CAPÍTULO XXXXX

Título: Fixação Biológica de Nitrogênio Atmosférico

Autores: Enilson Luiz Saccol de Sá a, Benjamin Dias Osório Filho b, Rafael Goulart
Machado c e Pedro Alberto Selbach a

a Departamento de Solos, Faculdade de Agronomia-Universidade Federal do Rio

Grande do Sul (UFRGS), Av. Bento Gonçalves, 7712, Bairro Agronomia, Porto Alegre –
RS, CEP: 91540-000.
b Universidade Estadual do Rio Grande do Sul. Unidade em Cachoeira do Sul. Rua Sete

de Setembro, 1040 – Centro, Cachoeira do Sul - RS – Brasil, CEP. 96508-010.

c Emater/RS-ASCAR, Escritório Municipal de Coxilha, Avenida Fioravante Franciosi, 37,

Bairro Centro, Coxilha-RS, CEP 99145-000; Instituto de Desenvolvimento Educacional

de Passo Fundo, Faculdade IDEAU de Passo Fundo, Avenida Rui Barbosa, 103, Bairro
Petrópolis, Passo Fundo-RS, CEP: 99.050-120.

1.- Introdução
O Nitrogênio é um dos principais constituintes do planeta terra. A maior parte
do nitrogênio (93%), está na crosta terrestre. Os 6,2% restantes estão na ecosfera.
Nesta, 99,96% (equivalente a 3,9 x 1021 g) está na forma de N2 (gás dinitrogênio) na
atmosfera e, os restantes 0,04%, nas formas combinadas orgânicas ou inorgânicas
encontradas tanto em ecossistemas aquáticos como terrestres (Roswall, 1979). A
maioria dos organismos vivos, incluindo-se todos os animais, vegetais e grande parte
dos micro-organismos, dependem desta pequena parcela de N nas formas combinadas,
pois o grande reservatório de N2 que compõe cerca de 78% da atmosfera não é acessível
a todos eucariotos (incluindo plantas) e a maioria dos procariotos. Apenas um grupo
restrito de micro-organismos procariotos possui a capacidade de realizar a conversão
do N2 atmosférico em formas assimiláveis pelas plantas e outros micro-organismos. Essa
conversão é realizada por alguns procariotos (bactérias, archaebactérias e
cianobactérias) que apresentam o complexo enzimático nitrogenase que é capaz de
reduzir o N2 para a forma de NH3 (amônia). Quando apresentam esta capacidade, estes
micro-organismos são denominados diazotróficos.
No ambiente, os organismos diazotróficos estão por toda a parte, vivendo
livremente ou podendo estar associados com as plantas. As interações entre estas
bactérias e plantas podem ser de diferentes naturezas e intensidades, variando desde
colonização rizosférica, endofítica ou até mesmo simbiose. A capacidade de fixação de
nitrogênio varia entre espécies de microrganismo diazotrófico. Isso porque cada grupo
de bactérias apresenta mecanismos específicos para garantir a eficiência do complexo
enzimático nitrogenase. A presença de gás oxigênio afeta a eficiência da nitrogenase em
fixar o gás nitrogênio. Os diazotróficos que conseguem afastar o gás oxigênio ou mesmo
compartimentalizar a nitrogenase, são mais eficientes na fixação de nitrogênio.
Além disso, como o processo de fixação de N demanda muita energia, os
microrganismos que se associam a plantas conseguem obter carboidratos mais
facilmente para geração de energia. Trata-se de um tipo de interação mais íntima, em
que além de garantir energia para a nitrogenase, fornecem nitrogênio para a formação
dos compostos orgânicos da planta. Ambos os participantes são beneficiados nesta
associação. Para exemplificar, nos cultivos de soja no Brasil e Argentina, 70 a 90 % do
nitrogênio é proveniente da Fixação Biológica de Nitrogênio (Herridge et al., 2008). Pelo
fato de o processo de fixação ser de elevada demanda energética, os microrganismos
simbiontes recebem da planta os fotossintatos ricos em energia, como malato e
sacarose. Como exemplo, Azospirillum utilizando malato, consegue fixar 26 mg de N por
grama de carbono e Azotobacter, utilizando sacarose, fixa 7 mg de N por grama de
carbono (Bottomley & Myrold, 2015).
A presença e a atuação dos micro-organismos diazotróficos no planeta garante
o fluxo de nitrogênio na ecosfera e a manutenção dos ecossistemas. A magnitude da
fixação de nitrogênio oriundo da atmosfera na biomassa em um determinado ambiente
depende da composição quali e quantitativa destes organismos no solo. Estima-se que
haja uma grande variabilidade na quantidade anual de nitrogênio fixado nos solos
tropicais dependendo do ambiente. Naqueles ecossistemas em que há uma maior
proporção de organismos simbióticos, como associações entre rizóbios e leguminosas
ou entre cianobactérias e Azolla, a quantidade de N fixado por área, tende a ser maior.
Na Tabela 1, são apresentadas estimativas de fixação de nitrogênio por diferentes
organismos diazotróficos em condições de campo.
Os micro-organismos diazotróficos podem ser aeróbios, anaeróbios ou
anaeróbios facultativas. Diante dessa diversidade de organismos, por exemplo, em áreas
de solo alagado, inúmeros são os organismos com capacidade de fixar nitrogênio sendo
mais eficientes aqueles que conseguem obter mais energia para a produção de ATP. Em
cultivos de arroz alagado destacam-se as cianobactérias simbiontes com a planta
aquática do gênero Azolla, os rizóbios, que nodulam leguminosas na entressafra do
arroz e diazotróficos de vida livre e associativos que conseguem permanecer no
agroecossistema.

Tabela 1. Estimativa da Fixação biológica de N em condições de campo por diferentes

organismos diazotróficos.
Sistema bacteriano Quantidade de N fixado
(kg ha-1)
Bactérias de vida livre 1 a 10 /ano
Cianobactérias de vida livre 7 a 80 /ano
Bactérias associativas 0 a 33/ano
Arroz / cianobactérias 10 a 80 /cultivo
Arroz / bactérias associativas 10 a 30 /cultivo
Cana de açúcar / bactérias associativas 20 a 160 /cultivo
Trigo /bactérias associativas 10 a 30 /cultivo
Azolla/Cianobactéria 33 a 40 /ano
Frankia / Casuarina 10 a 300 /ano
Rizóbio / soja 24 a 584 /ano
Rizóbio / ervilha 17–244 /ano
Rizóbio /Forrageiras 110 a 230 /ano
Rizóbio /Árvores 50 a 300 /ano
(Adaptado de Bohlool et al., 1992, Peoples et al., 1995 e Bottomley & Myrold, 2015)
 2.- Fixação de nitrogênio por microrganismos não simbióticos
Microrganismos diazotróficos considerados não simbióticos ou assimbióticos são
os que fixam nitrogênio atmosférico tanto em vida livre quanto associados com plantas,
na rizosfera ou via endofítica, mas cuja interação não é condição sine qua non para a
fixação. Estes organismos podem, além de colonizar abundantemente a rizosfera,
ocorrer endofiticamente, ou seja, invadir o córtex e colonizar tecidos internos em
diversas espécies vegetais. Diferentemente dos organismos simbióticos, os fixadores
associativos não causam mudanças morfológicas no seu hospedeiro. De acordo com o
ambiente onde os microrganismos não simbióticos realizam a fixação de nitrogênio,
estes podem ser classificados como de vida livre ou associativos. Os primeiros fixam N
para seu benefício próprio, podendo ser encontrados em todos os tipos de solo, na
rizosfera de plantas. Os associativos vivem endofiticamente, colonizando os espaços
intercelulares dos tecidos vegetais e não apresentam especificidade, podendo uma
mesma estirpe bacteriana colonizar plantas de diferentes famílias.
Estes dois grupos apresentam grande importância por atuarem como
colonizadores de rochas e cinzas vulcânicas, serem agentes do intemperismo de rochas,
responderem pela manutenção do nitrogênio do solo em ecossistemas naturais e
realizarem associações benéficas com diversas plantas cultivadas. Muitas vezes, em
determinados ambientes, como pastagens nativas por exemplo, em que não houve
aplicação de fertilizantes nitrogenados, se observa um considerável crescimento vegetal
e ausência de sintomas de deficiência de nitrogênio. Este discreto aporte de nitrogênio
pode estar relacionado com a ocorrência de bactérias diazotróficas de vida livre ou
associativas no solo.
Muitas são as espécies de microrganismos diazotróficos não simbióticos e
variados são os ambientes em que vivem e fixam nitrogênio, graças aos diferentes
padrões de metabolismo energético que desempenham. De acordo com a fonte de
carbono para a biossíntese e a energia para atividade biológica, as bactérias
diazotróficas não simbióticas podem ser classificadas em quimiorganotróficas e
fotolitotroficas.
Os quimioroganotróficos retiram a energia química e o carbono dos compostos
orgânicos, como os presentes nos resíduos orgânicos e nas substâncias húmicas do solo.
No processo de obtenção de energia, ou seja, respiração, que consiste na produção de
adenosina trifosfato (ATP), esses organismos utilizam a fosforilação oxidativa, associada
a rotas metabólicas como glicólise, ciclo do ácido cítrico e cadeia respiratória. Estes
processos de obtenção de energia a partir de moléculas orgânicas podem ser
desempenhados em condições de aerobiose, anaerobiose, de forma obrigatória ou
facultativa.
A respiração aeróbia ocorre quando o aceptor final de elétrons da cadeia
respiratória é a molécula de gás oxigênio (O2). Para os microrganismos aeróbios, este
gás precisa estar presente. Além disso, o microrganismo deve possuir condições
metabólicas para degradar superóxidos oriundos de reações com oxigênio. Por outro
lado, a respiração anaeróbia é usada por aqueles microrganismos incapazes de degradar
os superóxidos. Neste caso, o aceptor final de elétrons são outras moléculas oxidadas
diferentes de O2, tais como nitrato, sulfato e óxido férrico. A respiração anaeróbia
facultativa é realizada por organismos que usam diferentes aceptores finais de elétrons
e são capazes de degradar superoxidos. Seguindo nesta classificação, ainda há os
microrganismos microaerofílicos. Estes possuem um tipo especial de respiração aeróbia,
porém não toleram grandes concentrações de O2 no meio.
Os microrganismos fotolitotróficos retiram a energia para suas funções vitais da
luz e o carbono a partir de CO2 atmosférico, em processos metabólicos análogos à
fotossíntese das plantas. Assim como os quimiolitotóficos, podem viver em aerobiose e
anaerobiose, tanto obrigatória quanto facultativa, além de microaerofilia. Na tabela 2
são apresentados exemplos de microrganismos diazotróficos não associativos para estes
diferentes padrões metabólicos.

Tabela 2. Classes e exemplos de microrganismos diazotróficos não simbióticos de acordo

com o padrão metabólico e respiração.
Classe Aeróbios Anaeróbios Facultativos Microaerofílicos

Quimiorgano Azomonas Clostridium Klebsiella Herbaspirillum

tróficos Azotobacter Desulfovibrio Bacillus Azospirillum
Azotococcus Desulfotomaculum
Beijerinckia,
Derxia

Fotolito Anabaena Chromatium Rhodospirillu Plectonema

tróficos Nostoc Chlorobium m Lyngbia
Rhodopseudo Oscilatoria
monas

Dentre os exemplos de microrganismos diazotróficos não simbióticos

quimiorganotróficos, apresentados na tabela 2, as bactérias anaeróbias do gênero
Clostridium, estão presentes em solos com elevados teores de matéria orgânica em
decomposição e no rúmen, sendo esporuláveis. As bactérias do gênero
Desulfotomaculum vivem no mar e são redutores de sulfato. Muito comum nos solos,
os diazotróficos do gênero Bacillus, fixam N somente em anaerobiose. Estes também
vivem na água, solo e rúmen de animais. Bactérias do gênero Herbaspirillum,
Azospirillum são comuns na rizosfera e interior de raízes de gramíneas.
Como exemplos fotolitotróficos diazotroficos na tabela 2, as bactérias do gênero
Chlorobium, que oxidam enxofre elementar e tiossulfatos a sulfatos, podem ser verdes,
vermelhas ou purpuras. As bactérias do gênero Rhodopseudomonas realizam
fotossíntese anoxigênica, podendo crescer heterotroficamente e com presença de O2
no escuro. Como exemplo de diazotróficos fotolitotróficos aeróbios estão as
cianobactérias dos gêneros Anabaena e Nostoc. A quantidade de nitrogênio fixado,
entre os organismos associativos, em condições normais, é restrita à grande exigência
de energia. Azotobacter e Clostridium podem fixar cerca de 0,5kg de N/ha. Os baixos
ganhos de nitrogênio no solo por fixadores assimbióticos podem ser devidos às
seguintes razões:
- Os fixadores de vida livre quimiorganotróficos são ineficientes na conversão de
carboidratos, - 1g de carboidrato/1-10mg de N fixado.
- Competem pela fonte de energia com outros microrganismos.
- A fixação de N é inibida em presença de N mineral.
 2.1- Fixação de nitrogênio por cianobactérias de vida livre
As cianobactérias ocupam papel ecológico como colonizadores primários,
proporcionando condições de crescimento para outros organismos, contribuindo na
acumulação de húmus, prevenindo a erosão auxiliando na agregação das partículas do
solo e colaborando para a manutenção da umidade do solo. A capacidade de
fornecimento de N de cianobactérias em arroz foi evidenciada em estudo com
inoculação que resultou em rendimento de grãos de arroz equivalente a dose de
100kg/ha de N (Pontes, 1988)

2.2- Fixação de N em associação com gramíneas

As bactérias diazotróficas associativas, são assim denominadas pois se associam
às plantas, contribuindo para a sua nutrição por meio da fixação biológica de nitrogênio
(FBN), porém sem formar estruturas diferenciadas. Podem ser classificadas em
facultativas ou obrigatórias (Baldani et al., 1997). Quando não estão em associação com
espécies vegetais, as bactérias fixadoras de N associativas facultativas, podem
sobreviver livremente no solo, também podendo fixar o nitrogênio (N) em vida livre
(Hungria, 2011). O gênero Azospirillum é o principal representante deste grupo, tendo
cinco espécies descritas: A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense, A. halopraeferans
e A. irakense. São exemplos de fixadores de nitrogênio associativos obrigatórios os
gêneros Acetobacter spp., Herbaspirillum spp. e Burkholderia spp. (Marin et al., 1999).
A maior parte dos estudos de fixação biológica de nitrogênio (FBN) por bactérias
associativas relata a interação entre estas bactérias e gramíneas, porém também podem
atuar em associação com outras famílias vegetais. A espécie A. amazonense por
exemplo, além de ser encontrada em diversas espécies de monocotiledôneas, também
foi detectada em associação com dicotiledôneas herbáceas, arbustivas e arbóreas
(Lange & Moreira, 2002).
A colonização do tecido vegetal de gramíneas por diazotróficas associativas
comprovadamente eficientes, permite um contato mais próximo, melhorando o
aproveitamento do N fixado pela planta consumidora. Neste sentido, a inoculação de
diazotróficas associativas a gramíneas consiste-se em uma importante tecnologia para
o incremento da produtividade vegetal, bem como para a redução no uso de fertilizantes
nitrogenados sem prejuízos à produtividade.
Com a inoculação de A. brasiliense em milho, foram observados ganhos nos
parâmetros crescimento vegetativo, peso de mil grãos e rendimento de grãos (Schaefer
et al., 2019). Também em estudo da inoculação de A. brasiliense na cultura do milho, a
máxima produtividade obtida na ausência de inoculação foi superada com a presença
do inoculante, propiciando economia de 75 kg ha-1 de N mineral (Basi, 2013). Em outro
estudo, sobre a eficiência da inoculação de Azospirillum spp. na cultura do milho, foi
observado um aumento médio de 17% na produtividade de grãos (Cavallet et al., 2000).
Na cultura do trigo, a inoculação com os gêneros Azospirillum e Herbaspirillum
propiciou maior crescimento radicular (Sala et al., 2005). A inoculação de trigo com a
bactéria diazotrófica Achromobacter insolitus, aumentou a produtividade de grãos,
mesmo quando utilizada em associação com altas doses de nitrogênio mineral (Sala et
al., 2008).
 A utilização de bactérias diazotróficas na cultura da cana de açúcar também tem
sido bem sucedida. A inoculação da cana de açúcar com bactérias diazotróficas induziu
maior número de perfilhos, porém, como em outras culturas, a resposta das cultivares
de cana de açúcar à inoculação depende da cultivar (Oliveira & Simões, 2016).
É importante destacar que além do processo de fixação biológica do nitrogênio
atmosférico, as bactérias diazotróficas apresentam uma ampla gama de mecanismos
pelos quais favorecem as plantas cultivadas, cujos efeitos benéficos somam-se aos
ganhos produtivos decorrentes da fixação biológica de nitrogênio, a se destacar:
solubilização de fosfatos, como por exemplo fosfato de cálcio, pelo qual é possível
acessar fontes de fósforo insolúvel (Shukla, 2008); produção de sideróforos, um
importante mecanismo de proteção vegetal e supressão de patógenos, decorrente da
competição pelo íon Fe3+ (Bortolotti, 2014); produção de substâncias fitoestimuladoras,
como hormônios do grupo das auxinas, os quais estimulam o crescimento de parte aérea
e radicular, diferenciação do tecido vascular, dominância apical e diferenciação de raízes
secundárias (Cassán et al., 2008).
Devido à diversidade de mecanismos para promoção de crescimento de plantas
observados na associação de bactérias diazotróficas com gramíneas cultivadas, uma
tendência que se tem observado é a recomendação de inoculação de consórcios de
bactérias diazotróficas, combinando diferentes mecanismos de promoção de
crescimento vegetal, os quais somam-se aos efeitos da fixação biológica do nitrogênio
atmosférico.

3.- Fixação simbiótica de nitrogênio.

Entre as interações mutualísticas planta/micro-organismos, mutualmente
benéficas a bactéria e plantas superiores, a simbiose é a que envolve maior sincronia
bioquímica e genética entre os organismos parceiros da interação. Plantas e bactérias
fixadoras de nitrogênio necessitam realizar diversos processos complexos de interação
para que a simbiose se estabeleça. Somente alguns indivíduos de três grupos
bacterianos desenvolveram capacidade de realizar associações simbioticas: as bactérias
filamentosas (actinomicetos) do gênero Frankia, com várias plantas como Alder e
Casuarina; cianobactérias heterocisticas com diversos hospedeiros, como fungos, algas,
plantas do gênero Gunnera, Cicas e pteridofitas aquáticas (diversas espécies de Azolla);
e bactérias indutoras de nodulação radicular , conhecidas como rizóbios (pertencentes
a diversos gêneros como Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium,
Azorhizobium, Devosia etc.) com várias espécies de leguminosas e uma não leguminosa
do gênero Parasponia.

3.1- Interações actinorrízicas

Os actinomicetos embora apresentem células alongadas que lembram hifas de
fungos, são bactérias e são chamados de actinobactérias. O único gênero de
actinobactérias conhecido por fixar nitrogênio em simbiose com algumas espécies de
plantas é o gênero Frankia. Esta simbiose é similar à que ocorre entre rizóbios e
leguminosas também formando nódulos radiculares em plantas predominantemente
arbóreas e arbustivas, de oito famílias: Betulaceae, Casuarinaceae, Coriariaceae,
Datiscaceae, Elaeagnaceae, Myricaceae, Rhamnaceae e Rosaceae (Valdez, 2008). As
mais de 200 espécies destas famílias, que realizam a simbiose, se distribuem em
florestas temperadas, solos arenosos, dunas, e montanhas em todo o planeta. Pela sua
capacidade de associação com esse gênero de actinomiceto diazotrófico, conseguem
crescer em solos pobres em nitrogênio. Devido a essa capacidade, algumas espécies são
pioneiras, fundamentais em processos de sucessão ecológica (Wall, 2000). Na América
do Sul, os principais gêneros encontrados são Alnus, Casuarina, Colletia, Coriaria,
Discaria, Kentrothamus, Retanilla e Talguenea, sendo os dois primeiros os mais
estudados no Brasil (Moreira & Siqueira, 2006).
As associações simbióticas entre os actinomicetos do gênero Frankia e as plantas
das famílias citadas acima, recebem o nome de actinorrizas e também promovem a
formação de nódulos radiculares (Wall, 2000). Estes nódulos apresentam-se agrupados
em aglomerados (Diem et al., 2000). Diferentemente dos nódulos de leguminosas, os
nódulos de plantas actinorrízicas, possuem tecido vascular interno aos tecidos
colonizados (Powlowski & Bisseling, 1996). Esta diferença anatômica, aliada à baixa taxa
de crescimento em meio nutritivo in vitro dificulta o trabalho de isolamento em
laboratório, quando comparado ao isolamento de rizóbios de nódulos de leguminosas
(Moreira & Siqueira, 2006). Mais uma semelhança da simbiose actinorrízica com a
simbiose entre rizóbios e leguminosa, confirmada por Abdel-Lateif et al. (2013) é a
produção de flavonóides para a atração dos microssimbiontes e início do processo de
infecção.
Os actinomicetos do gênero Frankia são quimiorganotróficos, mesofílicos,
aeróbios microaerofílicos e de reação positiva quanto à catalase. O nome do gênero,
proposto por Jorgen Brunchorst em 1886, tem origem em uma homenagem ao botânico
alemão Albert Bernard Frank, que já estudava interações entre plantas e
microrganismos (Prasad & Harsh, 2015). Embora sendo procariotos, os actinomicetos
possuem um desenvolvimento mais complexo, assemelhando-se aos fungos. Formam
três tipos de células. Um tipo é semelhante a hifas vegetativas, outro tipo consiste em
esporângios contendo esporos e o terceiro tipo, na forma de vesículas (Rehan et al.,
2016).
Nas vesículas ocorre o processo de fixação de nitrogênio pela enzima
nitrogenase que está ativa no interior dessas estruturas, protegida do gás oxigênio (O2),
que reduz sua atividade. As paredes das vesículas são envoltas por várias camadas
lipídicas que impedem a entrada de O2 (Berry et al, 1993). O teor de leg-hemoglobina
no interior do nódulo é muito variável. Dessa forma, em algumas espécies podem
ocorrer nódulos cujo interior apresenta coloração branca, enquanto, em outras
espécies, podem ocorrer nódulos de coloração bem avermelhada. Especificamente no
caso da simbiose com o gênero Casuarina, não ocorre formação de vesículas e a
proteção da nitrogenase contra o efeito do O2 se dá pela alta concentração de leg-
hemoglobina (Van Nguyen & Pawlowski, 2017).
As plantas actinorrízicas mais cultivadas no mundo pertencem ao gênero
Casuarina, família Casuarinaceae (Figura 1), principalmente com finalidades
relacionadas à recuperação de áreas degradadas, incorporação de nitrogênio ao solo,
estabilização de dunas, controle da erosão e produção de madeira para geração de
energia (Narayanasamy et al., 2020). Além de realizar associação actinorrízica, a mesma
planta pode, ao mesmo tempo realizar simbiose com fungos, chamada de associação
micorrízica, compondo um complexo sistema de interação (Gardner, 1986). As
micorrizas com sua capacidade de ampliar a mobilidade de água e de nutrientes para a
planta, permitem que as espécies de dupla simbiose possam crescer e se desenvolver
em solos com limitações hídricas e nutricionais.
Assim como outras bactérias diazotróficas, os actinomicetos do gênero Frankia
também apresentam outros mecanismos de promoção de crescimento, como
capacidade de produção de ácido indol acético, produção de sideróforos e solubilização
de fosfato (Jog et al., 2016). A fixação de nitrogênio, aliada a estes outros mecanismos
e, ainda a possibilidade de dupla simbiose, reforça o potencial pioneiro e
biorremediador das espécies actinorrízicas.
Comercialmente não existem inoculantes a base de Frankia para uso na
agricultura no Brasil. Entretanto, este tipo de simbiose pode ser aproveitado na
atividade humana pelo manejo das espécies actinorrízicas. Em se tratando de árvores e
arbustos, tais espécies merecem mais estudos para o uso deste potencial de adaptação
e rusticidade no planejamento e implantação de sistemas agroflorestais.

Figura 1. Imagens de plantas de Casuarina equisetifolia (A), raízes contendo nódulos em

aglomerados (B) detalhes das aglomerações de nódulos (C) e de nódulo destacado (D).
Adaptado de Narayanasamy et al., 2020.

3.2- Simbiose entre cianobactérias e Azolla

As cianobactérias, anteriormente conhecidas como cianofíceas ou algas azuis,
são procariotos encontrados em diferentes ambientes, tais como desertos, florestas,
campos, solos cultivados e ambientes aquáticos, tanto de água doce ou marinhos
(Alcántara et al., 2020). Estas bactérias são fotossintetizantes e algumas espécies podem
também realizar fixação de nitrogênio (Herrero et al., 2016). As células de cianobactérias
apresentam grande variação entre as espécies, inclusive formando estruturas
especializadas para a fixação de nitrogênio, como os heterocistos (Komárek et al., 2014).
A fotossíntese em cianobactérias é predominantemente oxigênica, como nas plantas, a
maioria possui apenas clorofila a, entretanto já foram encontras clorofilas b e d em
cianobactérias (Stucken et al., 2013; Komárek et al., 2014).
Algumas espécies podem ser tóxicas à saúde, em função da liberação de toxinas.
Estas cianotoxinas podem ser encontradas na água e, podem levar a morte de pessoas
e animais após o consumo (Gradíssimo et al., 2020). Por outro lado, o gênero Spirulina
é utilizado na alimentação humana e no tratamento de enfermidades, por sua
capacidade anti-oxidante (Lafarga et al., 2020), além de apresentar potencial para
produção de biodiesel (Shimi et al., 2015). Recentemente, alguns produtos à base deste
gênero têm sido comercializados como insumo biológico para a produção agrícola,
tendo estudos demonstrado respostas a aplicações de produtos à base de S. platensis
em tomate (Anitha et al., 2020) e rabanete (Godlewska et al., 2019). Em estudo realizado
por Maarouf et al. (2018), foi observado potencial da aplicação de cianobactérias dos
gêneros Anabaena, Nostoc e Spiriluna para a promoção de crescimento de milho. A co-
inoculação de Anabaena cylindrica com Azospirillum brasilense aumentou a
produtividade de híbridos de milho em 9% em um ambiente e em 23% em outro, ambos
no Estado do Paraná (Gavilanes et al., 2020).
As cianobactérias podem ocorrer livremente ou associadas a outros organismos.
Os líquens, associações muito comuns em superfícies rochosas, metálicas ou sobre
galhos de árvores são simbioses entre algas e fungos, e até outros procariotos. Em
aproximadamente 10% dos liquens, as algas são procarióticas, ou seja, cianobactérias.
Os líquens são fundamentais no início do processo de intemperismo, colonizando as
rochas, absorvendo nutrientes e formando biomassa precursora no processo de
sucessão ecológica. Esta capacidade se deve à absorção fúngica e às capacidades
fotossintética e diazotrófica das cianobactérias (Zachariah & Varghese, 2018).
As cianobactérias também podem estar associadas em simbiose com algumas
espécies de diatomáceas e plantas briófitas, pteridófitas, gimnonospermas e
angiospermas (Moreira & Siqueira, 2006). Do ponto de vista agronômico, a simbiose
mais estudada envolvendo cianobactérias ocorre entre estes procariotos e plantas
pteridófitas do gênero Azolla. As espécies de Azolla são geralmente encontradas em
ambientes úmidos ou em corpos de água parada, pois não toleram turbidez na água
(Giannuzzi et al., 2017). Em países asiáticos, a Azolla é cultivada como adubo verde, em
rotação com arroz. O nitrogênio atmosférico incorporado aos seus tecidos pela simbiose
com cianobactérias é posteriormente disponibilizado para o arroz, reduzindo a
necessidade de adubação nitrogenada (Safriyani et al., 2020a). Além disso, algumas
espécies de Azolla podem ser utilizadas na alimentação animal, como de peixes, aves,
suínos e bovinos, sendo uma importante fonte proteica (Cherryl et al., 2014; Sankar et
al., 2020).
As cianobactérias diazotróficas simbióticas com Azolla sempre foram apontadas
como sendo dos gêneros Anabaena e Nostoc, entretanto estudos envolvendo análises
genéticas indicam a necessidade de revisão na classificação dos microssimbiontes com
Azolla (Baker et al., 2003). Como estas cianobactérias também realizam a fotossíntese,
a liberação de O2 dos cloroplastos poderia interferir na ação da nitrogenase. Para que
os dois processos ocorram plenamente, um mecanismo evolutivo permite a
compartimentalização celular. As células ao se dividirem, permanecem unidas formando
filamentos (Figura 2) e, algumas delas se diferenciam em heterocistos, que possuem
paredes espessas sem realização de fotossíntese, propiciando condições favoráveis à
nitrogenase. Nas demais células não ocorre fixação de nitrogênio e sim, fotossíntese.
Entre o heterocisto e as demais células, transportadores de membrana permitem a
transferência de fotoassimilados e moléculas nitrogenadas (Herrero et al., 2016).

Figura 2. Filamentos da cianobactéria Anabaena sp. apresentando heterocisto entre

células fotossintetizantes.

A diferenciação e compartimentalização celular permite à simbiose

Azolla/cianobatéria incorporar significativas quantidades de nitrogênio aos sistemas
biológicos. Em trabalho realizado por Naz et al., (2014) em Bangladesh, em sistema de
rizipiscicultura, a incorporação de biomassa de Azolla antes e depois do transplante de
arroz permitiu ganhos de 29% na produtividade deste cereal, comparando-se com
tratamentos que receberam 80 kg de nitrogênio por hectare. O crescimento da Azolla é
muito sensível a disponibilidade de nutrientes. Enquanto o aumento da disponibilidade
de nitrogênio no solo diminui o crescimento da pteridófita, a baixa disponibilidade de
fósforo limita o crescimento das plantas (Safriyani et al., 2020a; Safriyani et al., 2020b).
Em função da alta demanda nutricional, exceto por nitrogênio, a Azolla também é
cultivada com finalidade de biorremediação, absorvendo nutrientes de águas
eutrofizadas, sendo a biomassa gerada utilizada posteriormente para outros fins, como
compostagem e adubação ou alimentação animal (Hanafy et al., 2020).
Na Ásia, há diferentes sistemas de integração de Azolla com arroz visando a
redução da adubação nitrogenada. Em algumas propriedades, o arroz é cultivado em
rotação com a Azolla. Em outras ocorre o consórcio entre os dois cultivos (Figura 3).
Neste caso, a Azolla tem maior crescimento logo após o transplante das mudas de arroz,
mas conforme as plantas da gramínea vão fechando a entrelinha, a pteridófita passa a
reduzir seu crescimento pelo sombreamento (Safriyani et al., 2020a). Há também
utilização de sistemas integrados entre arroz, Azolla e patos, aumentando as
possibilidades de renda para os agricultores, como apresentado em um estudo realizado
na Indonésia por Safriyani et al., (2020b).
Ainda, é possível se utilizar da compostagem da biomassa de Azolla para
posterior aplicação no cultivo de arroz. Em trabalho realizado por Hazmi et al., (2020), a
aplicação de composto a base de Azolla incrementou a produtividade de arroz. Além
disso, as cianobactérias da simbiose também promovem outros benefícios ao solo. Em
uma pesquisa realizada por Abdd El-AAI (2013), foi detectada supressão dos fungos
patogênicos Fusarium oxysporum e Alternaria alternate por Anabaena azollae isolada
de Azolla pinnata.

Figura 3. Consorcio de arroz com Azolla (Fonte: Reddy, 2016)

Embora amplamente empregada na agricultura asiática, a simbiose

Azolla/cianobactérias em sistemas de produção de arroz e de animais, ainda não é
utilizada no Brasil. O uso de cianobactérias na agricultura brasileira se restringe
atualmente, ainda de maneira incipiente, ao uso de insumos biológicos a base de
Spirulina. Entretanto, com a crescente demanda por alimentos orgânicos, há um
mercado em ascensão para o arroz orgânico e, novas tecnologias para adubação neste
tipo de sistema de produção necessitam ser desenvolvidas e adaptadas. Portanto,
merecem ser realizados estudos sobre a viabilidade de implantação de Azolla em terras
baixas no sul do Brasil, uma vez que há espécies de Azolla de ocorrência espontânea
nestes ambientes e seu potencial de aportar nitrogênio, graças à simbiose com
cianobactérias, é bastante significativo.

3.3- Simbiose entre rizóbios e leguminosas

Leguminosas
As leguminosas são um grupo muito grande e diverso, variando de pequenos
trevos até plantas arbóreas como Acacia. Estima-se que o grupo contenha de 23.535
espécies em 917 gêneros diferentes (The Plant List, 2013) e a maioria dos examinados
até agora podem fixar nitrogênio em simbiose com rizóbio. Deste grupo cerca de 200
são cultivadas pelo homem sendo 20 de maior importância econômica (Allen & Allen,
1981).
Desde 1886 já se conhece a função dos nódulos em leguminosas e a capacidade
de fixação de nitrogênio pelo microsimbionte, o qual foi isolado e cultivado pela primeira
vez por Beijerinck em 1888, sendo denominado de Bacillus radicícola. A aplicação prática
destes conhecimentos deu-se de forma lenta, sendo o primeiro inoculante constituído
de terra de cultivo antigo e macerado de nódulos revolvidos com as sementes.
No Brasil, segundo Lopes (1974), o Instituto Agronômico de Campinas foi o
pioneiro nas pesquisas com rizóbio/leguminosas, sendo que em 1930 já havia
distribuído culturas puras de Rhizobium para inoculação de sementes. A primeira fábrica
de inoculantes particular no país foi estabelecida em 1956 na cidade de Pelotas, com a
assistência técnica do grupo da Secretaria da Agricultura do Rio Grande do Sul, que
iniciou em 1950 a produção de inoculantes (Freire & Vidor, 1981).

Microssimbionte
As leguminosas formam simbiose com diversas espécies de microrganismos,
coletivamente chamados de rizóbios. A primeira classificação das bactérias se baseava
nos conceitos de grupos de inoculação cruzada (Fred et al., 1932) em que as bactérias
eram classificadas em função da planta hospedeira com a qual formavam simbiose. Os
estudos mais abrangentes demonstraram a alta ocorrência de infecções cruzadas entre
grupos distintos, inviabilizando a manutenção desta classificação.
Na classificação atual, com base nas características do DNA dos micro-
organismos, algumas espécies foram fundidas e gêneros desmembrados. Na
classificação mais recente (Tabela 1), os rizóbios foram agrupados em α-proteobacterias
e β-proteobactérias, sendo também conhecidos como alfa-rizóbios e beta-rizóbios. Os
gêneros de rizóbios da classe alfa são: Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium,
Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium, Devosia, Methylobacterium, Microvirga,
Ochrobactrum, Shinella, e Phyllobacterium. Enquanto na classe beta encontramos os
rizóbios dos gêneros: Cuproavidus e Burkholderia (Zakhia & de Lajudie, 2001; Willens,
2006; Lin et al., 2008; Ardley et al., 2012).
A especificidade hospedeira é característica deste grupo de simbiontes, no
entanto, pode variar desde estirpes altamente específicas, como as que formam nódulos
em plantas de trevo, até estirpes promíscuas que podem formar nódulos em mais de
um hospedeiro como a estirpe NGR234, que pode induzir nodulação em 34 diferentes
espécies de leguminosas e em uma espécie não-leguminosa (Parasponia andersonii)
(Stanley & Cervantes, 1991).
Os rizóbios são, de maneira geral, bacilos Gram negativos, de 0,5 a 0,9 micras
por 1,2 a 3,0 micras, geralmente móveis quando jovens por flagelos peritríquios, polares
ou sub-polares, não formam endosporos, suas células podem conter grânulos de poli-
beta-hidroxibutirato. A maioria das estirpes produzem grande quantidade de
polissacarídeos extracelulares mucilaginosos, de composição variável segundo a estirpe
e o meio de cultivo.
Os rizóbios são bactérias pleomórficas sofrendo alterações morfológicas,
fisiológicas e bioquímicas dentro do nódulo, transformando-se em células que são
denominadas bacteróides e que podem apresentar formas irregulares de X , Y ou de
clavas, não apresentando flagelos e perdendo a capacidade de divisão celular. São
encontrados dentro das células da região fixadora do nódulo radicular em grupos
isolados por um envelope membranoso originado pela planta denominado
simbiossoma.
 Tabela 1 – Relação de exemplos de gêneros e espécies de bactérias simbiontes
chamadas comumente de rizóbios
Gênero Espécies Leguminosas
Bradyrhizobium B. japonicum e B. Elkanii Soja
Rhizobium R. leguminosarum bv. Feijão
phaseoli
R. trifolii Trevo
Azorhizobium A. Caulinodans Anjiquinho
Ensifer (Sinorhizobium) E. Fredii soja asiática
E. meliloti Alfafa
Mesorhizobium M. Ciceri grão de bico
M. loti Lotus
Allorhizobium A. Undicola Crotalaria
Devosia D. Neptuniae Neptunia natans
Methylobacterium M. Nodulans Crotalária
Burkholderia B. tuberum Leguminosas tropicais
Cupriavidus (Ralstonia) C. taiwanensis Mimosa sp.
Ochrobactrum O. lupine tremoço branco
Shinella S. kumerovia Kummerowia stipulacea
Phyllobacterium P. trifolii trevo e tremoço (Esp)
Microvirga M. lupinii Lupinus texensis

Estabelecimento da simbiose e formação do nódulo

Na grande maioria das plantas hospedeiras, a fixação simbiótica de Nitrogênio
ocorre em órgãos radiculares especializados chamados nódulos. Também podem
ocorrer nódulos caulinares em algumas espécies dos gêneros Aeschynomene e
Discolobium (Martins et al, 2015) e na não leguminosa Parasponia andersonii.
No campo, com o emprego de sementes inoculadas, o período de tempo desde
semeadura para a formação dos nódulos e início do processo de fixação simbiótica de
nitrogênio é muito variável. Este período depende da leguminosa hospedeira, da
espécie de rizobio e do teor de nitrogênio no solo disponível para a planta, que pode
atrasar ou inibir a formação de nódulos.
A formação dos nódulos e a Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) são
resultantes de complexas interações químicas e físicas entre o microssimbionte
(rizóbios) e o macrosimbionte (planta hospedeira) compatíveis. Estas interações incluem
processos de sinalização que resultam na expressão gênica em ambos os parceiros,
definem a compatibilidade entre planta e micro-organismo e suprimem os mecanismos
de defesa das plantas contra a invasão pelos simbiontes. No caso da soja, por exemplo,
os primeiros nódulos podem ser observados 10 a 12 dias após a emergência e a fixação
de nitrogênio inicia entre 15 a 20 dias após a emergência.
As vias de sinalização no desenvolvimento dos nódulos são divididas em dois
eventos principais, infecção pelos rizóbios e organogênese (formação) do nódulo. Para
uma associação simbiótica bem-sucedida, é essencial que os dois fenômenos ocorram
em diferentes tecidos radiculares de forma simultânea (Crespi & Frugier, 2008; Madsen
et al., 2010; Oldroyd, 2013)
O processo de formação do nódulo (organogênese), mostrado na Figura 4, de
uma forma geral pode ser resumidamente dividido nas seguintes fases:

a) - Quimiotaxia: Movimentação dos rizóbios em direção à superfície das raízes.

As plantas excretam para o meio rizosférico diversas substâncias atraindo os micro-
organismos que as utilizam como nutrientes. Esta atração química é inespecífica, uma
vez que a maioria das rizobactérias, incluindo os rizóbios, são atraídos para o ambiente
da rizosfera.
Entre as substâncias nos exsudatos das raízes das leguminosas, os flavonóides
atuam como sinais químicos atraindo os rizóbios em condições de baixos teores de
Nitrogênio (Liu & Murray, 2016).

Figura 4: Esquema resumido dos processos relacionados à organogênese do nódulo

radicular na simbiose de Sinorhizobium meliloti-Medicago sativa. Adaptado de Kapp
(1996)
 b) - Proliferação dos rizóbios na rizosfera: Os exsudatos radiculares estimulam
a população de rizóbios na rizosfera. Entretanto, o estímulo não é específico aos rizóbios
simbiontes pois pode ocorrer a proliferação de rizóbios na rizosfera de leguminosas não
compatíveis simbioticamente.
A multiplicação dos rizóbios sobre o sistema radicular em muitos casos é
necessária para ocorrer a nodulação. Rizóbios produzem N-acil-homoserina lactonas
(AHLs), derivadas de precursores de ácidos graxos e aminoácidos, as quais, pelo sistema
de “quorum sensing” dependente da densidade da população de rizóbios, regulam a
expressão de genes (Wisniewski-Dyé & Downie, 2002; Sanchez-Contreras et al., 2007)
como os genes nod em R. leguminosarum bv viciae.

c) - Aderência às raízes: Diversos mecanismos conduzem à aderência das

células bacterianas aos pelos radiculares. A aderência é um estágio inicial para a
formação de biofilmes microbianos nas raízes das plantas permitindo reações
bioquímicas que desencadeiam o encurvamento do pelo radicular e a penetração dos
rizóbios. Diversos mecanismos e moléculas de superfície de ambos os parceiros da
simbiose rizóbios/leguminosas podem estar envolvidos na aderência às raízes. A
primeira fase da aderência é uma ligação fraca, reversível e inespecífica na qual estão
envolvidas lectinas vegetais, ricadesina (proteína bacteriana ligante de Ca+2) e
polissacarídeos bacterianos de superfície. A segunda fase causa uma ligação forte e
irreversível da bactéria às raízes e requer a síntese de fibrilas de celulose pela bactéria
(Rodríguez-Navarro et al., 2007).
Estudos de simbiose com leguminosas utilizadas como modelos como
Medicago truncatula e Lotus japonicus, mostram que a infecção começa após a fixação
dos rizóbios nos pelos radiculares (Popp & Ott, 2011).

d) - reconhecimento: Plantas leguminosas, em condições de baixos teores de

nitrogênio no solo, excretam diversos flavonóides e isoflavonóides cujo papel como
quimio-atratores para concentrar os rizóbios compatíveis na superfície da raiz já é bem
conhecido (Abdel-Lateif et al., 2012). Os flavonóides são liberados em concentrações
ótimas próximos à zona de emergência dos pelos radiculares, a qual é o local de infecção
pelos rizóbios (Zuanazzi et al., 1998). Os flavonóides são moléculas que induzem a
expressão de genes (nod, nol e noe) dos rizóbios envolvidos no processo de nodulação.
Os flavonóides específicos liberados pelas raízes interagem com a proteína Nod
D do rizóbio ativando a região promotora (nod box) no DNA da bactéria para ativar a
transcrição dos genes nod responsáveis pela síntese de lipoquitooligossacarídeos
denominados fatores Nod (Dénarié et al., 1996) que são reconhecidos pela planta.
A regulação positiva dos genes nod pela proteína Nod D em resposta aos
flavonóides exsudatos pela planta hospedeira é em parte responsável pela
especificidade hospedeira dos rizóbios.
Os fatores Nod são importantes sinais simbióticos, atuando como moléculas
sinalizadoras essenciais para a invasão bacteriana e início e a formação do nódulo. As
plantas percebem os fatores Nod dos rizóbios por meio de proteínas localizadas na
membrana citoplasmática da célula vegetal chamadas de quinases tipo-receptores LysM
(Kouchi et al., 2010), as quais acionam a organogênese do nódulo e a formação do
cordão de infecção (Madsen et al., 2010).
 e) - Encurvamento do pelo radicular: Durante o processo de aderência e
reconhecimento, a bactéria causa o encurvamento do pelo radicular. Quando o rizóbio
específico adere ao pelo radicular, a bactéria excreta Fatores Nod no local sendo
armazenados dentro da parede do pelo radicular (Goedhart et al., 2008). Este acúmulo
de Fator Nod causa alterações locais da concentração de Ca2+ e rearranjo das
microfibrilas de actina da célula do pelo radicular, o que redireciona o crescimento do
pelo radicular em direção à micro-colônia de rizóbios aderida. A multiplicação das
bactérias incrementa a área de contato com o pelo causando o encurvamento do pelo
radicular (Esseling et al., 2003)
Somente o rizóbio homólogo consegue infectar a leguminosa susceptível, a
partir de células que se localizam em uma espécie de bolsão, englobadas pelo
encurvamento do pelo radicular.

f) - Formação do cordão de infecção: A infecção da raiz pelos rizóbios inicia

pelas células epidérmicas da raiz. Os rizóbios podem penetrar na raiz através dos pelos
radiculares e também por meio de fissuras na superfície da raiz (Sprent & James, 2007).
A infecção progride através de um canal intracelular chamado cordão de infecção (Vasse
& Truchet, 1984) em direção às células do córtex radicular. A bactéria penetra o pelo
radicular por invaginação da parede, que pode ser devida à dissolução enzimática,
abrandando a resistência da parede celular, ou devido à penetração entre espaços das
microfibrilas celulósicas do pelo radicular.
A penetração dos rizóbios, com a formação do cordão de infecção, e a
organogênese dos nódulos são dois processos distintos, mas altamente coordenados. A
divisão celular para a formação de nódulos inicia-se aproximadamente no momento em
que os rizóbios se aderem ao pelo radicular e exatamente abaixo do local da infecção
pelos rizóbios. Essa coordenação permite que os cordões de infecção atinjam o
primórdio nodular enquanto se estendem a partir da epiderme até o córtex da raiz
(Oldroyd & Downie, 2008).

g) - Formação do nódulo: À medida em que os pelos radiculares se curvam,

prendem os rizóbios compatíveis e desenvolvem os cordões de infecção para
transportar as bactérias para dentro dos tecidos radiculares, tem início a formação
(organogênese) do nódulo radicular. A organogênese nodular inicia com a estimulação
da divisão celular de células do periciclo, camada mais externa do cilindro central da raiz,
e do córtex, as quais originam a formação e a vascularização dos primórdios nodulares
(Oldroyd et al., 2011; Guan et al., 2013)
Os nódulos derivam da divisão celular no córtex radicular e no periciclo que é
iniciada enquanto os rizóbios ainda estão na epiderme da raiz, um estágio que envolve
a percepção dos fatores Nod pelas quinases tipo-receptores LysM da planta (Gough &
Cullimore, 2011). Eles se tornam habitados por rizóbios que entram na raiz através do
cordão de infecção. Os cordões de infecção se agrupam e crescem de célula em célula
partindo da epiderme em direção ao córtex radicular (Harrison & Ivanov, 2017). No
cordão de infecção, os rizóbios são conduzidos através de várias camadas celulares para
o nódulo em desenvolvimento (Popp & Ott, 2011).
Quando o cordão de infecção atinge as células do córtex incipiente do nódulo,
ocorre a ramificação do cordão de infecção e os rizóbios são liberados dentro das células
vegetais em pequenas vesículas constituídas por membrana da célula vegetal e
desprovidas de parede formando uma organela única e temporária chamada
Simbiossoma (Roth & Stacey, 1988). As bactérias dentro dos simbiossomas crescem e se
dividem, juntamente com a membrana do simbiossoma, até que a célula vegetal esteja
mais ou menos repleta de milhares de simbiossomas, cada um contendo uma ou
algumas poucas bactérias (Roth & Stacey, 1989).
Os rizóbios dentro do simbiossoma sofrem uma diferenciação em bacteroides
fixadores de Nitrogênio que liberam amônia dentro da célula do hospedeiro, a qual é
transferida por meio de transportadores na membrana do simbiossoma (Udvardi &
Poole, 2013), em troca de fontes de carbono e outros nutrientes fornecidos pela planta.
A diferenciação em bacteroides envolve mudanças de forma e volume e perda da
capacidade de vida livre.
Em nódulos formados pela simbiose de espécies de rizóbios com leguminosas
e de Frankia com não leguminosas, ocorre a produção de uma proteína de ligação e
transporte de oxigênio chamada leghemoglobina, a qual confere coloração avermelhada
à região fixadora de Nitrogênio dos nódulos. Apesar da ocorrência de processos
demandantes de Oxigênio como produção de ATP e respiração pelos bacteroides,
condições microaeróbicas dentro dos nódulos são obtidas por difusão gasosa restrita
para dentro dos nódulos e altas taxas de respiração facilitada pela leghemoglobina (Ott
et al., 2005). A localização da leghemoglobina nos nódulos foi controversa com trabalhos
indicando que a leghemolobina localizava-se exclusivamente no citoplasma das células
de nódulos de leguminosas (Bisseling et al., 1983), enquanto outros indicaram a
localização da leghemoglobina dentro do espaço peribacteróide (Bergersen & Appleby
1981). Em secções finas de nodulos de ervilha, usando-se imunocoloração com ouro da
leghemoglobina observou-se que esta podia ser encontrada no citoplasma e nos núcleos
das células vegetais infectadas, mas não nos espaços peribacteróides, dentro do
simbiossoma (Robertson et al., 1984). A leghemoglobina transporta o O2 aos bacteróides
e agem como tampões de O2, impedindo a inativação da nitrogenase (Larrainzar et al.,
2020)
Após a diferenciação dos rizóbios em bacteroides e da síntese de
leghemoglobina ocorre a síntese das proteínas dos componentes I e II da nitrogenase e
a fixação simbiótica de nitrogênio inicia. A indução de genes da nitrogenase nos
bacteroides é controlada pelo oxigênio. As concentrações de oxigênio livre nas células
dos nódulos tornam-se tão baixas quanto 10-8 M na zona de fixação, permitindo que a
nitrogenase, que é sensível ao oxigênio, funcione (Tjepkema & Yocum, 1974). A
nitrogenase é sintetizada após a leghemoglobina em nódulos de ervilha (Bisseling et al.,
1979) e caupi (Bisseling et al., 1980). Além de baixas concentrações de O2, a atividade
da nitrogenase também depende do fornecimento do cofator homocitrato pela planta
(Hakoyama et al., 2009).

Estrutura dos nódulos

Ao contrário de outras hiperplasias em vegetais provocadas por insetos,
nematóides ou Agrobacterium tumefaciens, os nódulos têm estrutura perfeitamente
organizada. No nódulo maduro se diferenciam as seguintes regiões, conforme Figura 5:
a) zona de fixação - apresenta células infectadas e não infectadas. As primeiras
contêm os bacteróides e aparecem hipertrofiadas alcançando dimensões de 4 a 8 vezes
superiores às células não infectadas. As células infectadas da zona de fixação contêm os
bacteróides, os quais são incapazes de crescer em meios de cultivo, possuem o sistema
de citocromos e outros componentes da cadeia respiratória alterados e apresentam a
nitrogenase ativa bem como a leghemoglobina comentada anteriormente.
b) zona vascular - constitui o sistema de vasos que é conectado ao da raiz. Por
meio do sistema de vasos a planta aporta fotossintatos e retira os produtos
nitrogenados resultantes da fixação.
c) zona cortical - formada por células não diferenciadas nem infectadas.
d) zona meristemática - com divisões celulares ativas, com células não
infectadas que darão origem às outras regiões;

Figura 5: Imagens de microscopia de campo claro de preparações histológicas de corte

transversal de nódulos de soja: a) zona de fixação, b) vasos condutores, c) zona cortical
e R) raiz.

Tipos de nódulos
Na simbiose entre leguminosas / rizóbios os nódulos são estruturas novas,
altamente organizadas e que apresentam a zona fixadora envolta pelos vasos
condutores. Na simbiose entre Frankia / não leguminosas os nódulos são modificações
de raízes secundárias e apresentam os vasos condutores centrais e zona fixadora lateral
aos vasos condutores.
Os tipos de nódulos mais comumente encontrados podem ser sumarizados de
uma maneira geral como os seguintes:
a) - Nódulos de crescimento determinado: são nódulos com meristema circular
originando nódulos esféricos - Exemplos: soja, feijão, amendoim, cornichão (Figura 6 a)
b) - Nódulos de crescimento indeterminado: são nódulos com meristema apical
originando nódulos digitiformes (em forma de dedos) Exemplos: trevo, alfafa, ervilhaca
(Figura 6 b)
c) - Também podem ocorrer nódulos com formas irregulares muito aderidos à raiz
como em tremoço (Figura 6 c e d).
Figura 6: exemplos de tipos de nódulos: a) nódulos de cornichão; b) nódulos de
ervilhaca; c) nódulos de tremoço e d) corte de nódulos de tremoço mostrando
aderência às raízes e zona fixadora de N.

Uma classificação mais detalhada da morfologia dos nódulos de leguminosas,

que é utilizada como importante característica taxonômica de leguminosas, pode ser
encontrada em Sprent et al. (2013 - DOI: 10.1016/j.sajb.2013.06.011)

4.- Bioquímica e fisiologia da fixação de nitrogênio

Por fixação de nitrogênio atmosférico compreende-se a ruptura da ligação
tripla da molécula de N2 possibilitando a redução do Nitrogênio. Isto pode ser
conseguido pelo processo industrial (Haber-Bosch), com alta demanda energética não
renovável, ou por ação da enzima nitrogenase.
A reação de redução do nitrogênio pela nitrogenase é descrita como:

N + 8 flavodoxina + 8H++ 16 MgATP2-+ 18 H2O nitrogenase 2NH4+ +

2
2OH- + 8 flavodoxina + 16 MgADP- + 16H 2PO4 - + H
2

Esta reação é dependente de energia na forma de ATP ligado a Magnésio

(MgATP). Os elétrons disponíveis não são destinados somente ao nitrogênio, parte deles
será utilizado na produção de hidrogênio. A formação de hidrogênio e sua posterior
evolução em alguns sistemas biológicos ainda não são bem entendidas, calculando-se,
no entanto, que cerca de 25% dos elétrons disponíveis são obrigatoriamente gastos
nesta conversão (Neves & Rumjaneck, 1992). A fixação biológica do Nitrogênio e todas
as outras reduções catalizadas pela nitrogenase exigem: nitrogenase ativa, uma fonte
de poder redutor metabólico NADH+, MgATP, prótons e um ambiente anaeróbico.
 Nitrogenase ativa:
A Nitrogenase é sintetizada a partir da expressão dos genes nif HDK do rizóbio
e é composta por dois componentes protéicos, purificados separadamente, chamados
de Ferro-Molibdênio - proteína (MoFe - proteína ou componente I) e Ferro-proteína (Fe
- proteína ou componente II ou subunidade D e K).
Componente I (MoFe -Proteína ou subunidade D e K) - A MoFe -proteína é um
tetrâmero constituído por duas subunidades alfa e duas subunidades beta com peso
molecular entre 200.000 a 250.000 daltons. Este componente contém dois átomos de
Mo e, aproximadamente 33 átomos de Fe por molécula (Burgess, 1984). Esta proteína
também é conhecida como dinitrogenase e é onde ocorre a fixação do substrato (Burris
et al.,1981)
Componente II (Fe-proteína ou subunidade H) - A ferro-proteína é um dímero
composto de duas subunidades idênticas de peso molecular entre 57.000 e 72.000
daltons e quatro átomos de ferro. Este componente transfere os elétrons para a MoFe-
proteína e por isso é chamado de nitrogenase redutase.
A nitrogenase mais comumente encontrada é aquela que contém molibdênio
e, por isso, é conhecida como nitrogenase convencional. Entretanto, outras
nitrogenases têm sido encontradas e são definidas como alternativas, a mais conhecida
é a de Azotobacter vinelandii, onde o vanádio substitui o Mo (Halles et al., 1986).
Os dois componentes da nitrogenase podem ser separados, mas isoladamente
não são capazes de reduzir o nitrogênio, porem quando se misturam os dois
componentes provenientes inclusive de espécies diazotróficas distintas, a atividade da
enzima é recuperada.

Poder Redutor:
A flavodoxina e a ferrodoxina são doadores de elétrons para a nitrogenase in
vivo. Estas substâncias recebem elétrons do NADH, o qual é reduzido a partir da
oxidação de compostos de carbono, via cadeia respiratória ou via metabolismo
anaeróbico.

Suprimento de Energia
A reação de redução do N consome energia que é fornecida ao sistema
enzimático sob a forma de ATP. O ATP é produzido a partir da oxidação de substratos
que podem ser provenientes da fotossíntese (nódulos de leguminosas e cianobactérias)
ou então substratos disponíveis no ambiente (bactéria fixadora de vida livre).

4.1- Ativadores e inibidores de nitrogenase

Além do nitrogênio o complexo enzimático da nitrogenase é capaz de doar
elétrons a uma série de outros substratos, tais como, óxido nitroso, acetileno, azida,
cianeto, metil isocianeto e também prótons.
O próton (H+) e o óxido nitroso (N2O) atuam como inibidores competitivos do
nitrogênio. Por esta razão, tem sido postulado que estes três substratos são capazes de
interagir com a nitrogenase utilizando o mesmo centro ativo. Por outro lado, cianeto,
azida e metil isocianeto são inibidores competitivos entre si, porém não competem com
o nitrogênio, o que indica que os mesmos atuam em local diferente do centro que
apresenta afinidade pelo nitrogênio.
O monóxido de carbono é um inibidor não competitivo da maioria dos
substratos da nitrogenase, ou seja, atua em outro local da estrutura enzimática que não
o local de interações com o substrato. Entretanto, ele não apresenta nenhum efeito
sobre a transferência de elétrons para os prótons, e é por isso que a liberação de
hidrogênio permanece inalterada, quando em presença do monóxido de carbono. Este
fato é uma indicação que a liberação de hidrogênio não deve ocorrer no mesmo sítio da
nitrogenase que apresenta afinidade pelo nitrogênio.
Tem sido postulado para o acetileno um sítio de ligação com a nitrogenase
diferente do sítio do nitrogênio, embora os dois sejam capazes de se inibir entre si, o
que tem sido creditado ao fato dos dois competirem pela mesma fonte de elétrons.

4.2- Como funciona a nitrogenase.

A dinitrogenase redutase (componente II) recebe o elétron fornecido pelo
NADH. O elétron adquirido deverá então ser transportado para a dinitrogenase
(componente I). Esta transferência de elétron necessita de energia. Cerca de duas
moléculas de ATP devem ser consumidas para cada elétron transferido. A Fe-proteína
ligada ao ATP, especificamente MgATP torna-se mais negativa e, por isso, é capaz de
reduzir a MoFe-proteína.
O elétron que alcança a dinitrogenase se localiza junto ao molibdênio,
permitindo a ligação entre o nitrogênio molecular e aquele átomo. As evidências
indicam que o molibdênio é o centro ativo da nitrogenase. Um novo elétron percorre o
mesmo caminho do primeiro até ser capaz de propiciar um novo grau de redução ao
nitrogênio. A redução ocorre em etapas gradativas até haver a formação da amônia, a
qual é liberada e seguirá a rota metabólica característica de cada microrganismo.
O mecanismo dessa reação enzimática pode parecer, à primeira vista, bastante
complexo. Porém se observarmos detalhadamente existem duas reações envolvidas, ou
seja, reação de oxi-redução e reação de transferência de energia.
As reações de oxi-redução são reações que acarretam a transferência de
elétrons. Se observarmos o trajeto do elétron ao longo das diversas etapas de
funcionamento da nitrogenase, veremos que ele passa do NADH para a ferredoxina ou
flavoproteína, para a Fe-proteína, e em seguida para a MoFe-proteína e daí para o
nitrogênio. Nesta trajetória ocorrem uma série de reações de oxi-redução.

4.3- Mecanismos de proteção da nitrogenase contra Oxigênio

A sensibilidade da nitrogenase ao oxigênio, que pode destruir
irreversivelmente a enzima, representa um grande problema de ordem fisiológica para
a maioria dos microrganismos diazotróficos, exceto aqueles com metabolismo
anaeróbio como Clostridium pasteurianum.
A nitrogenase não funciona na presença de oxigênio desta forma os
microrganismos aeróbios desenvolveram uma série de estratégias para proteger a
nitrogenase.

Proteção respiratória: espécies do gênero Azotobacter são muito bem

adaptadas à fixação de nitrogênio em condições aeróbias porque nestas espécies a
respiração desenvolve uma função protetora. Taxas respiratórias excepcionalmente
altas são observadas, servindo para eliminar o oxigênio do sítio da fixação.

Produção de exopolissacarídeos: a produção de uma densa camada de

exopolissacarídeos serve como uma barreira restringindo a difusão de oxigênio até as
bactérias no interior de colônias de Beijerinckia, Azotobacter, Derxia gummosa .
Entretanto há estirpes que não produzem goma e não apresentam sensibilidade ao
oxigênio.

Proteção conformacional da Nitrogenase: As espécies de Azotobacter também

apresentam um mecanismo de proteção conformacional onde a nitrogenase encontra-
se numa fração micro-particulada juntamente com uma proteína que é capaz de se ligar
ao sítio sensível a oxigênio, impedindo assim a inativação. Este mecanismo confere às
bactérias a capacidade de ligar e desligar a nitrogenase. Sempre que as condições de
oxigenação excederem a capacidade protetora da respiração, a nitrogenase é desligada
através do bloqueio do sítio da nitrogenase pela proteína. Assim que as condições
favoráveis são restabelecidas a nitrogenase é ligada pelo desacoplamento da proteína.

Heterocistos: nas cianobactérias, o processo fotossintético é semelhante ao

das plantas superiores, gerando oxigênio. Enquanto algumas espécies (Plectonema)
simplesmente separam no tempo os dois processos fisiologicamente incompatíveis,
fixando nitrogênio apenas em condições microaerofílicas quando a iluminação é baixa e
o processo fotossintético cessa. Outras espécies (Anabaena) desenvolveram células
adaptadas chamadas heterocistos onde a nitrogenase é sintetizada e ocorre a fixação
de nitrogênio. Os heterocistos desaparecem sempre que existe nitrogênio mineral
disponível no meio. As células vegetativas das cianobactérias realizam o processo
fotossintético e produzem oxigênio, enquanto nos heterocistos o fotossistema II
(responsável pela liberação de Oxigênio) está ausente. Deste modo não há redução de
dióxido de carbono pelos heterocistos, mas eles são capazes de fotofosforilação. Além
disso, a grossa parede celular restringe a difusão de oxigênio do meio externo, sendo
que a troca gasosa se dá pelos plasmodesmas que ligam os heterocistos às demais
células vegetativas.

Associações com outros organismos: As associações dos diazotróficos podem

incluir outros microrganismos como fungos, formando liquens, e os vegetais superiores.
Alguns diazotróficos apenas se beneficiam da proximidade de uma raiz, Azotobacter na
rizosfera de Paspalum notatum, outros são capazes de penetrar no interior das raízes,
Azospirillum em cereais, enquanto que os diazotróficos mais especializados (como
rizóbio com leguminosas e Frankia com Casuarina) formam estruturas especializadas
(nódulos) onde a difusão de oxigênio é bastante limitada.

Leghemoglobina: Nas associações de rizóbio com leguminosas ocorre a

formação de nódulos radiculares onde os bacteróides encontram-se encapsulados
dentro do simbiossoma dentro do citoplasma de células vegetais, na região fixadora do
nódulo, que contém uma hemoproteína chamada leghemoglobina. Da mesma forma
que a proteína do sangue, sua função é transportar o oxigênio, porém sua alta afinidade
com o oxigênio faz com que seja capaz de liberar oxigênio para o bacteróide, em
concentrações nunca prejudiciais à nitrogenase, representando uma forma de sistema-
tampão para oxigênio.

5.- Principais fatores limitantes à fixação de nitrogênio pela simbiose

rizóbio/leguminosa
Tendo em vista o envolvimento de organismos vivos, em um local
extremamente dinâmico como o solo, e sujeito às variações das condições climáticas do
ambiente, vários fatores sejam bióticos ou abióticos podem interferir no processo da
FBN.

1 – Fatores bióticos de solo:

O estabelecimento do processo simbiótico entre leguminosa e rizóbio deve
atender mecanismo específico de reconhecimento. A infecção dos pelos radiculares da
leguminosa pelo rizóbio inicia com o reconhecimento através de sinais moleculares,
como flavonóides e isoflavonóides emitidos pelas raízes da planta, que são reconhecidos
pela bactéria similar a um sistema chave – fechadura. No entanto, na maioria dos solos,
existem rizóbios nativos em grande quantidade e adaptados às condições vigentes. Elas
são capazes de infectar a planta, mas apresentam baixa capacidade de fixação do N2.
Portanto, no processo competitivo que se apresenta, a qualidade do inoculante utilizado
é imprescindível tanto na quantidade de células viáveis como comprovadamente
eficientes na fixação. Segundo Moreira & Siqueira (2006), as estirpes devem apresentar
uma série de características para serem usadas em inoculantes comerciais como mostra
a Tabela 4.

Tabela 4 – Características desejáveis de estirpes de rizóbio usadas em inoculantes

comerciais.
- formar nódulos e fixar N na espécie alvo
- fixar N numa ampla faixa de genótipos de hospedeiros
- crescer bem em meio artificial no veículo do inoculante e no solo
- apresentar estabilidade genética
- baixa mortalidade na semente
- compatibilidade com agroquímicos
- competir na formação de nódulos com população de rizóbios já presente no solo
(nativa)
- colonizar a rizosfera da planta hospedeira
- migrar a partir de um sítio inicial de inoculação
- fixar N numa ampla faixa de condições ambientais
- formar nódulos e fixar N na presença de N mineral no solo
- tolerar estresses ambientais
- persistir no solo, particularmente para leguminosas que se regeneram anualmente
- colonizar o solo na ausência do hospedeiro

Em solos com baixa população ou ausência de rizóbios o sucesso da inoculação

é facilitado, entretanto, deve ser considerado que predação por protozoários e
antibioses por actinomicetos também podem ocorrer.
Outros fatores bióticos, como desfolhação excessiva da planta pelo ataque de
pragas pode prejudicar a fixação de N pois reduz a fotossíntese da planta e o
fornecimento de fotossintatos à raiz. Da mesma forma a competição por nutrientes ou
por luz, que geralmente ocorre em consórcios mal planejados, pode comprometer o
desenvolvimento da planta e da simbiose. Também devem ser consideradas pragas de
solo, como insetos (ex. gênero Ceratoma) e nematóides que preferem atacar os nódulos
devido à ausência de lignina e ao alto teor de nitrogênio, reduzindo assim a eficiência
da fixação de N.

2 - Fatores abióticos de solo:

2.1 – Temperatura.
A temperatura ótima tanto para nodulação como para fixação do N situa-se
entre 25 a 32 oC, considerando as leguminosas tropicais. A simbiose Rizóbio/leguminosa
é mais sensível à temperatura do que a planta que recebe N mineral. Temperaturas
baixas retardam o processo de nodulação e altas prejudicam a fixação devido às
modificações fisiológicas e bioquímicas tanto da bactéria como da planta.

2.2 – Umidade e concentração de O2.

Para a grande maioria dos microrganismos do solo a umidade ideal situa-se
entre 60 a 80% da capacidade de campo do solo. Baixa disponibilidade de água afeta o
desenvolvimento da planta hospedeira e consequentemente a emissão e a infecção dos
pelos absorventes nas raízes, menos nódulos e menor fixação de N. A atividade da
nitrogenase é afetada e a síntese da leg-hemoglobina prejudicada (Goormachtig et al.,
2004).
Por outro lado, água em excesso como em solos alagados, pode afetar
negativamente a simbiose pois tanto a maioria das plantas produtoras de grãos como a
bactéria requerem oxigênio para seu desenvolvimento. Em geral, os nódulos não
toleram excesso de umidade, exceto espécies do gênero Neptunia, que são plantas
aquáticas. Conforme Moreira et al. (1992), em solos periodicamente inundados, como
em florestas tropicais da Amazônia, a nodulação pode ser maior do que em solos não
inundados.

2.3 – Aspectos químicos.

a) Acidez do solo, expressa pelo seu pH, tanto baixo (<5,5) como alto (>7,5)
interfere na FBN afetando ambos simbiontes. De uma forma geral os solos
brasileiros são ácidos (pH<5,0), o que acarreta aspectos nutricionais indesejáveis
como altas concentrações de Al+3 (>10µM), teores de fósforo baixos ou muito
baixos e presença de teores tóxicos de Mn que reduzem a área fotossintética das
folhas. Altos teores de alumínio no solo inibe o desenvolvimento da bactéria e
inibe o desenvolvimento da raiz.
b) Baixos teores de P (fósforo): A presença de fósforo aumenta a nodulação e a
fixação de N. A deficiência de P reduz a massa de nódulos, a produção de
fotossintatos da planta e a atividade das enzimas responsáveis pela absorção do
Nitrogênio fixado (GS – GOGAT) tanto em nódulos como nas folhas.
c) Baixo teor de Ca – deficiência de Ca impede a infecção e os estágios iniciais da
nodulação, além de inibir a fixação em nódulos maduros.
 d) A acidez do solo também termina provocando um desbalanço de alguns
micronutrientes como cobalto, ferro, molibdênio, integrantes da enzima
nitrogenase, além do zinco e do boro (Vieira et al., 1998). Deve ser considerado
também que esses micronutrientes são essenciais para o desenvolvimento da
planta.
e) A calagem tem sido uma prática recomendada para corrigir a acidez do solo,
precipitando o Al trocável, favorecendo a disponibilidade de fósforo pela
diminuição de sua adsorção aos colóides de ferro e alumínio além de
disponibilizar cálcio e magnésio.
f) A quantidade de calcário e de nutrientes, como fósforo e potássio, devem seguir
as recomendações técnicas em função dos resultados da análise da fertilidade
do solo por laboratório credenciado.
g) Nitrogênio mineral: Apesar da necessidade do N mineral nos primórdios do
desenvolvimento da planta e do processo de infecção, formação e crescimento
do nódulo, sua presença em excesso inibe a formação dos nódulos e o processo
de fixação em nódulos desenvolvidos. De uma forma geral os solos têm
disponibilidade de N mineral (NO3 ou NH4) para atender a demanda inicial do
processo de estabelecimento da simbiose. Observações com a cultura da soja
demonstraram que 12 ppm de N mineral foi suficiente para diminuir a nodulação
inicial, atrasando o processo de infecção, com diminuição da produção de grãos
(Selbach, 1979). Da mesma forma, a tentativa de substituir o nitrogênio
simbiótico pelo mineral em doses crescentes e escalonadas de fertilizante
nitrogenado para a cultura da soja apresentou os mesmos rendimentos de grãos
do tratamento apenas inoculado. Desta forma, aumentou apenas o custo de
produção onde foi aplicado fertilizante.

6.- Utilização dos microrganismos diazotróficos na agricultura

Os microrganimos fixadores de nitrogênio são utilizados na agricultura desde os
tempos mais remotos. Os antigos chineses, gregos e romanos, ao cultivarem
leguminosas como adubos verdes (Kiehl, 1984) já estavam utilizando os rizóbios como
aliados da produção vegetal, sem, obviamente, tomar conhecimento. No Brasil, graças
às pesquisas iniciadas na década de 50, pelo grupo do Dr. João Rui Jardim Freire no Rio
Grande do Sul com rizóbios e no Rio de Janeiro pelo grupo da Dra. Johanna Dobereiner
com Azospirillum, foram lançados os primeiros inoculantes comerciais para uso em
sementes.
No caso dos rizóbios para leguminosas, atualmente existem uma ampla gama de
estirpes oficialmente recomendadas para uso em diferentes espécies, armazenadas em
bancos de germoplasmas, em diferentes instituições de pesquisa. A Coleção SEMIA é
responsável pela manutenção e distribuição das estirpes de rizóbios recomendadas para
o uso em inoculantes comerciais. Estas estirpes são catalogadas com a sigla SEMIA,
seguida por um código numérico. A coleção SEMIA está vinculada ao Departamento de
Diagnóstico e Pesquisa Agropecuária, da Secretaria de Agricultura, Pecuária e
Desenvolvimento Rural do Estado do Rio Grande do Sul (SEAPDR, 2017).
Com a importância comercial do cultivo da soja no Brasil, o inoculante de rizóbios
para esta leguminosa é o mais empregado e comercializado. Por outro lado, na Coleção
SEMIA há centenas de estirpes de rizóbios para muitas espécies de leguminosas
disponíveis para a multiplicação em biofábricas. A produção comercial de inoculantes
ocorre por demandas de utilização nos cultivos. Entretanto, dada a importância da
fixação de nitrogênio para a agricultura, esta produção tem potencial para crescer
muito, atendendo cultivos importantes, como de feijão, leguminosas olerícolas, como
ervilha e grão-de-bico, leguminosas forrageiras como trevos e cornichões, espécies
florestais como acácia e, as plantas de cobertura como ervilhacas, crotalárias, feijões de
porco, guandú, mucunas e tantas outras.
As recentes descobertas científicas sobre os outros mecanismos de promoção de
crescimento além da fixação de nitrogênio pelos rizóbios, aumentam ainda mais a
importância destes microrganismos na agricultura. Uma mesma estirpe que fixa
nitrogênio ao nodular uma leguminosa pode incrementar a produção de plantas de
outra família no sistema de rotação, sucessão ou consórcio. Começa-se a pensar em
recomendações de inoculantes para sistemas de produção. O grupo de pesquisa em
rizobiologia da Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
tem identificado capacidades de promoção de crescimento em gramíneas por rizóbios
de diferentes leguminosas. Por exemplo, rizóbios de leguminosas forrageiras como
trevo e cornichão podem incrementar a produção de arroz irrigado em sistemas de
rotação.
Dados os altos custos com adubação nitrogenada e os problemas ambientais,
decorrentes dessa prática, vem aumentando a demanda por outras formas de aportar
nitrogênio em cultivos que demandam grandes quantidades deste nutriente. Neste
sentido, surgem mais pesquisas com Azospirillum em cultivos de gramíneas, como arroz,
milho e trigo no sul do Brasil e, graças aos resultados promissores já há uma
disponibilidade de inoculantes comerciais a base desta bactéria associativa.
O uso combinado de rizóbios com Azospirillum também vem despertando
interesse de pesquisadores, extensionistas e agricultores, principalmente na cultura da
soja. Estudos sobre a prática da inoculação combinada com mais de um tipo de
microrganismo, também conhecida como co-inoculação estão sendo realizados por
diferentes instituições, para aprimorar a técnica e entender os mecanismos envolvidos.
Nos últimos anos, é notável o aumento do interesse dos diferentes setores da
agricultura pelos processos biológicos. A fixação biológica de nitrogênio é um dos
processos mais estudados, graças ao importante papel na sustentabilidade da
agricultura. Com o avanço das técnicas de biologia molecular, cada vez mais, são
descobertas novas espécies e estirpes microbianas com diferentes funções para uso na
agricultura e, o profissional moderno das ciências agrárias precisa estar sempre atento
a estas novidades microbiológicas.

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