CENTRO PAULA SOUZA

ETEC RAPOSO TAVARES

ETIM Química

ANNA JULIA ANDRADE DA COSTA

BÁRBARA DOMINGUES DIAS
GABRIELA SANTOS DE ALMEIDA
JULIA FERNANDES DE OLIVEIRA
LUCAS DE OLIVEIRA QUINTÃO
MARIA FERNANDA ALVES COSTA
NATHALIA MANRIQUEZ DA PAZ

DISCO DE DIFUSÃO

SÃO PAULO
2023
ANNA JULIA ANDRADE DA COSTA
BÁRBARA DOMINGUES DIAS
GABRIELA SANTOS DE ALMEIDA
JULIA FERNANDES DE OLIVEIRA
LUCAS DE OLIVEIRA QUINTÃO
MARIA FERNANDA ALVES COSTA
NATHALIA MANRIQUEZ DA PAZ

DISCO DE DIFUSÃO
Relatório apresentado para avaliação da disciplina
de Microbiologia do 3° ano do ensino médio, turno
integral da ETEC Raposo Tavares, ministrado
pelos professores: doutora Regina Siqueira
Haddad Carvalho e professor doutor Vitor Amaral
Sanches Lucas.

SÃO PAULO
2023
 ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Resultado dos diâmetros dos halos de inibição .............................. 13
Tabela 2: Leitura das suspensões bacterianas ............................................... 15
 ÍNDICE DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Ácido salicílico com água em diferentes concentrações ............................ 11
Figura 2: Soluções de ácido salicílico (2% e 4%) com glicerina antes do banho-maria
.................................................................................................................................. 11
Figura 3: Soluções de ácido salicílico (2% e 4%) com glicerina após banho-maria .. 12
Figura 4: Soluções de ácido salicílico com glicerina em diferentes concentrações ... 12
Figura 5: Discos 1, 2 e 3 nas placas de bactérias 2, 4, 10, 17 e 18 após 24h em
estufa a 35ºC ............................................................................................................. 13
Figura 6: Placa com bactéria 20, sem crescimento bacteriano ................................. 14
Figura 7: Varredura da suspensão bacteriana ........................................................... 14
Figura 8: Bactéria 2, em diferentes concentrações do ácido salicílico ...................... 16
Figura 9: Bactéria 2, em diferentes concentrações da Aloe vera .............................. 16
Figura 10: Bactéria 2, ácido salicílico + Aloe vera ..................................................... 17
Figura 11: Bactéria 4, em diferentes concentrações do ácido salicílico .................... 17
Figura 12: Bactéria 4, em diferentes concentrações da Aloe vera ............................ 17
Figura 13: Bactéria 4, ácido salicílico + Aloe vera ..................................................... 18
Figura 14: Bactéria 17, em diferentes concentrações do ácido salicílico .................. 18
Figura 15: Bactéria 17, em diferentes concentrações da Aloe vera .......................... 18
Figura 16: Bactéria 17, ácido salicílico + Aloe vera ................................................... 19
Figura 17: Bactéria 18, em diferentes concentrações do ácido salicílico .................. 19
Figura 18: Bactéria 18, em diferentes concentrações da Aloe vera .......................... 19
Figura 19: Bactéria 18, ácido salicílico + Aloe vera ................................................... 20
 SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 6
2. OBJETIVOS ................................................................................................... 7
2.1. OBJETIVO GERAL......................................................................................... 7
2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO ............................................................................... 7
3. MATERIAL E MÉTODO ................................................................................. 8
3.1. MATERIAL ...................................................................................................... 8
3.1.1. Materiais........................................................................................................ 8
3.1.2. Equipamentos................................................................................................8
3.1.3. Reagentes......................................................................................................8
3.2. MÉTODO ........................................................................................................ 9
3.2.1. Extração do gel da Aloe vera.......................................................................9
3.2.2. Preparação da solução de ácido salicílico.................................................9
3.2.3. Teste de disco-difusão..................................................................................9
4. RESULTADOS ............................................................................................. 11
4.1. PREPARAÇÃO DO ÁCIDO SALICÍLICO ..................................................... 11
4.2. TESTE DE DISCO-DIFUSÃO ...................................................................... 12
4.3. AJUSTE DA ESCALA MCFARLAND EM ESPECTROFOTÔMETRO .......... 14
4.4. TESTE DE CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) ......................... 15
5. CONCLUSÃO .............................................................................................. 21
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 22
 6

1. INTRODUÇÃO
Diversos métodos microbiológicos existem para definir a suscetibilidade e
sensibilidade de microrganismos à ação de antimicrobianos. A resistência
bacteriana, seja ela natural ou devido a ação de agentes químicos, necessita de
avaliações constantes para que haja uma efetiva análise.
Em 1966 foi desenvolvido o método disco de difusão, por Bauer et al, que
atualmente é utilizado amplamente nos laboratórios de microbiologia. Tal método
baseia-se na difusão por meio do ágar de um antimicrobiano absorvido em um disco
de papel de filtro. Desta forma, a formação do halo de inibição de um crescimento
bacteriano é produzida pela difusão do antimicrobiano cujo diâmetro é
posteriormente medido e é inversamente proporcional à concentração inibitória
mínima (CIM).
Portanto, o disco de difusão é um método qualitativo que permite a
classificação bacteriana idealizado para bactérias de rápido desenvolvimento sendo
rápido e prático. Além disso, é importante o controle periódico que assegure a
qualidade do método para que sejam obtidos resultados confiáveis.
O relatório tem a finalidade de analisar e verificar a resistência microbiana
através do disco de difusão em ágar a partir de bactérias coletadas durante o
experimento laboratorial.
 7

2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Testar a sensibilidade dos microrganismos e a concentração inibitória
necessária dos agentes antibactericidas e antibióticos para cada bactéria.

2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO

• Identificar a sensibilidade da bactéria a antibióticos e antibactericidas;
• Classificar quantitativamente os antibactericidas por nível de eficácia;
• Auxiliar clinicamente selecionando o antibiótico mais adequado para a
bactéria responsável pela infecção.
 8

3. MATERIAL E MÉTODO
3.1. MATERIAL
3.1.1. Materiais
• Água destilada
• Alça em círculo
• Balão volumétrico 100 mL
• Bastão de vidro
• Discos de papel de filtro
• Erlenmeyer 100 mL
• Espátula
• Faca com corte
• Peneira
• Placa de Petri 9 mm
• Swab estéril
• Tubo de ensaio
• Vidro âmbar

3.1.2. Equipamentos
• Bico de Bunsen
• Espectrofotômetro Thermo Scientific®
• Estufa de cultura bacteriológica SolidSteel®
• Geladeira
• Liquidificador comum
• Micropipeta

3.1.3. Reagentes
• Ácido salicílico P.A. (C7H6O3)
• Ágar Mueller Hinton P.A.
• Caldo Mueller Hinton P.A.
• Folhas de Aloe vera
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3.2. MÉTODO
3.2.1. Extração do gel da Aloe vera
a) Pegou-se folhas de Aloe vera.
b) Deixou-as na vertical, dentro de um copo ou jarra, por pelo menos 2 horas
para eliminar a toxicidade da aloína.
c) Lavou-se bem para retirar todos os resíduos.
d) Retirou-se os espinhos laterais e as cascas.
e) Homogeneizou-se o extrato bruto da Aloe vera no liquidificador comum.
f) Filtrou-se através de uma peneira comum.
g) Armazenou-se em um recipiente estéril âmbar sob refrigeração (4°C).

3.2.2. Preparação da solução de ácido salicílico

a) Pesou-se 10 g de ácido salicílico P.A.
b) Adicionou-se 50 mL de água destilada estéril (100 mL).
c) Transferiu-se a solução em balão volumétrico (100 mL) e completou-se o
menisco com água destilada estéril.
d) Repetiu-se em pentaplicata, diferindo as concentrações (10%, 8%, 6%, 4% e
2%).
e) Agitou-se manualmente com bastão de vidro e armazenou-se em um vidro
âmbar em temperatura ambiente.

3.2.3. Teste de disco-difusão

a) Preparou-se as placas de Petri com o Ágar Mueller Hinton, de acordo com as
instruções do fabricante no rótulo.
b) Esterilizou-se em autoclave à 121ºC, à 1atm por 15 minutos.
c) Preparou-se a suspensão com as bactérias coletadas.
d) Com o auxílio da pinça esterilizada (flambagem), aplicou-se os discos de
papel filtro de 5 mm estéreis sobre os produtos individuais (Aloe vera e ácido
salicílico) e uma concentração de 1:1 (v/v) dos dois produtos totalizando 3
discos por placa previamente inoculadas.
e) Após 24h na estufa a 35ºC, mediu-se o halo de inibição em milímetros (mm)
com o auxílio de régua milimetrada e interpretou-se os resultados como
bactéria sensível (morte), resistência intermediária e resistente, de acordo
com o padrão da tabela padronizada (ANVISA, 2005) de antibióticos.
 10

f) Analisou-se um produto comercial como controle positivo contra as bactérias

da acne para a comparação do produto fabricado.

g) Preparou-se o Caldo Mueller Hinton de acordo com as especificações do

fabricante.
h) Esterilizou-se em autoclave à 121ºC, à 1atm por 15 minutos.
i) Distribuiu-se o meio de cultura em dez tubos de ensaio
j) Diluiu-se seriadamente as concentrações da solução de ácido salicílico (10%)
e do extrato de Aloe vera (extrato bruto – 100%) em cada tubo.
k) Produziu-se uma suspensão bacteriana padronizada com 106 por turvação e
ajuste em espectrofotometria (UV-VIS) em 560, 600, 640 e 660 nm em água
destilada estéril de acordo com a escala de McFarland 0,5.
l) Adicionou-se 1000 uL do inóculo bacteriano em cada tubo de ensaio através
da coleta com a micropipeta, além de 1 mL de Caldo Mueller Hinton e 1 mL do
extrato bruto de Aloe vera. Em seguida, repetiu-se a mesma metodologia
citada anteriormente com a diferença de adição de 1 mL apenas do ácido
salicílico e mais uma série de tubos com diferentes concentrações de ácido
salicílico e Aloe vera.
m) Analisou-se visualmente a turvação nos tubos de ensaio, anotou-se a
concentração mínima necessária para impedir o crescimento bacteriano e
interpretou-se os resultados.
 11

4. RESULTADOS
4.1. PREPARAÇÃO DO ÁCIDO SALICÍLICO
Após a classificação microscópica das colônias de bactérias desejadas (por
meio da coloração Gram), prosseguiu-se para a preparação da solução de ácido
salicílico, a fim de realizar o teste disco-difusão e de Concentração Inibitória Mínima
(CIM).
Primordialmente, pesou-se 10 g de ácido salicílico P.A. e adicionou-se a 100
mL de água, em pentaplicata, diferindo apenas as concentrações das soluções,
assim como descrito no item 3.2.3 e conforme apresentado na Figura 1.

Figura 1: Ácido salicílico com água em diferentes concentrações

Fonte: AUTORAL, 2023.

Entretanto, devido à insolubilidade do ácido salicílico em água, o reagente

decantou e cristalizou-se nas soluções, não sendo apropriado para os testes,
portanto, testou-se sua solubilidade em glicerina, tanto em temperatura ambiente
quanto a 95°C em banho-maria, obtendo-se os resultados exibidos nas Figuras 2 e
3.
Figura 2: Soluções de ácido salicílico (2% e 4%) com glicerina antes do banho-maria

Fonte: AUTORAL, 2023.

 12

Figura 3: Soluções de ácido salicílico (2% e 4%) com glicerina após banho-maria

Fonte: AUTORAL, 2023.

Portanto, foi possível observar através dos resultados apresentados acima

que, em todas as concentrações testadas, conforme observável na Figura 4, o ácido
salicílico solubilizou-se apenas em glicerina a 95ºC em banho-maria.

Figura 4: Soluções de ácido salicílico com glicerina em diferentes concentrações

Fonte: AUTORAL, 2023.

4.2. TESTE DE DISCO-DIFUSÃO

Após o preparo da solução, fez-se o teste de disco-difusão, isolando as
bácterias em outra placa e colocando os seguintes discos nas placas:
Disco 1 - Ácido salicílico, mostrado na Figura 5.
Disco 2 - Aloe vera, mostrado na Figura 5.
Disco 3 - Ácido salicílico e Aloe vera, mostrado na Figura 5.
 13

Figura 5: Discos 1, 2 e 3 nas placas de bactérias 2, 4, 10, 17 e 18 após 24h em

estufa a 35ºC

Fonte: AUTORAL, 2023.

Observa-se que o ácido salicílico, Aloe vera e os dois juntos, tem ação
bacteriostática, pois não permite o crescimento bacteriano ao seu redor. Analisou-se
os esthalos de inibição com o auxílio de uma régua e obteu-se os seguintes valores
demonstrados na Tabela 1.
Tabela 1: Resultado dos diâmetros dos halos de inibição

Fonte: AUTORAL, 2023

Com base nos valores do diâmetro, conclui-se que os ativos têm função
intermediária, pois não há morte bacteriana e nem crescimento bacteriano ao redor
do disco, tendo somente uma atividade inibitória.
A placa contendo a bactéria 20, foi descartada por não apresentar
crescimento bacteriano sobre o meio de cultura mesmo após 24h em estufa a 35ºC,
o que implica na impossibilidade de realização e precisão do teste, assim como é
mostrado na Figura 6.
 14

Figura 6: Placa com bactéria 20, sem crescimento bacteriano

Fonte: AUTORAL, 2023.

4.3. AJUSTE DA ESCALA MCFARLAND EM ESPECTROFOTÔMETRO

Para quantificar e ajustar as suspensões bacterianas, chegando a uma
quantidade de bactérias aproximada a escala padronizada McFarland (constituída
por uma solução do sal insolúvel em água, sulfato de bário), primeiramente uma
varredura foi realizada com o fito de encontrar o comprimento de onda ideal para a
leitura. No entanto, não foi possivel visualizá-lo perfeitamente, devido ao meio de
análise (por turbidez) que acarretou a dificuldade da leitura de apenas um
comprimento de onda, que seria usado como ideal para análise, assim como mostra
a Figura 7.
Figura 7: Varredura da suspensão bacteriana

Fonte: AUTORAL, 2023.

 15

Portanto, utilizou-se os comprimentos de onda teóricos para a leitura da

turbidez referente à escala e às suspensões bacterianas, sendo eles: 540 nm, 600
nm, 640 nm e 660 nm. Os resultados obtidos foram os exibidos na Tabela 2.

Tabela 2: Leitura das suspensões bacterianas

540 nm 600 nm 640 nm 660 nm
Escala 0,079 A 0,081 A 0,071 A 0,073 A
Bactéria 2 0,088 A 0,083 A 0,069 A 0,069 A
Bactéria 4 0,093 A 0,085 A 0,068 A 0,070 A
Bactéria 17 0,087 A 0,083 A 0,068 A 0,073 A
Bactéria 18 0,089 A 0,084 A 0,068 A 0,070 A
Fonte: AUTORAL, 2023.

A variação ocorrida na absorbância da escala entre uma leitura e outra é

devido à instabilidade do sulfato de bário, não prejudicando os resultados, que
deveriam ser apenas aproximados.

4.4. TESTE DE CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)

Os resultados obtidos na análise do teste de Concentração Inibitória Mínima
(CIM), verificam que o os maiores efeitos bactericidas da solução de ácido salicílico,
está presente em 2% do ácido diluído em glicerina. Já na Aloe vera, foi avaliado que
o melhor resultado é observado na concentração de 10% do extrato bruto desta.
Estas verificações só foram possíveis através do efeito inibitório das matérias-primas
apresentadas sobre o crescimento visível dos micro-organismos em Caldo Mueller
Hinton, sendo o ideal o qual apresentou a menor turvação.
Tendo como exemplo os resultados obtidos nas bactérias 2, 4, 17 e 18,
expostas nas Figuras 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19, sendo agrupadas
respectivamente em ácido salicílico, Aloe vera, e os dois juntos, nas concentrações
de 2%, 4%, 6%, 8% e 10%.
 16

Figura 8: Bactéria 2, em diferentes concentrações do ácido salicílico

Fonte: AUTORAL, 2023.

Figura 9: Bactéria 2, em diferentes concentrações da Aloe vera

Fonte: AUTORAL, 2023.

 17

Figura 10: Bactéria 2, ácido salicílico + Aloe vera

Fonte: AUTORAL, 2023.

Figura 11: Bactéria 4, em diferentes concentrações do ácido salicílico

Fonte: AUTORAL, 2023.

Figura 12: Bactéria 4, em diferentes concentrações da Aloe vera

Fonte: AUTORAL, 2023.

 18

Figura 13: Bactéria 4, ácido salicílico + Aloe vera

Fonte: AUTORAL, 2023.

Figura 14: Bactéria 17, em diferentes concentrações do ácido salicílico

Fonte: AUTORAL, 2023.

Figura 15: Bactéria 17, em diferentes concentrações da Aloe vera

Fonte: AUTORAL, 2023.

 19

Figura 16: Bactéria 17, ácido salicílico + Aloe vera

Fonte: AUTORAL, 2023.

Figura 17: Bactéria 18, em diferentes concentrações do ácido salicílico

Fonte: AUTORAL, 2023.

Figura 18: Bactéria 18, em diferentes concentrações da Aloe vera

Fonte: AUTORAL, 2023.

 20

Figura 19: Bactéria 18, ácido salicílico + Aloe vera

Fonte: AUTORAL, 2023.

Devido a problemas técnicos apresentados, pela falta de disponibilidade de

matéria-prima para a realização do teste de CIM, a bactéria 10 teve que ser
descartada.
 21

5. CONCLUSÃO
Portanto, conclui-se que o teste de disco de difusão é positivamente aplicado
para a verificação da resistência bacteriana, permitindo analisar a sensibilidade
microbiológica e sua suscetibilidade à ação de antimicrobianos.
Logo, após a realização do método, foi possível a visualização dos halos de
inibição e a medição do diâmetro bacteriano.
 22

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANVISA. Normas de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana:

15o Suplemento Informativo. CLSI, 2005. Disponível em:
https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/metodo_ref_testes_diluicao_modulo4.pd
f. Acesso em: 04/11/2023.

SEJAS, M, L. et al. Avaliação da qualidade dos discos com antimicrobianos

para testes de disco-difusão disponíveis comercialmente no Brasil. 2002.
Acesso em: 29 de out de 2023.

XIMENES, L. A. Avaliação da qualidade dos discos de antimicrobianos para

teste de disco-difusão produzidos no Brasil. Anais da Academia de Ciências e
Tecnologia de São José do Rio Preto, p. 16, 2008. Acesso em: 29 de out de 2023.