Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Centro Biomédico

Faculdade de Enfermagem

Michelle Pereira Caiado

Biomarcadores de exposição à sílica: Uma nova abordagem na

detecção e prevenção da silicose

Rio de Janeiro

2017
 Michelle Pereira Caiado

Biomarcadores de exposição à sílica: Uma nova abordagem na detecção e

prevenção da silicose

Apresentado à Sub-ÁreaI B – Pesquisa

em Enfermagem IV – Monografia do
Curso de Graduação em Enfermagem
da Universidade do Estado do Rio de
Janeiro, como requisito parcial para a
conclusão da subárea.

Orientador(es): Prof. Dr.ª Magda Guimarães de Araujo Faria

Prof. Dr. José Carlos Pelielo de Mattos

Rio de Janeiro

2017
 DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho primeiramente a Deus, depois aminha família e a todos que
estiveram me apoiando durante esses anos, presentes ou que já partiram em especial ao
Dr. Adriano Caldeira de Araújo (in memorian).
 AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus e minha família representada na figura de meu avô ,

Antonio Carlos Dias Caiado (in memorian). , por terem me conferido saúde, confiança
epermitido meu avanço nos estudos com o permanente apoio nesse sentido desde o
colégio até a universidade

Agradeço ao Laboratório de Radio e Fotobiologia do Departamento de Biofísica e

Biometria (IBRAG/UERJ) representado pelos professores e co-orientadores Dr. José
Carlos Pelielo de Mattos e Dr. Adriano Caldeira de Araújo (in memorian) por terem me
recebido como estagiária de iniciação científica (IC) e contribuído ainda mais para meu
crescimento na área acadêmica e científica. Agradeço pela maneira humana como
sempre fui tratada ao longo do caminho presenciando a grande capacidade e
generosidade desses cientistas.

Agradeço a minha orientadora Dr.ª Magda Guimarães de Araujo Faria, professora da

Faculdade de Enfermagem da UERJ (FENF), por ter me apoiado no desafio de
execução do presente trabalho junto a FENF.

Agradeço a todos os professores da FENF que contribuíram para meu crescimento e

amadurecimento dentro do universo da Enfermagem.

Agradeço ao Dr. Flavio José da Silva Dantas do Laboratório de Radio e Fotobiologia

pelo constante apoio dentro da minha caminhada no estágio de iniciação científica.

Agradeço ao Amigo e Dr. Marcos Massao Murata que muito se dedicou para me ensinar
e aconselhar tornando possível enfrentar todas as dificuldades. Sem suas orientações,
apoio, confiança e amizade, não somente neste trabalho, mas em todo caminho
percorrido até aqui , nada disso seria viável.

Agradeço ao Dr. Eduardo Santos Silva pela grande ajuda na parte técnica do trabalho
contribuindo com seu vasto conhecimento, como também como grande amigo com
apoio nas horas mais difíceis.

Agradeço a equipe ligada ao projeto como um todo representada pelos ICs Thaís,
Nathalia, Letycia Chagas, Fernanda, Elouise, Maurício, Mariana e Gabriel. Além dos
mestres Paulo Vinicius e Leticia.
Agradeço ao Departamento de Microbiologia (IBRAG/UERJ) representado pela Dra
Alessandra Saliba por ter cedido as células da linhagem A549.

Agradeço ao Departamento de Bioquímica (IBRAG/UERJ) representado pela Dra

Tatiana de Almeida Simão, e pelos técnicos Paulinho, Lin e Beto, pelo auxílio na parte
instrumental para conservação de células bem como preparo de soluções e ensaios.
 RESUMO

MICHELLE, Pereira Caiado. Biomarcadores de exposição à sílica: Uma nova

abordagem na detecção e prevenção da silicose. Faculdade de Enfermagem,
Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.

A sílica é composta dos elementos silício e oxigênio, encontrada nasformas amorfa

e cristalina, sendo a última mais abundante na Terra. A inalação de cristais de sílica
pode resultar em uma grave doença pulmonar conhecida como silicose, com alta
prevalência em todo o mundo devido à exposição ocupacional em atividades como
mineração, jateamento de areia e construção. A doença é progressiva e irreversível,
iniciada por um processo inflamatório com produção de Espécies Reativas de
Oxigênio (ERO)resultando em fibrose pulmonar e até mesmo no desenvolvimento
do câncer. Como a silicose não possui cura,é necessário um olhar diferenciado por
parte dos enfermeiros para utilizarem métodos que visem o monitoramento da
exposição à sílica e consequentemente a prevenção da silicose. Por isso, ao
estabelecer biomarcadores que indiquem que o trabalhador está exposto à sílica, o
enfermeiro poderá estabelecer condutas que visem à prevenção da silicose. Assim,
este estudo buscou estabelecer biomarcadores como avaliação da citotoxicidade,dos
níveis de estresse oxidativo e da genotoxicidade, possivelmente correlatos com o
início da exposição à sílica e desenvolvimento da silicose. Os ensaios foram
realizados in vitro utilizando culturas de células provenientes de carcinoma alveolar
de epitélio basal pulmonar humano (linhagem A549).As células A549 foram
incubadas com uma solução de sílica (300µg/mL), durante 30min, 1 hora e 2 horas.
Uma outra amostra de células permaneceu apenas em meio nutriente, como controle
do experimento.Os resultados mostraram um aumento da citotoxicidade e do
estresse oxidativo, após os diferentes tempos de incubação das células com sílica.
Além disso, também foi observado um aumento da taxa de dano no DNA após2h de
exposição, através do ensaio de genotoxicidade. Os dados obtidos indicam que a
exposição à sílica é capaz de promover efeitos citotóxicos e provavelmente
genotóxicos que parecem ser mediados pela ação de espécies reativas de oxigênio.
ABSTRACT

Silica is composed by the elements silicon and oxygen, found in the amorphous and
crystalline forms, being the last the most abundant in the Earth. The inhalation of
crystalline form can turn in a serious pulmonary disease known as silicosis, with high
predominance in whole world due to the occupational exhibition in activities like
mining, sand blasting and construction. The disease is progressive and irreversible,
started by an inflammation process with ROS production resulting in pulmonary fibrosis
and even in cancer development. Since silicosis has no cure, a differentiated look is
needed by the nurses in order to use methods that aim to monitoring the silica exposure
and consequently the prevention of the silicosis. Therefore, while establishing
biomarkers which indicate that the worker is exposed to the silica, the nurse will be able
to establish conducts that aim the prevention of the silicosis. So, this study aimed to
establish biomarkers like evaluation of cytotoxicity, of the stress oxidative level and the
genotoxicity, which possibly correlates with the beginning of silica exposure and
development of the silicosis. The tests were carried out in vitro using cells cultures
originating from carcinoma alveolar of human pulmonary basic epithelium (cell line
A549). Cells A549 were incubated with a silica solution (300µg/mL), during 30min, 1
hour and 2 hours. Another sample of cells remained only in nutritious environment, as
control of the experiment. The results showed an increase in the cytotoxicity and the
stress oxidative, after the cells incubation time with silica. Besides, it was also observed
an increase of the damage tax of the DNA after 2 h of exposure, through the
genotoxicity test. The obtained data indicate that the silica exposure is able to promote
cytotoxicity and probably genotoxicity effects which seem to be mediated by the action
of reactive oxygen species.
 LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Pirâmide de Maslow......................................................................... 16

Figura 2 - Desenho experimental....................................................................... 28

Figura 3 - Representação ilustrativa das células A549 com 80% de

confluência........................................................................................ 30

Figura 4 - Protocolo de contagem das células................................................... 31

Figura 5 - Representação ilustrativa das células viáveis e inviáveis através da 34

câmara de Neubauer..........................................................................

Figura 6 - Protocolo do ensaio cometa.............................................................. 38

Figura 7 - Representação ilustrativa das quatro classes existentes no teste do

cometa............................................................................................... 39

Figura 8 - Viabilidade em células A549 expostas a 300μg/mL de sílica por 30

minutos , 1 hora e 2 horas............................................................ 40

Figura 9 - Avaliação do estresse oxidativo através do TBARS em células A549

expostas a 300μg/mL de sílica por 30 minutos , 1 hora e 2
41
horas..................................................................................................
Figura 10 -
Taxa de dano ao DNA em células A549 expostas a 300μg/mL de 42
sílica por 2 horas...............................................................................
Figura11 -
Média do número de cometas contados nas classes 0 até 4 em células 43
A549 expostas a 300μg/mL de sílica por 2 horas................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Agarose LMP Agarose Low Melting point
Agarose NMP Agarose Normal Melting point
ANOVA Análise de Variância
DNA Ácido desoxirribonucleico
DMSO Ácido Dimetil sulfóxido
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EPI Equipamento de proteção individual
ERO Espécie Reativa de Oxigênio
EUA Estados Unidos da América
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
IBRAG/UERJ Instituto de biologia Roberto Alcantara Gomes da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro
IOC Instituto Oswaldo Cruz
PBS Tampão Fosfato Salino
SFB Soro Fetal Bovino
TC Tomografia Computadorizada
TCA Ácido Tricloroacético
Tris Hidroximetilaminometano

LISTA DE SÍMBOLOS
AgNO3 Nitrato de prata
CH3COOH Ácido acético
CO2 Dióxido de carbono
Fe2+ Ferro bivalente
H2O2 Peróxido de hidrogênio
H4[Si(W3O10)4]· xH2O Ácido tungstosilicico
H2CO Formaldeído
KCl Cloreto de potássio
KH2PO4 Fosfato monopotássico
Min Minutos
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
Na2HPO4 Fosfato dissódico
Na2PO47H2O Fosfato dissódicoheptahidratado
Na2CO3 Carbonato de sódio
O2 Molécula de oxigênio
pH Potencial de hidrogênio
Si Átomo de silício
SiO2 Dióxido de Silício
 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO................................................................................................ 13

1 REFERENCIAL TEÓRICO.......................................................................... 18

1.1 A silicose enquanto importante pmeumoconiose no Brasil e no mundo..... 18

1.2 O potencial da pesquisa experimental no estudo da silicose: Etapas e

conceitos............................................................................................................
22
1.2.1 O uso de Biomarcadores nas pesquisas experimentais......................................
22
1.2.2 Citotoxicidade e o ensaio exclusão do azul de trypan.......................................
23
1.2.3 Estresse oxidativo e o TBARS...........................................................................
23
1.2.4 Genotoxicidade e o ensaio cometa.....................................................................
24
1.2.5 Cultura de células...............................................................................................
25
2 METODOLOGIA............................................................................................
26
2.1 Tipo de estudo..................................................................................................
27
2.2 Cenário, material e variáveis..........................................................................
27
2.3 Técnicas de coleta e análise de dados.............................................................
28
2.3.1 Etapa Preparatória..............................................................................................
28
2.3.2 Fase Pragmática I - Exclusão do azul de trypan................................................
33
2.3.3 Fase Pragmática II – Avaliação do Estresse Oxidativoatravés do TBARS.......
34
2.3.4 Fase Pragmática III – EnsaioCometa...............................................................
35
2.3.5 Fase Avaliativa..................................................................................................
39
3 RESULTADOS................................................................................................
40
3.1 Avaliação da citotoxicidade através do ensaio de exclusão do azul de
40
trypan...........................................................................................................
3.2 Avaliação do estresse oxidativo através do TBARS..................................... 41

3.3 Avaliação da genotoxicidade através do ensaio cometa............................... 42

4 DISCUSSÃO.................................................................................................... 43
.
5 46
CONCLUSÕES................................................................................................
6 48
ETAPAS FUTURAS........................................................................................
7 49
REFERÊNCIAS...............................................................................................
54
APÊNDICES....................................................................................................
54
Apêndice A – Composição dos meios de cultura...........................................
56
Apêndice B – Soluções do ensaio cometa.......................................................
 13

INTRODUÇÃO

O estudo traz como problema de pesquisa a utilização de biomarcadores de exposição

à sílica para auxiliar na identificação precoce da silicose.
O interesse por esta pesquisa surgiu de uma experiência vivenciada no Laboratório de
Rádio e Fotobiologia do departamento de Biofísica e Biometria – IBRAG, localizado na
UERJ (Universidade do Estado do Rio de Janeiro). Considerando que a silicose é uma doença
crônica que não há um tratamento específico e apesar de poder ser prevenida apresenta altos
índices de incidência e prevalência em todo o mundo.
A silicose é uma doença que está dentro do grupo de enfermidades conhecidas como
pneumoconioses. As pneumoconioses são doenças relacionadas ao ambiente de trabalho e são
causadas por inalação de uma grande variedade de partículas de poeira ou de substâncias
químicas. O desenvolvimento da doença em um trabalhador individual é dependente dos
efeitos tóxicos da substância inalada, da intensidade, duração da exposição e da
vulnerabilidade do trabalhador (MULLER et al., 2005; LEUNG; YU; CHEN, 2012).
Por ser uma doença pulmonar, a silicose é causada pela inalação, retenção e reação
pulmonar a partículas na fração respirável contendo sílica cristalina em suspensão no ar.É
caracterizada por fibrose do tecido pulmonares e uma vez a doença iniciada, é irreversível e
geralmente progressiva (NIOSH, 2002).
O Programa Nacional de Eliminação da Silicose traçou como meta reduzir a
incidência de silicose até 2015 e eliminar a silicose como problema de saúde pública no Brasil
até 2030 (OIT, 2011). Apesar disso, a prevalência desta doença continua elevada por causa da
dificuldade de eliminar a exposição à poeira nos ambientes ocupacionais. Isso ocorre por
diversos fatores interdependentes, como: baixo nível de investimento financeiro em controle
ambiental dos processos de trabalho, fiscalização governamental inadequada e insuficiente,
ausência de um cadastramento específico das indústrias que manipulam matérias-primas
contendo sílica, ausência de percepção de risco por parte dos trabalhadores, não priorização
do problema por parte dos sindicatos de trabalhadores e baixa qualidade dos programas de
controle médico e de saúde ocupacional praticados pelas empresas empregadoras, o que leva a
um baixo índice de diagnósticos precoces (CASTRO; SILVA; VICENTE, 2005).
Embora esforços para prevenção tenham sido feitos por muitas décadas, a silicose é
um problema mundial. A doença ocorre principalmente em países em desenvolvimento
 14

devido à baixa vigilância, mas ao contrário do que muitos pensam também ocorre em países
desenvolvidos (LEUNG; YU; CHEN, 2012).
Por volta de 600 mil trabalhadores no Reino Unido e mais de 3 milhões de
trabalhadores na Europa foram expostos a sílica cristalina de 1990 a 1993. Entretanto, menos
de 100 casos foram registrados por ano no Reino Unido entre 1996 e 2009, e as mortes por
silicose decaíram de 28 em 1993, para 10 em 2008 (LEUNG; YU; CHEN, 2012).
Nos EUA, cerca de 7 mil casos de silicose ocorreram anualmente entre 1987-1996.
Por outro lado, na maioria dos países desenvolvidos, medidas de proteção (por exemplo,
controle de poeira e respiradores) têm contribuído para um declínio regular nas taxas de
mortalidade devido à silicose nas últimas décadas, mas novos casos ainda ocorrem em níveis
preocupantes (LEUNG; YU; CHEN, 2012).
Estudos epidemiológicos mostram que a China tem o maior número de pacientes com
silicose, com mais de 500 mil casos registrados entre 1991 e 1995, e mais de 24 mil mortes
relatadas anualmente, desde 1995 até 2012. O problema é ainda maior para os trabalhadores
de minas de pequena escala, que muitas vezes têm uma forma acelerada de doença. (WHO,
2000; LEUNG; YU; CHEN, 2012). Na África do Sul, mineradores de ouro com mortes por
causas externas (por exemplo, ferimentos, queimaduras, intoxicações e afogamento), foram
identificados com silicose após realização de autopsia, entre 1975 e 2007 (NELSON et al.,
2010; LEUNG; YU; CHEN, 2012).
No Brasil, o número de trabalhadores expostos à sílica em 2006 estava estimado em,
aproximadamente, seis milhões. Sendo quatro milhões na construção civil, quinhentos mil na
mineração e garimpo e mais de dois milhões em indústrias de transformação de minerais,
metalurgia, indústria química, da borracha, cerâmicas e vidro. Com isso, o número de
trabalhadores expostos representa 14,6% do total de trabalhadores inseridos no mercado
formal (FILHO; SANTOS, 2006).
A atuação do enfermeiro na prevenção da silicose enquanto doença ocupacional é
indispensável, pois o mesmo é responsável pelo bem-estar físico e mental do profissional,
tendo funções administrativas, assistenciais e principalmente educativas, onde deve-se
capacitar os trabalhadores quanto ao grau de risco e ao uso dos equipamentos de
proteção individual necessários (JOCELLY; BOLLTINE; BRASILEIRO, 2011).
Neste sentido, o seguinte problema de pesquisa foi levantado: Quais são os
Biomarcadores que podem indicar a exposição à sílica e também o surgimento da silicose?
A hipótese do estudo é que a utilização conjunta de ensaios de citotoxicidade, de
avaliação do nível de estresse oxidativo e de genotoxicidade pode ser uma abordagem
 15

promissora para avaliação do risco de exposição à sílica, estabelecendo biomarcadores e

contribuindo para um melhor controle da doença.
O estudo tem como objetivo geral estabelecer biomarcadores, em culturas de células
expostas à sílica, que possam apontar os danos celulares gerados por essa exposição e também
o tempo necessário para o surgimento das lesões. Os objetivos específicos serão revisar
conceitos e características sobre a silicose; avaliar em culturas de células A549, a
citotoxicidade (pelo ensaio de exclusão do azul de trypan); os níveis de estresse oxidativo
(pelo ensaio de peroxidação lipídica - TBARS); e a genotoxicidade (pelo ensaio cometa),
fatores possivelmente correlatos com o início da exposição à sílica e desenvolvimento da
silicose.
O que se espera com esse estudo é contribuir para o estabelecimento de biomarcadores
de exposição que identifiquem de maneira precoce a exposição à sílica. Desse modo é
possível contribuir para que em um futuro próximo os enfermeiros possam dispor de uma
bateria de indicadores que identifiquem precocemente a exposição a esse agente ambiental.
Assim sendo, o enfermeiro poderá tomar medidas preventivas para que não ocorra o
surgimento da silicose.
 16

Justificativa

No Brasil, as teorias de enfermagem tiveram seu início com os escritos de Wanda

Horta, sobre as “Necessidades Humanas Básicas”. Horta descreve a enfermagem como
responsável pelo atendimento das necessidades humanas básicas do indivíduo (paciente
família e sociedade). A enfermagem deve ser orientada pela pirâmide das necessidades
humanas básicas de Maslow (Figura 1): necessidades fisiológicas; necessidades de segurança;
necessidades de amor; necessidades de estima; necessidades de auto-realização, sendo que
todas as necessidades estão interligadas, e deve haver equilíbrio entre elas. Se algum fator
ocasionar o desequilíbrio, o processo de resolução deve ser efetivado pelo papel da
enfermagem na assistência. Deste modo, a enfermagem tem um papel fundamental na
garantia deste estado de equilíbrio das necessidades humanas básicas (HORTA, 1979).

Figura 1- Pirâmide de Maslow

O procedimento recomendado para o indivíduo com silicose consiste principalmente
no afastamento do trabalhador da fonte de exposição e consequentemente do seu ambiente
ocupacional. Esse afastamento poderá provocar um desequilíbrio em duas neccesidades
humanas básicas: autoestima e autorealização. Por isso é necessário um olhar diferenciado por
parte dos enfermeiros para desenvolverem métodos que visem o monitoramento da exposição
 17

à sílica e consequentemente a prevenção da silicose. Desta forma, ao estabelecer

biomarcadores que indiquem que o trabalhador está exposto à sílica, o enfermeiro poderá
estabelecer condutas que visem à prevenção da silicose.
O estudo experimental sobre silicose já vem sendo realizado há alguns anospor
diferentes grupos de pesquisa, como por exemplo, realizado na Fundação Oswaldo Cruz onde
situa-se o Laboratório de Inflamação do Instituto Oswaldo Cruz (IOC), que tem como uma de
suas linhas de pesquisa a busca por novas terapias frente à silicose.
A partir da colaboração entre o Laboratório de Inflamação do IOC e o Laboratório de
Radio e Fotobiologia, do Departamento de Biofísica e Biometria do IBRAG/UERJ iniciou-se
um projeto conjunto, utilizando camundongos como modelo experimental, que visa
estabelecer indicadores de efeito, em nível celular e molecular, que possam apontar, de
maneira precoce, a exposição à sílica, e também o surgimento da silicose dentro de um
contexto de avaliação de risco toxicológico. Resultados obtidos mostraram que camundongos
Swiss-Webster expostos à sílica tiveram um aumento do número de lesões no DNA de células
de sangue periférico e variação na expressão de alguns genes ligados ao processo de
inflamação. Esses dados fazem parte da tese de doutorado de um aluno do laboratório de
Radio e Fotobiologia (MURATA, 2014).
Acredita-se que esta parceria institucional, bem como as pesquisas em
desenvolvimento sejam de grande valor, pois a partir destas, será possível identificar a
exposição, bem como o início da silicose, contribuindo assim, para construção
desconhecimento sobre a temática, podendo auxiliar na prevenção e terapêutica.
Como desdobramento desse projeto inicial houve a preocupação de avaliar o risco
toxicológico da exposição à sílica também in vitro, utilizando culturas de células provenientes
de carcinoma alveolar de epitélio basal pulmonar humano, a linhagem A549. A primeira
etapa desse projeto foi a padronização do ensaio cometa em culturas de células A549 através
da monografia de um aluno do laboratório de Radio e Fotobiologia (LIMA ,2014). Em
continuidade ao projeto inicial, a etapa seguinte foi o presente trabalho que busca
biomarcadores in vitro utilizando culturas de células da linhagem A549 que possam apontar a
exposição à sílica e também o surgimento da silicose.
 18

1-REFERENCIAL TEÓRICO

1.1 A silicose enquanto importante pmeumoconiose no Brasil e no mundo

Pneumoconiose é um termo criado para se referir ao grupo de doenças respiratórias

decorrentes da inalação de poeiras. Com o passar do tempo, o termo foi sendo ajustado a
denominações próprias de acordo como o nome da doença. Sendo assim, a doença causada
por sílica chama-se silicose, asbesto – asbestose, ferro - siderose, estanho - estanhose, talco –
talcose, e cada uma delas recebem um código na Classificação Internacional de Doenças
(CID) (CASTRO; VINCENTIN; GONÇALVES, 2005).
O processo fisiopatológico inicia-se quando a poeira inalada atinge o parênquima
pulmonar, atraindo células fagocitárias e de defesa para o local, ocasionando a liberação de
substâncias quimiotáxicas e também fibrogênicas, dando início à lesão silicótica (CASTRO;
VINCENTIN; GONÇALVES, 2005).
Para que ocorra o desenvolvimento de uma pneumoconiose é necessário que o
material particulado seja inalado e atinja as vias respiratórias inferiores em quantidade capaz
de superar os mecanismos de depuração: o transporte mucociliar, o transporte linfático
(conhecidos como clearence) e a fagocitose pelos macrófagos alveolares (ALGRANTI,
2003).
Para ter eficácia em atingir as vias respiratórias inferiores, as partículas devem ter um
diâmetro aerodinâmico inferior a 10μm, pois acima deste tamanho são retidas nas vias aéreas
superiores. A fração respirável com tamanho menor que 5μm tem maior chance de se
depositar no trato respiratório baixo (bronquíolos terminais e respiratórios e os alvéolos), e
dar início ao processo inflamatório que, se perpetuado pela inalação crônica e/ou em
quantidades que superam as defesas, pode levar à instalação das alterações pulmonares.
Partículas com diâmetros entre 5 a 10μm, embora em menor proporção, também têm
condições de se depositar nessas regiões e produzir uma pneumoconiose (ALGRANTI, 2003).
Neste sentido, a silicose caracteriza-se pela formação de pequenos nódulos
arredondados nos pulmões de pessoas expostas a poeira de sílica cristalina, sendo uma doença
fibrótica pulmonar potencialmente fatal, irreversível, progressiva e não tratável causada pela
inalação prolongada e deposição de sílica cristalina respirável nas vias respiratórias inferiores
(PANDEY; AGARWAL, 2012).
 19

O termo silicose, empregado pela primeira vez por Visconti, em 1870, é o nome dado
à fibrose pulmonar causada pela inalação de poeira contendo sílica cristalina, sendo a mais
frequente das pneumoconioses (FILHO; SANTOS, 2006).
A silicose é considerada uma das mais antigas doenças ocupacionais conhecidas,
oriunda da inalação de poeira de sílica cristalina, sendo a mais comum causada pela partícula
em forma de quartzo. No Brasil e no mundo, esta doença constitui um problema de Saúde
Pública que já poderia ter sido erradicado com o uso de medidas de controle nos ambientes
ocupacionais (RIBEIRO et al., 2008).
Por ser uma doença pulmonar fibrosante com evolução crônica, a silicose é causada
por inalação da poeira da sílica, que acomete as regiões peribronquiolares, no centro do lóbulo
pulmonar secundário. A drenagem linfática é o mecanismo envolvido na remoção das
partículas dos pulmões, mas esta não é completamente efetiva, fazendo com que haja acúmulo
gradual de partículas nas regiões onde esta drenagem é menos eficiente, que são as faces
posteriores dos lobos superiores (MEIRELLES; KAVAKAMA; RODRIGUES, 2006).
Uma vez inaladas, as partículas de sílica1 depositam-se principalmente nos
bronquíolos respiratórios e alvéolos. Se o clearance mucociliar ascendente e linfático não for
capaz de remover as partículas, elas acabam por induzir um processo inflamatório,
caracterizado inicialmente como uma alveolite, podendo evoluir para a fase de fibrose
(MEIRELLES; KAVAKAMA; RODRIGUES, 2006).
Segundo a Fundacentro (2011), no Brasil, as atividades que apresentam os maiores
riscos de se adquirir a silicose são: a) fundição de ferro, aço ou outros metais onde se utilizam
moldes de areia; b) indústria extrativa (mineração, atividades de extração e beneficiamento de
pedras que contenham o mineral); c) cerâmicas: fábricas de pisos, azulejos, louças sanitárias,
louças domésticas e o uso de tijolos refratários; d) fabricação de vidros (preparação e também
no uso de jateamento de areia para opacificação); e) perfuração de rochas na indústria da
construção (túneis, barragens e estradas), moagem de quartzo e pedras; f) construção de
fornos refratários, jateamento de areia (utilizado na indústria naval, na fundição e polimento
de peças na indústria metalúrgica); g) execução de trabalho em mármore, ardósia, granito e
outras pedras, fabricação de material abrasivo; h) mineração subterrânea; i) escavação de
poços; j) atividades de protético.

1
A sílica, ou dióxido de silício, é formada pelos elementos oxigênio e silício em condições de pressão e calor elevados. Ela
existe nas formas amorfa e cristalina. A forma mais comum da sílica cristalina é o quartzo, um típico componente de rochas,
que está presente no arenito, granito e calcário, por exemplo, e é o segundo mineral mais abundante no planeta. A inalação de
sílica cristalina livre resulta num espectro de doenças pulmonares conhecidas como silicose (TIWARI, 2005)
 20

Para evitar a respiração de poeira de sílica, algumas medidas de controle da saúde do

trabalhador podem ser adotadas pela empregadora, tais como: mudança da matéria-prima,
adoção de processos ou operações que não produzam poeira, umidificação do local para evitar
que a poeira se espalhe pelo ambiente, instalação de um sistema de ventilação local exaustora,
limpeza do local por lavagem ou por aspiração, realização de manutenções preventivas e
corretivas em todos os equipamentos operacionais, sinalização e rotulagem da área e de
produtos que contenham sílica, monitoramento ambiental, utilização de proteção respiratória
para o trabalhador, realização de exames periódicos, limitação de tempos de exposição e
treinamentos periódicos. (FUNDACENTRO, 2011)
A silicose pode ser classificada em três formas clínicas: silicose aguda, acelerada e
crônica (LEUNG; YU; CHEN, 2012). A fase aguda, ou proteinose alveolar silicótica, ocorre
geralmente após meses ou poucos anos de exposição elevada a partículas de sílica.
Habitualmente, há rápida evolução para o óbito. Manifesta-se com quadro de intensa dispnéia,
astenia, perda de peso e hipoxemia, e apresenta como achado, na radiografia, padrão de
infiltrado alveolar bilateral, com distribuição difusa e, na tomografia de alta resolução, padrão
de opacidade em vidro fosco, espessamento septal liso nas áreas alteradas e imagem de
condensação com distribuição geográfica ou regional. As alterações patológicas são: lesão de
pneumócitos tipo I e presença na luz alveolar de exsudado constituído por material
lipoproteináceo. A inflamação intersticial com presença de fibrose geralmente está presente,
mas não é intensa, podendo ou não ser detectada a presença de granulomas (FILHO;
SANTOS, 2006; MEIRELLES; KAVAKAMA; RODRIGUES, 2006).
A silicose acelerada é causada pela inalação de grandes quantidades de sílica, com
evolução mais rápida que a crônica e a silicose aguda, também conhecida como
silicoproteinose, decorrente da inalação maciça de sílica por períodos muito curtos. As
alterações patológicas são representadas pela presença de granulomas ou nódulos silicóticos
(FILHO; SANTOS, 2006 ; MEIRELLES; KAVAKAMA; RODRIGUES, 2006).
A forma crônica é a mais comum e geralmente ocorre após mais de dez a quinze anos
de exposição ou de latência. Tem evolução insidiosa, sendo inicialmente assintomática, e
pode evoluir com sintomas de dispnéia progressiva. O exame de imagem apresenta, nos
estágios iniciais, infiltrado micronodular bilateral, com predomínio nas zonas pulmonar
superiores, poupando os seios costofrênicos. A alteração patológica típica é o nódulo
silicótico encontrado no interstício pulmonar, ao redor de bronquíolos respiratórios e dos
vasos, nas regiões subpleurais, na pleura visceral e em linfonodos (FILHO; SANTOS, 2006;
MEIRELLES; KAVAKAMA; RODRIGUES, 2006).
 21

Visto a agressividade da doença, é essencial a criação de estratégias de combate a

silicose. Atitudes voltadas para a própria segurança e a daqueles a sua volta são
imprescindíveis por parte dos trabalhadores, em todo e qualquer ambiente de trabalho. Entre
outros procedimentos, o uso dos Equipamentos de Proteção Individual adequados a cada
ocupação conforme a NR22, e em perfeito estado de conservação, representa grande
diminuição dos riscos de contrair doenças como a silicose (BELTRAME et al, 2010).
Para combater a silicose, o Brasil criou em 2001 o Programa Nacional De Eliminação
da silicose, sob a coordenação técnica da FUNDACENTRO, que desenvolve ações de caráter
nacional e setorial com o objetivo de reduzir significativamente as taxas de incidência da
doença e até a sua eliminação como problema de saúde pública (FUNDACENTRO, 2011).
Algumas orientações para redução e eliminação da silicose são: eliminação da
exposição não usando a sílica ou usando-as nas menores quantidades possíveis e de forma que
ninguém se exponha; quando não se pode eliminar por completo a exposição à sílica livre
cristalizada, deve-se controlar ou minimizar a emissão de poeira de sílica para o ar; se não for
possível controlar a exposição por qualquer método, deve-se então fornecer equipamentos de
proteção respiratória para os trabalhadores e outras pessoas que necessitem circular pela área
(FUNDACENTRO, 2011).
A criação de dispositivos legais que inibam ou regularizam a prática de atividades
reconhecidas cientificamente pelo alto potencial de surgimento da doença também pode ser
considerada uma estratégia de combate. No estado do Rio de Janeiro, por exemplo, a prática
de jateamento de areia foi proibida, pela Lei nº 1979 de 23 de março de 1992. E a partir de
2005, a portaria 99 de outubro de 2004 do Ministério do Trabalho e Emprego proibiu, em
todo o território nacional, as atividades de jateamento de areia de qualquer tipo. (CAPITANI;
ALGRANTI, 2006).
O enfermeiro tem como função a prevenção e promoção da saúde, visando o bem estar
físico e mental e contribui diretamente para a melhoria das condições de trabalho, pois a
silicose é a principal causa de aposentadoria por doenças respiratórias ocupacionais. Sendo
assim, a enfermagem deve estar apta a promover educação continuada com seus
trabalhadores, para evitar danos futuros. Observando que as doenças profissionais têm
relação direta de causa e efeito entre os fatores de riscos no ambiente de trabalho as empresas
devem estar atentas aos riscos que seus trabalhadores são submetidos (JOCELLY;
BOLLETINE; BRASILEIRO, 2011).
 22

1.2 O potencial da pesquisa experimental no estudo da silicose: Etapas e conceitos

1.2.1 O uso de Biomarcadores nas pesquisas experimentais

Compreende-se por Biomarcadores, toda substância, produto de biotransformação ou

alteração bioquímica precoce ocorrida a partir da exposição de um material biológico a um
agente tóxico. Sua determinação nos fluidos biológicos, tecidos ou ar exalado tem a
capacidade de avaliar a intensidade da exposição e o risco à saúde (GULUMIAN et al., 2006).
Uma atenção considerável tem sido dada na literatura científica à utilização de
biomarcadores na prevenção de doenças ocupacionais. Categorias diferentes de
biomarcadores são usadas para avaliar exposição, identificar mudanças ou efeitos iniciais da
exposição, identificar mudanças patológicas previamente ao desenvolvimento da doença e
ainda predizer suscetibilidade para desenvolver uma doença ocupacional. Biomarcadores tem
grande potencial de melhorar o processo de avaliação de risco em ambientes de trabalho em
geral e especificamente em doenças pulmonares, como a silicose . (GULUMIAN et al., 2006).
Alguns biomarcadores podem detectar o estadiamento de determinadas doenças, como
os biomarcadores de efeito. Estes indicam a presença da doença em fase inicial, precursores
da doença, ou ainda eventos periféricos ao processo que podem predizer o desenvolvimento
de um dano à saúde. Marcadores de efeito podem incluir mudanças, como uma resposta na
função de tecidos alvos ou órgãos, frente a danos cromossomiais, mutações em genes alvos
críticos, ou alteração no estado hormonal. (BHATTACHARYA et al., 2005).
O diagnóstico precoce e a predição podem tornar-se muito úteis para controlar a
silicose. Os biomarcadores são parâmetros biológicos em várias matrizes biológicas que
podem detectar mudanças com a deposição de pó de sílica nos pulmões e o início da fibrose
pulmonar. Estes biomarcadores também podem ajudar no prognóstico da doença antes de ser
realmente diagnosticada por técnicas convencionais como o Raio-x ou TC (PANDEY;
AGARWAL, 2012).
 23

1.2.2 Citotoxicidade e o ensaio exclusão do azul de trypan

A citotoxicidade foi definida por Nardone (1977) como sendo o conjunto de alterações
da homeostase celular, que leva a uma série de modificações, que interferem na capacidade
adaptativa das células, bem como na sua sobrevivência, reprodução e realização de suas
funções metabólicas.
Para a avaliação da citotoxicidade, podemos utilizar o ensaio de exclusão do azul de
trypan. Na qual o corante não atravessa membranas íntegras, devido à permeabilidade seletiva
das mesmas. Assim, membranas de células vivas não são permeáveis ao corante e, logo, não
adquirem nenhuma coloração. Como as células mortas têm suas membranas danificadas,
ocorre o fluxo de corante para o seu interior, conferindo-lhes uma coloração azul (ZEFERINO
et al., 2010).

1.2.3 Estresse oxidativo e o TBARS

O estresse oxidativo é consequência de um desequilíbrio entre a produção de

compostos oxidantes, chamados coletivamente de espécies reativas de oxigênio (ERO)e sua
degradação pelos sistemas celulares de defesa antioxidante. Esse desequilíbrio pode ser
causado por diversos fatores, endógenos ou exógenos, relacionados com o aumento da
produção de ERO e/ou com a redução da disponibilidade de antioxidantes (SOUZA;
FERREIRA, 2007).
Devido ao fato de que as espécies reativas de oxigênio têm meia-vida extremamente
curta, elas são difíceis de diretamente. Porém, podem ser medidos os vários produtos dos
danos produzidos pelo estresse oxidativo, tais como as substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico TBARS (do inglês: Thiobarbituric acid reactive substances).Entre os principais
danos celulares causados pelas espécies reativas de oxigênio está a oxidação dos lipídios das
membranas celulares, levando à perda da fluidez e aumento da permeabilidade das
membranas, com liberação de nutrientes e substâncias tóxicas à célula no espaço extracelular,
e até mesmo sua ruptura. As substâncias formadas como subproduto da peroxidação lipídica
 24

podem ser detectadas pelo ensaio TBARS por serem reativas ao ácido tiobarbitúrico, um dos
principais marcadores biológicos desse tipo de lesão em membranas celulares
(DAMASCENO et al., 2002)

1.2.4 Genotoxicidade e o ensaio cometa

O termo genotoxicidade foi utilizado pela primeira vez há três décadas para descrever
componentes da interação química com material genético. O termo genotóxico é uma
expressão geral proposta para expressar efeitos tóxicos, letais e/ou hereditários no material
genético nuclear e externo ao núcleo celular, tanto em células somáticas como em células
germinativas (WEISBURGER; WILLIAMS, 2000).
Substâncias genotóxicas são aquelas que possuem uma capacidade biológica direta, ou
secundária, através de seus metabólitos, de alterar a codificação do DNA. Um agente tóxico é
dito genotóxico quando ocasiona alterações na estrutura ou no conteúdo dos cromossomos
(clastogenicidade) ou da sequência de pares de bases do DNA. Estes efeitos podem ocorrer
mesmo em exposições a baixas concentrações e, deste modo, podem acarretar problemas
reprodutivos, alteração do desenvolvimento embrionário e alterar o desenvolvimento do
organismo adulto, incluindo processos carcinogênicos (WEISBURGER; WILLIAMS, 2000).
Já o ensaio cometa é uma técnica de eletroforese em microgel desenvolvida para
detectar estes danos no DNA em nível celular, individualmente. Uma vez que as lesões
detectáveis por este teste são passíveis de correção, o teste do cometa pode também ser
utilizado para estudar reparo no DNA, trazendo informação sobre a cinética e o tipo de lesão
reparada.
A técnica utiliza um meio fortemente alcalino (pH>13), possibilitando a separação das
fitas de DNA e facilitando a migração desta molécula no gel, bem como de fragmentos. O
princípio básico do ensaio cometa é a migração do DNA em uma lâmina de microscopia com
agarose, quando submetido a uma diferença de potencial. O núcleo da célula ganha a
aparência de um cometa, com uma cabeça e uma cauda contendo fragmentos resultantes de
danos ao DNA, que migram em direção ao anodo (HARTMANN et al., 2003;
AZQUETA ;COLLINS, 2013).
O ensaio cometa é um atrativo para pesquisadores devido à sua simplicidade,
sensibilidade e versatilidade. Embora cada célula, ou “individuo cometa”, esteja marcada para
 25

se obter medidas de dano ao DNA, é necessário, para validar os resultados, o número mínimo
de 100 “indivíduos cometa” para obter o nível global de danos de uma população de células
(AZQUETA; COLLINS, 2013).
Em comparação com outros testes de genotoxicidade, as vantagens do ensaio cometa
são a detecção de dano rapidamente, o baixo número de células necessário para a realização
do ensaio, seu baixo custo, precisão, facilidade de aplicação, reprodutibilidade e curto período
de tempo para realização do ensaio (BELPAEME; COOREMAN; KIRSCH-VOLDERS, 1998
; TICE et al., 2000;. BUCKER et al., 2006).

1.2.5 Cultura de células

A cultura de células é uma ferramenta muito útil em múltiplas áreas de investigação

das ciências da saúde. O termo cultura celular refere-se ao processo de extração de células de
tecidos ou órgãos de um animal ou planta, com consequente colocação num ambiente
artificial capaz de sustentar e proporcionar o seu crescimento (FRESHNEY, 2005).
O cultivo de células é caracterizado por permitir a manutenção de células vivas (in
vitro) em laboratório, independente do organismo que a originou. As células mantidas em
culturas não estão mais organizadas em tecidos, e crescem em recipientes estéreis, usualmente
placas e frascos plásticos descartáveis, contendo meio de cultura líquido ou semi-sólido capaz
de fornecer nutrientes essenciais para sua sobrevivência e crescimento (FRESHNEY, 2005).
A cultura de células eucariotas tornou-se um recurso valioso tanto para a pesquisa
biomédica como para a área de biotecnologia industrial. Células mantidas em cultura são
modelos biológicos mais simples do que os estabelecidos com base em animais de
experimentação e tendem a fornecer respostas simplificadas para problemas complexos de
investigação biomédica (FRESHNEY, 2005).
Os dados produzidos a partir de culturas de células eucariotas in vitro podem ser
suficientemente informativos, particularmente para estudos funcionais, bioquímicos e
moleculares, como também para análise de alvos farmacológicos e produção de produtos
biológicos, incluindo vacinas e anticorpos, por exemplo. (FRESHNEY, 2005).
Células normais de mamíferos geralmente possuem tempo finito de sobrevivência em
cultura (ABBAS et al., 2010). Entretanto, células tumorais ou fisiologicamente modificadas
por carcinógenos químicos ou vírus podem ser propagadas indefinidamente em cultura de
 26

tecidos e são denominadas imortais. Tais células apresentam características singênicas e são
referidas como linhagens celulares (FAGUNDES; TAHA, 2004).
 27

2 METODOLOGIA

2.1 Tipo de estudo

Trata-sede uma pesquisa quantitativa e explicativa de caráter experimental. Na

pesquisa quantitativa é considerado tudo que pode ser quantificável, o que significa traduzir
em números opiniões e informações para classificá-las e analisá-las. Requer o uso de recursos
e de técnicas estatísticas tais como, descritivas, percentagem, média, moda, mediana, desvio-
padrão, análise de regressão, análise de variância e outros (GIL, 2007).
A pesquisa explicativa visa identificar os fatores que determinam ou contribuem para a
ocorrência dos fenômenos. Aprofunda o conhecimento da realidade porque explica a razão, o
“porquê” das coisas. Quando realizada nas ciências naturais, requer o uso do método
experimental, e nas ciências sociais requer o uso do método observacional. Assume, em geral,
a forma de pesquisa experimental. O método experimental consiste na determinação de um
objeto de estudo, onde variáveis influenciáveis são selecionadas e definem-se as formas de
controle e de observação dos efeitos que a variável produz no objeto (GIL, 2007).

2.2 Cenário, material e variáveis

Esse estudo foi realizado no Laboratório de Rádio e Fotobiologia do Departamento de

Biofísica e Biometria, localizado no 4º andar Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes
da UERJ (Universidade do Estado do Rio de Janeiro).
As células utilizadas no estudo foram células da linhagem A549 (fibroblastos de
carcinoma pulmonar), que foram gentilmente doadas pela Dra. Alessandra Saliba, do
Departamento de Microbiologia e Imunologia, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
As células A549 foram incubadas em meio nutritivo (meio F12) contendo uma solução
de sílica na concentração de 300µg/ml. Nos tempos 30min, 1 hora e 2 horas foram retiradas
alíquotas da cultura celular e realizados o ensaio de avaliação de viabilidade por exclusão do
azul de trypan e a avaliação do estresse oxidativo pelo TBARS (substâncias reativas ao ácido
 28

tiobarbitúrico).Para o tempo de incubação de 2 horas também foi feito o ensaio cometa para
avaliação de quebras no DNA. Todos os experimentos foram realizados sempre em triplicata.
(Figura 2)
Também foi preparada uma amostra controle, na qual as células A549 não foram
incubadas apenas em meio nutriente, sem a presença de sílica. É denominado grupo controle,
o grupo que não recebe o tratamento. Para determinar o efeito do tratamento sobre as células
compara-se os resultados nos dois grupos. (Figura 2)

Placas de células com 24 poços

controle controle controle controle controle Vazio

controle

controle controle
Exclu
controle controle controle controle Vazio

Vazio
tratado Vazio
tratado Vazio
tratado tratado Vazio
tratado Vazio
tratado

Vazio
tratado Vazio
tratado tratado
Vazio Vazio
tratado Vazio
tratado Vazio
tratado

controle
Células A549 mais meio F12

tratado Células A549 tratadas com solução de sílica de 300µg/mL

Figura 2. Desenho experimental

2.3 Técnicas de coleta e análise de dados

 29

2.3.1 Etapa Preparatória

a) Biossegurança aplicada a laboratórios de cultivo celular

O trabalho com cultivos celulares exige uma série de cuidados para se reduzir os riscos
de contaminação. As técnicas assépticas reduzem a probabilidade de contaminação, sendo
importante que sejam mantidas durante todo o procedimento, ou seja: antes, durante e ao
término do experimento. A necessidade de manutenção da assepsia inclui a observação de
uma série de regras que vão desde a esterilização dos meios de cultura e instrumentos, até a
adoção de quarentena para os cultivos novos. Isso porque as células são cultivadas em meios
ricos em nutrientes e a possibilidade de ocorrer propagação de microrganismos contaminantes
é alta (PERES; CURI, 2005).
A temperatura e a umidade foram controladas para evitar o crescimento de
microrganismos no ambiente. A climatização de uma sala de 15m² (45m³) foifeita por um
aparelho de ar condicionado de 15.000 BTUs, levando-se em conta que existe o aquecimento
produzido pelos equipamentos.
Toda a manipulação com as células que exigia um ambiente de trabalho estéril foi
realizada em uma câmara de fluxo laminar (Filterflux808/4). Antes de iniciar os
procedimentos experimentais, a câmara interna do fluxo laminar foi limpa com gaze
embebida em álcool etílico 70% (v/v). O etanol a 70% (v/v) é um excelente desinfetante,
sendo eficaz também na redução da flora bacteriana da pele. Suas propriedades desidratante e
desnaturante de proteínas são responsáveis por sua ação antimicrobiana (PERES; CURI,
2005).
O fluxo de ar, assim como a lâmpada de luz ultravioleta (UV) foram ligados por 20
minutos antes do uso, sendo a lâmpada de luz UV desligada ao final desse período. Todo
material foi limpo com álcool etílico a 70% (v/v) antes de ser introduzido na câmara de fluxo.
Ao final de cada experimento o procedimento de limpeza da câmara de fluxo foi repetido.
Os meios de cultura e soluções eram mantidos em banho-maria antes do início dos
experimentos (37oC – mesma temperatura de crescimento das culturas celulares). Ao retirar o
material do banho-maria, o excesso de umidade foi removido com auxílio de uma gaze e o
frasco limpo com álcool 70% (v/v).
 30

As vidrarias utilizadas foram autoclavadas sob pressão a 121°C por 20 minutos.

Entretanto pipetas graduadas, os microtubos, os frascos e as placas de incubação de células
eram estéreis e foram descartados logo após o uso.

b) Obtenção e conservação de estoques da linhagem celular A549

Os estoques da linhagem A549 foram preparados em meio nutritivo F12 (Cultilab)

acrescido de soro fetal bovino (SFB – 10%) (Cripion) utilizando garrafas de 75cm², e com
todas as etapas realizadas na câmara de fluxo de laminar, previamente esterilizada com álcool
70% e radiação ultravioleta (UV).
Após as células em fase logarítmica de crescimento apresentar uma confluência de
cerca de 80% da área da garrafa (Figura 3), o meio nutriente foi descartado e as garrafas
foram lavadas duas vezes com 5 ml de tampão fosfato salino (PBS), para remover impurezas
e possíveis proteínas liberadas pelas células. Em seguida, um volume de 3 ml da solução de
Tripsina-EDTA (0,1% tripsina e 0,01% EDTA) foi adicionado para que as células fossem
isoladas por ação proteolítica. A tripsina hidrolisa as proteínas de adesão celular, enquanto o
EDTA quela os íons divalentes livres, responsáveis por manter a integridade dessas proteínas
de adesão.

Figura 3. Representação ilustrativa das células A549 com 80% de confluência. Adaptado ATCC, 2016.

Após 3 minutos de incubação em estufa (37ºC, 5% de CO 2), as células foram liberadas

da superfície em que se encontram e 5mL de meio de cultura F12 enriquecido com SFB 10%
foi adicionado na garrafa para neutralizar a ação da enzima. O conteúdo foi centrifugado a
 31

1500rpm por 10 minutos (Eppendorf - Mini Spin Plus), e o sobrenadante descartado para
eliminação da tripsina. O precipitado celular foi lavado com PBS e novamente centrifugado,
nas mesmas condições, para retirada de qualquer resíduo de tripsina.
Para a contagem das células (figura 4), o precipitado foi ressuspenso em 2mL de meio
de cultura F12 em tubo de polipropileno (15mL). Em seguida, uma alíquota (10µL) foi
retirada e diluída em 10µL de Azul de trypan para que as células viáveis pudessemser
contadas com auxílio da câmara de Neubauer, em um microscópio invertido. Os cálculos
foram realizados para determinar o quantitativo celular segundo Peres e Curi (2005).
Assim, um volume que continha 2x106células/mL foi misturada com meio de
congelamento composto por 95% de SFB e 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenado
em tubo de polipropileno (1mL). Após a realização de todas essas etapas, os tubos com as
células foram levados ao freezer (-80ºC).

Garrafa semeadas Ficarão na estufa até quando A garrafa será

estiver 80% confluida. lavada com PBS- 2X Trip

10µL + 90µL de Ressuspenso com

Contagem de células em Azul de Trypan
câmara de Neubauer de meio

Figura 4. Protocolo de contagem de células

 32

c) Descongelamento das culturas celulares

Um tubo de polipropileno (1 mL) era retirado do freezer (-80ºC), descongelado em

água ultrapura (37ºC) e seu conteúdo transferido para um tubo de polipropileno (15 ml) que
era centrifugado (1500rpm, 5 min – Eppendorf modelo 5804R)e o sobrenadante desprezado.
Após isso, foi adicionado PBS e centrifugado novamente nas mesmas condições. O
sobrenadante foi novamente descartado para retirada de qualquer resíduo de DMSO, um
crioprotetor usado para o congelamento das células.
Após a realização dessas etapas, um volume de 10 mL de meio F12 suplementado com
SFB 20%, foi adicionado ao tubo com o pellet, suavemente agitado para suspensão das
células e vertido para uma garrafa, que ficará 24 horas na estufa (37ºC, 5% de CO2 ).
Ao final desse tempo, o meio nutritivo foi retirado e um volume de 10mL de meio
fresco com SFB 10% foi adicionado. Em seguida, a garrafa foi colocada na estufa para
multiplicação do número de células, formando uma monocamada celular.

d) Obtenção das culturas celulares para os experimentos

Quando a garrafa atingiu confluência de 80% de sua área (figura 3) o meio de cultura
foi trocado para repor os nutrientes e eliminar as excretas celulares. Ao atingir o estágio de
confluência desejado, foi adicionado PBS para limpeza da garrafa e 3mL de tripsina, sendo
levada para estufa (4min, 37ºC, 5% de CO2). Após o isolamento das células, visualizado por
meio de um microscópio invertido, um volume de 5mL de meio nutriente suplementado com
SFB 10% foi adicionado. O volume foi transferido para um tubo de polipropileno (15 mL) e
levado à centrifuga (1500rpm, 8 min). O sobrenadante foi eliminado suavemente e o pellet foi
usado para contagem do número de células.

e) Contagem do número de células

Para contagem do número de células, 2 mL de meio de cultura F12 foi adicionado ao

tubo de polipropileno (15mL) que continha o precipitado (ítem d). Uma alíquota (10µL) foi
retirada e diluída com 10µL de azul de trypan. O número de células foi contado na câmara de
Neubauer com o auxílio de um microscópio invertido, conforme figura 4.
 33

f) Semeando células em placas de 24 poços

Realizada a determinação do número de células presentes no volume de 2 mL de

cultura, elas foram divididas em uma placa de 24 poços, de modo que em cada poço, em um
volume de 500µL, a concentração celular fosse de 1x105células/ml. A placa foi mantida em
estufa (37ºC, 5% CO2, 24 h) para que as células pudessem formar uma monocamada no
fundo dos poços.

g) Exposição das células ao pó de sílica

Com a formação da monocamada, o meio de cultura utilizado foi retirado, e os poços

foram separados em dois grupos: controle e exposto à sílica, com três poços para cada grupo.
A sílica foi pesada e alíquotas (10mg) foram armazenadas em tubos de polipropileno
(1,5mL) e estocadas em dessecador. No dia do experimento, 1 mL de meio de cultura fresco
foi adicionado ao tubo com sílica previamente pesada, formando uma solução mãe de
concentração 10mg/mL. Em seguida, visando impedir a formação de grumos de sílica, a
solução foi submetida à sonicação durante 30 minutos, na intensidade máxima permitida pelo
fabricante do equipamento (Heat Systems - Sonicatorultrasonic processor XL).
Em seguida um volume correspondente a 300µg/mL de sílica foram adicionados nos
respectivos poços da placa e as frações celulares incubadas em estufa (37ºC, 5% CO2).
As células então foram expostas à sílica durante 30 min, 1 hora e 2 horas. Ao final de
cada intervalo de tempo, o meio nutritivo foi retirado dos poços lavado com 500µL de PBS, e
adicionado 200µL de solução de Tripsina-EDTA (0,1%:0,01%), a 37ºC. Após alguns
minutos, foi adicionado meio nutriente com SFB (10%), realizando-se, então, fluxo-refluxo
com a pipeta para que as células se soltassem do fundo da placa. As células, já em suspensão,
foram recolhidas centrifugadas a 1500rpm por 10 minutos (Eppendorf - Mini Spin Plus).
Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em meio F12
suplementado com SFB 10%.

2.3.2 Fase Pragmática I - Exclusão do azul de trypan

 34

Para analisar a viabilidade das células, foi utilizada a metodologia de exclusão do azul
de trypan, que não atravessa membranas íntegras, devido à permeabilidade seletiva das
mesmas. Assim, membranas de células vivas não são permeáveis ao corante e, logo, não
adquirem nenhuma coloração. Como as células mortas têm suas membranas danificadas,
ocorre o fluxo de corante para o interior das mesmas, conferindo-lhes uma coloração azul
(FIDALGO et al., 2009).
Após a exposição das células à sílica, as células foram analisadas em câmara de
Neubauer, para contagem de células viáveis e inviáveis em microscópio óptico invertido
(FIDALGO et al., 2009). (Figura 5)

Célula
inviável

Célula viável

Figura 5. Representações ilustrativa das viáveis e inviáveis através da câmara de Neubauer

2.3.3 Fase Pragmática II – Avaliação do Estresse Oxidativo através do TBARS

A quantificação dos níveis de TBARS foi realizada segundo a metodologia de Yagi

(1998) e as concentrações de proteínas das células foram determinadas usando o método de
Peterson (1977).
Ao final de cada intervalo de tempo de exposição das células à sílica (30min, 1 hora e
2 horas), o meio nutritivo foi retirado dos poços e em seguida foram lavados com 500µL de
PBS, e adicionado 200µL de tripsina. O procedimento para isolamento das células, com
auxílio da tripsina, foi realizado como descrito acima.
Após a digestão com a tripsina, 800µL de meio F12 fresco suplementado com SFB
10% foi adicionado e a retirada das células da placa realizada com muito cuidado, evitando ao
máximo a formação de bolhas. Em seguida, todo volume da amostra foi transferido para tubos
 35

tipo eppendorf e centrifugado (3000rpm, 5min) em microcentrifuga; o sobrenadante foi

ressuspenso com 500 µL de PBS. Todo conteúdo foi vertido  para um tubo falcon e foi
adicionado 5µL de TRITON X e 500 µL de TBA (0,375% de ácido tiobarbitúrico, 30% de
ácido acético e 0,5 N de HCL). Em seguida, os tubos foram mantidas em banho maria por 20
minutos e então foram colocadas no gelo para esfriarem. Ao atingir a temperatura ambiente,
as amostras foram centrifugadas (1200rpm por 30s) e, em seguida, alíquotas
contendo500 µL foram retiradas e a absorbância medida em espectrofotômetro (Shimadzu
UV- 160A) a 532 nm. Os valores de TBARS são expressos em µmol/mg de proteínas.
As concentrações de proteínas das células foram determinadas usando o método de
Peterson (1977). Alíquotas de células foram elevadas a um mililitro com água destilada em
um tubo de ensaio. De acordo com a faixa de sensibilidade do método deve-se usar uma
alíquota que contenha de 10 a 100 µg de proteínas totais. A seguir acrescentou-se 1,0 mL de
reagente A, que é composto pela mistura de quatro componentes: a solução CTC (carbonato
de sódio a 10%, tartarato duplo de sódio e potássio a 0,2% e sulfato de cobre a 0,1%), NaOH
3,2%, dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% e água destilada na proporção de 1:1:1:1. Após
agitação as amostras foram deixadas em repouso por 10 minutos seguindo-se a adição do
reagente B (Reativo de Folin e Ciocalteau mais água destilada, na proporção de 1:6). Após 30
min de desenvolvimento da reação, os valores de absorbância a 750 nm das amostras controle
e incubadas com sílica, além dos brancos foram medidos em espectrofotômetro contra água
destilada.

2.3.4 Fase Pragmática III – Ensaio Cometa

a) Preparo das lâminas com agarose de ponto de fusão normal

Para preparo das lâminas, 3g de agarose NMP (Normal Melting Point ou ponto de
fusão normal) foi pesada e dissolvida em 200mL de tampão PBS. A solução foi fervida,
ficando homogênea. Este processo foi repetido por mais duas vezes e todo volume perdido
por evaporação foi completado com PBS (concentração final de 1,5%).
A solução de agarose foi então mantida a 65ºC para evitar que gelificasse. As lâminas
de microscopia foram mergulhadas na solução de agarose até chegar a parte fosca. Sua face
posterior foi limpa com papel seco, sendo então colocadas na posição horizontal,
permanecendo secando em temperatura ambiente por pelo menos 24horas.
 36

b) Preparo da solução de agarose de baixo ponto de fusão

Uma solução de agarose LMP 0,5% foi preparada dissolvendo 1g de agarose LMP em
200mL de tampão PBS, sendo realizado o mesmo procedimento descrito acima para
homogeneização .
Para que a solução de agarose LMP não gelificasse durante o procedimento, foi usado
o banho-maria, ligado a 37ºC.

c) Aplicação da matriz biológica nas lâminas

As células então foram expostas à sílica durante 2 horas. Ao final, o meio nutritivo foi
retirado dos poços que em seguida foram lavados com 500µL de PBS, e adicionado 200µL de
tripsina. Após a digestão com a tripsina, 800µL de meio F12 fresco suplementado com SFB
10% foi adicionado e a retirada das células da placa foi realizada com muito cuidado,
evitando ao máximo a formação de bolhas. Posteriormente, todo volume da amostra foi
transferido para microtubos de 1,5 ml e centrifugado (3000rpm, 5min) em microcentrifuga; o
sobrenadante foi descartado com cuidado para manter o precipitado formado e as células
foram ressuspensas em 80µL agarose LMP (Low Melting Point ou baixo ponto de fusão).
Todo o volume foi então aplicado nas lâminas previamente preparadas com agarose NMP e
uma lamínula foi colocada sobre a lâmina. Posteriormente, as lâminas foram levadas a
geladeira durante 10 minutos para gelificar. Ao final desse tempo as lamínulas foram retiradas
de forma cuidadosa para evitar qualquer tipo de dano à camada de agarose gelificada.

d) Preparo da solução lise e imersão das lâminas

A solução de lise foi dividida em soluções 1 e 2, cujas composições estão apresentadas

no apêndice B, sendo misturadas pouco tempo antes do uso e depositada em uma cuba
envolvida com papel alumínio para impedir a entrada de luz, e mantida na geladeira para ser
utilizada a 4º C.
As lâminas sem as lamínulas foram colocadas de forma cuidadosa nos berços para que
possam ser imersas na solução de lise e mantidas por 48 horas à 40 °C. ( figura 6)
 37

e) Eletroforese em gel de agarose em condições alcalinas

As lâminas com as células que ficaram 48 horas imersas em solução de lise, foram
retiradas e organizadas em uma cuba de eletroforese 25x20 cm (Digel), sempre na mesma
orientação. Em seguida, 800mL de tampão de corrida alcalino (apêndice B) foram
adicionados. Essa etapa foi realizada em um ambiente em ausência de luz direta para que o
material genético não sofresse danos provenientes dessa fonte.
As lâminas permaneceram imersas no tampão de corrida por 20 minutos, para o
rompimento das pontes de hidrogênio entre a dupla fita do DNA, fazendo com que a molécula
seja completamente desnaturada. Em seguida a etapa de eletroforese foi realizada por 25
minutos (25volts, 300 miliamperes), utilizando-se uma fonte marca GE, modelo
EPS301(Figura 6).

f) Solução de neutralização

Ao final da eletroforese, as lâminas foram retiradas e o tampão de neutralização

(apêndice B) foi gotejado sobre as lâminas. O excesso foi retirado após 5 minutos, sendo tal
processo repetido por mais 2 vezes. Em seguida, para limpeza das lâminas, foi usada água
ultrapura e elas permaneceram secando durante 24 horas em posição horizontal (Figura 6).

g) Solução fixadora

Com as lâminas secas, elas foram mergulhadas em uma cuba de vidro com solução
Fixadora (apêndice B) por 10 minutos. Ao final desse processo, as lâminas foram lavadas com
água ultrapura e ficaram por mais 24 horas secando (Figura 6).

h) Coloração com prata

Após a etapa de fixação as lâminas foram hidratadas por 5 minutos. Com o banho-
maria ligado a 37ºC, a solução A (apêndice B) foi misturada a solução B (apêndice B) em
 38

uma cuba de vidro. As lâminas foram colocadas na cuba por aproximadamente 25 minutos até
que a reação ocorresse e fosse visualizada por mudança de cor (Prata) (Figura 6).

i) Solução stop

Após a reação acontecer dentro da cuba, as lâminas foram hidratadas com água
ultrapura 3 vezes. Em seguida, foram imersas em outra cuba com a solução STOP (apêndice
B) por 10 minutos, para interromper o processo de fixação da prata e permitir a visualização
das lâminas ao microscópio. No final, elas foram hidratas mais 3 vezes e permaneceram
secando em temperatura ambiente, para serem classificadas com microscópio de luz. O
protocolo foi adaptado de Christofolettiet et al., 2013 (Figura 6).

j) Classificação dos cometas

Os experimentos foram realizados sempre em triplicata, sendo que em cada lâmina

100 cometas foram contados e utilizados para análise dos danos.
Com auxílio de um microscópio de luz (Leica -ICC50HD), a classificação foi feita
segundo Villela et al., 2006.O cálculo da taxa de dano foi realizado da seguinte forma: em
cada lâmina observada ao microscópio (aumento de 400 vezes), cem células foram escolhidas
aleatoriamente (no sentido da esquerda para a direita), analisadas quanto à intensidade e o
tamanho da cauda e então classificadas em uma de 5 classes (desde 0, não lesado, até 4, o
nível máximo de lesão). A seguir, foi feito o cálculo da taxa de dano que consiste no
somatório dos valores obtidos na multiplicação do número de cometas pela sua respectiva
classe. Esse somatório foi então dividido por 100, encontrando-se então o valor da taxa de
dano em unidades arbitrárias. (Figura 7)
 39

Figura 6. Protocolo do Ensaio Cometa

Figura 7. Representação ilustrativa das quatro classes existentes no teste do cometa. Adaptado
de Villela et al., 2006.

2.3.5 Fase Avaliativa

 40

Os ensaios foram realizados em triplicata. A análise estatística, em cada um dos

ensaios experimentais, envolveu a utilização do programa GraphpadInStat 4.0. Em cada
experimento, os dados obtidos foram testados quanto à sua normalidade e foi selecionado o
teste paramétrico para ser utilizado. Foram aplicados os testes t de Student e análise de
variância unidirecional (ANOVA oneway) seguido do Teste de comparações múltiplas de
Tukey.

4 RESULTADOS

4.1 Avaliação da citotoxicidade através do ensaio de exclusão do azul de trypan.

Para estudar a ação citotóxica da sílica em função do tempo de exposição, a

viabilidade celular foi determinada através do ensaio de exclusão do azul de trypan após 30
minutos, 1 hora e 2 horas de incubação das células da linhagem A549 em uma solução
contendo 300 µg/mL de sílica,.
Os resultados apresentados na figura 8 demonstram uma diferença significativa entre a
amostra controle e os grupos expostos à sílica por 30 minutos, 1 hora e 2 horas
(p<0,05),observando assim uma tendência na redução da viabilidade. Entretanto não houve
diferença significativa entre os grupos expostos à sílica por 1h e 2h (p>0,05).
 41

Figura 8. Viabilidade em células A549 expostas a 300μg/mL de sílica por 30 minutos , 1 hora e 2
horas. Símbolos diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos
(ANOVA - p<0,05)

4.2 Avaliação do estresse oxidativo através do TBARS.

Na segunda etapa do trabalho o estresse oxidativo foi avaliado através do TBARS. A

figura 9 mostra que houve uma diferença significativa (p<0,05) entre a amostra controle e os
grupos expostos àsílicanos tempos de 1 hora e 2 horas e um consequentedesequilíbrio no
metabolismo celular. Nota-se também que não houve diferença significativa entre os grupos
sílica 30 minutos econtrole(p>0,05).
 42

Figura 9. Avaliação do estresse oxidativo através do TBARS em células A549 expostas a

300μg/mL de sílica por 30 minutos , 1 hora e 2 horas. Símbolos diferentes indicam diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos (ANOVA - p<0,05)

4.3 Avaliação da genotoxicidade através do ensaio cometa.

Na terceira etapa as células foram expostas à sílica durante 2 horas e os danos ao DNA
avaliados pelo ensaio cometa. A figura 10 apresenta os resultados dessa exposição, onde
pode-severificar que a incubação com sílica promove um aumento significativo no número de
quebras no DNA das células expostas em comparação com a amostra controle (p<0,05).
 43

Figura 10. Taxa de dano ao DNA em células A549 expostas a 300μg/mL de sílica por2 horas.
Símbolos diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (Teste t de
Student - p<0,05)

A figura 11 compara o número de cometas por classe (0 a 4), mostrando um aumento

do número de lesões (classes 3 e 4) nas amostras de células expostas à sílica por 2 horas.

Figura 11. Média do número de cometas contados nas classes 0 até 4 em células A549 expostas a
300μg/mL de sílica por 2 horas

5 DISCUSSÃO

Já foi mostrado ao longo desse trabalhoque a silicose consiste em uma doença

pulmonar ocupacional crônica (causada pela exposição à sílica livre cristalizada), fibrogênica,
de evolução lenta, com caráter progressivo e irreversível e de diagnóstico tardio (TELES,
2016). Portanto, a busca por biomarcadores que possam indicar a exposição inicial á sílica
 44

cristalina é relevante para identificação de alterações fisiopatológicas que possam demonstrar

suscetibilidade para o desenvolvimento da doença, conforme foi destacado por alguns autores.
(LEUNG; YU; CHEN, 2012; PANDEY; AGARWAL, 2012; GULUMIAN, 2006; TIWARI,
2005). Desse modo, o presente trabalho buscou avaliar, por meio de diferentes técnicas
experimentais, os efeitos da exposição precoce à sílica em células de linhagem A549 através
da viabilidade celular; por meio de um produto da peroxidação lipídica indicando assim um
possível estresse oxidativo; e através de presença de lesões no DNA.
Os resultados apresentados na figura 8 demonstram que houve uma diferença
significativa entre os grupos expostos e o controle (p<0,05). Esses resultados estão de acordo
com Weisheng (2006), que verificou em seus experimentos que as nanopartículas de sílica
reduzem de maneira significativa a viabilidade celular em células A549 de acordo com o
tempo de exposição e em uma amplitude deconcentração de 10 à 100 μg/mL.Portanto, os
resultados obtidos no presente trabalho sugerem que a sílica poderia promover alterações
metabólicas celulares capazes de induzir a morte celular em função do tempo de exposição.
Entretanto,a figura 8 mostra que entregrupos sílica 1hora e 2horas a redução na
viabilidade se manteve semelhante não apresentando uma diferença significativa entre eles
(p>0,05). Isto pode indicaruma possível indução da expressão de genes resposta inflamatória
e/ou demecanismos de reparo celular, amenizando assim os efeitos da sílica e permitindo que
a taxa de viabilidade se mantenha constante entre 1 e 2 horas de exposição ao agente.
Diferentes grupos de pesquisa têm estudado a expressão de genes de reparo, deresposta
inflamatória e de defesa oxidativa frente à exposição a agentes como a sílica (ZHANG et al.,
2010; PERKINS et al., 2012; FERREIRA et al., 2013; SONG et al., 2014). Isso indica ser
possível que asdefesas celulares, constitutivas e indutivas, possam ser responsáveispela
estabilização da viabilidade celular após 1 hora de exposição. Novos experimentos deverão
ser programados para verificar como se mantém a viabilidade após 2 horas de exposição.
Segundo Chen e Von Mikecz (2005) a sílica pode levar a alterações funcionais,tais
como inibição da replicação, transcrição e da proliferação celular, de acordo com Porter et.al
(2006), essas alterações funcionais celulares podem sermediadas pelaliberação de espécies
reativas de oxigênio que induzem a oxidação de lipídios e consequentemente, induz a
liberação de fatores de crescimentos, interleucinas, citocinas pró-inflamatórias e fator de
necrose tumoral.
A silicose é resultante de um ciclo que envolve dano celular, geração de espécies
oxidativas, inflamação e fibrose. Este ciclo envolve a citotoxicidade direta da sílica cristalina
nas células pulmonares devido às propriedades de superfície únicas do quartzo. Em adição, os
 45

macrófagos e/ou as células epiteliais são estimuladas a produzir quimiocinas e citocinas

inflamatórias. Comoresultado do recrutamento e ativação dos macrófagos alveolares e de
leucócitos polimorfonucleares há uma produção elevada de espécies reativas de oxigênio que
quando não combatidos por enzimas antioxidantes podem gerar um estresse
oxidativo(RIMAL; GREENBERG; ROM, 2005).
O estudo feito por Zhang et.al (2000) enfatiza os efeitos citotóxicos e genotóxicos
mediados pelo estresse oxidativo induzido pela exposição à sílica cristalina em macrófagos
alveolares. Isso levou a pensar que a que a redução da viabilidade celular visto pelo ensaio de
exclusão do azul de trypan poderia estar sendo induzida por um processo de estresse oxidativo
provocado pela sílica. Por isso a etapa seguinte foi avaliar o estresse oxidativo através do
ensaio de TBARS.
Na avaliação do estresse oxidativo através do ensaio de TBARS , os resultados da
figura 9 apresentam uma diferença significativa (p<0,05) entre o controle e osgrupos expostos
a sílica por 1 hora e 2horas, sugerindo.um aumento do estresse oxidativo ao longo do tempo
de exposição. Entretanto, entre o controle e o grupo sílica 30 minutos não houve diferença
significativa (p>0,05). Esse fenômeno pode estar ocorrendo devido a atuação de enzimas
antioxidantes no início da exposição permitindo que as espécies reativas de oxigênio sejam
combatidas. De acordo com Guimarães (2009), enzimas antioxidantes como glutationa
peroxidase (GPX) envolvem-se de maneira precoce noseventos iniciais que antecedem os
efeitos irreversíveis desencadeados pelaexposição à sílica. Além disso, apresentam um
comportamento dinâmico ecaracterístico ao longo das etapas da silicose.Como também foi
observado em um estudo realizado por Murata (2014) em camundongos expostos à 300 μg/ml
de sílica, apontou um pico de atividade da enzima antioxidante chamada GPX após 4 dias de
exposição.
A exposição a partículas de sílica provoca uma produção de espécies reativas de
oxigênio (EROs) incluindo radicais hidroxil, superóxido, peróxido de hidrogênio e oxigênio
singleto , que são gerados tanto nas superfícies das partículas de sílica, mas também pelas
células fagocíticas na tentativa de digerir essas partículas . De acordo com Fanizza e
colaboradores (2007), através da geração de estresse oxidativo pelas partículas de sílica
cristalina podem ser disparados mecanismos e sinalizações celulares que levam aos danos
genotóxicos da exposição à sílica. Além disto, o dano oxidativo no DNA é considerado um
importante fator no processo de mutagênese e carcinogênese (AKHTAR et al., 2010;
SHARAWY, 2013). Por isso foi empregado no presente trabalho ensaio cometa para avaliar a
presença de possíveis quebras no DNA das células A549 expostas à sílica. Os resultados
 46

apresentados na figura 10 mostram uma diferença significativa (p<0,05) da taxa de dano entre
o grupo controle e o expostoà sílicapor 2horas.
Fanizza et al. (2007) demonstraram in vitro, através do ensaio cometa, a presença de
dano ao DNA em células A549 expostas a100 µg/ml de sílica livre respirável. Lima (2014)
também observou que a exposição das células à sílica numa concentração 300 μg/ml , é capaz
de promoverlesões no DNA em função do aumento do tempo de exposição.
Desse modo, os resultados apresentados ao longo do presente trabalho de monografia
permitem sugerir que o aumento do estresse oxidativo nas amostras expostas à sílica (figura
9) pode contribuir para indução dos efeitos citotóxicos (figura 8) e genotóxicos (figura 10),
resultando em quebras no DNA e morte celular.

6 CONCLUSÕES

-A exposição das células A549 à sílica (300µg/mL) promove uma diminuição da

viabilidade celular em função do tempo de incubação;
- A morte celular pode estar relacionada, ao menos em parte, ao desequilíbrio
oxidativo promovido pela sílica;
- A incubação das células com cristais de sílica é capaz de provocar lesões no DNA,
que podem ser devidas a uma ação direta ou indireta (através da formação de espécies reativas
de oxigênio) desse agente.
 47

De modo geral, a pesquisa experimentalcontribuiu para o desenvolvimento acadêmico

e profissional, proporcionando o amadurecimento de ideias, ampliando a visão crítica e
possibilitando a experiência de convivência com uma equipe multidisciplinar, levando a uma
formação em enfermagem com qualidade e inovação no cuidado com o paciente.
Portanto, os resultados sugerem que a exposição à sílica é capaz de promover efeitos
citotóxicos e genotóxicos que parecem ser mediados pela ação de espécies reativas de
oxigênio. Portanto, ressalta a importânciadaassistênciadeenfermagemnaprevenção
dasilicose,como não existe tratamento curativo torna-se fundamental a atuação do enfermeiro
na identificação da exposição à sílica precocemente podendo assim avaliar os profissionais
que estão em situações de risco buscando as melhores formas de prevenção através de
capacitações, treinamentos e implantação dos equipamentos de proteção individuais
necessários.
Para realização deste trabalho foi necessário o estudo e domínio de algumas técnicas.O
cultivo celular da linhagem A549 assume uma importância crucial para o avanço desse
trabalho.O cultivo celular exige uma série de cuidados para reduzir os riscos de contaminação.
Entretanto, mesmo tomando todas as precauções a contaminação pode existir.
Durante parte da realização do trabalho a sala de cultivo de células,que é utilizada por
vários alunos e professores do Departamento, permaneceu fechada devido a uma persistente
contaminação das garrafas de células A540 por bactérias e fungos. Diversas medidas
foramtomadas para o controle e erradicação da contaminação, para que assim fosse possível
dar continuidade ao trabalho.
A pesquisa experimental contribuiu para o desenvolvimento acadêmico e a formação
profissional, proporcionando o amadurecimento de ideias, ampliando a visão crítica e
possibilitando a experiência de convivência com uma equipe multidisciplinar, levando a
garantiruma assistência de enfermagem com qualidade einovação no cuidado com o paciente.
 48

7 ETAPAS FUTURAS

Para a continuidade desse estudo estão previstas as seguintes etapas: avaliação dos
danos ao DNA nas células expostas à sílica por 30 minutos e 1 hora; ensaios de expressão
gênica e quantificação de enzimas antioxidantes; e avaliação dos biomarcadores testados em
células da linhagem MRC-5 (oriunda de tecido pulmonar não tumoral de humanos).
Aproximando a utilização dos biomarcadores, com o foco no principal alvo final que é na
utilização dessas ferramentas no monitoramento da exposição de humanos envolvidos em
atividades ocupacionais.
 49

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 54

APÊNDICES

Apêndice A – Composição dos meios de cultura

As soluções utilizadas para o cultivo e manutenção das células A549 estão listadas no quadro
abaixo.

Soluções e Meios Composição e Concentração

Meio de cultura Pó para preparo
HAM F-12
Bicarbonato de Sódio 2,2g/L

Água ultrapura pH 7,2

Soro Fetal Bovino Soro fetal 10% pH7,2

Estéril

Gentamicina Gentamicina 1mL

Água ultrapuraqsp 100mL
 55

5mg/mL

Glutamina Glutamina 1mL

Água ultrapura qsp100mL
25mg/mL

Anfotericina B Anfotericina B 1mL%

Água ultrapura qsp 100 mL
25mg/mL

Tripsina EDTA Tripsina 0,1%

EDTA 0,01%

Base 10x Dulbecco 10%

(NaCl 8%; KCl 0,3%; Na2PO4

7H2O 0,14% KH2PO4 0,02%)

Solução Vermelho de Fenol

1% Água ultrapura qsp100mL

Tampão Fosfato NaCl, Na2HPO4, KH2PO4

Salino (PBS) Reconstituir 1 frasco em

1000mL de Água Ultrapura

Azul de Trypan Azul de Trypan 1%

Solução de Congelamento Dimetilsulfóxido 5%

Soro fetal Bovino 95%

Solução de Dióxido de Silício Dióxido de Silício

(300µg/mL) Meio de cultura F12

Salino (PBS) Reconstituir 1 frasco em

 56

1000mL de Água Ultrapura

Apêndice B – Soluções do ensaio cometa

As soluções utilizadas no ensaio cometa estão listadas, a seguir

Soluções e Meios Composição e Concentração

Agarose NMP 1,5% Agarose NMP -1,5%

PBS

Agarose LMP 0,5% Agarose LMP 0,5%

PBS

Solução de Lise 1 NaCl -14,61%

Laurilsarcosinato de sódio - 1%

NaOH - 0,8%
 57

EDTA - 3,72%

Tris - 0,12 %

Água Ultrapura

pH 10

Solução de Lise 2 Solução de lise 1 – 89%

(8º C) Triton X-100 – 1%

DMSO – 10%

Solução de NaOH NaOH- 40%

Água Ultrapura

Solução de EDTA dissódico200mM EDTA – 14,89%

Água Ultrapura pH: 10

Tampão Alcalino para eletroforese Solução de NaOH 10N – 3%

(2ºC - 8ºC) Solução de EDTA dissódico

200mM – 0,5%

Água Ultrapura

pH> 13

Tampão de Tris-Cl 0,4M – 4,85%

Neutralização Água ultrapura pH: 7,5

Solução Fixadora Ácido Tricloroacético – 15%

Sulfato de Zinco – 5%

Glicerol – 5%
 58

Água ultrapura

Solução A para Carbonato de Sódio 5%

Coloração por Água ultrapura

Prata

Solução B para coloração por Prata Nitrato de Amônio – 0,1%

Nitrato de Prata – 0,1%

Ácido Tungstosilicico - 0,25%

Formaldeído – 0,15%

Água ultrapura

Solução STOP Ácido Acético 1%

Água Ultrapura