Pró-reitoria de Graduação

Departamento de Estágio

TRABALHO DE
MICROBIOLOGIA

IDENTIFICAÇÃO DE
COCOS GRAM-POSITIVOS

Curso: Farmácia

Termo: 5° Termo

Ano: 2023

Professor-Orientador: ELIZANDRA APARECIDA DE OLIVEIRA LOPES

WALTER ROBERTO SCHILLER

Aluno(s): Paulo Roberto G Grespan/ R.A: 191065-9

David Nathan Dias Bertolucci/ R.A: 190627-2
Milena Nayumi Saijo/ R.A: 192017-6

Avenida: Hygino Muzzy Filho, 1001 Campus Universitário – (Bloco IX – anexo) - CEP: 17525–902 - Marília/SP
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Identificação de Cocos Gram-positivos

1) Staphylococcus spp

Os estafilococos representam um gênero de bactérias gram-positivas e estão entre

os patógenos mais comuns nos seres humanos. São microrganismos de formato
esférico e, geralmente, se arranjam em grupos com aspecto de cachos de uva.

Após coloração de técnica de Gram, adquirem cor púrpura ou arroxeada quando

visualizados sob microscopia (bacterioscopia). Essa retenção do corante de Gram
se dá por uma característica de membrana simples e parede celular de
peptideoglicano grossa, constituída de mureína, ácido teicóico e polissacarídeos.

São microrganismos anaeróbios-facultativos, isto é, vivem sob anaerobiose porém

conseguem crescer também sob tensões baixas de oxigênio através da
fermentação. Mas são bactérias que crescem melhor em aerobiose e em meios
ricos.

Dentre as principais espécies, estão:

 Staphylococcus aureus
 Staphylococcus auricularis
 Staphylococcus capitis
 Staphylococcus epidermidis
 Staphylococcus haemolyticus
 Staphylococcus hominis
 Staphylococcus lugdunensis
 Staphylococcus saprophyticus

1.2) Teste da Catalase:

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É uma prova bioquímica utilizada para

diferenciar Staphylococcus spp de Streptococcus spp, porém esse teste
diferencia família e não gênero.

Staphylococcus são produtores da catalase, uma enzima que converte o H2O2 em

O2 + H20.

Quando estamos diante de uma espécie e não temos certeza se estão arranjados
em grupos/cachos ou em fileiras, montamos uma lâmina com gotas de peróxido de
hidrogênio e misturamos uma pequena porção da colônia em cada uma das gotas.

Se neste momento houver efervescência, significa que estamos diante de

um Staphylococcus spp, caso não haja produção de gás podemos estar diante de
um Streptococcus spp.

1.3) Teste da Coagulase:

Prova bioquímica utilizada quando estamos diante de um Staphylococcus spp e

queremos saber a sua espécie, por exemplo se trata-se de Staphylococcus
aureus ou SCN (Staphylococcus coagulase negativa)

Algumas espécies de Staphylococcus spp, como por exemplo o Staphylococcus

aureus, são produtoras de uma enzima chamada coagulase.

Essa enzima converte o fibrinogênio em fibrina, formando coágulo que atuará como
proteção da bactéria contra os fagócitos e a isolando de outros sistemas de defesa
do hospedeiro. (Tortora et al., 2012.)

A realização desse teste se dá misturando uma pequena porção da colônia sobre

uma gota de plasma de coelho e após determinado tempo é possível observar a
formação ou não de pequenos coágulos.

Caso esse processo seja positivo, estamos diante de um Staphylococcus

aureus (espécie produtora de coagulase).

Nas situações em que o teste da coagulase seja negativo, podemos possivelmente

estar na presença de um S. epidermidis ou S. saprophyticus.

- Staphy test

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Prova bioquímica utilizada para diferenciar S. aureus de outras espécies

de Staphylococcus spp, seria como uma variação do teste da coagulase.

Esse teste se baseia na capacidade do Staphylococcus aureus em aglutinar

hemácias de carneiro previamente sensibilizadas com hemolisina e fibrinogênio. Ao
homogeneizar uma pequena porção da colônia nesse componente de hemácias +
fibrinogênio + hemolisina, se houver aglutinação trata-se positivamente
de Staphylococcus aureus.

1.4) Teste da DNase:

É um teste para avaliar a capacidade de um microrganismo ser produtor de uma

enzima chamada desoxirribonuclease, que tem por finalidade de ação
despolimerizar/degradar o ácido desoxirribonucleico (DNA) presente no meio de
cultura.

É útil para diferenciar diversas espécies bacterianas, como:

 Bacilos Gram-negativos.
 Cocos Gram-positivos (Staphylococcus aureus de outras espécies, como
por exemplo S. epidermidis, S.
saprophyticus ou Staphylococcus coagulase negativo).
 Não fermentadores.

- Técnica do teste

Neste teste deve-se utilizar um meio de cultura específico, o Ágar DNase, onde a
triptona será a fonte de aminoácidos para promover o crescimento bacteriano, o
NaCl será responsável pelo equilíbrio osmótico do meio e o DNA é o substrato para
determinar a ação enzimática.

Inicia-se fazendo um inoculo no meio de cultura e seguindo para incubação a 35°C

por um período de 18h a 24h. Posteriormente à incubação, adiciona-se HCl 1N
cobrindo as colônias e aguardamos aproximadamente 30 segundos para avaliar a
atividade enzimática.

O ácido clorídrico (HCl) promoverá a precipitação do DNA degradado, fazendo com

que o meio de cultura fique opaco. As espécies de bactérias produtoras da enzima
dnase, e que obviamente degradaram o DNA presente no ágar, apresentarão ao seu
redor um alo transparente.

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Comercialmente, além do Ágar DNase, temos à disposição o Ágar com Azul de

Toluidina, onde a ação enzimática da DNase será revelada pela quebra do complexo

DNA-Corante formando uma cor metacromática identificada por zonas de coloração

róseas a vermelhas ao redor das colônias.

1.5) Teste de Sensibilização à Novobiocina:

Prova que permite diferenciar cepas de Staphylococcus saprophyticus de outros

estafilococos não produtores de coagulase. O Staphylococcus saprophyticus tem
resistência conferida à Novobiocina.

A técnica deste teste baseia-se em semear em Ágar Muller-Hinton com disco de

novobiocina 5mg a cepa que desejamos identificar. Após incubação verificar a
formação de halo de inibição para Staphylococcus aureus e Staphylococcus
epidermidis, como na imagem abaixo:

2) Streptococcus spp

São microrganismos também de morfologia esférica, gram-positivos, que se

agrupam em pares ou cadeias curtas. São bactérias que, no geral, não são
patogênicas aos seres humanos, porém algumas espécies podem sim causar
patologias graves.

Os estreptococos não são produtores da enzima catalase, portanto uma

característica de diferenciação importante dos estafilococos. Apesar de que,
conforme dito mais acima, existem espécies de Staphylococcus que não
produzem essa enzima e são negativos para o teste da catalase.

A classificação das mais de 100 espécies dentro do gênero Streptococcus é

complicada, sendo utilizados três diferentes esquemas que se complementam:
(1) propriedades sorológicas: separação nos grupos de Lancefield (originalmente de
A a W);
(2) padrões hemolíticos: hemólise completa (beta [β]), hemólise incompleta (alfa [α]),
e sem hemólise (gama [γ]);
(3) propriedades bioquímicas (fisiológicas). Apesar de representar uma simplificação
excessiva, é prático dividir os estreptococos em dois grupos: (1) os estreptococos β-
hemolíticos, que são classificados nos grupos de Lancefield, e (2) os estreptococos
α-hemolíticos e γ-hemolíticos, que são classificados por testes bioquímicos. O

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segundo grupo é conhecido coletivamente como estreptococos viridans, um nome

derivado de viridis (do latim para “verde”), em referência à pigmentação verde
formada pela hemólise parcial do ágar-sangue.

Dentre algumas espécies de interesse clínico, estão:

 Streptococcus agalactiae
 Streptococcus bovis (Streptococcus do grupo D)
 Streptococcus canis
 Streptococcus mutans
 Streptococcus pneumoniae
 Streptococcus pyogenes
 Streptococcus salivarius
 Streptococcus viridans

2.1) Teste da Optoquina:

Prova de identificação utilizada para diferenciação entre estreptococos alfa-

hemolíticos e pneumococos (Streptococcus pneumoniae).

Os pneumococos são normalmente sensíveis a optoquina, enquanto os

estreptococos (em especial os estreptococos alfa-hemolíticos) não o são.

- Técnica do teste:

Partindo do caldo BHI ou TSB recém turvado, proceder com a semeadura em Ágar
Sangue com disco de optoquina 5mg e seguir com incubação a 35°C por 24 horas.

Após incubação, verificar a formação de halo de inibição de 14mm ou mais para

disco de optoquina de 6mm.

2.2) Teste da Bile Esculina:

Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp de Streptococcus do grupo D,

porém é um teste com possibilidade de uso na diferenciação de Enterococcus spp
e Streptococcus bovis de Streptococcus spp.

A presença de bile no meio inibe o crescimento de microrganismos Gram-negativos.

A hidrólise da esculina em esculetina reage com o citrato férrico presente no meio

formando um complexo negro, o que garante a diferenciação entre os 2 gêneros
(enterococos de estreptococos).

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2.3) Ágar Bile Azida Esculina:

É um meio de cultura utilizado utilizado para isolamento seletivo de estreptococos do

grupo D (Streptococcus bovis), e também para diferenciação de Enterococcus spp
e Streptococcus bovis (Streptococcus do grupo D) de Streptococcus spp. em
amostras farmacêuticas e de alimentos. É um meio que promove uma ação

bioquímica muito parecida com o teste da bile esculine mencionado mais acima,
porém não é recomendado para uso diagnóstico em seres humanos.

O princípio de ação é semelhante ao teste da bile esculina:

A esculina do meio de cultura é degradada em esculetina que reagirá com sais de

ferro presente no ágar.
Essa interação promoverá uma reação bioquímica formando um complexo de cor
enegrecida e escurecendo o meio de cultura.

2.4) CAMP:

O teste de CAMP (acrônimo para Christie, Atkins e Munch-Petersen) é utilizado para

a identificação presuntiva de estreptococos do grupo B e é realizado utilizando uma
cepa de S. aureus produtora de β-hemolisina. Os estreptococos do grupo B
secretam uma proteína denominada “fator CAMP”, que interage com a β-hemolisina
produzida e secretada por S. aureus, causando aumento ou sinergismo da hemólise.
Isso aparece como uma área de hemólise aumentada em forma de ponta de seta na
área onde as duas estrias de crescimento estão mais próximas. Esse teste é
altamente sensível, e até mesmo cepas do grupo B não hemolíticas serão CAMP-

positivas. Uma pequena porcentagem de estreptococos do grupo A também será

CAMP-positiva, assim como Listeria monocytogenes. Entretanto, o formato da
reação de CAMP com L. monocytogenes é retangular em lugar da forma em ponta
de seta produzida pelos estreptococos do grupo B. Esse teste é frequentemente
usado em associação com os testes de bacitracina e de SXT na mesma placa de
ágar-sangue para a identificação presuntiva desses microrganismos. Os laudos
devem fornecer a seguinte informação: “estreptococos beta-hemolíticos do grupo B
presuntivos pelo teste de CAMP.

A β-hemolisina, juntamente com o fator CAMP produzido por estreptococos do grupo

B, é responsável pela hemólise sinérgica observada em teste CAMP positivo para
identificação presuntiva de estreptococos do grupo B.

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2.5) PYR:

O substrato L-pirrolidol-b-naftilamida (PYR) oferece um método simples para a

identificação rápida dos enterococos. A formação de uma coloração avermelhada
depois de acrescentar o reagente N,N-metilamino-cianomaldeído indica positividade
do teste com PYR. Esse teste é utilizado principalmente para determinar o gênero
Enterococcus, mas outras bactérias (p. ex., S. pyogenes) também são positivas.

O teste da PYR também se mostra útil como teste fenotípico para a identificação de
estafilococos coagulase-negativos. À semelhança dos enterococos, a L-pirrolidonil β-
naftilamida é clivada pela arilamidase a L-pirrolidona e β-naftilamida livre, que se
combina com o reagente PYR (p-dimetilamino-cinomaldeído [PACA]), produzindo
uma cor vermelha. O teste é efetuado com caldo PYR semeado até um padrão de
turvação de McFarland aproximado de no 2. Depois de 2 horas de incubação a
35°C, adiciona-se o reagente PYR. O aparecimento de uma cor vermelha dentro de
2 minutos representa um teste positivo, enquanto uma cor amarela, laranja ou rosa
indica um resultado negativo. Como alternativa, pode-se utilizar qualquer um dos
testes comerciais rápidos com discos de PYR. A hidrólise de PYR também é
observada em alguns sistemas de kits que estão disponíveis para a identificação dos
estafilococos. Tanto S. aureus quanto S. epidermidis são PYR-negativos, enquanto
S. haemolyticus, S. intermedius, S. lugdunensis e S. schleiferi subesp. schleiferi são
PYR-positivos.

Os estreptococos do grupo A são identificados de maneira definitiva por meio da

demonstração do carboidrato grupo-específico, uma metodologia que não era
prática até a implementação de testes de detecção direta do antígeno. A
diferenciação de S. pyogenes de outras espécies de estreptococos que também
apresentam o antígeno de grupo A pode ser determinada pela suscetibilidade à
bacitracina ou pela presença da enzima L-pirrolidonil arilamidase (PYR).
A suscetibilidade à bacitracina é determinada pela colocação de um disco de papel
de filtro saturado com o antimicrobiano sobre uma placa com meio de cultura
inoculado com estreptococos do grupo A; após incubação durante a noite, as cepas
inibidas pela bacitracina são consideradas estreptococos do grupo A.
O teste do PYR indica a hidrólise do L-pirrolodonil-β-naftilamida, liberando β-
naftilamina, que, na presença de p-diaminocinamaldeído, forma um composto de cor
púrpura. A vantagem desse teste específico é que leva menos de 1 minuto para
determinar se a reação é positiva (S. pyogenes) ou negativa (todos os demais
estreptococos). Enterococos são PYR positivo, mas não reagem com os antissoros
do grupo A.

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- Streptococcus pneumoniae:

Cocos Gram-positivos alongados e dispostos aos pares (diplococos), ou em cadeias

curtas; alfa hemolíticos parede celular apresenta ácido teicoico rico em fosforilcolina
(polissacarídeo C), necessário para a atividade da enzima autolítica, amidase.
As cepas são identificadas pelo teste da catalase (negativo), suscetibilidade à
optoquina e solubilidade em bile.

- Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae:

Streptococcus pyogenes, também conhecido como estreptococos beta- -hemolíticos
do grupo A. O grupo A representa um componente de um grupo antigênico (A até G)
dentro dos estreptococos hemolíticos.
Streptococcus agalactiae, que se encontra no grupo beta-hemolítico B. Essa é a
única espécie que apresenta o antígeno do grupo B e é a causa de uma importante
doença de recém-nascidos, a septicemia neonatal

- Enterococcus:

Diplococos, transporte gastrointestinal, resistente a medicamentos, infecções do

trato urinário, peritoniteOs gêneros Streptococcus e Enterococcus são formados por
um grupo diverso de cocos Gram-positivos tipicamente dispostos aos pares ou em
cadeias (diferentemente do arranjo em grumos formado por Staphylococcus).
catalase-negativos.

-Streptococcus bovis:

Espécie de estreptococos do grupo D que colonizam o trato gastro-intestinal de

ruminantes. É um coco GRAM-positiva. No homem, tem importância clínica como
causa de endocardite e relação com neoplasia do trato gastro-intestinal.

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Referências Bibliográficas:

OPLUSTIL,C. P. et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica 3ª ed. São Paulo: Sarvier,
2010.

TORTORA, G. J. FUNKE, B. R. CASE, C. L. Microbiologia 10º ed. Porto Alegre: ARTMED, 2012. 934
p.

TRABULSI, L. R. Microbiologia 5º ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2008. 760 p.

KONEMAN, E. W. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 5º ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2001. Tradução A. E. Cury.

https://maestrovirtuale.com/agar-mueller-hinton-fundacao-preparacao-e-usos/.

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https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo4/
intr_sta.htm#:~:text=Os%20estafilococos%20s%C3%A3o%20cocos%20Gram,auxiliares%20na
%20identifica%C3%A7%C3%A3o%20destes%20microrganismos.

MURRAY, Patrick. Microbiologia Médica. [Digite o Local da Editora]: Grupo GEN, 2017. E-book. ISBN
9788595151741. Disponível em: https://app.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788595151741/. Acesso
em: 15 mai. 2023.

Procop, Gary W. Diagnóstico Microbiológico - Texto e Atlas, 7ª edição . Disponível em: Minha
Biblioteca, Grupo GEN, 2018.

https://app.minhabiblioteca.com.br/reader/books/9788527734516/epubcfi/6/2%5B%3Bvnd.vst.idref
%3Dcover%5D!/4/2/2%4051:35

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