciadas contêm uma divisão
inativada dos antígenos virais da gripe H1N1, H3N2 e da gripe B
para promover a proteção de anticorpos específicos para subtipos
de HA e NA e cepas (Barrett et al., 2009). Há pouca ou nenhuma
proteção cruzada conhecida contra cepas derivadas dentro de
subtipos ou para outros subtipos (Bright, 2011).
A produção de LAIV baseada em cultura de células oferece as vantagens de
ciclos de produção mais curtos, maior controle de processo, substratos de
produção bem caracterizados e fornecimento de maiores quantidades de
vacina em um período de tempo mais curto (Aggarwal et al., 2011; George et
al., 2010; Liu et al.,
2009). A desvantagem é a produtividade relativamente baixa e um
longo período de adaptação do vírus, o que seria problemático
durante uma pandemia. O uso de vírus vivos também requer um
nível mais alto de contenção de biossegurança.
As células hospedeiras mais comuns usadas para vacinas contra
a gripe são células MDCK que são cultivadas e infectadas em
grânulos de microtransportadores ou em cultura em suspensão. As
células MDCK demonstram um alto grau de robustez, são
facilmente adaptadas a diferentes formulações de meio, podem
tolerar uma ampla faixa de pH e são menos sensíveis à aeração do
que outras linhas celulares (Genzel e Reichl, 2009). Existem
atualmente duas vacinas contra a gripe sazonal licenciadas,
fabricadas em células MDCK. Abbott (adquiriu a Solvay
Pharmaceuticals em 2009) In fl uvac TC 1 foi licenciado na Holanda
em 2001, enquanto o Opta fl u da Novartis 1 foi aprovado na UE em
2007. Novartis também produz Celtura 1 com base na cepa H1N1
para uso em pandemias. In fl uvac TC 1 é produzido em cultura
aderente, enquanto Opta fl u 1 e Celtura 1 são produzidos em cultura
em suspensão.
As tecnologias recombinantes provavelmente se tornarão o caminho
do futuro para as vacinas contra a gripe, uma vez que os processos
upstream são rápidos em comparação com a produção in ovo e cultura
de células e devido ao fato de que evitam o manuseio de vírus vivos e a
dispendiosa contenção de biossegurança associada. Um processo
recombinante também permitiria a clonagem rápida de uma nova cepa e
o uso de instalações de produção não especializadas para aumentar a
capacidade durante uma pandemia.
O sistema de vetor de expressão de baculovírus (BEVS) é uma
excelente opção para a produção de vacinas contra influenza
recombinantes, uma vez que envolve a infecção de células de
inseto com baculovírus, que são inerentemente seguras porque
não se replicam em células de mamíferos (Wang et al., 2006) .
Além disso, virtualmente nenhum agente adventício conhecido
pode se replicar em células de inseto e células de mamíferos.
Protein Sciences Flublok 1 é a primeira vacina contra influenza
HA recombinante (trivalente) produzida em BEVS e está
atualmente em revisão para aprovação nos EUA. Se aprovada,
seria a primeira vacina recombinante contra a gripe licenciada.
A Figura 2B mostra o processo de produção para Flublok 1,
que envolve clonagem padrão, cultura de células e procedimentos de
purificação (Cox, 2010; Cox e Hollister, 2009). O gene HA de um novo vírus da
gripe é clonado diretamente em um vetor de expressão de baculovírus. O
baculovírus recombinante é então usado para infectar células de inseto em
biorreatores agitados em grande escala. Após a expressão da proteína, as
células infectadas são colhidas por centrifugação e o antígeno é coletado por
extração com detergente. O HA é purificado por duas etapas de cromatografia
em coluna e duas etapas de filtração. O tempo desde a aquisição da sequência
de DNA para uma nova cepa da gripe até a produção de uma proteína em
forma de roseta é rápido usando essa tecnologia. Existem muitas
semelhanças, tanto a montante como a jusante, entre os
expres Processo de célula de inseto SF (derivado de células Sf9) e um processo
de fabricação de anticorpo baseado em CHO. Isso cria um cenário plausível no
qual uma instalação existente com base em CHO poderia ser usada para fazer
vacina contra a gripe, uma vez que o processo é prontamente escalonável
para grandes biorreatores de tanque agitado.
Várias outras empresas estão desenvolvendo vacinas contra a gripe
recombinantes em sistemas de expressão padrão também. Novavax explora
vários antígenos de superfície da gripe em sua vacina VLP, que também é
produzida em BEVS; consiste em uma casca de proteína decorada com
antígenos HA, NA e M1 (Extance, 2011; Singhvi, 2010). A empresa VaxInnate
Josefsberg e Buckland: Tecnologia de Processo de Vacina 1447
Biotecnologia e Bioengenharia
Figura 2. Painel A: Partícula do vírus da gripe mostrando os peptídeos de superfície de maior interesse na pesquisa atual da vacina da gripe: proteína básica da polimerase 1 (PB1), proteína
básica da polimerase 2 (PB2), proteína ácida da polimerase (PA), hemaglutinina (HA), nucleoproteína (NP), neuraminidase (NA), matriz 1 (M1), matriz 2 (M2), proteína não estrutural 2 (NS2) e
proteína não estrutural 1 (NS1). Painel B: Esquema do processo de produção e purificação para FluBlok 1, uma vacina contra influenza HA produzida no sistema de vetor de expressão de
baculovírus (BEVS) pela Protein Sciences. [A figura colorida pode ser vista na versão online deste artigo, disponível em http://wileyonlinelibrary.com/bit]

usa recombinante E. coli para expressar HA na forma de uma
proteína de fusão agonista-antígeno de TLR, que demonstrou forte
potência em um décimo de uma dose humana padrão. As proteínas
de fusão agonista-antígeno de TLR mimetizam a infecção natural ao
apresentar simultaneamente um agonista de TLR e um antígeno na
mesma célula apresentadora de antígeno (APC). O processo de
fermentação bacteriana requer aproximadamente 3 semanas e
pode usar as instalações de fabricação de procariotos existentes em
todo o mundo, permitindo um aumento rápido da capacidade em
resposta a uma pandemia (Shaw, 2006). Tanto a Novavax quanto a
VaxInnate receberam contratos do governo dos Estados Unidos da
BARDA em fevereiro de 2011, totalizando US $ 215 milhões, que
usarão para levar suas respectivas vacinas para os testes de Fase III
(Young, 2011).
Outras abordagens de vacina contra gripe recombinante incluem
HA administrado por um vetor viral recombinante modificado
(Vaxin, Birmingham, AL) e um vetor de DNA plasmidial (P fi zer,
New York, NY). Várias vacinas universais baseadas no peptídeo
M2e (constante em todas as cepas de gripe) também estão em
desenvolvimento, incluindo duas por Acambis / Sano fi Pasteur
e VaxInnate (Price, 2011).
Vacinas Conjugadas
As vacinas conjugadas combinam um antígeno de patógeno com uma
proteína transportadora que confere imunogenicidade adicional à vacina. Por
exemplo, a eficácia de três vacinas contra patógenos bacterianos
encapsulados, Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, e Haemophilus
in fl uenzae tipo b (Hib), foi significativamente aprimorado pela ligação
covalente (conjugação) dos polissacarídeos (PS) no original

1448 Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, nº 6, junho de 2012

vacinas com proteínas carreadoras (Frasch, 2009). Vacinas contra
febre tifóide com base no polissacarídeo Vi de Salmonella typhi
também foram melhorados pela conjugação com várias proteínas
transportadoras (Knuf et al., 2011; Thiem et al., 2011), incluindo toxóides
do tétano ou difteria, subunidade B da toxina da cólera ou mutante
recombinante Pseudomonas aeruginosa exoproteína A (rEPA). Embora
essas vacinas conjugadas específicas sejam não recombinantes e exijam
a fermentação dos patógenos originais em uma instalação de maior
nível de biossegurança, elas representam um avanço na tecnologia de
vacinas. As vacinas PS estimulam anticorpos bactericidas anticapsulares,
que fornecem boa imunogenicidade de curto prazo, mas não têm a
capacidade de montar uma resposta imunológica adequada em crianças
menores de 2 anos de idade. As vacinas de PS conjugadas desencadeiam
uma resposta de antígeno dependente de células T (células T auxiliares
promovem a ativação de células B) que induz imunidade de longo prazo.

Existem cinco proteínas transportadoras principais usadas em

vacinas hoje: toxóide do tétano (TT), toxóide da difteria (DT),
material de reação cruzada 197 (CRM197), N. meningitides proteína
da membrana externa (OMP), e não tipificável H. influenza
proteína D derivada (PD). As vacinas conjugadas contra Hib, meningocócica e
pneumocócica mostraram boa segurança e imunogenicidade, independentemente
da proteína carreadora usada, embora os dados sejam conflitantes quanto a qual
proteína é mais imunogênica e as implicações do tamanho da proteína não sejam
claras. No futuro, a produção de vacinas geneticamente desintoxicadas
provavelmente se tornará mais amplamente utilizada à medida que o mecanismo de
ação se torna mais bem compreendido (Bae et al.,

Figura 3. Um processo típico para a produção de uma vacina conjugada multivalente em que os
2009).
polissacarídeos são produzidos individualmente por fermentação, individualmente conjugados a uma
No processo de conjugação, conforme mostrado na Figura 3, o PS proteína transportadora, individualmente purificada e, em seguida, combinados na formulação final.

purificado deve primeiro ser modificado quimicamente para gerar grupos
reativos que podem se ligar à proteína, por exemplo, com periodato ou
1-ciano-4-dimetilaminopiridínio (CDAP). Vários fatores, incluindo impurezas de
baixo peso molecular na proteína e proporção de PS para proteína subótima,
podem resultar em conjugação ineficiente com menos de 20% do PS ativado
se tornando conjugado (Lee et al., 2009). Métodos de conjugação mais
recentes foram desenvolvidos recentemente (adição de hidrozonas a grupos
carboxila ou oximas a grupos amino) que envolvem a geração de grupos
altamente reativos tanto no PS quanto na proteína carreadora e têm
rendimentos próximos a 50% (Lees et al., 2006).
Prevnar 13 1 é uma vacina pneumocócica da P fi zer, licenciada em
2010, que contém PS da membrana celular de 13 sorotipos
bacterianos conjugados à proteína carreadora diftérica CRM197,
uma variante não tóxica da toxina diftérica (Cooper et al., 2011).
Cada PS é fabricado de forma independente com combinação
subsequente durante o processo de formulação, exigindo quase um
ano desde a fabricação até o lançamento. O número de sorotipos
torna os aspectos analíticos e de fabricação desta vacina
particularmente complexos.
Ancora está explorando atualmente uma abordagem sintética
para a produção de carboidratos, que oferece as vantagens de
purificação mais fácil (versus antígenos de carboidratos naturais),
opções de fabricação aprimoradas e a adição de uma âncora para
conjugação conveniente a uma proteína transportadora. Um
exemplo foi recentemente descrito para fazer um sintético
[A figura colorida pode ser vista na versão online deste artigo, disponível em
http://wileyonlinelibrary.com/bit]
oligossacarídeo para Streptococcus do Grupo A (GAS) que foi subsequentemente
conjugado com CRM197 e mostrou imunogenicidade promissora em camundongos
(Kabanova et al., 2010).
Vacinas de DNA
As vacinas de DNA podem levar a uma resposta imune forte e
duradoura por meio da inoculação de um plasmídeo contendo
um gene para um antígeno proteico específico, que é
subsequentemente expresso pela maquinaria celular da pessoa
que recebe a vacina. As vacinas de DNA oferecem o potencial
para imunoterapia de doenças como tumores porque podem
induzir uma resposta de linfócitos T citotóxicos para apoptose
específica de antígeno de células infectadas (Polakova et al.,
2009). Embora apenas vacinas veterinárias de DNA tenham sido
aprovadas até o momento (por exemplo, vacina eqüina para
proteção contra o vírus do Nilo Ocidental), existem inúmeras
vacinas de DNA em vários estágios de desenvolvimento para alvos
como HIV, câncer e esclerose múltipla (Stuve et al. , 2007).
A produção de plasmídeos de DNA por fermentação bacteriana
em grande escala é relativamente simples. O principal desafio do
processo reside no desenvolvimento eficaz e econômico

Josefsberg e Buckland: Tecnologia de Processo de Vacina 1449

Biotecnologia e Bioengenharia
protocolos de purificação celular, dificultados porque o DNA de
plasmídeo superenrolado é bastante semelhante em tamanho
e estrutura ao RNA contaminante, DNA genômico e DNA de
plasmídeo circular aberto que são liberados na lise celular junto
com o produto de DNA superenrolado.
Para satisfazer as diretrizes regulatórias para vacinas de DNA, o
DNA plasmídico (pDNA) deve ser uma preparação homogênea e
altamente purificada de plasmídeos circulares superenrolados
covalentemente fechados (ccc). A purificação para este nível de
qualidade é cara e pode representar a maior parte dos custos
operacionais totais.
A Figura 4 mostra várias das estratégias de purificação de pDNA mais
frequentemente usadas, todas as quais começam com centrifugação
Figura 4. Processos de purificação de DNA de plasmídeo relevantes para a preparação
em larga escala de vacinas de DNA. [A figura colorida pode ser vista na versão online deste
artigo, disponível em http://wileyonlinelibrary.com/bit]
1450 Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, nº 6, junho de 2012
ou, mais comumente, filtração da massa celular de fermentação
para reduzir o volume geral (Freitas et al., 2009; Hoare et al., 2005;
Lis e Schleif, 1975; Murphy et al., 2005; Stadler et al., 2004 ; Williams
et al., 2009). Se a centrifugação for usada, uma centrífuga de tigela
sólida foi considerada preferível a uma centrífuga de pilha a disco,
que tem um estágio adicional de alta tensão de descarga do bico
para a tigela inferior (Kong et al., 2008). O DNA degradado adicional
resultante da descarga do bocal não foi efetivamente removido
durante a fl oculação e levou ao aumento da incrustação das
colunas cromatográficas. Também foi descoberto que uma etapa de
congelamento / descongelamento ou uma retenção prolongada de
células frescas em tampão de ressuspensão após a colheita resultou
em níveis mais elevados de DNA contaminante. O uso de um
geneticamente modificado E. coli com um endA a mutação de
deleção pode superar parte dessa degradação do DNA.
Isso é seguido por uma lise baseada em calor, alcalina ou
mecânica das paredes das células bacterianas para liberar os
plasmídeos em solução (Cheetham et al., 1982). A lise de calor é
um método relativamente simples que pode fazer uso de
trocadores de calor industriais padrão, reduzindo assim os
custos de capital. Ele tem a desvantagem de exigir uma
quantidade significativa de lisozima cara para muitos
protocolos, embora um método de lise por calor sem lisozima
tenha sido relatado que dá um rendimento comparável a um
método alcalino (Wang et al., 2002). Também há relatos do uso
de autolítico E. coli cepas que expressam lisozima (endolisina)
no citoplasma, que é liberada para o periplasma após a indução
(Carnes e Williams, 2007).
A precipitação é um método de separação sólido-líquido que pode
lidar com volumes muito grandes. A precipitação fracionada com o
detergente catiônico brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) isola ccc
pDNA não apenas de proteínas, RNA e endotoxina, mas também DNA
genômico hospedeiro e formas relaxadas e desnaturadas do plasmídeo
(Lander et al.,
2002). O ccc pDNA pode então ser dissolvido seletivamente em uma
concentração de sal controlada como uma etapa de recuperação
inicial. Usar a concentração mínima de sal necessária para dissolver
o pDNA permite que quaisquer impurezas remanescentes não
removidas pelas precipitações anteriores sejam separadas em uma
forma insolúvel e filtrável. Como a precipitação e a dissolução são
operações unitárias convencionais, o aumento de escala da
fabricação é relativamente simples. A Figura 5 é um gráfico de
Lander et al. (2002) que mostra a concentração padronizada (% p /
v) de CTAB necessária para a precipitação de várias formas de
plasmídeo e DNA genômico. Este gráfico ilustra que há uma
concentração específica de CTAB na qual as formas contaminantes
de DNA de plasmídeo precipitam, mas o produto de plasmídeo
superenrolado permanece solúvel.
O silicato de cálcio hidratado (girolita) adsorve seletivamente
as impurezas de DNA, incluindo DNA genômico e circular
aberto, deixando o ccc pDNA em solução (Winters et al.,
2003). Esta etapa de adsorção seletiva frequentemente segue métodos
de precipitação, pois a girólita também adsorve surfactantes das etapas
de processamento a montante, como CTAB e Triton X-100, bem como
endotoxina. Como a girólita é muito mais barata do que as resinas
cromatográficas de poros largos convencionais, seu uso na purificação
de plasmídeos é escalonável e econômico.
 cepas de engenharia de S. cerevisiae. A Figura 6 mostra um
processo para a produção de HBsAg começando com a
fermentação de S. cerevisiae em um meio de fermentação
complexo (Dekleva, 1999; Geels e Ye, 2010; Kee et al.,
2008). A proteína HBsAg é liberada na solução após o
rompimento das células e extração com detergente, e então
purificada por uma série de métodos físicos e químicos,
incluindo adsorção de sílica pirogênica, cromatografia de
interação hidrofóbica e várias etapas de ultrafiltração (não
mostradas). A proteína purificada é tratada em uma solução de
tiocinato de potássio com formaldeído e então co-precipitada
com sulfato de alumínio e potássio (alúmen).

Figura 5. Gráfico de Lander et al. (2002) exibindo a solubilidade de formas superenroladas,

circulares abertas e multiméricas de DNA de plasmídeo e DNA genômico como uma função da
concentração de CTAB no lisado clarificado. A concentração de DNA total (formas de plasmídeo mais
DNA genômico) foi medida por ensaio de HPLC. A concentração de DNA genômico foi medida usando
o ensaio qPCR. A porcentagem de DNA de plasmídeo superenrolado de ensaios em gel de agarose
ilustra que as formas de plasmídeo circular aberto e multimérico e o DNA genômico precipitam antes
do DNA de plasmídeo superenrolado. As barras de erro são baseadas em medições duplicadas de
ensaios de gel de agarose e qPCR.

Partículas semelhantes a vírus

VLPs são proteínas estruturais virais que são expressas em células e

possuem epítopos conformacionais nativos. No entanto, as VLPs
são vacinas de subunidade que não contêm um genoma e são
incapazes de disseminar a infecção. As VLPs têm uma estrutura
antigênica repetitiva que é capaz de estimular com eficiência as
respostas imunes celulares e humorais (Bolhassani et al., 2011; Roy
e Noad, 2008). Potencialmente, as VLPs também podem servir como
excelentes moléculas transportadoras para a entrega de epítopos
em vacinas. Trabalhos notáveis nesta área incluem partículas
nucleares de hepatite B, VLPs de HPV e VLPs de parvovírus exibindo
epítopos específicos de células T de outra proteína em seu capsídeo
(Cook et al., 1999).
Recombivax HB 1 para prevenção da infecção por hepatite B foi a
primeira vacina de proteína recombinante para uso humano,
licenciada nos Estados Unidos em 1986 pela Merck. Engerix-B da
GlaxoSmithKline (GSK) é uma vacina semelhante que foi licenciada
logo depois. Essas foram consideradas vacinas revolucionárias na
época, porque foram as primeiras a usar partículas semelhantes a
vírus (VLPs) e porque foram indiscutivelmente as primeiras vacinas
anticâncer (a infecção por hepatite B aumenta a incidência de
câncer de fígado). Eles substituíram uma vacina anterior contra a
hepatite B produzida pelo processo de trabalho intensivo de
purificação do antígeno do sangue de doadores infectados. Havia
uma grande urgência para desenvolver essas novas vacinas
Figura 6. Processo de fabricação de vacina contra hepatite B recombinante que envolve
recombinantes devido ao advento da infecção pelo HIV na a fermentação de cepas geneticamente modificadas de Saccharomyces cerevisiae
população em geral, o que levantou questões adicionais sobre a contendo a sequência genética que codifica o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg).
Recombivax HB 1 foi a primeira vacina recombinante aprovada pelo FDA em 1986. [A figura
segurança dos produtos derivados do sangue.
colorida pode ser vista na versão online deste artigo, disponível em http: //
Ambas as vacinas foram feitas inserindo o gene para um wileyonlinelibrary.com/bit]
antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) em geneticamente

Josefsberg e Buckland: Tecnologia de Processo de Vacina 1451

Biotecnologia e Bioengenharia
 Duas vacinas baseadas em VLP para HPV já foram aprovadas pela
FDA, Gardasil 1 ( Merck) e Cervarix 1 ( GSK), tanto para a prevenção do
HPV quanto para o câncer cervical. Numerosas outras vacinas de
partículas estão em vários estágios de testes clínicos, incluindo
vacinas contra influenza e vírus sincicial respiratório (RSV)
produzidas usando BEVS com células de inseto (Novavax,
Gaithersburg, MD) e uma vacina contra influenza produzida em
células vegetais (Medicago, Quebec City, Canadá ) Vacinas para
melanoma, malária e vacinas contra hepatite B e C que usam VLPs
essenciais da hepatite B quimérica também estão sendo exploradas
(Kazaks et al., 2008; Plummer e Manchester, 2010).
O Gardasil 1 a vacina quadrivalente (tipos de HPV 6, 11, 16 e 18) é produzida
pela expressão da proteína do capsídeo principal do papilomavírus específico
do tipo, L1, em S. cerevisiae
(Shi et al., 2007). Trabalhos anteriores mostraram que
pentâmeros L1 de HPV16 recombinantes se montam in vitro em
estruturas semelhantes a capsídeo, e o truncamento de 10
resíduos N-terminais leva a uma preparação homogênea de
partículas icosaédricas de 12 pentâmeros (Chen et al., 2000). O
processo de fermentação usa um sistema de expressão de
levedura recombinante com um promotor indutível de
galactose (GAL1) expressando proteínas da cápside de HPV, o
que permite que altas densidades celulares sejam alcançadas
antes que a proteína L1 seja expressa (a expressão prematura
de altos níveis de proteínas estranhas pode ser prejudicial para
o hospedeiro células). A colheita é iniciada quando a galactose
atinge um determinado nível. A proteína L1 constitui
aproximadamente 15% da proteína solúvel total. Os principais
desafios técnicos ocorrem a jusante e incluem a liberação de
VLPs intracelulares, normalmente por homogeneização, Figura 7. Processo de purificação inicial para o Gardasil 1 ( Merck) vacina de partículas
semelhantes a vírus, que é produzida em Saccharomyces cerevisiae e requer ruptura celular
para liberar as partículas semelhantes a vírus. [A figura colorida pode ser vista na versão
Um grande desafio para o desenvolvimento da vacina VLP é que o online deste artigo, disponível em http://wileyonlinelibrary.com/bit]
monitoramento da fermentação requer a remoção frequente de amostras, seguida
por centrifugação, ruptura celular e cromatografia para purificar parcialmente as
VLPs. Uma versão miniaturizada disso foi recentemente descrita, na qual as Etapas de fracionamento CEX; a primeira passagem captura os VLPs e a
principais etapas de ruptura celular e cromatografia são executadas em uma escala segunda passagem serve como uma etapa de polimento. Usando este
muito pequena (Wenger et al., 2007). O processo de cromatografia em várias etapas processo, as VLPs purificadas são 98% homogêneas (pureza) e o
foi reduzido 1.000 vezes usando volumes de microlitro de resina em uma ponta de rendimento geral de purificação é de 10% (Ding et al., 2010).
pipeta e automatizado em uma estação de trabalho robótica para tratamento de Recentemente, uma nova abordagem para criar VLPs
líquidos. Esta plataforma de alto rendimento foi considerada preditiva de purificação com base na proteína estrutural VP1 de poliomavírus
em escala de laboratório em termos de rendimento e pureza, permitindo a murino (MuPyV) em E. coli foi descrito (Middleberg et al.,
otimização de um processo de fermentação enquanto reduz o tempo geral e os 2011). Dois locais de inserção na superfície do MuPyV VP1
materiais. são explorados para a apresentação do antígeno M2e da
gripe e do peptídeo J8 do Streptococcus do Grupo A (GAS).

A purificação de VLPs é semelhante à purificação de vacina de vírus, com a
vantagem de requisitos de biossegurança menos rigorosos devido à
incapacidade do VLP de se replicar e causar doença. A Figura 7 mostra o
processo de purificação do Gardasil 1 vacina contra HPV (Cook et al., 1999). As
células de levedura são colhidas do fermentador e congeladas. Após o
descongelamento, a benzonase é adicionada às células para enfraquecer a
membrana celular e a pasta celular é passada duas vezes por um
homogeneizador, que atinge uma ruptura celular superior a 95%. A mistura é
incubada a 4 8 C por 12–20 h para completar a lise. O lisado é então clarificado
por microfiltração de fluxo cruzado no modo de diafiltração e seguido por dois
O sistema de expressão de levedura mais amplamente utilizado é
S. cerevisiae, mas outra cepa de levedura está se tornando cada
vez mais popular. A levedura metilotrófica Pichia pastoris, com
seu promotor eficiente e rigidamente regulado do gene da
álcool oxidase I (AOX1), utiliza fontes econômicas de carbono
para atingir as altas densidades celulares necessárias para a
produção em larga escala de vacinas (Geels e Ye, 2010). Isso foi
aplicado com sucesso à fabricação de vacina de baixo custo
contra a hepatite B por vários fabricantes indianos. As proteínas
recombinantes são freqüentemente secretadas na mídia, o que
facilita a purificação e análise downstream. Proteínas expressas
em P. pastoris têm altos níveis de

1452 Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, nº 6, junho de 2012

glicosilação que pode aumentar a eficácia das vacinas em vacina a ser aprovada pelo FDA. Foi aprovado em abril de 2010 para
alguns casos. Uma equipe desenvolveu um protocolo de o câncer de próstata refratário ao hormônio metastático e é
purificação cromatográfica em grande escala para a produção considerado um avanço no tratamento do câncer. O componente
de HBsAg a partir de P. pastoris ( Hardy et al., 2000), embora a ativo são as células apresentadoras de antígenos (APCs) que
purificação baseada em cromatografia possa se tornar apresentam fosfatase ácida prostática (PAP) às células T. A Figura 8
proibitivamente cara em grande escala (Curling e Gottschalk, mostra o processo onde os APCs são leucócitos de pacientes
2007). Outra equipe triplicou a produção de uma proteína obtidos por aférese e combinados com PA2024, que é PAP ligado ao
da malária rica em dissulfito recombinante em P. pastoris fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF),
por engenharia genética da cepa para superproduzir a uma proteína que induz uma poderosa resposta imune (Divisão de
proteína dissulfide isomerase (Tsai et al., 2006). Célula e Gene Therapies, 2010). O PA2024 ativa os leucócitos, que
são infundidos de volta no paciente, onde apresentam PAP às
células T, que por sua vez têm como alvo e matam as células
cancerosas.
Vacinas contra o Câncer
A geração in vitro de células dendríticas (DC) carregadas com
Estima-se recentemente que o total de infecções atribuíveis TAAs também foi investigada contra o glioblastoma multiforme
ao câncer no ano de 2002 foi de 1,9 milhões de casos, ou humano, um tumor cerebral primário agressivo (Bolhassani et
17,8% da carga global de câncer (Parkin, 2006). Os al., 2011). Foi relatado que a injeção de exossomos derivados de
principais agentes foram a bactéria Helicobacter pylori, DCs carregados com peptídeos tumorais
vírus da hepatite B e C, vírus Epstein-Barr, HIV, vírus do herpes e
HPV. A prevenção do câncer protegendo o hospedeiro contra
patógenos infecciosos mostra uma mudança de paradigma nas
vacinas profiláticas. Um novo relatório prevê que o mercado de
vacinas contra o câncer aumentará para uma indústria de US $ 7
bilhões até 2015, o que depende do sucesso em testes clínicos e da
capacidade de expandir a tecnologia (Martino, 2011). Existem seis
tipos de vacinas em desenvolvimento: vacinas de antígeno /
adjuvante, vacinas de DNA, vacinas baseadas em vetores, vacinas de
células tumorais, vacinas de células dendríticas e vacinas
anti-idiotipo (Bolhassani et al., 2011; Schuster et al., 2009) .
O objetivo das vacinas terapêuticas contra o câncer é induzir imunidade contra

antígenos associados a tumores (TAAs). Um avanço importante é o desenvolvimento de

técnicas para identificar antígenos que são reconhecidos por linfócitos T específicos para

tumores (Bolhassani et al., 2011). Esses antígenos tumorais se enquadram em duas

categorias amplas: (1) antígenos compartilhados específicos do tumor ou TAAs e (2)

antígenos exclusivos específicos do tumor. Os TAAs são expressos por mais de um tipo de

células tumorais, como o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) e o

antígeno carcinoembrionário (CEA), mas também podem ser expressos em tecidos normais

em quantidades diferentes. Antígenos tumorais únicos resultam de mutações induzidas por

carcinógenos físicos ou químicos. Ambos os antígenos tumorais compartilhados e únicos

podem ser usados no desenvolvimento de vacinas contra o câncer, embora uma vacina

eficaz deva fornecer memória de longo prazo para prevenir a recorrência do tumor. Alguns

cientistas acreditam que para a eliminação total do tumor, tanto o sistema imunológico inato

quanto o adaptativo devem ser ativados (PejawarGaddy e Finn, 2008). A imunoterapia

baseada em células T demonstrou a prova de princípio de que o controle imunológico do

câncer é possível mesmo com doença metastática. Os desafios, entretanto, são formidáveis

e provavelmente precisarão incluir estratégias não apenas para estimular a imunidade

específica ao tumor, mas também maneiras de superar a supressão imunológica associada à

malignidade (Douek e Nabel, 2011). A imunoterapia baseada em células T demonstrou a

prova de princípio de que o controle imunológico do câncer é possível mesmo com doença

metastática. Os desafios, entretanto, são formidáveis e provavelmente precisarão incluir

estratégias não apenas para estimular a imunidade específica ao tumor, mas também

maneiras de superar a supressão imunológica associada à malignidade (Douek e Nabel,

2011). A imunoterapia baseada em células T demonstrou a prova de princípio de que o

Figura 8. Processo específico do paciente para a produção da vacina de Dendreon contra
controle imunológico do câncer é possível mesmo com doença metastática. Os desafios, o câncer de próstata Provenge 1 ( Sipuleucel-T) que envolve a obtenção de leucócitos de um
paciente por aférese, ativação dos leucócitos com PA2024 e seu retorno ao paciente. [A
entretanto, são formidáveis e provavelmente precisarão incluir estratégias não apenas para estimular a imunidade específica ao tumor, mas também maneiras de superar a supressão imunológica associada à
figura colorida pode ser vista na versão online deste artigo, disponível em http: //
A vacina contra o câncer de próstata específica do paciente de wileyonlinelibrary.com/bit]
Dendreon Provenge (Sipuleucel-T) foi a primeira terapia contra câncer

Josefsberg e Buckland: Tecnologia de Processo de Vacina 1453

Biotecnologia e Bioengenharia
induz uma resposta imune antitumoral potente. A eficácia da vacina de
peptídeos é determinada pela maneira como os peptídeos são reconhecidos e
processados pelo sistema imunológico. Especificamente, a concentração de
peptídeos, multivalência, estrutura secundária, comprimento e a presença de
epítopos de células T auxiliares podem afetar significativamente a resposta
imune.
Geron's autólogo Câncer vacina candidato,
GRNVAC1, também é um produto de células dendríticas (Dimond,
2010). Foi estudado em ensaios PhI e atualmente está em um
estudo PhII de pacientes com leucemia mielóide aguda em
remissão. É distinto de Provenge porque Geron transfecta
células dendríticas imaturas através de eletroporação com
mRNA que codifica as sequências para a subunidade catalítica
da telomerase humana (hTERT) ligada a uma sequência de
direcionamento lisossomal (LAMP). As células transfectadas
expressam hTERTLAMP como proteína, que pode ser
apresentada no contexto do antígeno leucocitário humano
específico de cada paciente. As células transfectadas são então
maturadas em meio contendo uma mistura de citocinas.
Alíquotas criopreservadas das preparações finais de DC
maduras são fornecidas à clínica para injeções intradérmicas.
Em janeiro de 2011, a Amgen comprou a Biovex e adquiriu seu produto
candidato principal OncoVEXGM-CSF, uma vacina oncolítica terapêutica para
melanoma e câncer de cabeça e pescoço que está em testes clínicos PhIII.
OncoVEX GM-CSF é uma versão do vírus herpes simplex que foi projetado para
se replicar seletivamente em tumores, deixando os tecidos saudáveis
circundantes ilesos, e também projetado para expressar GM-CSF. Isso
aumenta a resposta imune antitumoral aos antígenos tumorais liberados após
a replicação do vírus lítico.
Analítico
O desenvolvimento do processo para uma vacina ocorre em
paralelo ao desenvolvimento dos métodos analíticos. É necessário
desenvolver técnicas de medição do produto e de eventuais
impurezas, além de avaliar a potência do produto final. Este tópico
está além do escopo desta revisão, mas alguns pontos-chave estão
incluídos aqui.
Requisitos regulamentares rigorosos são frequentemente a base para
estabelecer um paradigma de purificação e técnicas analíticas precisas
são essenciais para validar cada etapa. Exceto para vacinas preparadas
em células humanas diplóides, as concentrações residuais de DNA da
célula hospedeira devem ser <10 ng por dose humana e o tamanho do
DNA residual não deve ser maior do que o tamanho de um gene (Board
on Life Sciences, 2011). As concentrações de proteína na célula
hospedeira também precisam ser controladas e as novas vacinas
geralmente contêm <1 m g por dose. Existem numerosos ensaios que
podem quantificar com segurança as concentrações de proteínas,
incluindo imunoensaio, imunotransferência, HPLC, atividade enzimática,
citometria de fluxo e biossensores ópticos, embora esses ensaios não
possam determinar com eficácia a faixa de heterogeneidade nas
principais propriedades de superfície, como tamanho, carga e agregação
( Rathore et al., 2008, 2010). Mudanças nas condições de fermentação
durante o desenvolvimento do processo podem impactar a agregação
intracelular, proteólise, pós-
1454 Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, nº 6, junho de 2012
modificações translacionais e diferenças nos níveis relativos de
impureza, todas as quais podem ter um impacto significativo no
processamento posterior e na qualidade do produto final (Metz
et al., 2009).
Os testes para agentes adventícios tornaram-se gradualmente
mais extensos e complexos. Sempre que possível, a filtragem de
eliminação viral é incluída como uma etapa do processo e parte da
mitigação de risco para a remoção de agentes adventícios. Novas
abordagens baseadas no sequenciamento maciçamente paralelo do
transcriptoma foram descritas como uma técnica para uso em um
programa de teste integrado para liberação de uma linha celular
que utiliza métodos de detecção específicos e de base ampla
(Onions et al., 2011).
Um ensaio chave de liberação de vacina é o ensaio de potência, que é,
idealmente, um preditor do desempenho clínico. O desenvolvimento de
um ensaio de potência deve começar assim que o material de vacina
representativo estiver disponível. Historicamente, muitos ensaios de
potência foram desenvolvidos usando animais, mas as novas vacinas
normalmente dependem de métodos de teste in vitro. Existem
essencialmente quatro abordagens diferentes para desenvolver um
ensaio de potência: (1) teste de imunização-desafio, (2) análises
sorológicas, (3) ensaios baseados em células e (4) ensaios de titulação. O
teste de imunização-desafio requer modelos animais de trabalho
intensivo e intrinsecamente variáveis que raramente são usados para
vacinas mais novas. As análises sorológicas normalmente envolvem a
medição da concentração de anticorpos, avidez de anticorpos (marcador
substituto para memória) ou respostas imunes celulares (proliferação de
células T e quantificação de citocinas), mas também pode envolver
ensaios de anticorpos funcionais (por exemplo, neutralização de
patógenos ou toxinas). As respostas de anticorpos podem ser medidas
com ELISA ou em ensaios multiplex que analisam vários antígenos
simultaneamente em volumes muito pequenos (Metz et al., 2009).
Ensaios baseados em células detectam respostas imunes celulares em
células T, como CD8 citotóxico º e CD4 º.
Muitos ensaios de quantificação de células T e caracterização
funcional são baseados em citometria de fluxo, como análise de
classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de
citocinas intracelulares e moléculas efetoras. Um avanço recente é o
desenvolvimento de ensaios multiplex baseados em microesferas
que quantificam vários fatores de células T solúveis em pequenos
volumes. Os ensaios de titulação medem a potência indiretamente,
por exemplo, medindo o número de partículas viáveis, determinado
por contagem de colônias ou por titulação de vírus, no caso de
vacinas de vírus vivos atenuados. Em alguns casos, pode ser viável
usar PCR quantitativo, que é mais rápido, menos trabalhoso e
provavelmente mais preciso.
O desenvolvimento de ensaios de potência apropriados é difícil
porque os epítopos exatos que determinam a qualidade do produto
muitas vezes não são definidos. Além disso, adjuvantes com mecanismos
de ação apenas parcialmente compreendidos devem ser adicionados
para atingir a resposta imune desejada. Freqüentemente, é melhor
desenvolver ensaios de "marcadores" para a qualidade do produto que
possam ser vinculados às respostas dos animais e, após os ensaios
clínicos, às respostas humanas. Essas informações podem ser usadas
para desenvolver uma melhor compreensão científica do processo de
produção e seu impacto na qualidade do produto, conforme promovido
pela iniciativa FDA Process Analytical Technology (PAT), que é discutida
na seção Globalização e influências regulatórias deste
artigo.
Formulação e Entrega
Dois dos principais objetivos do desenvolvimento da formulação
são: (1) melhorar a imunogenicidade de uma vacina e (2) melhorar a
estabilidade dos componentes da vacina. Esses objetivos são
normalmente alcançados através da implementação de um ou mais
dos seguintes: veículos adjuvantes, excipientes, ligantes,
conservantes, acoplamento de carreadores, agentes tamponantes,
agentes emulsificantes, agentes umectantes, vetores não virais e
compostos facilitadores de transfecção (Jones, 2008).
Um dos principais desafios para as vacinas baseadas em
proteínas recombinantes é que a própria proteína pode ser pouco
imunogênica e muitas requerem a adição de um adjuvante para
aumentar as respostas imunológicas. Os adjuvantes testados
incluem emulsões sintéticas (óleo em água), alúmen (gel de
hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio), formulações de
lipídios e adjuvantes à base de citocinas, como interferon tipo um,
com alúmen sendo o mais amplamente utilizado (Li et al., 2007). Os
adjuvantes geralmente aumentam a inflamação e ativam a cascata
de complemento, possivelmente criando multivalência particulada,
bem como permitindo maior exposição do antígeno ao prolongar
sua liberação no local da injeção. Na prática, a abordagem
regulatória para novos adjuvantes é conservadora, com preferência
por aqueles com histórico de uso seguro (por exemplo, alúmen). As
exceções incluem MF59 (emulsão de esqualeno), que tem sido
usado em mais de 20 países na última década como um adjuvante
para antígenos da gripe HA e NA para aumentar a captação por
APCs e monofosforil lipídeo A (MPL), que é um lipopolissacarídeo
componente bacteriano que atua no TLR- altamente expresso 4 em
APCs que induzem imunidade mediada por células (Tritto et al.,
2009). MPL é usado na vacina HPV da GSK Cervarix 1 como um
componente de seu Sistema Adjuvante proprietário 04 (AS04).
Um grande desafio de formulação para Gardasil 1 ( Merck) era
a preparação de uma solução aquosa que era estável sob uma
variedade de condições de purificação, processamento e
armazenamento (Shank-Retzlaff et al., 2006). Para tanto,
surfactantes não iônicos foram introduzidos e a concentração
de sal foi ajustada, o que estabilizou as VLPs contra adsorção de
superfície, mudança conformacional, agregação de antígeno
induzível e perda de antigenicidade. A formulação para Gardasil 1
quadrivalente contém Adjuvante de Alumínio Merck (MAA),
NaCl 0,32 N, polissorbato 80 0,01%, histidina 10 mM e pH 6,2,
com VLPs de HPV desmontadas e remontadas (Shi et al., 2007).
O MAA aumentou significativamente a estabilidade acelerada
da vacina contra a degradação induzida pelo estresse térmico,
que se acredita ser devido às propriedades físicas do adjuvante,
que serve como uma barreira física, evitando colisões
intermoleculares e, assim, minimizando a agregação de VLPs do
HPV. O processo de desmontagem e remontagem foi
fundamental para melhorar a estabilidade (3mo º em 37 8 C) e a
potência in vitro da vacina. Além disso, a imunogenicidade in
vivo do
a vacina foi melhorada em 10 vezes, conforme demonstrado por estudos de potência
em camundongos.
As limitações de vírus ou bactérias vivos como vetores
incluem sua capacidade limitada de transporte de DNA,
toxicidade, imunogenicidade, a possibilidade de integração
aleatória do DNA do vetor no genoma do hospedeiro e seu
alto custo (Khatri et al., 2008; Mills, 2009) . Devido a isso, os
vetores não virais foram ainda mais focados como uma
alternativa em sistemas de entrega e incluem polímeros
catiônicos, como polietilenimina (PEI), polilisina (PLL),
peptídeos catiônicos e lipossomas catiônicos (Martin e Rice,
2007). Atualmente, o objetivo principal é otimizar a
eficiência de transfecção das opções acima. As vias de
administração e formulação das vacinas de DNA afetam a
resposta terapêutica, alterando a via imunológica; a maior
eficácia foi alcançada após eletroporação in vivo e entrega
de arma de gene.
Outro objetivo principal do projeto de formulação e entrega de
vacinas destinadas tanto ao mundo desenvolvido quanto ao em
desenvolvimento é melhorar a conveniência e a acessibilidade do
paciente por meio de transporte e armazenamento não refrigerado,
administração sem agulha e minimização de dose (Aunins et al.,
2011).
Devido à preocupação com os efeitos na saúde, muitos fabricantes de
vacinas deixaram de usar o timerosal como conservante e, em geral, nenhum
conservante é usado para frascos de dose única ou seringas. Alguns
fabricantes estão usando 2-fenoxietanol para prevenir o crescimento de
bactérias gram-negativas em vacinas de dose única, como DTaP, hepatite A e
vacina inativada contra poliomielite (Bae et al., 2009). O desenvolvimento de
uma formulação multidose para Prevnar 13 TM
o uso de 2-fenoxietanol (2-PE) na concentração de 5 mg por
dose foi estável e atendeu aos critérios recomendados para
eficácia antimicrobiana em um período de 30 meses
(Khandke et al., 2011).
Apesar dos esforços significativos durante o desenvolvimento
para otimizar os excipientes para a estabilização do produto, muitas
vacinas não exibem estabilidade de longo prazo em soluções
aquosas, especialmente se não puderem ser armazenadas
ininterruptamente em temperaturas frias (difícil em países em
desenvolvimento). Por esse motivo, muitas vacinas são liofilizadas
em uma formulação em pó. A liofilização, entretanto, pode alterar
uma variedade de características do produto, incluindo pH e
concentração de soluto, o que pode afetar adversamente os
antígenos da vacina (Chen et al., 2010; Jennings, 2002). Além disso,
o tempo de desenvolvimento para estabelecer o ciclo de liofilização
ideal pode ser longo e caro.
Os aditivos tradicionais (lioprotetores) para a liofilização de agentes
biológicos incluem açúcares e álcoois de açúcar, que envolvem as proteínas
em estruturas de estado vítreo, proporcionando um estado mais rígido e
termodinamicamente estável (Amorij et al., 2007; Mouradian et al., 1984). Em
alguns casos, polímeros ou aminoácidos foram combinados com as
formulações de carboidratos para melhorar a estabilidade em uma rede
cristalina contínua, embora isso tenha levado à perda de
Josefsberg e Buckland: Tecnologia de Processo de Vacina 1455
Biotecnologia e Bioengenharia
produto em algumas situações (Zeng et al., 2009). A Aridis
Pharmaceutical melhorou isso desenvolvendo uma tecnologia de
estabilização que usa plastificantes de baixo peso molecular em
combinação com estabilizadores de açúcar tradicionais para
preencher quaisquer lacunas moleculares restantes, reduzindo
ainda mais as vibrações moleculares que levam à degradação. Eles
relatam que esta tecnologia aumentou a temperatura necessária
para armazenamento e distribuição de abaixo de zero para 25 8 C
com uma vida útil de vários anos (Cicerone et al., 2003; Cicerone e
Soles, 2004). A Stabilitech desenvolveu outra tecnologia de
estabilização envolvendo o uso de excipientes químicos que imitam
proteínas encontradas em vários tipos de sementes durante o
estágio de dessecação (por exemplo, maracujá, crisântemo). A partir
de um painel de excipientes proprietários, Stabilitech realiza
análises multivariadas para determinar a combinação ideal para
fornecer a melhor estabilização. O uso desses novos excipientes
durante a liofilização resultou em perda mínima de produto para
uma vacina de adenovírus armazenada em 37 8 C por 3 meses (Drew,
2011a, b).
A administração da vacina por agulha e seringa tem várias
desvantagens, incluindo: lesões potenciais por picada de agulha e
transmissão sanguínea de patógenos, fobia de agulha e resposta
imunológica ineficiente devido à menor densidade de APCs em
relação à pele. Existem várias alternativas à injeção intramuscular
que estão sendo exploradas. Um é o Nanopatch TM, um adesivo de
pele de matriz de microprojeção com revestimento seco que
fornece vacinas por via intracutânea em aproximadamente 5
minutos (Corbett et al., 2010). A densidade da agulha foi otimizada
para atingir as células do sistema imunológico na epiderme e
derme. Ambos Fluvax 2008 1 ( vacina trivalente contra a gripe sem
adjuvante) e Gardasil 1 ( Vacina de HPV com adjuvante de alúmen)
foram administrados em camundongos usando esta tecnologia,
resultando em títulos de anticorpos neutralizantes mais elevados do
que a injeção intramuscular. Outra equipe deu passos incrementais
importantes na evolução da tecnologia de microagulhas (Kim et al.,
2009; Lee et al., 2008). Sua primeira abordagem foi baseada em
microagulhas de aço inoxidável mergulhadas na vacina, que desde
então evoluiu para um design que encapsula moléculas dentro de
microagulhas. As microagulhas subsequentemente se dissolvem na
pele para bolus ou administração sustentada e não deixam resíduos
médicos perigosos ou pontiagudos. Os desafios incluem a
fabricação de dispositivos e o projeto de um pacote compacto, mas
robusto o suficiente para envio.
O sistema imunológico da mucosa é um local alvo atraente para
vacinas, uma vez que muitos patógenos infectam o hospedeiro nas
células M na superfície da mucosa. O parto pela mucosa, que não
requer agulha, já está sendo usado para várias vacinas (Chadwick et
al., 2009; Dennehy, 2007). Por exemplo, a vacina viva atenuada
contra a gripe FluMist 1 ( MedImmune) é administrado como um
spray nasal (Belshe et al., 1998). A via de entrega pela mucosa pode
contribuir para a proteção cruzada heterovariante observada com
ambas as vacinas, induzindo uma imunidade mais ampla, incluindo
imunoglobulina A na mucosa. A entrega pela mucosa também está
sendo estudada para várias outras vacinas potenciais dirigidas
contra doenças como infecção por HIV e tuberculose. Vacinação nas
superfícies mucosas
1456 Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, nº 6, junho de 2012
pode induzir proteção local nos locais de infecção, bem como
induzir imunidade sistêmica; no entanto, a entrega direta de
antígeno por via oral ou nasal geralmente leva a uma indução
fraca de imunidade. A eficácia pode ser melhorada pela
co-administração ou fusão do antígeno com um forte adjuvante
da mucosa, como a toxina da cólera (CT) de Vibrio cholera ou
subunidade B de toxina lábil ao calor (LTB) de E. coli. Uma
equipe produziu LTB de forma recombinante em plantas de
soja que estimularam a resposta de anticorpos contra um
antígeno coadministrado em 500 vezes (Moravec et al., 2007).
Essa tecnologia pode servir como uma plataforma eficiente e
econômica para a geração de vacinas orais no futuro.
Os sistemas de entrega mediada por partículas podem melhorar
a vacinação da mucosa protegendo o material imunogênico
durante a entrega, fornecendo sistemas de entrega direcionados e
permitindo a incorporação de material adjuvante (Chadwick et al.,
2009). O encapsulamento em microesferas ou sistemas multifásicos,
como emulsões múltiplas de água-óleo-água ou polímeros
biologicamente ativos, pode proteger os antígenos do trato
gastrointestinal. O tempo de residência intestinal pode ser
estendido com o uso de muco ou bioadesivas específicas que se
ligam ao muco intestinal ou às células epiteliais do intestino.
O FluGEM TM A vacina da Mucose (Groningen, Holanda) é uma
vacina contra a gripe intranasal, baseada em seu Mimopata TM tecnologia,
que recentemente entrou em testes de PhI. Esta tecnologia melhora
a potência da vacina por meio da formulação de Lactococcus lactis bactérias
em partículas não vivas semelhantes a bactérias que podem
apresentar patógenos ou antígenos tumorais em sua superfície. A
Mucose também está desenvolvendo dois produtos de vacina
adicionais: PneuGEM TM, uma vacina pneumocócica e SynGEM TM, uma
vacina para prevenir a infecção viral por RSV.
Globalização e influências regulatórias
Estima-se que 2,5 milhões de pessoas morrem globalmente a cada
ano de doenças evitáveis por vacinas, muitas delas atribuíveis ao
fato de as vacinas disponíveis não serem totalmente utilizadas. Essa
subutilização ocorre principalmente em países em desenvolvimento
devido à baixa renda, à falta de infraestrutura médica e à falta de
instalações da rede de frio. As inovações que poderiam melhorar
esta situação incluem: tecnologias de produção de alto rendimento
para reduzir os custos da vacina, adjuvantes aprimorados e vacinas
combinadas que reduzem o número de injeções necessárias,
embalagem que reduz o espaço necessário para uma vacina na
cadeia de frio e formulações estáveis ao calor que permitem
excursões dos sistemas da cadeia de frio. Essas inovações também
beneficiariam as nações desenvolvidas, reduzindo a carga de custos
de saúde e melhorando a adesão do paciente.
O Plano Nacional de Vacinas (NVP) de 2010 enfatiza a necessidade de
métodos de fabricação rápidos, flexíveis e econômicos (Departamento de
Saúde e Serviços Humanos dos EUA, 2010). Desde que a última NVP foi emitida
em 1994, surgiram novas preocupações com o fornecimento de vacinas,
incluindo a gripe pandêmica e ameaças de bioterrorismo, que exigem
capacidade de aumento. A criação de capacidade regional permitirá rápida e
relativamente
produção de vacina barata em tempos de necessidade e
elimina muitos problemas da cadeia de abastecimento. São
necessárias novas abordagens para a fabricação de vacinas,
junto com métodos de aplicação aprimorados, perfis de
estabilidade e procedimentos de teste de qualidade.
Naquele mesmo ano, Saúde e Serviços Humanos também
alocaram US $ 2 bilhões para revisar o processo de resposta
à pandemia. Essa reforma envolverá investimento em
ciência e revisão regulatória, uma reavaliação da política e
um uso mais eficaz de parcerias público-privadas. A
necessidade de uma revisão regulatória não é apenas
reconhecida pelos Estados Unidos, há uma necessidade
mundial crítica de melhor acesso às vacinas (Milstien et al.,
2006). Essa globalização das vacinas também envolverá os
processos lentos e árduos de harmonização regulatória,
amplo acordo sobre direitos de propriedade intelectual,
Muitos regulamentos são mais rigorosos para vacinas do que
produtos biotecnológicos, principalmente porque os processos de
vacinas são percebidos como mal caracterizados. Isso se deve, em
parte, ao fato de as vacinas envolverem diversas plataformas de
tecnologia, o que dificulta a padronização dos processos de
produção. Isso pode levar a uma instalação única para cada família
de vacinas, resultando em um longo tempo de espera para a
construção de uma instalação em escala comercial. Os ensaios
clínicos de Fase III requerem que as doses produzidas em
instalações de manufatura em grande escala sejam representativas
do processo final. Se forem feitas mudanças no processo, estudos
clínicos de ligação são necessários para demonstrar a equivalência.
O impacto disso é que decisões de processo sólidas devem ser
feitas no início do desenvolvimento. Isso leva a um nível de risco
mais alto, uma vez que é necessário um grande investimento de
capital inicial nas instalações.
Os benefícios dos biorreatores descartáveis ou de uso único (SUBs)
incluem custos de operação e capital da instalação mais baixos, tempos
de troca mais curtos, maior produtividade, menor risco de contaminação
por bactérias ou mofo e menos refugo. Eles aumentam a flexibilidade na
suíte de manufatura, permitindo vários processos usando o mesmo
equipamento sem riscos de contaminação cruzada ou problemas de
escala. GE fabrica biorreatores Wave TM, disponível em volumes de
trabalho de até 500 L, que são normalmente usados no
desenvolvimento de processos e na expansão do trem de sementes
durante a fabricação. Várias empresas desenvolveram SUBs de tanque
agitado em volumes de até 2.000 L, incluindo Xcellerex, Thermo Scienti fi
c (Marlborough, MA) e Sartorius Stedim (Goettingen, Alemanha). Esses
SUBs de tanque agitado superaram as limitações de transferência de
massa dos biorreatores descartáveis do tipo onda e oferecem opções
aprimoradas de agitação, pulverização e alimentação que rivalizam com
os biorreatores de aço inoxidável. Isso permitiu seu uso para o
crescimento de células animais onde as demandas de mistura para
transferência de oxigênio são modestas, tornando-as adequadas para
muitas aplicações de vacinas. Os SUBs de tanque agitado também
podem ser usados para fermentação bacteriana em alguns casos,
embora a maior entrada de energia necessária para a fermentação
bacteriana muitas vezes necessite de resfriamento, tornando o aumento
de escala menos simples do que para células animais. Apesar de sua
adequação para célula animal
processos, as limitações de volume atuais podem impedir a aceitação
generalizada de SUBs em casos onde grandes volumes são necessários,
limitando seu uso para a expansão do trem de sementes (Nienow, 2006).
Muitas empresas estão incorporando tecnologias de uso único em seus
processos de produção. Por exemplo, Bavarian Nordic (Kvistgaard,
Dinamarca) fabrica um novo modelo experimental
vaccinia Vacina contra a varíola de Ancara em bolsas de biorreator
GE Wave (Board on Life Sciences, 2011).
Várias empresas oferecem misturadores de uso único e sistemas
de purificação downstream também. A Sartorius Stedim e a Natrix
(Burlington, Canadá) vendem cartuchos de adsorção de membrana
de troca aniônica descartáveis de uso único, que podem ser
usados para remoção de DNA e proteína de célula hospedeira ou
eliminação viral. Da mesma forma, a Pall Corporation (Port
Washington, NY) oferece um produto de membrana descartável
semelhante projetado especificamente para a remoção de DNA.
Outras empresas, incluindo GE Healthcare (Little Chalfont, Reino
Unido), Millipore (Billerica, MA), BioFlash Partners (Worcester, MA) e
Tarpon Biosystems (Marlborough, MA) desenvolveram colunas de
cromatografia em formato descartável pré-embaladas e
pré-higienizadas. A maioria dessas colunas foi projetada para
aplicações de polimento.
A última década testemunhou um impulso regulatório
em direção à compreensão e controle de processos
aprimorados. Novas iniciativas regulatórias, como
Tecnologia Analítica de Processo (PAT), Qualidade por
Projeto (QbD) e Liberação em Tempo Real (RTR) impactarão
o futuro do desenvolvimento de processos de vacinas,
tendendo para tecnologias de plataforma. O PAT é um
marco regulatório de diretrizes que incentiva a inovação,
pois será necessário responder aos desafios das novas
tecnologias e formas de fazer negócios (por exemplo,
medicina personalizada e resposta à pandemia). Espera-se
que os ganhos em qualidade, segurança e eficiência
incluam: redução do tempo de ciclo com o uso de medições
e controles em linha, em linha ou em linha, prevenção de
rejeições, implementação de RTR, segurança aprimorada
com maior uso de automação, melhoria da eficiência do
processamento contínuo.
QbD envolve a criação de um espaço de design que é uma
combinação multidimensional de atributos de materiais e
parâmetros de processo que comprovadamente fornecem garantia
de qualidade. Mudanças de processo dentro de um espaço de
projeto aprovado não requerem submissões regulamentares e
aprovações adicionais, permitindo processos flexíveis. A criação de
um espaço de projeto envolve a identificação de parâmetros de
processo, que podem influenciar a qualidade do produto e, em
seguida, realizar uma análise multivariada para localizar os
intervalos nos quais os parâmetros de processo podem ser variados
sem afetar a qualidade do produto.
O RTR envolve basear o lançamento de um produto na compreensão
do processo, em vez de no teste do produto final ou na análise do lote.
Isso requer a identificação dos parâmetros críticos do processo (CPPs) e
a compreensão de sua influência nos atributos críticos de qualidade
(CQAs). Durante o processamento, uma estratégia de controle baseada
em risco deve estar em vigor para garantir que
Josefsberg e Buckland: Tecnologia de Processo de Vacina 1457
Biotecnologia e Bioengenharia
o processo é mantido dentro dos limites do espaço de
design.
Streefl e et al. publicaram vários artigos sobre a aplicação
dos conceitos de PAT e QbD ao Bordetella pertussis
vacina para coqueluche (Stree fl e et al., 2007, 2009; van de
Waterbeemd et al., 2009). Esta vacina bacteriana de células inteiras
depende da tecnologia de vacina convencional que está sujeita à
variabilidade inerente, mas os parâmetros críticos do processo
ainda foram facilmente definidos dentro de um espaço de design,
uma vez que os CQAs foram compreendidos. Neste exemplo, o CQA
principal foi a composição da proteína da membrana externa e os
CPPs foram o nível de oxigênio dissolvido e a concentração dos
nutrientes principais lactato e glutamato. A espectroscopia de
infravermelho próximo (NIR) foi usada simultaneamente para
monitorar outros parâmetros do processo, como densidade óptica e
tamanho de partícula, como um aplicativo PAT para permitir RTR.
Integrar e registrar esses dados criará um espaço de design mais
preciso ao longo do tempo.
Conclusão
A evolução das vacinas (por exemplo, atenuada ao vivo,
recombinante) e os métodos de produção de vacinas (por exemplo,
in ovo, cultura de células) estão intimamente ligados uns aos
outros. Conforme a tecnologia de vacinas avançou, os métodos
para produzir e analisar vacinas avançaram paralelamente. Os
impulsionadores da inovação tecnológica incluem o objetivo de
tornar as vacinas mais seguras e imunogênicas de uma forma
econômica que permita a distribuição mundial. Os avanços na
biologia também resultam na identificação de novos alvos para a
pesquisa de vacinas e essas oportunidades são freqüentemente
desenvolvidas devido à necessidade e desejo universal de melhorar
a saúde humana e obter proteção contra doenças evitáveis. Esses
avanços, juntamente com as melhorias no design de equipamentos
descartáveis, estão abrindo o caminho para vacinas que são mais
acessíveis aos países em desenvolvimento e em surtos de
pandemia, além de ser mais conveniente e seguro de usar. À
medida que iniciativas como PAT e QbD ganham aceitação
generalizada para vacinas altamente purificadas, podemos
antecipar aprovações regulamentares mais simplificadas,
melhorando em última análise a carga global de doenças.
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