ARTIGO DE REVISÃO
DE
Estimativa da idade dos equinos através do exame dentário
Estimation of horse age based on dental features
M. Fraústo da Silva1*, T. Gomes1, A. S. Dias1, J. Aquino Marques2, L. Mendes Jorge1, J. Cavaco Faísca1,
G. Alexandre Pires1, R. M. Caldeira1
Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa.
1
Rua Professor Cid dos Santos, 1300-477 Lisboa
2
Faculdade de Medicina Dentária, Universidade de Lisboa. Cidade Universitária 1649-019 Lisboa
Resumo: Embora a estimativa da idade dos equinos através do
exame dentário tenha actualmente uma aplicabilidade limitada,
continua a ser a melhor forma de conhecer a idade na ausência
de provas documentais. Depois da descrição de aspectos relati-
vos à estrutura, tipos de dentes, fórmula dentária e evolução den-
tária dos equinos, os autores resumem a cronologia dos eventos
observáveis no exame dentário principalmente da arcada inferior
dos equinos, ilustrando-a com imagens de arcadas de animais
em que se estimou a idade tendo em consideração os aspectos
descritos.
Summary: At present, age estimation in horses based on dental
features has a limited practical value. However, in the absence of
documental evidence, it is still the best way to know the age of
an animal. After describing aspects related with structure, teeth
types, dental formulas and dental evolution, the authors resume
the chronology of dental features observed mainly in the lower
dental arcade of horses, illustrating it with images of arcades
of animals which age was estimated according to the description.
Introdução
O conhecimento da idade dos animais é natural-
mente importante para adequarmos o seu acompanha-
mento e perspectivarmos a sua utilização futura. Se
num animal criado para fins exclusivamente produtivos
a idade nos dá uma noção eminentemente económica
do que ainda podemos esperar dele, já num animal de
companhia e/ou lazer a idade é uma indicação precisa
dos cuidados especiais a ter em cada fase da sua vida,
de modo a podermos usufruir dessa relação durante o
maior período de tempo possível. Em termos práticos,
a idade implica uma variação do valor comercial do
animal, assumindo assim uma importância decisiva na
determinação do valor da sua transacção.
Os dentes são os órgãos que melhor registam a pas-
sagem do tempo, constando o seu exame do reconheci-
mento dos tipos de dentes incisivos presentes e do seu
estado de erupção e desgaste (ou usura). O exame dos
* Correspondente: fsmarina@fmv.utl.pt
REVISTA PORTUGUESA
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
dentes continua a ser o método mais utilizado para, de
uma forma expedita e barata, estimar a idade dos equi-
nos. Naturalmente, com a sofisticação crescente das
metodologias de identificação e registo dos animais, a
avaliação da idade através deste método tende a perder
alguma aplicabilidade. No entanto, será sempre uma
forma de recurso na ausência de provas documentais,
ou quando surjam dúvidas relativamente à sua auten-
ticidade.
O exame da dentição não é todavia o único meio de
estimar a idade. O aspecto geral do animal, a sua esta-
tura e conformação, o seu comportamento, a presença
de pêlos brancos nalgumas pelagens, entre outros
aspectos, dão indicações valiosas que devem ser con-
sideradas. A estimativa da idade através da avaliação
do desenvolvimento ósseo por exame radiográfico é
também um método bastante preciso. A sua utilização
é contudo bastante limitada pela tecnologia requerida
e, naturalmente, aplica-se principalmente às primeiras
fases da vida do animal, no caso dos equinos até cerca
dos 6-7 anos.
Estrutura dos dentes
Cada dente é composto por uma parte visível exte-
riormente, a coroa, e por uma parte interna, a raiz
ou raízes. A zona estreita de separação entre a coroa
e a raiz ou raízes é denominada colo do dente. No
interior do dente encontra-se a cavidade pulpar, cuja
forma se assemelha à do dente, e que nas raízes ter-
mina num orifício designado foramen apical ou apex,
por onde passam os vasos e os nervos. Os principais
componentes dentários são o esmalte e a dentina
(componentes mineralizados) e a polpa (componente
não mineralizado). O esmalte forma uma camada fina
sobre a superfície dentária e a dentina encontra-se sob
o esmalte e constitui a maior parte do dente (Figura
1). A polpa encontra-se na cavidade pulpar (Ten Cate,
1998; Ferraris e Muñoz, 2001; Junqueira e Carneiro,
1995)
103
Silva, M.F. et al.
Figura 1 - Microscopia electrónica de varredura. Aspectos ultraestrutu-
rais da dentina com os seus canais
As estruturas responsáveis pela fixação dos dentes
são designadas no seu conjunto como periodonto e
incluem o cemento, o ligamento periodontal e o osso
alveolar. O cemento cobre a raiz dos dentes. Nos
dentes que ainda não sofreram desgaste a extremi-
dade livre termina no bordo oclusal, que constitui o
local de oclusão do dente com o dente antagonista da
outra maxila. Uma vez iniciado o desgaste do dente, é
mais correcto utilizar para aquele local as designações
mesa dentária ou face oclusal. A face do dente voltada
para o vestíbulo (espaço da boca entre os dentes e
os processos alveolares dum lado e os lábios e faces
do outro) é designada face vestibular. Por vezes são
aplicados também os termos face labial e face bucal
à face vestibular, sendo o primeiro utilizado para os
dentes incisivos e caninos, que se opõem aos lábios,
e o segundo para os pré-molares e molares, que se
opõem às faces. A face lingual é a face interna dos
dentes, que contacta com a língua no maxilar inferior,
e que no maxilar superior é também designada face
palatina. As superfícies que contactam com os dentes
vizinhos são designadas face mesial e face distal ou
caudal, correspondendo a primeira à superfície de
contacto virada para o plano médio e a segunda à
superfície oposta. Alguns autores aplicam o termo face
mesial à mesa dentária ou face oclusal dos ungulados
(Ten Cate, 1998; Ferraris e Muñoz, 2001; Getty, 1981;
Junqueira e Carneiro, 1995). O espaço que existe entre
os caninos e os pré-molares presentes numa arcada
designa-se barra ou diastema, sendo particulamente
grande quando os caninos estão ausentes. Nos equinos,
a mesa dentária dos dentes incisivos apresenta uma
cavidade (uma invaginação do esmalte), com mais de
1 cm de profundidade num dente virgem, designada
cavidade dentária externa, infundibulo ou corneto. Esta
cavidade está revestida por uma camada de cemento
que se denomina germe da fava (Caldeira et al., 2002;
Getty, 1981).
Tipos de dentes e fórmula dentária
Os mamíferos domésticos têm uma dentição classi-
ficada como heterodonte, ou seja, apresentam diversos
tipos ou grupos de dentes - incisivos, caninos, pré-
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molares e molares - cada um com características e fun-
ções específicas. Abreviadamente, os dentes incisivos
cortam, os caninos seguram e rasgam, e os pré-molares
e molares esmagam e trituram os alimentos. Os mamí-
feros domésticos são também difiodontes, ou seja,
possuem duas dentições, a 1ª dentição, decídua, tem-
porária ou de leite e a 2ª dentição, permanente ou defi-
nitiva. Na dentição definitiva os dentes incisivos e pré-
molares temporários são substituídos por outros dentes
com os mesmos nomes; os caninos e os molares exis-
tem apenas na dentição definitiva. Os incisivos tempo-
rários distinguem-se dos definitivos pela sua coloração
mais branca, pelo seu menor volume, pelo colo mais
marcado, pela ausência de sulcos na face vestibular ou
labial e pela menor profundidade do corneto.
A fórmula dentária indica o número de dentes de
cada tipo nas maxilas superior e inferior. Os equinos
têm as seguintes fórmulas dentárias:
1ª dentição, dentição decídua, temporária ou de leite
= 24 dentes
2ª dentição, dentição permanente, definitiva ou adulta
= 36 a 44 dentes
Nesta espécie, a dentição definitiva pode diferir
nos machos (40 a 44 dentes) e nas fêmeas (36 a 44
dentes), o que se deve ao facto de nas éguas os caninos
geralmente não existirem. Também, tanto nos machos
como nas fêmeas, os caninos podem ser apenas rudi-
mentares. A variabilidade no número de pré-molares
definitivos deve-se à presença irregular do primeiro
pré-molar vestigial, também conhecido como dente do
lobo. Este dente pode ser encontrado nas duas arcadas,
mas é mais frequente na arcada superior (Figura 2). É
bastante mais pequeno que os outros e as suas raízes
são curtas (Caldeira et al., 2002; Getty, 1981; Henning
e Steckel, 1995; Knottenbelt, 1996-97, Orsini, 1992).
Conforme a sua localização, os dentes incisivos
designam-se, em cada arcada: pinças, os dois mais pró-
ximos do plano médio, médios os dois que se seguem
aos pinças, cantos os dois mais distais, que se seguem
aos médios. Na Figura 3 localizam-se os diferentes
tipos de dentes na arcada inferior.
Evolução dentária
A estimativa da idade dos equinos através do exame
da dentição é realizada essencialmente através da
observação dos dentes incisivos, tendo em conta: (i)
na arcada inferior, a erupção dos dentes temporários
e permanentes, o seu desenvolvimento até ser atingido
o nível da arcada e, posteriormente, as alterações da
superfície oclusal ou mesa dentária devidas ao des-
gaste, no que se refere à cavidade dentária externa e ao
esmalte central, à estrela dentária e à forma da mesa
dentária, (ii) nos cantos superiores a apreciação da for-
Silva, M.F. et al.
Figura 2 - Presença de 1º pré-molar (dente do lobo) superior esquerdo
Figura 3 - Localização dos diferentes tipos de dentes na arcada inferior
(I - incisivos, C - caninos, PM - pré-molares, M - molares, p - pinças, m
- médios, c - cantos)
mação da cauda de andorinha e do sulco de Galvayne,
(iii) o perfil do ângulo de oclusão das duas arcadas.
Os dentes incisivos do cavalo têm a forma de uma
pirâmide, cujo vértice corresponde à raiz do dente,
enquanto a base corresponde à extremidade livre. O
dente é encurvado no sentido antero-posterior e acha-
tado e inclinado em sentido lábio-lingual na região
da base, correspondente à face oclusal. Desta região
para a raiz o achatamento modifica-se gradualmente
para lateral. Assim, da extremidade livre para a raiz,
a secção dos incisivos evolui de uma forma aproxi-
madamente elíptica para oval, redonda, triangular e
finalmente de novo oval (também designada biangular)
quando o achatamento é já nitidamente lateral (Figura
4) (Anónimo, 1988; Caldeira et al., 2002; Knottenbelt,
1996/97).
O desgaste dos dentes é devido a: (i) mecanismos de
abrasão, em que o desgaste resulta da acção de subs-
tâncias abrasivas durante a mastigação, (ii) mecanis-
mos de atrição em que o desgaste resulta da acção das
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Figura 4 - Forma dos dentes incisivos dos equinos e alterações da forma
da mesa dentária à medida que o desgaste progride. Adaptado de Masty e
Vojt (sem data), reprodução autorizada.
peças dentárias entre si, e (iii) mecanismos de erosão
em que o desgaste resulta da acção química de certas
substâncias. Naturalmente, os dois primeiros mecanis-
mos são os mais importantes nos equinos. A erupção e
o desgaste dos dentes incisivos é feita a partir do plano
médio para os extremos. Em cada dente, o desgaste
inicia-se pela região labial do bordo oclusal (por ser
mais alta que a região lingual), e divide o esmalte que
reveste o dente em duas partes: a externa ou periférica
e a interna ou central. À medida que o desgaste pro-
gride, o corneto diminui em largura e em profundidade
até não ser visível qualquer depressão física, sendo
no entanto ainda evidente o esmalte central. Quando
a depressão do corneto desaparece diz-se que o dente
está raso (Figura 5) (Caldeira et al., 2002).
Entretanto, com o desgaste, a cavidade pulpar fica-
ria exposta se não ocorresse a proliferação de den-
tina secundária, também designada marfim de nova
formação, que aparece com a forma de uma mancha
amarela mais escura na mesa dentária, em posição
labial relativamente à cavidade dentária externa, e que
se denomina mancha radicular ou estrela dentária. Ini-
Figura 5 - Aspecto dos dentes incisivos virgens, no início do desgaste
e rasos (a - cavidade dentária externa ou corneto, b - região labial do
bordo oclusal onde se inicia o desgaste do dente, c - esmalte periférico,
d - esmalte central, 1 - canto definitivo virgem, 2 - canto definitivo que
substituirá o canto temporário (3), 3 - canto temporário raso)
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Silva, M.F. et al. RPCV (2003) 98 (547) 103-110

cialmente, a estrela dentária tem a forma de uma linha e uma forma arredondada na mesa dentária dos inci-
transversal, tornando-se posteriormente ligeiramente sivos adultos. No Quadro 4 são referidas as idades
oval e finalmente arredondada. Altera também a sua aproximadas de alteração da forma da mesa dentária
localização, passando a ocupar o centro da mesa den- (Anónimo, 1988; Caldeira et al., 2002; Knottenbelt,
tária. Depois do rasamento, o esmalte central que se 1996/97; Richardson, 1997).
mantém ainda durante algum tempo em posição pos- A oclusão das mesas dentárias dos cantos não é geral-
terior à estrela dentária, acaba finalmente por desapare- mente total, deixando a região posterior das mesas den-
cer, dizendo-se então que o dente está nivelado. Apesar
das alterações visíveis com o desgaste dos dentes
estarem bem definidas, com o avançar da idade o rigor
da estimativa da idade com base na evolução dentária
diminui drasticamente, já que a velocidade de desgaste
dos dentes é influenciada por numerosos factores entre
os quais o genótipo, a alimentação, características indi-
viduais e desvios de comportamento (Caldeira, 2002;
Richardson et al., 1999).
No Quadro 1 indicam-se as idades de erupção dos
incisivos temporários e definitivos, bem como aquelas Figura 6 - Presença da cauda de andorinha no canto superior esquerdo
a que estes dentes atingem o nível da arcada. (Anó-
nimo, 1988; Caldeira et al., 2002; Knottenbelt, 1996/
97; Richardson, 1997).

Quadro 1 - Incisivos temporários e definitivos inferiores, idades

de erupção e em que atingem o nível da arcada
Incisivos Temporários Incisivos Definitivos
Erupção Erupção Atingem o nível
da arcada
Pinças 1ª semana 2,5 anos 3 anos
Médios 4/6 semanas 3,5 anos 4 anos
Cantos 6/9 meses 4,5 anos 5 anos

A substituição dos incisivos designa-se desfecho

(1º, 2º e 3º desfechos, para os pinças, médios e cantos, Figura 7 - Presença do sulco de Galvayne junto ao bordo gengival do
canto superior
respectivamente), dizendo-se quando está completa
e todos os dentes atingiram o nível da arcada que o
animal tem a boca feita (Caldeira et al., 2002)
Embora menos utilizadas, as idades de erupção dos
restantes tipos de dentes poderão também contribuir
para a estimativa da idade de um animal (Quadro 2)
(Anónimo, 1988; Caldeira et al., 2002; Knottenbelt,
1996/97; Richardson, 1997).
No Quadro 3 indicam-se as idades aproximadas
de rasamento, nivelamento, aparecimento da estrela Figura 8 - Alteração do perfil de oclusão das arcadas com o avançar da
dentária e em que esta assume uma posição central idade

Quadro 2 - Idades de erupção dos caninos, pré-molares e molares inferiores

Dentes Temporários Dentes Definitivos
Caninos n.e. > 3,5 anos
1º pré-molar n.e. 6 meses a 3 anos
2º pré-molar Entre o nascimento 2,5 anos
e as
3º pré-molar 2,5 - 3 anos
4 semanas
4º pré-molar 3,5 - 4 anos
1º molar n.e. 1 ano
2º molar n.e. 2 anos
3º molar n.e. 3,5 / 4 anos
n.e. não existem

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Quadro 3 - Incisivos definitivos inferiores - idades de rasamento, nivelamento, aparecimento da estrela dentária e alterações da sua
forma e posição na mesa dentária
Rasamento Aparecimento da Nivelamento Estrela dentária Estrela dentária
estrela dentária central arredondada
Pinças 6/7 anos 7/8 anos 12/15 anos 10/13 anos 10/15 anos
Médios 7/8 anos 8/9 anos 13/15 anos 10/15 anos 11/15 anos
Cantos 8/9 anos 9/10 anos 13/15 anos 10/15 anos 11/15 anos

Quadro 4 - Incisivos definitivos inferiores - idades de alteração da forma da mesa dentária

Mesa dentária redonda Mesa dentária triangular Mesa dentária oval
Pinças 8/12 anos 13/18 anos >18
Médios 9/13 anos 15/19 anos >19
Cantos 11/14 anos 17/20 anos >20

tárias dos cantos superiores sem oposição nos inferiores Aos 1,5 meses de idade
e, logo, sem desgaste. Este facto tem como conse- Os pinças temporários atingiram o nível da arcada
quência o aparecimento de uma proeminência naquela e podem apresentar algum desgaste. Estão também
região, designada cauda de andorinha (Figura 6). A presentes os médios temporários, ainda virgens, e os
cauda de andorinha não aparece geralmente em animais pré-molares temporários.
com menos de 7 anos de idade, mas por si só não é um
indicador fidedigno da idade de um animal (Anónimo,
1988; Knottenbelt, 1996/97; Richardson, 1997).
O sulco de Galvayne (sulco de coloração escura na
face vestibular dos cantos superiores) aparece junto ao
bordo gengival por volta dos 10 anos, prolongando-
se gradualmente até à fase oclusal, que atinge por
volta dos 20 anos de idade (Figura 7). Nos animais
mais velhos inicia-se o seu desaparecimento a partir
do bordo gengival chegando a estar completamente
ausente num animal muito velho (Anónimo, 1988;
Knottenbelt, 1996/97; Richardson, 1997).
Em consequência da forma dos dentes incisivos e do
seu desgaste, a aparência do perfil de oclusão das arca- 2 meses de idade
das altera-se com o avançar da idade, desde quase ver-
tical até mais horizontal (Figura 8) (Anónimo, 1988; Aos 9 meses de idade
Caldeira et al., 2002). Estão presentes todos os incisivos temporários. Os
Resume-se em seguida a cronologia dos eventos pinças e os médios apresentam desgaste, que é mais
observáveis no exame dentário da arcada inferior dos marcado nos primeiros. Os cantos ainda não atingiram
equinos, ilustrada, sempre que possível, com imagens o nível da arcada estando praticamente virgens.
de arcadas de animais em que se tenha estimado a
idade referida. Ao ano de idade
Normalmente a estrela dentária é bem visível nos
pinças e médios temporários. O desgaste dos cantos
Cronologia dos eventos observáveis no
é ainda pouco marcado. Estão presentes os primeiros
exame dentário dos equinos e exemplos molares.

Às 2 semanas de idade
Estão presentes apenas os pinças temporários

1 mês de idade 1,5 anos de idade

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Aos 2 anos de idade

Os pinças temporários estão rasos e os médios e
cantos apresentam um desgaste acentuado; a estrela
dentária é visível em todos os incisivos inferiores.
Estão presentes os primeiros e os segundos molares

Aos 2.5 anos de idade

Dá-se a erupção dos pinças definitivos. Os médios
temporários estão rasos e os cantos curtos e muito
gastos. Estão presentes os segundos pré-molares defi-
nitivos. Estão presentes os primeiros e os segundos
molares.
Próximo dos 4 anos de idade

Aos 4 anos de idade

Os pinças definitivos revelam alguma desgaste mas
os cornetos são ainda profundos. Os médios definitivos
atingem o nível da arcada. Estão presentes todos os
pré-molares e molares.

Aos 4,5 anos de idade

Inicia-se a erupção dos cantos definitivos. Os pinças
e os médios apresentam algum desgaste mas os corne-
tos são ainda profundos.

Aos 5 anos de idade

Estão presentes e atingiram o nível da arcada todos
os incisivos adultos. O animal tem a boca feita. Os
pinças e os médios apresentam algum desgaste; nos
cantos o desgaste é apenas visível na região labial do
Próximo dos 3 anos de idade
bordo oclusal

Aos 3 anos de idade

Os pinças definitivos estão ao nível da arcada. Estão
presentes os primeiros (caso existam), segundos e
terceiros pré-molares definitivos. Estão presentes os
primeiros e os segundos molares.

Aos 3,5 anos de idade

Dá-se a erupção dos médios definitivos. Os pinças
definitivos presentam algum desgaste e os cantos tem-
porários estão rasos. A partir desta idade pode iniciar-
se a erupção dos caninos (caso existam). Estão presen-
tes os primeiros (caso existam), segundos e terceiros
pré-molares definitivos. Estão presentes os primeiros e
os segundos molares.

5 anos de idade

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Silva, M.F. et al.
Aos 6 anos de idade
Os pinças poderão começar a apresentar-se rasos
Nos restantes incisivos o corneto é ainda bastante
evidente, sendo apenas os sinais de desgaste mais mar-
cados do que aos cinco anos. Os cantos apresentam já
desgaste na região lingual.
6 anos de idade
Aos 7 anos de idade
Normalmente os pinças estão rasos e o esmalte cen-
tral aproxima-se do bordo lingual, podendo também os
médios começar a rasar. A estrela dentária pode apa-
recer nos pinças com a forma de uma linha tranversal
em posição labial relativamente ao esmalte central.
Poderá estar presente nos cantos superiores a cauda de
andorinha.
Cerca de 7 anos de idade
Aos 8 anos de idade
Os pinças e os médios estão rasos, podendo também
os cantos começar a rasar. A estrela dentária é evidente
nos pinças e pode aparecer também nos médios. A
mesa dentária dos pinças começa a tomar uma forma
arredondada.
Cerca de 8 anos de idade
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Aos 9 anos de idade
Normalmente todos os os incisivos inferiores estão
rasos. O esmalte central dos pinças começa a assumir
uma forma triangular. A estrela dentária é evidente
nos pinças e nos médios e pode aparecer também nos
cantos. A mesa dentária dos pinças pode estar redonda
e a dos médios começa a tomar esta forma.
Cerca de 9 anos de idade
Aos 10 anos de idade
A mesa dentária dos pinças e dos médios pode já
estar redonda. O esmalte central dos pinças aproxima-
se do bordo lingual. A estrela dentária assume uma
posição mais próxima do centro da mesa dentária,
tendo uma forma cada vez mais arredondada.
Cerca de 10 anos de idade
Aos 11 anos de idade
Todos os incisivos podem apresentar uma mesa den-
tária redonda. O esmalte central aproxima-se do bordo
lingual em todos os incisivos. A estrela dentária pode
ocupar já uma posição central em todos os incisivos, e
pode assumir uma forma arredondada.
Cerca de 11 anos de idade
Aos 12 anos de idade
Todos os incisivos podem apresentar uma mesa
dentária redonda. Os pinças podem estar nivelados e
a estrela dentária resumir-se a uma pequena mancha
amarela no centro da mesa dentária.
109
Silva, M.F. et al.
Cerca de 12 anos de idade
Aos 13 anos de idade
A mesa dentária dos pinças pode começar a assu-
mir uma forma triangular. Todos os incisivos podem
estar nivelados e a estrela dentária resumir-se a uma
pequena mancha amarela no centro da mesa dentária.
Cerca de 13 anos de idade
Aos 15 anos de idade
A mesa dentária dos pinças e dos médios pode
ter uma forma triangular. Todos os incisivos estão
nivelados. Os acidentes da mesa dentária resumem-
se à estrela dentária que aparece como uma pequena
mancha amarela em posição central.
14 a 16 anos de idade
Aos 18 anos de idade
A mesa dentária pode ter uma forma triangular em
todos os incisivos. Os acidentes da mesa dentária
resumem-se à estrela dentária que aparece como uma
pequena mancha amarela em posição central.
18 a 20 anos de idade
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Aos 22 anos de idade
A mesa dentária pode ter uma forma oval em todos
os incisivos, que parecem estar comprimidos transver-
salmente. Os acidentes da mesa dentária resumem-se
à estrela dentária que aparece como uma pequena
mancha amarela em posição central.
Mais de 20 anos de idade
Agradecimentos
Os autores agradecem à Escola de Equitação da
Sociedade Hípica Portuguesa, à Coudelaria Nacional
e ao Picadeiro d-El Rey pela disponibilização dos ani-
mais cujas fotografias ilustram este trabalho.
Bibliografia
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RPCV (2003) 98 (547) 111-118
Neoplasias em canídeos - Um estudo descritivo de 6 anos
Dog’s neoplasia - A six years descriptive study
Maria dos Anjos Pires*, Fernanda Seixas Travassos e Isabel Pires
Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica; Departamento de Patologia e Clínicas Veterinárias. CECAV - UTAD. 5000-911 Vila Real. Portugal.
Resumo: Os autores apresentam um estudo da distribuição de
lesões neoplásicas em canídeos, por sexo, idade e aparelhos
afectados, baseado no material recebido durante 6 anos (entre
1996 e 2001) no Laboratório de Histologia e Anatomia Pato-
lógica da UTAD. Num universo de 3922 análises efectuadas
em canídeos, 1790 (45,6%) foram referentes a lesões do foro
neoplásico, das quais 36,3% (n=649) eram lesões neoplásicas
da glândula mamária, 29,9 % (n=535) eram neoplasias mesen-
quimatosas da pele e tecidos moles, 17,4% (n=312) neoplasias
epiteliais e melanocíticas da pele, 8,7% (n=155) neoplasias do
aparelho genital e urinário, 3,9% (n=70) lesões neoplásicas do
sistema hematopoiético, 1,7% (n=31) neoplasias do osso e arti-
culações e 2,1% (n=38) corresponderam a outras neoplasias. As
neoplasias observadas predominaram em fêmeas (61%). Os ani-
mais de raça indeterminada foram aqueles que, dentro da nossa
amostra, registaram mais tumores (25,86%). Nos animais com
idade igual ou inferior a 2 anos predominaram os histiocitomas;
nos de idade compreendida entre os 3 e os 8 anos predominaram
os tumores da glândula mamária (32,8%) assim como nos ani-
mais com idade igual ou superior a 9 anos (41,7%). O grupo de
animais com 11 anos foi aquele que apresentou maior número de
tumores (que registámos desde a idade inferior a um ano, até aos
17 anos).
Summary: The authors present a study of dog’s neoplasic
lesions distribution by means of sex, age and affected systems.
The material was received in the laboratory of Histology and
Surgical Pathology of the University of Trás-os-Montes e Alto
Douro. Out of a total of 3922 cases received, 1790 (45.6%) were
neoplasic lesions. From these, 36.3% (n=649) were mammary
gland tumors, 29.9 % (n=535) mesenchymal skin and soft tis-
sues tumors, 17.4% (n=312) epithelial and melanocytic tumors
of the skin, 8.7% (n=155) tumors of the urogenital system,
3.9% (n=70) hematopoietic tumors, 1.7% (n=31) bone and joint
tumors, and finally, 2.1% (n=38) were classified as other neo-
plasias. The neoplasia was most predominant in females (61%).
Besides that, the tumors were more recurrent in mongrel dogs
(25.86%). The histiocitomas were the leading lesion in young
animals (ages until 2 years). Between 3 and 8 years old, the
mammary gland tumor was the most frequent (32.8%); this same
situation was prevalent in the oldest animals (age higher than
9 years) with a percentage of 41.7%. Finally, is worth to point
out that the animal’s collection with 11 years old was the group
that presented the highest number of tumors (these animals were
closely fallowed and registered between the ages under one until
17 years).
* Correspondente: apires@utad.pt,
telefone 259350637, fax 259350480
REVISTA PORTUGUESA
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Introdução
A Anatomia Patológica desempenha um papel funda-
mental na pesquisa de características histológicas que,
associadas às informações provenientes de um exame
clínico sistemático, poderão fornecer dados essenciais
para o estadiamento das neoplasias, o estabelecimento
do prognóstico e da terapêutica. Estas características,
quer histológicas (a morfologia, o grau nuclear, o
padrão e taxa de crescimento tumoral, a invasão de teci-
dos, o grau histológico e a metastização), quer imuno-
citoquímicas (como os índices de proliferação celular,
receptores hormonais, densidade de microvasculariza-
ção, etc.) e os estudos de ploidia de ADN, permitem
prever o comportamento biológico das neoplasias,
constituindo importantes factores de prognóstico, e uma
fonte de informação para o clínico que pretenda instituir
uma terapêutica ao animal.
Em Portugal existem dados estatísticos de tumores
em animais domésticos em artigos publicados no Repo-
sitório de Trabalhos do LNIV e nos Anais da Faculdade
de Medicina Veterinária, relativos ao período compre-
endido entre 1947 (trabalho do Prof. Nunes Petisca
cit. por Silva, 1989) até 1988 (Durão e Santos, 1975;
Santos, 1976; Monteiro e Clemente, 1978; Baptista
e Silva, 1985; Gomes, 1987; Nunes, 1988/89; Silva,
1989), relativos aos tumores recebidos pelo LNIV de
Lisboa, Porto e Algarve e pela Secção de Anatomia
Patológica da Escola Superior de Medicina Veteriná-
ria de Lisboa. Não temos conhecimento de trabalhos
semelhantes que abranjam o intervalo compreendido
entre 1987 até hoje. Assim, neste trabalho realizámos o
estudo da casuística das neoplasias em canídeos recebi-
das no Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica
(LHAP) da UTAD durante 6 anos (com maior domínio
no Norte de Portugal), com o objectivo de enriquecer os
conhecimentos nesta área, e sensibilizar a comunidade
para um problema que se julga recente, mas que apenas
tem sido pouco estudado.
Materiais e métodos
As informações presentes neste trabalho referem-se
111
Pires, M.A. et al. RPCV (2003) 98 (547) 111-118

a 3922 análises de canídeos recebidas no Laboratório

de Histologia e Anatomia Patológica da UTAD no perí-
odo compreendido entre 1 de Janeiro de 1996 e 31 de
Dezembro de 2001. As amostras recebidas provieram
de Portugal Continental e Ilhas, com predominância
para o Hospital Universitário da UTAD e para a zona
Norte do país. As amostras eram acompanhadas por
uma ficha que incluía a identificação do animal, dados
e suspeita clínica, ainda que raras vezes estes parâme-
tros fossem devidamente preenchidos.
Este material biológico foi recebido sob a forma de
cadáveres, biópsias e exéreses cirúrgicas. O material
Gráfico 1 – Distribuição dos animais em função do sexo
foi fixado em formol a 10%, processado num micro-
processador automático de tecidos modelo Hyper-
center XP® Histoplast® da Shandon® e incluído
em parafina. Foram efectuados cortes em parafina a
2-3µm que foram corados com Hematoxilina-Eosina
(H-E). Sempre que necessário recorreu-se a técnicas de
histoquímica (P.A.S., Reticulina, Azul da Prússia, Azul
Alcião, Van Gieson, etc.), ou de imunohistoquímica
(marcação com anticorpos específicos por exemplo
anti-citoqueratinas, anti-vimentina, anti-desmina, anti-
α actina do musculo liso, anti-proteína S-100, entre
outros), para melhor caracterizar as neoplasias em
estudo.
As neoplasias foram avaliadas com base na classi-
ficação Histológica da OMS em vigor (classificação Gráfico 2 – Distribuição dos animais por raça
Histológica dos Tumores Animais publicado pela
Armed Forces Institute of Pathology – AFIP e pela A distribuição etária dos animais está representada
WHO – Slayter et al., 1994; Hendrick et al., 1998; no Gráfico 3.
Goldschmidt et al., 1998; Kennedy et al., 1998; Koes- A maioria da população da amostra tinha até 10
tner et al., 1999; Dungworth et al., 1999; Misdorp et anos. Observou-se um decréscimo no número de ani-
al., 1999; Valli et al., 2002). mais com idades superior a 11 anos e não se observou
A população foi dividida em três escalões etários: qualquer animal com idade superior a 17 anos. No
os animais jovens (os que apresentavam idades iguais gráfico 3, a idade referida como igual ou inferior a
ou inferiores aos 2 anos de idade); os animais adultos 1 abrange os animais com idades entre os zero e 12
- aqueles que, com idades compreendidas entre os 3 meses.
e os 8 anos, se encontravam na plenitude da idade;
e animais geriátricos os que tinham idade igual ou
superior a 9 anos. Estas idades adaptadas de trabalhos
desenvolvidos por outros autores (Mialot e Lagadic,
1990), tinham já sido definidas em trabalhos prévios
não publicados.

Resultados

Amostra

O nosso estudo teve como amostra 3922 canídeos,

constituída por 1749 machos e 1980 fêmeas. Não foi
especificado o sexo em 193 casos (Gráfico 1) excluídos Gráfico 3 – Distribuição dos animais por idade
dos dados totais.
No que respeita à raça, os animais de raça indetermi-
nada predominaram nesta amostra (n=1024) sobre as Frequência tumoral relativa
outras raças; seguiram-se-lhe os animais de raça Boxer
(n=355), raça Caniche e raça Cocker (n=345 e n=243). 1 - Distribuição por aparelhos e sistemas
No Gráfico 2 podemos observar a distribuição por raça As lesões neoplásicas corresponderam a 45,6%
da amostra. (n=1790) das análises que foram avaliadas. No grá-

112
Pires, M.A. et al.
Gráfico 4 – Distribuição das neoplasias por sistemas
fico 4, podemos observar a distribuição das neoplasias
por sistemas, de acordo com a actual classificação da
OMS.
Na nossa amostra predominaram as neoplasias da
glândula mamária (36,3%, n= 649), seguidas pelas
neoplasias mesenquimatosas da pele e tecidos moles
(29,9%, n=535) e das epiteliais e melanocíticas da pele
(17,4%, n=312). O aparelho genital foi sede de 8,1%
(n=145) das lesões observadas e o sistema hematopoi-
ético 3,9% (n=70). Com menor expressão observámos
neoplasias ósseas e das articulações (em 1,7% dos
casos, n=31), do sistema nervoso (0,8%, n=15), do
aparelho digestivo (0,7%, n=13), do aparelho urinário
(0,6%, n=10), de glândulas endócrinas (0,4%, n=8) e
do aparelho respiratório (0,1%, n=2).
Tabela 1 – Distribuição tumoral
Neoplasia Nº (%)
Neoplasia da glândula mamária 649 (36,3%)
Neoplasias mesenquimatosas da pele
535 (29,9%)
e dos tecidos moles
Neoplasias epiteliais e melanocíticas da pele 312 (17,4%)
Neoplasias do trato genital 145 (8,1%)
Neoplasia sistema hematopoiético 70 (3,9%)
Neoplasias do osso e articulações 31 (1,7%)
Neoplasias do sistema nervoso 15 (0,8%)
Neoplasias do aparelho digestivo 13 (0,7%)
Neoplasias do aparelho urinário 10 (0,6%)
Neoplasias das glândulas endócrinas 8 (0,4%)
Neoplasias do aparelho respiratório 2 (0,1%)
Total 1790
1.1 – Glândula mamária
As neoplasias da glândula mamária foram as mais
observadas nos canídeos e, em 72,6% (n=471) apre-
sentaram características malignas. Apenas em 27,4%
(n=178) dos casos foram diagnosticadas neoplasias
com comportamento benigno. As neoplasias mamárias
RPCV (2003) 98 (547) 111-118
incidiram quase exclusivamente sobre fêmeas, tendo
sido diagnosticadas apenas em 3 machos, e nestes
sempre com comportamento maligno.
1.2 – Neoplasias mesenquimatosas da pele e dos
tecidos moles
As neoplasias mesenquimatosas representaram
29,9% (n=535) das neoplasias diagnosticadas em caní-
deos no LHAP, as segundas mais frequentes logo após
as da glândula mamária. Dentro deste grupo, os his-
tiocitomas foram os tumores mais comuns, com uma
frequência de 29,4% (n=157), seguidos das neoplasias
do tecido conjuntivo (27,3%, n=146) onde englobámos
os tumores com origem fibroblástica e adiposa e, dos
mastocitomas presentes em 24,1% (n=129) dos casos
observados. Com menor frequência foram diagnostica-
dos tumores vasculares que constituíram 7,5% (n=40)
das lesões observadas, os hemangiopericitomas repre-
sentados em 5,1% (n=27) e as neoplasias musculares
3,9% (n=21). As neoplasias dos nervos periféricos
surgiram em 2,6% (n=14) dos casos apresentados, e
foram constituídos maioritariamente por schwanomas
(12 schwanomas e 2 paragangliomas).
Tabela 2 – Tumores mesenquimatosos da pele e dos tecidos
moles
Neoplasia Nº (%)
Histiocitoma 157 (29,4%)
Neoplasias conjuntivas 146 (27,3%)
Mastocitoma 129 (24,1%)
Neoplasias vasculares 40 (7,5%)
Hemangiopericitoma 27 (5,1%)
Neoplasias musculares 21 (3,9%)
Neoplasia do nervo periférico 14 (2,6%)
Neoplasias do mesotélio 1 (0,1%)
Total 535 (100%)
1.3 – Lesões epiteliais e melanocíticas da pele
Este constituiu o terceiro grupo de tumores mais
frequentes nos canídeos (n=312) abrangidos no estudo.
Dentro desta categoria, os tumores das glândulas hepa-
tóides foram os mais frequentes (29,8%, n=93), segui-
dos pelos carcinomas de células escamosas (CCE) com
17,3% (n=54), as lesões do folículo piloso (13,8%,
n=43), os papilomas (12,8%, n=40), os tumores melâ-
nicos (10,9%, n=34), as neoplasias das glândulas sebá-
ceas (7,1%, n=22), e por fim com menor casuística, as
neoplasias das outras glândulas da pele (n=12) (Tabela
3). As neoplasias do folículo piloso englobaram todas
as lesões não inflamatórias. Embora a classificação na
113
Pires, M.A. et al. RPCV (2003) 98 (547) 111-118

qual nos baseámos englobe os quistos como parte inte-
grante da classificação de neoplasias, estes não foram
considerados para a apreciação deste nosso estudo.
Tabela 3 – Tumores epiteliais e melanocíticos da pele
ram 3,9% da totalidade das neoplasias diagnosticadas
nestes animais (n=70). Observámos principalmente
linfomas nas suas diferentes variedades (64 casos), 3
plasmocitomas e três leucemias.

Neoplasia Nº (%) 1.6 – Osso e Articulações

Este grupo de neoplasias constituiu 3,7% (n=31) do
Neoplasia da glândula hepatóide 93 (29,8%) total destas lesões identificadas no LHAP para esta
Carcinoma de célula escamosa 54 (17,3%) espécie animal. Predominaram os tumores ósseos
(n=21) sobre os de origem na cartilagem ou nas arti-
Neoplasia do folículo piloso 43 (13,8%)
culações.
Papiloma 40 (12,8%)

Melânica 34 (10,9%) 1.7 – Aparelho Digestivo e Glândulas Anexas

Neoplasia da glândula sebácea
Neoplasia da glândula de Meibomio
Neoplasia da glândula apócrina
Neoplasia da glândula ceruminosa
Total
Representam um pequeno grupo de neoplasias
22 (7,1%) (0,7%, n=13), com predomínio para as lesões do intes-
14 (4,5%) tino (61,5%, n=8). O fígado esteve representado em
30,8% dos casos de neoplasias deste sistema (n=4) e
10 (3,2%)
o estômago em 1 caso (7,7%). As neoplasias melâni-
2 (0,6%) cas com sede na cavidade oral foram englobados nos
tumores melânicos.
312 (100%)

1.8 – Sistema Nervoso

1.4 – Neoplasias dos aparelhos genital e urinário
Neste grupo de neoplasias não estão incluídos os
Este grupo de neoplasias correspondeu a 8,7%
tumores dos nervos periféricos, que estão classificados
(n=155) da totalidade dos tumores em canídeos, em
juntamente com os tumores mesenquimatosos da pele
que o aparelho urinário apenas esteve representado em
e tecidos moles. Representou 0,8% (n=15) das neo-
0,6% dos casos.
plasias estudadas, com origem em vários tecidos do
Dadas as características do aparelho genital, fez-se
Sistema Nervoso Central.
um estudo diferenciado para machos e para fêmeas.
No macho, foram dominantes os tumores do testí-
1.9 – Glândulas Endócrinas
culo (68,4%). As neoplasias do pénis e prepúcio foram
Neste grupo incluímos neoplasias da glândula tiróide
exclusivamente tumores venéreos transmissíveis (TVT)
(n=3), adrenal (n=2) e pâncreas exócrino (n=3). Repre-
com 20,3% de frequência. Os tumores da próstata
sentaram 0,4% (n=8) das neoplasias que afectaram os
representaram 11,4% das lesões analisadas.
canídeos estudados.
Nas fêmeas, a vagina revelou-se como estrutura ana-
tómica mais afectada, manifestando neoplasias na sua
1.10 – Aparelho Respiratório
maior parte benignas (essencialmente fibroleiomio-
Foi o sistema menos afectado, apresentando 2 neo-
mas) representando 60% das lesões. Ainda na vagina
plasias do pulmão; representou apenas 0,1% dos tumo-
os TVT foram diagnosticados em 24,7% dos casos. O
res estudados.
ovário apresentou neoplasias em 13,8% das observa-
ções e o útero em 1,5% dos casos (Tabela 4).
2 – Distribuição das neoplasias em função da idade
Tabela 4 – Tumores dos aparelhos genital e urinário A omissão dos dados em 33,6% dos casos levou a
que este parâmetro apenas pudesse vir a ser apreciado
Sexo Neoplasia Nº (%)
em 66,4% dos casos que diagnosticámos.
Neoplasias do testículo 54 (68,4%) Alguns tumores predominaram nos animais jovens
Neoplasias do pénis e prepúcio 16 (20.3%) (com idade igual ou inferior a 2 anos), como foi o caso
Macho
Neoplasias da próstata 9 (11,4%) dos histiocitomas (56,6% das neoplasias observadas
Total 79 (100%)
em animais desta idade). Observaram-se ainda neste
grupo predomínio de papilomas (9,4%), mastocitomas
TVT 16 (24,7%)
Neoplasias da vagina (5,7%), linfomas e TVT (ambos com 6,3%). Todos os
Outros 39 (60%) outros tumores que surgiram neste grupo etário tive-
Fêmea Neoplasias do útero 1 (1,5%) ram representatividade inferior a 3,1% (Tabela 5). Não
observámos qualquer neoplasia de origem embrionária.
Neoplasias do ovário 9 (13,8%)
Entre os 3 e os 8 anos predominaram os tumores da
Total 65 (100%) glândula mamária (32,8% dos tumores nesta idade),
seguidos pelos mastocitomas (12,4%), pelos tumores
1.5 – Sistema Hematopoiético conjuntivos (8,1%), linfomas e neoplasias do folículo
As neoplasias do sistema hematopoiético constituí- piloso ambos com 6%, os CCE (4,1%), os histiocito-

114
Pires, M.A. et al. RPCV (2003) 98 (547) 111-118

Tabela 5 – Distribuição etária das neoplasias deste grupo). Seguiram-se as neoplasias das glândulas
≥9 hepatóides (7,9%), neoplasias do tecido conjuntivo
Neoplasia ≤ 2 anos 3 a 8 anos anos Total (6,6), do testículo (6,4%), do folículo piloso (4%) CCE
Neoplasias da (3,7%) e neoplasias das glândulas sebáceas com 3,1%.
glândula mamária 1 153 228 382 Todos os outros tumores tiveram uma representativi-
Histiocitomas 90 18 4 112 dade inferior a 3% (Tabela 5).
Mastocitomas 9 58 30 97
3 – Influência do sexo
Papilomas 15 12 1 28 Por falta de informação sobre este parâmetro, não
Neoplasias das podemos processar informação em 1,9% dos casos.
glândulas hepatóides 1 11 43 55 As neoplasias observadas predominaram nas fêmeas
Tumor venéreo (61%), provavelmente devido à elevada frequência
transmissível 10 13 3 26 das lesões da glândula mamária. Além das lesões neste
Hemangiopericitoma 0 6 16 22 órgão, não nos foi possível observar predisposição
Neoplasias do sexual relativamente à ocorrência de outras neoplasias.
testículo 3 7 35 45
Neoplasia do ovário 1 2 3 6 4 – Distribuição das neoplasias por raça
Não tivemos informação acerca deste parâmetro em
Neoplasias do tecido
conjuntivo 5 38 36 79 12,16% dos casos. Nos restantes, a raça indeterminada
foi aquela que predominou na amostra, sendo também
Neoplasias vasculares 2 15 13 30
aquela que apresentou maior casuística de neoplasias
Linfomas 10 28 14 52 (25,86%) (Gráfico 5).
Carcinoma de células Relativamente à distribuição das neoplasias por
escamosas 3 19 20 42 raças puras, os animais de raça Caniche foram aqueles
Neoplasias melânicas 1 10 14 25 em que o maior número de tumores foi diagnosticado
Neoplasias das (13,47%), seguida dos de raça Boxer (10,56%), Cocker
glândulas apócrinas 3 4 2 9 (8,5%), Pastor Alemão (4,39%), Dobermann (2,34%)
Neoplasias da e Perdigueiro Português (2%). Todas as outras raças
próstata 0 2 7 9 estiveram representadas em menos de 2% dos tumores
Neoplasias do
estudados no nosso Laboratório.
folículo piloso 3 28 22 53
Neoplasias do
músculo 1 9 11 21
Neoplasias do nervo
periférico 0 2 7 9
Neoplasias das
glândulas sebáceas 0 5 17 22
Neoplasias da
glândula de
Meibomio 0 7 4 11
Neoplasias do útero 0 0 3 3
Neoplasias da vulva
e vagina 0 3 7 10
Neoplasias do Gráfico 5 – Distribuição das neoplasias por raça
sistema nervoso 0 6 0 6
Neoplasias do osso e Discussão
articulações 1 11 7 19
Total 159 480 550 1189 Os estudos de prevalência tumoral no nosso país,
referem-se a períodos pouco recentes (Durão e Santos,
Nota: o total das neoplasias apresentadas nesta tabela não é sobreponível 1975; Santos, 1976; Monteiro e Clemente, 1978; Bap-
aos os valores apresentados nas tabelas anteriores, porque só estão regis-
tados os casos em que a idade foi referida. tista e Silva, 1985; Gomes, 1987; Nunes, 1988/89;
Silva, 1989), pelo que as autoras se propuseram a ela-
mas (3,9%) e os tumores vasculares (3,2%). Todos os borar um estudo retrospectivo das neoplasias em caní-
outros tumores tiveram uma representatividade inferior deos recebidas durante 6 anos no Laboratório de His-
a 3 % (Tabela 5). tologia e Anatomia Patológica da UTAD. Neste estudo
Os animais geriátricos (com idade igual ou superior foi realizada a distribuição dos tumores por raça, sexo,
a 9 anos), continuaram a apresentar predominância de idade e sistemas.
neoplasias da glândula mamária (41,7% das neoplasias Pela situação geográfica do nosso laboratório, a

115
Pires, M.A. et al.
maior parte das análises que recebemos para exame
histopatológico são provenientes do Norte de Portugal,
ao contrário das referidas nos trabalhos por nós con-
sultados e acima referidos. Pela quantidade e variedade
de tumores que nestes 6 anos foram enviados ao nosso
laboratório, consideramos ser este trabalho importante
para a actualização da realidade das neoplasias em
canídeos no nosso país.
A raça Caniche foi a raça pura que apresentou maior
número de neoplasias diagnosticadas (13,47%; n=236),
na nossa amostra, predominada pelos animais de raça
indeterminada.
A única lesão neoplásica para a qual observámos
predisposição sexual foi a da glândula mamária, para
as fêmeas, facto já referido por Mialot e Lagadic, em
1990.
Nos animais domésticos, a prevalência de neoplasias
aumenta com a idade, existindo, contudo um ligeiro
decréscimo em idades extremas. Com poucas excep-
ções, esta relação entre a idade e as neoplasias aplica-
se à maioria dos tipos neoplásicos e respectivos locais
de ocorrência (Dorn e Priester, 1987; Misdorp, 1990).
No estudo da distribuição das lesões neoplásicas por
idade observámos um pico de neoplasias aos 11 anos
de idade. Estes dados são semelhantes aos observados
por Mialot e Lagadic (1990), que registaram o pico
de incidência das neoplasias aos 10 anos. Por ter sido
omitido este parâmetro em 33,6% das análises por nós
observadas, a distribuição por idade poderá não corres-
ponder inteiramente à realidade.
Nos animais jovens (com idade igual ou inferior a 2
anos), observámos uma predominância do diagnóstico
de histiocitomas e de papilomas, o que está de acordo
com o referido por Estrada (1993).
No grupo dos animais abrangidos pelo estudo, a
frequência dos tumores da glândula mamária, das
glândulas hepatóides, do testículo, do ovário, do tecido
conjuntivo, dos tumores melânicos e dos carcinomas
de células escamosas aumentou com a idade, predomi-
nando no grupo de animais geriátricos.
Após os tumores da glândula mamária, os mastoci-
tomas foram as neoplasias com maior frequência nos
animais adultos, com uma idade média de 8 anos,
como o observado por Lemarié et al. (1995), por
Pulley e Stannard (1990) e por Gorman e Dobson
(1995).
Os hemangiopericitomas, os tumores do útero e da
próstata só foram observados em animais adultos.
Nielsen e Kennedy (1990) referem que os TVT são
neoplasias mais comuns nos animais sexualmente
activos e Rogers (1997) observou uma maior incidên-
cia desta lesão entre os 4 e 5 anos. No nosso estudo,
este tipo tumoral foi mais frequente em animais com
idade igual ou inferior a 2 anos e no grupo de animais
adultos (entre 3 e 8 anos com 3,1%), podendo esta dis-
tribuição não estar apenas de acordo com a actividade
sexual dos animais, mas também ser o reflexo de uma
detecção precoce e do tipo de tratamento actualmente
116
RPCV (2003) 98 (547) 111-118
preconizado. Os TVT são tumores de características
enzoóticas em diversas zonas do mundo, principal-
mente tropicais, subtropicais e nos países mediter-
rânicos. A quimioterapia e a radioterapia são muito
eficientes na sua resolução, e estas lesões podem
mesmo regredir espontaneamente (Brealey, 1995). Por
isso esta neoplasia raramente é enviada para estudos
de anatomia patológica, podendo por isso a baixa fre-
quência por nós observada não se reflectir na realidade
clínica.
O estudo das neoplasias por aparelhos e sistemas
baseou-se na actual classificação histológica da OMS
(Slayter et al.,1994; Hendrick et al., 1998; Golds-
chmidt et al., 1998; Kennedy et al., 1998; Koestner
et al., 1999; Dungworth et al., 1999; Misdorp et al.,
1999; Valli et al., 2002). A nossa amostra apresentou
um predomínio das neoplasias da glândula mamária
seguidas pelas lesões da pele (quer tumores epiteliais e
melanocíticos quer tumores mesenquimatosos da pele
e tecidos moles), dados semelhantes aos registados por
Mialot e Lagadic no seu trabalho de 1990.
De todas as neoplasias observadas no cão, os his-
tiocitomas (com 8,8%) foram as neoplasias mais fre-
quentes, logo após as da glândula mamária, tendo sido
observados sobretudo em animais com idade inferior a
dois anos; foram as lesões mais frequentes no grupo
das neoplasias mesenquimatosas da pele e tecidos
moles, assim como de todas as neoplasias cutâneas
(18,5%). Estes valores foram superiores aos observa-
dos por Gorman e Dobson (1995), que referem ser os
histiocitomas 10% de todos os tumores cutâneos do
cão.
Os tumores com origem no tecido conjuntivo foram
os terceiros mais frequentes no nosso estudo (8,2%),
seguidos pelos mastocitomas, que representam 7,2%
de todas as neoplasias observadas e 15,2% das neo-
plasias da pele. Estes dados são mais elevados que
os registados por Walder (citado por Walder e Gross,
1992), mas estão de acordo com os valores referidos
por Lemarié et al.(1995). Estas divergências poderão
ser reflexo da população de referência em cada um dos
estudos, da situação geográfica ou de factores induto-
res da neoplasia em causa.
As lesões das glândulas hepatóides foram o 5º tipo
de neoplasia mais frequente (5,2%), mas dentro do seu
grupo histológico (as neoplasias epiteliais e melano-
cíticas da pele), foram o tipo tumoral predominante.
Neste grupo de neoplasias, o CCE é a segunda neopla-
sia mais frequente, e a 7ª (3%) de todas as observadas
no cão. Estas observações em relação a estes dois tipos
neoplásicos estão de acordo com o referido por Godsh-
midt et al. (1999). Os estudos de Gorman e Dobson
(1995) referem os CCE como o tumor maligno mais
comum da pele dos cães, representando entre 4 e 8 %
de todos os tumores cutâneos destes animais, dados
mais elevados que os apresentados por nós.
Neste estudo, os linfomas foram o 6º tipo de neo-
plasia mais observada (3,9%), e o mais frequente do
Pires, M.A. et al.
sistema hematopoiético, o que também foi referido por
Moulton e Harvey (1990).
Os papilomas representaram 4,7% de todas as neo-
plasias cutâneas (embora represente 12,8% das neo-
plasias epiteliais e melanocíticas da pele), dados dis-
cordantes dos observados por Walder e Gross (1992)
e por Pulley e Stannard (1990), que se referem a esta
patologia como sendo uma neoplasia pouco frequente,
representando apenas 1 a 2,5 % das neoplasias cutâ-
neas. A maioria dos papilomas observados eram lesões
compatíveis com etiologia vírica. Este dado, em con-
junto com a elevada frequência desta lesão em relação
aos autores por nós consultados, alerta-nos para o facto
de podermos estar perante uma situação de transmissão
e propagação do vírus em causa, no nosso país.
As neoplasias dos aparelhos genital e urinário cor-
responderam a 9% do total dos tumores observados
nos canídeos, havendo natural diferença nos orgãos
afectados em função do sexo. Nos machos o predo-
mínio das lesões ocorreu no testículo e nas fêmeas na
genitália externa, afectada principalmente por TVT,
tal como foi referido por Phillips (1999), os restantes
orgãos deste sistema registaram poucas lesões. O rim
foi o orgão menos afectado.
Como já foi mencionado previamente, a glândula
mamária foi o orgão que registou maior número de
neoplasias (36,3%), o que está de acordo com o refe-
rido na bibliografia por nós consultada (Jones et al.,
1997; Misdorp et al., 1999). Observámos uma clara
predominância destas lesões em fêmeas relativamente
aos machos, sendo os tumores mamários no macho de
grande agressividade.
As neoplasias do osso e articulações apenas repre-
sentaram 1,7% da nossa amostra. O sistema nervoso
esteve representado em 0,8% das neoplasias obser-
vadas, o sistema digestivo em 0,7%, as glândulas
endócrinas em 0,4% e o sistema respiratório em 0,1%.
Todos estes valores são muito inferiores aos referen-
ciados por White (1995), McGlennon (1995) e Nelson
e Feldman (1995).
Em comparação com estudos efectuados por outros
autores, podemos concluir que a distribuição de lesões
neoplásicas espontâneas nos canídeos domésticos nem
sempre é igual àquelas observadas noutros países, o
que torna importante o seu estudo e comparação.
A frequência das neoplasias aumenta com a idade
sendo mais frequente nas fêmeas que nos machos, em
consequência da elevada frequência das neoplasias da
glândula mamária. O pico etário com maior frequência
de neoplasias para os canídeos registou-se aos 11 anos.
Observámos neoplasias características dos animais
jovens (como os histiocitomas e os papilomas), e
outras cuja frequência aumenta com a idade dos ani-
mais.
Não encontrámos qualquer predisposição racial
relevante e a distribuição das neoplasias relativa a este
parâmetro é sobreponível com a distribuição da popu-
lação de referência.
RPCV (2003) 98 (547) 111-118
Julgamos, por tudo isto, ser este trabalho um ponto
de partida para outros estudos, e esperamos contribuir
para o conhecimento das lesões neoplásicas dos caní-
deos domésticos que ocorrem na nossa região e no
nosso país.
Agradecimentos
Não queremos deixar de agradecer a todas as nossas
colegas que desempenham ou desempenharam funções
de Anatomopatologistas no Laboratório de Histologia
e Anatomia Patológica da UTAD, e que com o diag-
nóstico colaboraram para o conhecimento e casuística
que nos permitiram elaborar este trabalho. Assim,
agradecemos à Profª Doutora Anabela Alves, Drª Paula
Robrigues, Profª Doutora Helena Vala, Drª Justina Oli-
veira, Drª Maria de Lurdes Pinto, Drª Adelina Gama,
Drª Maria do Carmo Topa e Drª Patrícia Pereira. Agra-
decemos ainda, e de forma muito especial, ao pessoal
técnico e auxiliar nas pessoas da D. Lígia Lourenço
Bento, D. Ana Plácido e D. Glória Milagres.
Ao Dr. Pedro R. Ferreira de Carvalho e ao Prof.
Doutor Carlos Lopes endereçamos o nosso especial
agradecimento pela disponibilidade sempre demons-
trada no esclarecimento de dúvidas e auxílio prestado
no diagnóstico de situações mais raras, ou casos mais
duvidosos. À Profª Doutora Rita Payan, ao Prof Doutor
Jorge Colaço e à Prof. Doutora Raquel Chaves, pelos
valiosos comentários.
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RPCV (2003) 98 (547) 119-124
Development of a Fluorescent In Situ Hybridization protocol for the rapid
detection and enumeration of Listeria monocytogenes in milk
Desenvolvimento de um protocolo de “Fluorescent In Situ Hybridization”
para a detecção rápida e contagem de Listeria monocytogenes em leite
Manuela Oliveira, Gonçalo Andrade, Manuela Guerra e Fernando Bernardo*
Laboratório de Inspecção Sanitária - CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos,
Polo Universitário do Alto da Ajuda, Lisboa, Portugal
Summary: A rapid method for the specific detection and enu-
meration of Listeria monocytogenes in milk was developed. This
method is based on Fluorescent In Situ Hybridization (FISH),
using a fluorescent 19-mer oligonucleotide probe, homologous
to 16S rRNA of L. monocytogenes, and adapted from a dot-blot
hybridization technique (Wang et al., 1991). The protocol was
established through the hybridization of 68 reference strains,
and tested against 114 Listeria cultures isolated from food and
environmental samples, including L. monocytogenes, L. innocua,
L. ivanovii, L. grayi, L. seeligeri and L. welshimeri. The probe
hybridized specifically to all L. monocytogenes serovars, and no
cross hybridization was observed with any of the other strains
tested. The protocol was then applied to the direct detection of
L. monocytogenes in natural and artificially contaminated milk
samples, and the relation between the traditional plating method
and FISH cell counting was evaluated. Results show that FISH
is a promising technique for the rapid detection and enumeration
of L. monocytogenes in food and environmental samples, allo-
wing positive identification in approximately seven hours, with
a consumable cost of 0.45 to 3.0 euro, depending on the number
of simultaneously processed samples.
Resumo: Foi desenvolvido um método rápido para a detecção
específica e contagem de Listeria monocytogenes em leite. Este
método baseia-se na técnica Fluorescent In Situ Hybridization
(FISH), e recorre a uma sonda fluorescente de 19 oligonucleó-
tidos, homóloga ao 16S rRNA de L. monocytogenes, e adaptada
de uma técnica de hibridação dot-blot (Wang et al., 1991). O
protocolo foi estabelecido através da hibridação de 68 estirpes
de referência, e testado em 114 isolados de Listeria obtidos
a partir de amostras de alimentos e ambientais, incluindo L.
monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. grayi, L. seeligeri e
L. welshimeri. A sonda hibridou especificamente com todas as
serovariedades de L. monocytogenes, não se tendo observado
hibridações cruzadas com as outras estirpes. O protocolo foi
aplicado à detecção directa de L. monocytogenes em amostras de
leite naturais e contaminadas artificialmente, e a relação entre o
método de plaqueamento tradicional e a contagem de células por
FISH foi avaliada. Os resultados demonstram que esta técnica é
promissora para a detecção rápida e contagem de L. monocyto-
genes em amostras de alimentos e ambientais, permitindo a sua
identificação positiva em aproximadamente sete horas, com um
custo entre 0,45 e 3,0 euro, dependendo do número de amostras
processadas simultaneamente.
* Corresponding author: e-mail: bernardo@fmv.utl.pt; telephone
213652846, fax 213652882.
REVISTA PORTUGUESA
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Introduction
Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen
able of causing either outbreaks or sporadic episodes
of listeriosis. The organism has been incriminated in
foodborne diseases promoted by a wide variety of
food products, in many countries, since the 1980s
(Sutherland and Porritt, 1997). In 1997, the worldwide
incidence was two to five cases/million population
(Rocourt and Cossart, 1997), and although infection
can be treated successfully with antibiotics, between
20 and 40% of the cases are fatal (McLauchlin, 1996).
Recently in the United States, listeriosis was estimated
as the second largest identified cause of death from a
foodborne disease (Mead et al., 1999), which justifies
the continued analysis of the causative organism, L.
monocytogenes.
The development of methods for the rapid detection
of L. monocytogenes in food is therefore critical for
ensuring food safety. Traditional plating methods are
well established, but complex and time consuming.
They depend upon the obtention of pure cultures and
include long steps of pre-enrichment, enrichment,
selection and identification. For L. monocytogenes,
positive results are only obtained after 5 days. Scien-
tific advances over the past years resulted in the deve-
lopment of faster, more sensitive and more specific
methods for the detection of pathogenic microorga-
nisms. These methods, which include immunomag-
netic techniques, biochemical kits (Olsen et al., 1995)
and molecular techniques, such as PCR (Jaton et al.,
1992; Lantz et al., 1994; Wang et al., 1997; Ingianni
et al., 2001) and FISH, eliminate the need for pure
cultures and give results in 3-8 hours.
The FISH technique, already applied to clinical
investigation of faeces (Sghir et al., 2000), urine
and blood, and to the microbiological analysis of
water (Kenzaka et al., 1998), soils, activated sludges
(Wagner et al., 1994) and biofilms (Poulsen et al.,
1993), is based on the hibridization of specific geno-
119
Oliveira, M. et al.
mic sequences of a microorganism, with a fluorescent
labelled-probe. It usually involves four steps: sample
fixation and permeabilization; hibridization of the
target sequence and the fluorescent probe; stringency
washes; and detection of the hibridized cells (Amann
et al., 2001).
The purpose of this study was to develop a FISH
protocol for the specific detection of L. monocytogenes
in approximately seven hours; to evaluate its applica-
bility for the direct detection and enumeration of this
pathogen in food samples; and to evaluate the relation
between the traditional plating method and FISH cell
counting.
Materials and Methods
Bacterial strains and culture methods
In this study 68 reference strains of different bac-
teria species were used, including 24 Listeria strains,
17 of which correspond to different serotypes of
L. monocytogenes (Table 1). Ninety-two other L.
monocytogenes isolates, previously identified and sero-
typed (Guerra et al., 2001), were also used. Seventy-
two of the isolates were recovered from food and 20
from environmental samples. Isolates belong to four
serovars: 1/2a (11 isolates), 1/2b (23 isolates), 3b (2
isolates), 4b (56 isolates). Other Listeria species were
also included: L. innocua (5 isolates), L. ivanovii (3
isolates), L. grayi (4 isolates), L. seeligeri (4 isolates)
and L. welshimeri (6 isolates) (Table 2). All cultures
were grown in Tryptone Soya Agar (TSA) (CM0131,
Oxoid, Hampshire, England).
Fixation of bacteria
Overnight cultures grown in TSA (CM0131, Oxoid,
Hampshire, England) were resuspended in 1000µl of
distilled water (H2O) and centrifuged (14000 rpm,
10 mins). Pellets were resuspended in 100µl of a 4%
paraformaldehyde solution (Merck Sharp & Dohme,
Lisbon, Portugal). This mixtures were incubated for 20
mins, centrifuged (14000 rpm, 10 mins), and washed
in 1000 µl of PBS. Bacteria were pelleted by centri-
fugation (14000 rpm, 10 mins), and resuspended in
distilled H2O.
Oligonucleotide probes
Three oligonucleotide probes were used: a Liste-
ria oligonucleotide probe RL-2 (Wang et al., 1991);
the universal bacteria probe Eub338 (Christensen et
al., 1999); and a nonsense probe complementary to
Eub338, Non338 (Christensen et al., 1999). Eub338
and Non338 were used as positive and negative con-
trols of the hybridization protocol, respectively. The
probes were synthesized and labelled with fluorescein
at the 5’ end (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany).
120
RPCV (2003) 98 (547) 119-124
FISH technique
Ten-well teflon-coated slides (Heinz Herenz, Ham-
burg, Germany) were covered with a 2 % 3-trimetho-
xysilylpropylamine solution (Merck Sharp & Dohme,
Lisbon, Portugal) in acetone; 10 µl of fixed bacteria
were placed on the wells, air-dried and dehydrated
in 70 and 96 % ethanol, for two minutes each. After
drying, 10µl of hybridization buffer (0.7 M NaCl,
0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 0.1 % SDS, 10 mM EDTA)
containing 5 ng/µl of probe were added. The slides
were incubated in a moisture chamber (45 ºC, 4 h),
and washed in hybridization buffer (45 ºC, 15 mins).
Afterwards, they were rinsed in distilled H2O and
mounted in Vectashield Mounting Medium (Vector
Laboratories, Inc., Burlingame, U.S.A.) containing
0.5 µg/µl of 4’-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
(Sigma-Aldrich Química, S.A., Sintra, Portugal). All
assays were performed in duplicate. The hybridized
bacteria were visualized by fluorescence microscopy
at x1000 magnification (Objective HCX PLAN APD)
on a Leica DMR microscope equipped with a 100 W
mercury lamp and an I3 filter (Leica Microsistemas
Lda, Lisboa, Portugal). Non-hybridized bacteria were
located using DAPI staining and identified by obser-
vation through an A filter (Leica Microsistemas Lda,
Lisboa, Portugal). Images were captured with a Leica
DC200 camera.
Direct detection in milk samples and bacteria quan-
tification
Tenfold dilutions from natural and artificially con-
taminated sheep milk inoculated with 0.5 McFarland
suspensions (1.5 x 108 bacteria/ml) (bioMérieux, Marcy
L’Etoile, France) of L. monocytogenes 4b CECT935,
were performed. One ml of each was simultaneously
plated through incorporation on Palcam Agar (CM877,
Oxoid, Hampshire, England) and directly fixed for
FISH as described. The plates were incubated at 37ºC
for 24 h, and the colonies counted. FISH was perfor-
med as described. Cells with positive hibridization
signal were counted on 20 microscope fields, and the
number of cells/ml was estimated using the formula: nº
cells / ml = (nº cells counted / nº fields counted x well
area / field area) / volume used x dilution. Assays were
repeated 5 times, in duplicate.
Results
The FISH protocol revealed to be specific for L.
monocytogenes detection, since all L. monocytogenes
isolates showed a positive hybridization signal, and no
cross-hybridization was observed (Tables 1 and 2) .
Fifteen of the reference L. monocytogenes strains
yielded a strong hybridization signal with the RL-2
probe. The hybridization signals of L. monocytogenes
Oliveira, M. et al. RPCV (2003) 98 (547) 119-124

Table 1 – Reference strains tested by FISH with the specific protocol for L. monocytogenes
Species Serotype Strain Code Positive hybridisation
RL-2 Eub338 Non338
Citrobacter freundii CECT401T 0 1 0
Edwardsiella tarda CECT849T 0 1 0
Enterobacter aerogenes CECT684T 0 1 0
Enterobacter cloacae CECT194T 0 1 0
Enterococcus hirae DSMZ20160T 0 1 0
Enterococcus faecium DSMZ20477T 0 1 0
Enterococcus faecalis DSMZ20478T 0 1 0
Enterococcus gallinarum DSMZ20628T 0 1 0
Enterococcus durans DSMZ20633T 0 1 0
Enterococcus avium DSMZ20679T 0 1 0
Enterococcus casseliflavus DSMZ20689T 0 1 0
Enterococcus pseudoavium DSMZ5632T 0 1 0
Escherichia coli O127a CECT352 0 1 0
O1 CECT515NT 0 1 0
O25 CECT685 0 1 0
O111 CECT727 0 1 0
HfrK12 CECT4624 0 1 0
O157:H7 CECT4782; CDC3834 0 2 0
Klebsiella pneumoniae CECT143T 0 1 0
Klebsiella aerogenes NCTC418 0 1 0
Listeria grayi CECT931T 0 1 0
Listeria innocua CECT910T; NCTC11288 0 2 0
Listeria ivanovii CECT913T; NCTN11846 0 2 0
Listeria monocytogenes 1a CECT932; CECT4031T 2 2 0
1/2a CIP104794 1 1 0
1/2b CECT936 1 1 0
1/2c CECT 911 1 1 0
3b CECT937 1 1 0
4a CECT934 1 1 0
4b CECT935; CECT4032 2 2 0
4c CECT939; CIP78.39 2 2 0
6 CECT941 1 1 0
Others NCTC11994; L7946; L7947; L2036C; ScottA 5 5 0
Listeria seeligeri CECT917T 0 1 0
Listeria welshimeri CECT919T 0 1 0
Morganella morganii CECT173T 0 1 0
Pantoea agglomerans CECT850T 0 1 0
Proteus mirabilis CECT4168T 0 1 0
Proteus vulgaris NCTC4175 0 1 0
Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 0 1 0
Salmonella anatum K84 0 1 0
derby K1205 0 1 0
dublin K65 0 1 0
enteritidis CECT4300; K64 0 2 0
heidelberg CIS154 0 1 0
infantis K158 0 1 0
newport K50 0 1 0
typhimurium CECT443; NCTC74 0 2 0
Serratia marcesens NCTC1377 0 1 0
Shigella dysenteriae CECT584T; NCTC4837 0 2 0
Staphylococcus aureus ATCC25923 0 1 0
Staphylococcus Epidermidis NCTC4276 0 1 0
Streptococcus faecalis NCTC5213 0 1 0
Streptococcus faecium NCTC1377 0 1 0
Yersinia enterocolitica CECT4315T 0 1 0

ATCC – American Type Culture Collection; CDC – Central Disease Control; CECT – Colección Española de Cultivo Tipo; CIS – WHO Collaborating Centre for Reference and Research
on Salmonella, Collection de l’Institut Pasteur; DSMZ – Deutsch Sammlung für Mikroorganismen; K – Statens Seruminstitut; NCTC – National Collection Type Cultures.

121
Oliveira, M. et al. RPCV (2003) 98 (547) 119-124

Table 2 – Bacterial strains isolated from food and environmental samples and tested with the specific FISH protocol for L. monocyto-
genes
Origin Species Serotype Total Positive Hybridisation
RL-2 Eub338 Non338
Environment Seagull L.monocytogenes 1/2a 1 1 1 0
Faeces 1/2b 4 4 4 0
4b 13 13 13 0
L. welshimeri 2 0 2 0
Silages L.monocytogenes 4b 2 2 2 0
L. innocua 2 0 2 0
Food Milk L.monocytogenes 1/2a 1 1 1 0
1/2b 8 8 8 0
L. innocua 1 0 1 0
L. ivanovii 3 0 3 0
L. seeligeri 1 0 1 0
Turkey L.monocytogenes 1/2a 1 1 1 0
1/2b 1 1 1 0
L. grayi 2 0 2 0
L. welshimeri 4 0 4 0
Fish L.monocytogenes 1/2a 1 1 1 0
1/2b 1 1 1 0
4b 35 35 35 0
Meat L.monocytogenes 1/2b 7 7 7 0
4b 6 6 6 0
L. grayi 2 0 2 0
L. innocua 2 0 2 0
L. seeligeri 3 0 3 0
Chicken L.monocytogenes 1/2a 7 7 7 0
1/2b 2 2 2 0
3b 2 2 2 0

Table 3 – Determination of the bacteria concentration through
the conventional methods and the FISH technique (bacteria/ml)
Milk Samples Quantification L. monocytogenes 4b
method
Natural Plating 0 applied to milk samples, and it allowed the detection
FISH 0 and enumeration of bacteria in the contaminated sam-
Inoculated Plating 9.0 x 10 (± 4.1 x 106)a
7 ples. The bacteria quantification obtained by the FISH
FISH 2.0 x 109 (± 5.0 x 108)b
The results correspond to the average values from 5 assays,
a,b
performed in duplicate (± standard deviation).
CECT941 and L. monocytogenes L2036C were posi-
tive, but weak. No cross hybridization was observed to
any of the other non-L. monocytogenes strains tested.
All 68 reference strains were able to hybridize with
Eub338, and none hybridized with Non338 (Table 1).
The applicability of the FISH technique to detect
bacterial strains isolated from food and environmental
samples was tested against 114 Listeria cultures, inclu-
ding 92 L. monocytogenes samples, corresponding
to different serotypes. All L. monocytogenes cultures
showed positive hybridization signal with RL-2 (Fig.
1A), and no cross hybridization was observed with any
of the other Listeria strains tested (Fig. 1B and 1C).
All strains were able to hybridize with Eub338, and
none hybridized with Non338 (Table 2).
The applicability of the FISH protocol for the direct
detection and enumeration of L. monocytogenes
in food samples was also tested. The protocol was
technique and the conventional bacteriological method
were studied, by comparing results obtained by colony
counting and by the number of hybridized cells in 20
microscope fields. It was found that the FISH techni-
que could count 100 x more bacteria than the plating
method (Table 3).
Discussion
A specific FISH protocol for the rapid detection
and enumeration of L. monocytogenes was developed,
using a fluorescent 19-mer oligonucleotide probe,
homologous to 16S rRNA of L. monocytogenes (Wang
et al., 1991). Although this probe was originally used
in a dot-blot hybridization technique, its characteris-
tics were ideal for application in FISH: it is specific
for L. monocytogenes (Wang et al., 1991); its target
is the 16S rRNA subunit, a conserved gene, present in

122
Oliveira, M. et al.
A B
Figure 1. Applicability of the FISH protocol.
(A) After hybridization with RL-2, L.monocytogenes 3b isolated from chicken (F10) showed a positive hybridization signal. Clum-
ping effect can be observed ( ).
(B) L.welshimeri (R48-b1) isolated from turkey showed a negative hybridization signal.
(C) The L.welshimeri (R48-b1) cells were located using DAPI staining.
a high number of copies in the cell (> 104 copies per
cell), which represent enough targets so that the cell
becomes visible through FISH (Amann et al., 1995);
its size, 19 oligonucleotides, allows the penetration
through the cell wall, reducing the time and the tem-
perature required for hybridization; and its melting
temperature, determined by the G+C content, is 48 ºC,
in accordance with the recommended range of 60 ºC ≥
Tm ≥ 46 ºC (Fuchs et al., 1998; Fuchs et al., 2000).
The protocol was established through the hybridi-
zation with reference strains. The first step was the
fixation of the bacterial cells, which should be done
in the exponential growth phase, in order to guarantee
the maximum number of ribosomes (Rice et al., 1997).
This step is crucial, since it allows the immobilization
of the cells, facilitates the penetration of the probe,
protects the ribosomes from degradation by endoge-
nous RNase activity, and maintains the morphological
structure of the cells (Amann et al., 1995). There are
several protocols for the fixation of the cells. We used
a paraformaldehyde solution, with an additional step of
permeabilisation of the membrane through dehydration
in 70 and 96 % ethanol. This additional step is someti-
mes necessary, in order to allow the penetration of the
probe (Meier et al., 1999).
The next step was the hybridization of the probe
and the target sequence. The probe was diluted in a
hybridization solution, to a concentration of 5 ng/µl
(Wallner et al., 1993). This concentration should be
determined in order to allow the maximum velocity
of hybridization and the minimum of non-specific
staining (Wallner et al., 1993). The composition of the
hybridization solution and the hybridization tempera-
ture determined the stringency conditions necessary
for the discrimination between strains with two misma-
tches, which include the related species L. innocua and
L. ivanovii (Wang et al., 1991), allowing the specific
detection of L. monocytogenes. The buffer used in the
following washing step should provide the same strin-
gency conditions as the hybridization buffer. This step
is crucial for the elimination of non-bonded probe and
non-specific hybrids.
RPCV (2003) 98 (547) 119-124
C
This protocol was tested against 68 reference strains,
including 24 Listeria strains, 17 of which correspond
to different serotypes of L. monocytogenes. Only L.
monocytogenes strains were able to hybridize with RL-
2, and no cross hybridization was observed with any
of the other strains tested. Fifteen L. monocytogenes
strains yielded a strong hybridization signal with RL-
2, and the hybridization signal of L. monocytogenes
CECT941 (serovar 6) and L. monocytogenes L2036
was positive, but weak. Differences between the inten-
sity in the hybridization signal might be related with
differences in the ribosome content of the cell (Amann
et al., 1995).
The protocol was applied to 114 Listeria indigenous
isolates, obtained from food and environmental samples,
including 92 strains of L. monocytogenes, corresponding
to four serovars. All L. monocytogenes cultures showed
positive hybridization signals and no cross hybridization
was observed to any of the other Listeria species tested.
After its optimisation, the FISH protocol was applied
to the direct detection in milk samples. To evaluate
weather or not this technique could be implemented
in food safety analysis, it was necessary to estimate
the relation between CFU and the FISH cell counting.
With that purpose, tenfold dilutions from natural and
artificially contaminated sheep milk were simultane-
ously analysed by the conventional method and the
FISH technique. In all assays, the sensitivity of the
FISH technique was 100 x superior to the plating
method, as already reported (Auty et al., 2001; Oli-
veira and Bernardo, 2002). This can be explained by
the detection of non-viable cells that still have mRNA
molecules, by the observation of individual cells,
even when organised in aggregates, and by variations
in the sample distribution along the total area of the
slide well, which may affect the determination of the
number of hybridized cells/ml.
These results suggest that the FISH technique can
be used for the rapid and specific detection of L.
monocytogenes in food samples, although the appli-
cation of this methodology to pathogen quantification
needs to be optimised. This technique allows positive
123
Oliveira, M. et al.
results in approximately 7 hours, with a consumable
cost of 0.45 to 3.0 euro, depending on the number of
simultaneously processed samples.
Acknowledgements
We thank Sergi Ferrer (Universitat Valência), Ana
Tenreiro and Rogério Tenreiro (Faculdade de Ciências
de Lisboa) for technical and scientific support.
The work was supported by the following projects:
CIISA43, POCTI/CVT/43252/2001, POCTI/ESP/
39233/2001. M. Oliveira has a PhD grant from Funda-
ção Ciência e Tecnologia (BD 905/2000).
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RPCV (2003) 98 (547) 125-134
Morfometria e Ultra-Estrutura da Mucosa Intestinal de Frangos de Corte
alimentados com Dietas contendo diferentes Probióticos
Intestinal Mucosa Structure and Ultrastructure in Broilers fed with Diets
supplemented with different Probiotics
Elizabete Regina Leone Pelicano*, Pedro Alves de Souzaa, Hirasilva Borba Alves de Souzaa,
Alexandre Obab, Eduardo Antônio Norkusc, Luís Marcelo Kodawarac, Tânia Mara Azevedo de Limad
FCAV/UNESP - Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n. Departamento de Tecnologia, cep: 14884-900, Jaboticabal, SP, Brazil.
Resumo: O estudo foi conduzido com o objectivo de avaliar
o uso de diferentes probióticos sobre a morfometria e a ultra-
estrutura da mucosa intestinal de frangos. Foram utilizadas no
total 28 aves (4 aves por tratamento), distribuídas em um deli-
neamento ao acaso em esquema factorial 3 x 2 + 1 (3 fontes
de probióticos na ração, 2 níveis de concentração de probiótico
na água de bebida e 1 testemunha - controle negativo). Aos 42
dias, observou-se que as aves pertencentes ao grupo controle
apresentaram significativamente (P<0,01) uma menor altura e
perímetro de vilo no duodeno em relação as aves que receberam
os probióticos, não sendo observada esta diferença no jejuno e
no íleo. Um aumento significativo foi obtido na altura de vilo
(duodeno) e no perímetro (duodeno e jejuno) com o uso do pro-
biótico na água de bebida. Observou-se a menor profundidade de
cripta (P<0,01) com o uso do probiótico na ração contendo Sac-
charomyces cerevisiae. Houve interacção significativa (P<0,01)
na profundidade de cripta em todos os segmentos intestinais
analisados. A não administração do probiótico na água de bebida
proporcionou significativamente maiores densidades de vilo, em
todos os segmentos do intestino delgado. Como conclusão, não
foram encontrados benefícios na morfologia intestinal das aves
com o uso dos probióticos.
Summary: This study was conducted to evaluate the effect of
different probiotics on the intestinal mucosa structure and ultras-
tructure of broilers chickens. 28 Cobb male chicks were distri-
buted in a completely randomised design in a 3 x 2 + 1 factorial
arrangement (3 probiotic sources in the diet, 2 probiotic concen-
trations in drinking water and 1 negative control). To the 42 days
of age, it was observed that the birds pertaining to the control
group had presented significantly (P<0.01) a lesser height and
villus perimeter in the duodenum in relation to the birds that
received probiotic, not being observed this difference in the jeju-
num and in the ileum. A significant increase was obtained in the
villus height (duodenum) and in the perimeter (duodenum and
jejunum) with the use of probiotic in drinking water. Crypts with
smaller depths (P<0.01) were seen with the use of a probiotic
in the diet that contained Saccharomyces cerevisiae. There was
* Correspondente: e-mail erlpelicano@yahoo.com.br.
Zootecnista, Mestre, Pós-graduanda em Produção Animal,
FCAV/UNESP.
a
Professores do Departamento de Tecnologia, FCAV/UNESP
b
Zootecnista, Mestre, Pós-graduando em Produção Animal,
FCAV/UNESP
c
Zootecnistas
d
Técnica do Laboratório de TPOA, FCAV/UNESP
REVISTA PORTUGUESA
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
a significant interaction (P<0.01) in the intestinal segments for
crypt depth. The non administration of probiotic in drinking
water has provided significantly higher villus densities in all
segments of the small intestine. Thus, no beneficial effects were
seen in intestinal morphology when the probiotics were used.
Introdução
A sobrevivência e o bom desempenho das aves
dependem da obtenção adequada de energia e com-
postos químicos pelo organismo. Para que isso ocorra
é necessário que o tracto digestivo apresente caracte-
rísticas estruturais funcionais desde a ingestão dos ali-
mentos até à sua absorção (Romer e Parsons, 1981).
O sistema digestivo das aves, à semelhança do que
ocorre com o sistema termorregulador e o imunoló-
gico, sofre um processo de maturação no período pós-
eclosão, sendo que há uma maior necessidade em se
estudar os seus processos de desenvolvimento.
Sabe-se que o desenvolvimento da mucosa intestinal
é decorrente de dois eventos citológicos primários
associados: renovação celular (proliferação e diferen-
ciação), resultante das divisões mitóticas sofridas por
células totepotentes localizadas na cripta e ao longo
dos vilos (Uni et al., 1998; Uni et al., 2000) e a perda
de células por descamação, que ocorre naturalmente
no ápice dos vilos. O equilíbrio entre esses dois pro-
cessos é determinado por uma taxa de renovação cons-
tante e, portanto, a capacidade digestiva e de absorção
intestinal.
Segundo Yamauchi e Ishiki (1991), a densidade de
vilos é diferente nas várias porções intestinais (duo-
deno, jejuno e íleo), onde o número de vilos é redu-
zido aos 10 dias de idade, independente da raça. O
fato não implica em menor capacidade absortiva, e sim
em maior desenvolvimento do vilo. Assim, o número
de vilos/área é reduzido em função da idade, sendo
observado uma redução maior no frango de corte em
relação à poedeira. De acordo com Macari (1999) o
125
Pelicano, E.R.L. et al.
número de vilosidades e seu tamanho, bem como o de
microvilos, em cada segmento do intestino delgado,
conferem a eles características próprias, sendo que na
presença de nutrientes a capacidade absortiva do seg-
mento será directamente proporcional ao número de
vilosidades ali presentes, tamanho dos vilos e área de
superfície disponível para a absorção.
Normalmente, o epitélio intestinal age como uma
barreira natural contra bactérias patogénicas e substân-
cias tóxicas presentes na luz intestinal. Distúrbios na
microflora normal ou nas células epiteliais intestinais,
causados por algum tipo de estresse, patógenos, subs-
tâncias químicas e radiação, podem alterar a permea-
bilidade desta barreira natural, facilitando a invasão de
patógenos e outras substâncias nocivas, modificando o
metabolismo, a capacidade de digestão e absorção de
nutrientes e causando ainda inflamações crónicas na
mucosa intestinal (Hofstad, 1972; Podolsky, 1993; Oli-
veira, 1998). Consequentemente ocorre diminuição das
vilosidades, aumento do turnover celular e diminuição
da actividade digestiva e absortiva (Visek, 1978).
Como os processos de absorção de nutrientes são
totalmente dependentes dos mecanismos que ocorrem
na mucosa intestinal, a manipulação de microrganis-
mos probióticos (suplementos microbianos vivos for-
mados por bactérias ou fungos específicos) dentro do
tracto gastrointestinal têm sido usada com o objectivo
de melhorias no desempenho e, consequentemente na
eficiência energética do intestino (Dobrogosz et al.,
1991; Bradley et al., 1994; Spring, 1996 e Savage et
al., 1997).
A acção dos probióticos pode ser explicada através
de alguns mecanismos como a produção de substân-
cias antimicrobianas e ácidos orgânicos, protecção aos
vilos e superfícies absortivas contra toxinas produzidas
por microrganismos patógenos, bem como estímulo ao
sistema imune (Vicent, 1959; Dobrogosz et al., 1991;
Walker e Duff, 1998). De acordo com alguns autores,
a utilização dos probióticos propiciaria a colonização
do tracto digestivo, mantendo ou incrementando a flora
natural dele, prevenindo a colonização de microrganis-
mos patogénicos e mantendo a óptima utilização dos
alimentos (Fuller, 1989; Vanbelle et al., 1990; Houdijk
et al., 1999).
Relatos de Cook e Bird (1973) indicam que aves
criadas em ambientes livres de patógenos apresentam
uma redução na altura de vilos, bem como na profun-
didade de cripta, sugerindo que o crescimento normal
do epitélio intestinal dependa também do equilíbrio
da microbiota ali residente. Assim, a integridade da
mucosa do tracto gastrointestinal conferiria ao frango
de corte condições adequadas para a digestão e absor-
ção dos nutrientes.
Desta forma, o objectivo deste trabalho foi avaliar a
influência de diferentes probióticos (na água de bebida
e na ração) sobre as características morfométricas e
ultra-estruturais do tracto intestinal das aves (altura e
perímetro de vilo, profundidade de cripta e densidade
de vilos/área).
126
RPCV (2003) 98 (547) 125-134
Material e métodos
Local
Este trabalho foi desenvolvido na Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias - FCAV/UNESP,
Jaboticabal, São Paulo, Brasil. A fase de campo e o
abate dos animais foram desenvolvidos nas dependên-
cias do Sector de Avicultura e as análises laboratoriais
nos Laboratórios de Microscopia Ótica e Microsco-
pia Electrónica de Varredura, ambos pertencentes ao
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da
referida Faculdade.
Animais e Maneio
O experimento foi conduzido inicialmente com 1050
pintainhos de corte (7 tratamentos com 5 repetições
de 30 aves), machos, de um dia de idade, da linhagem
comercial Cobb, sendo que, para a efectuação das aná-
lises de morfometria e ultra-estrutura da mucosa intes-
tinal, foram necessárias apenas 28 aves (4 animais por
tratamento), com peso vivo médio de 2,3 kg, aos 42
dias de idade. Os animais foram alojados em galpão,
ou pavilhão, convencional de alvenaria e distribuídos
em boxes com as dimensões de 2,75 m x 1,40 m.
O maneio adoptado durante a condução do experi-
mento foi o usualmente empregado na criação comer-
cial de frangos de corte. Antes das aves serem alojadas
colocou-se sobre o piso de alvenaria do galpão cama
de maravalha de ± 5 cm de espessura e, posteriormente
comedouros tubulares infantis e bebedouros de alu-
mínio de pressão. A fonte de aquecimento fornecida
para as aves nos primeiros dias de criação foi feita
através da utilização de lâmpadas de infravermelho.
Da segunda até a sétima semanas de idade, os equipa-
mentos infantis foram substituídos pelos definitivos; ou
seja, comedouros tubulares com capacidade para 20 kg
e bebedouros automáticos pendulares.
As vacinações efectuadas foram: no 5o dia contra
a doença de Gumboro e no 15o dia contra Gumboro
(reforço) e doença de Newcastle, ambas aplicadas
directamente nos olhos dos animais.
A temperatura ambiental e a humidade relativa do
ar foram registradas diariamente, procedendo-se ao
maneio adequado de cortinas e ventiladores para a
garantia do conforto térmico dos animais. A água e a
ração foram fornecidas ad libitum.
Maneio alimentar
O abastecimento dos comedouros com ração foi feito
através do uso de conchas específicas para cada trata-
mento, tomando-se assim o devido cuidado para que os
microrganismos de um tratamento não contaminassem
o outro, sendo este mesmo procedimento adoptado
com o material de limpeza necessário para a lavagem
dos bebedouros.
As aves receberam durante todo o período de criação
Pelicano, E.R.L. et al.
ração (a base de milho e soja) e água ad libitum, sendo
que este período foi divido em três fases: fase inicial
(1 a 21 dias), onde as aves receberam uma dieta inicial
contendo 2944 kcal/kg de ração de energia metabolizá-
vel e 23% de proteína bruta, 1,285% de lisina, 0,537%
de metionina, 1,001% de Ca e 0,481% de P total. A
dieta de crescimento (22 a 35 dias) continha 3100
kcal/kg de ração de energia metabolizável e 20% de
proteína bruta, 1,074% de lisina, 0,388% de metionina,
0,913% de Ca e 0,377% de P total, enquanto que a
dieta final ou de acabamento (36 a 42 dias de idade)
continha 3200 kcal/kg de ração de energia metabolizá-
vel e 18% de proteína bruta, 0,935% de lisina, 0,333%
de metionina, 0,803% de Ca e 0,327% de P total. Os
outros níveis nutricionais foram aqueles recomendados
pelo NRC (1994). Em nenhuma das fases de criação
foi adicionado agente anticoccidiano ou qualquer outro
produto que pudesse ter acção antibiótica.
Delineamento experimental e tratamentos
O delineamento experimental utilizado foi o intei-
ramente casualizado em esquema factorial 3 x 2 + 1,
sendo constituído por 3 diferentes fontes de probió-
ticos na ração (Bacillus subtilis; Bacillus subtilis e
Bacillus licheniformis e; Saccharomyces cerevisiae) 2
níveis de concentração de probiótico na água de bebida
(sem e com probiótico na água de bebida) e 1 testemu-
nha (controle), com 7 tratamentos, 4 aves/tratamento,
totalizando 28 animais experimentais para as análises
de morfometria e ultra-estrutura da mucosa intestinal.
As análises de variância foram realizadas segundo
procedimentos do SAS (1998) e os contrastes entre
médias dos tratamentos pelo teste de Tukey num nível
de significância de 5 % (H0:P<0,05). O esquema de
análise de variância do experimento está apresentado
na Tabela 1.
Tabela 1 - Esquema de análise de variância do experimento
Causas de Variação G.L.
Controle vs Probióticos
Probiótico na Ração (R)
Probiótico na Água de Bebida (A)
RXA
(Tratamentos)
Resíduo
Total
Os tratamentos utilizados foram: 1 - controle (sem
adição de antibiótico e probiótico); 2 - probiótico
adicionado na ração contendo Bacillus subtilis (1010
UFC/g do produto); 3 - probiótico adicionado na ração
contendo Bacillus subtilis (1010 UFC/g do produto)
e probiótico adicionado na água de bebida contendo
Lactobacillus reuteri (6,6 x 109 UFC/g do produto) e
Lactobacillus johnsonii (3,3 x 109 UFC/g do produto);
4 - probiótico adicionado na ração contendo uma mis-
RPCV (2003) 98 (547) 125-134
tura de Bacillus subtilis (1,6 x 109 UFC/g do produto) e
Bacillus licheniformis (1,6 x 109 UFC/g do produto);
5 - probiótico adicionado na ração contendo uma mis-
tura de Bacillus subtilis (1,6 x 109 UFC/g do produto)
e Bacillus licheniformis (1,6 x 109 UFC/g do produto)
e probiótico adicionado na água de bebida contendo
Lactobacillus reuteri (6,6 x 109 UFC/g do produto) e
Lactobacillus johnsonii (3,3 x 109 UFC/g do produto);
6 - probiótico adicionado na ração contendo Saccha-
romyces cerevisiae (8 x 109 UFC/g do produto); 7 -
probiótico adicionado na ração contendo Saccharomy-
ces cerevisiae (8 x 109 UFC/g do produto) e probiótico
adicionado na água de bebida contendo Lactobacillus
reuteri (6,6 x 109 UFC/g do produto) e Lactobacillus
johnsonii (3,3 x 109 UFC/g do produto).
Dosagens dos probióticos na ração e na água
de bebida
As dosagens dos probióticos citados nos tratamentos
acima foram efectuadas conforme a recomendação dos
respectivos fabricantes: probiótico contendo Bacillus
subtilis adicionado na ração na dosagem de 300 g do
produto/ton. de ração, para todo o período de criação
(1 a 42 dias de idade); probiótico contendo uma mis-
tura de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis adi-
cionado na ração nas dosagens de 1000 g do produto/
ton. de ração na fase inicial (1 a 21 dias) e 400 g do
produto/ton. de ração até a idade de abate (22 a 42 dias
de idade); probiótico contendo Saccharomyces cerevi-
siae adicionado na ração nas dosagens de 2000 g do
produto/ton. de ração na fase inicial (1 a 21 dias), 1000
g do produto/ton. de ração na fase de crescimento (22 a
35 dias) e 800 g do produto/ton. de ração na fase final
(36 a 42 dias de idade); probiótico contendo uma mis-
tura de Lactobacillus reuteri e Lactobacillus johnsonii
adicionado na água de bebida na dosagem de 25 g para
cada 5000 pintos apenas no primeiro dia de vida. Após
a chegada dos pintainhos, foi fornecido o probiótico
na primeira água de bebida, sendo somente efectuada
1
a troca desta água por outra sem o produto após obser-
vada sua completa ingestão pelos animais.
2
1 Procedimentos para análises laboratoriais
2
6 Aos 42 dias de idade, após jejum de 12 horas, foi
realizado o abate de 28 aves para a colecta dos seg-
21
mentos do intestino delgado.
27
Morfometria Intestinal - Microscopia de Luz
Nas avaliações de microscopia de luz, amostras de 2
cm de duodeno, jejuno e íleo foram colectadas, abertas
longitudinalmente, lavadas em solução tampão fosfato
(0,1 M, pH 7,4) e, fixadas em solução de Bouin por 36
horas. Em seguida foram lavadas em álcool 70% para
a retirada do fixador e posteriormente foram desidra-
tadas em série crescente de álcoois, diafanizadas em
xilol e incluídas em parafina. Após a microtomia semi-
127
Pelicano, E.R.L. et al.
seriada, a uma espessura de 7 µm, 7 cortes histológicos
foram colocados em cada lâmina, sendo corados pelas
técnicas do PAS (Ácido Periódico de Shift), e obser-
vados a microscopia de luz. O estudo morfométrico
da altura das vilosidades, do perímetro e da profun-
didade das criptas intestinais (em µm) foi realizado
através do sistema analisador de imagens da Kontron
Elektronik (Vídeo Plan), acoplado a um microscópio
binocular. Em um total de 84 lâminas (7 tratamentos x
4 animais x 3 segmentos intestinais), foram efectuadas
90 leituras/lâmina (30 leituras para altura de vilo, perí-
metro de vilo e profundidade de cripta), perfazendo
no total 7560 leituras de microscopia de luz (1080
leituras/tratamento).
A altura de vilo foi medida a partir da região basal
do vilo, coincidente com a porção superior das criptas,
até ao seu ápice, sendo o mesmo efectuado nas deter-
minações do perímetro, sendo que para esta última
medição contornou-se as reentrâncias presentes no
vilo. As criptas foram medidas da sua base até a região
de transição cripta:vilosidade.
Ultra-Estrutura da Mucosa Intestinal - Microscopia
Electrónica de Varredura
Para a microscopia electrónica de varredura, amos-
tras intestinais de duodeno, jejuno e íleo, com apro-
ximadamente 2 cm de comprimento foram extraídas
de cada ave. Após isto, fragmentos de 0,5 cm foram
fixados por 24 horas à 4oC em glutaraldeído 2,5% em
tampão fosfato (0,1 M, pH 7,4) e pós-fixados em tetró-
xido de ósmio 1 % por 2 horas. A seguir, os fragmentos
foram desidratados em série de concentração crescente
de etanol (70 a 100%). Seguindo a desidratação as
amostras foram submetidas a obtenção do ponto crí-
tico de secagem, utilizando CO2 (aparelho BAL-TEC),
montadas em suporte, metalizadas com ouro paládio
em aparelho DENTON VACUM DESK II, e observa-
das em microscópio electrónico de varredura (JEOL-
JSM 5410). Para a mensuração do número de vilos,
as amostras foram eletronmicrografadas em 5 campos
distintos, totalizando 420 fotos (28 aves/3 segmentos/5
campos). Foi verificada a escala da foto, mensurado o
campo de observação apresentado, através da largura
de comprimento, obtendo-se assim a área da foto.
Feito isto, foram realizadas as contagens dos vilos de
cada campo e feita a relação número de vilos/µm2.
Resultados
A Tabela 2 apresenta os valores médios de altura de
vilo, dos segmentos do intestino delgado de frangos de
corte submetidos a dietas contendo diferentes probióti-
cos, aos 42 dias de idade. Observa-se que as aves per-
tencentes ao grupo controle apresentaram significativa-
mente (P<0,01) uma menor altura de vilo no duodeno
em relação as aves que receberam os probióticos, não
sendo observada esta diferença no jejuno e no íleo.
128
RPCV (2003) 98 (547) 125-134
Os diferentes probióticos administrados na ração não
afectaram (P>0,05) a altura de vilos nos diferentes seg-
mentos intestinais.
Também observou-se aumento significativo na altura
de vilo do duodeno, com o uso do probiótico na água
de bebida, não sendo observado esse aumento para o
jejuno e o íleo.
A Tabela 3 apresenta os valores médios de perímetro
de vilo, dos segmentos do intestino delgado de fran-
gos de corte submetidos a dietas contendo diferentes
probióticos, aos 42 dias de idade. Para este parâme-
tro, também foi observado que as aves pertencentes
ao grupo controle apresentaram significativamente
(P<0,01) um menor perímetro de vilo duodenal, em
relação as aves que receberam os probióticos, não per-
sistindo esta observação para o jejuno e o íleo.
Da mesma maneira, os diferentes probióticos admi-
nistrados na ração não afectaram (P>0,05) o perímetro
de vilos nos diferentes segmentos intestinais.
Também foi observado que a administração do probi-
ótico na água de bebida proporcionou maiores médias
(P<0,05) de perímetro de vilo no duodeno e jejuno, não
sendo este facto observado para o íleo.
A Tabela 4 apresenta os valores médios de profun-
didade de cripta, dos segmentos do intestino delgado,
de frangos de corte submetidos a dietas contendo
diferentes probióticos, aos 42 dias de idade. Não houve
diferença (P>0,05) na profundidade de cripta entre as
aves pertencentes ao grupo controle e as que receberam
os probióticos. Foi observado para todos os segmentos
intestinais interacção significativa (P<0,01) entre os
factores estudados, demonstrando que o efeito do pro-
biótico na ração foi dependente do nível de concentra-
ção do probiótico na água de bebida, na determinação
da profundidade de cripta.
Observa-se ainda que os diferentes probióticos admi-
nistrados na ração afectaram (P<0,01) a profundidade
de cripta nos diferentes segmentos intestinais. O probi-
ótico contendo Saccharomyces cerevisiae proporcionou
as menores profundidades no duodeno, jejuno e íleo em
relação aos outros dois probióticos contendo Bacillus
subtilis e a mistura de Bacillus subtilis e Bacillus liche-
niformis, que não diferiram entre si (P>0,05).
Não houveram diferenças nas médias para a profun-
didade de cripta (P>0,05) com o uso de probióticos na
água de bebida em relação a sua não utilização.
A Tabela 5 apresenta os valores do desdobramento da
interacção (probiótico na ração x probiótico na água de
bebida) para a profundidade de cripta, dos segmentos
do intestino delgado de frangos de corte, aos 42 dias de
idade.
Através do desdobramento da interacção observa-se
que: para o probiótico administrado na ração contendo
Bacillus subtilis, maiores profundidades de cripta
(P<0,01) são obtidas no duodeno e jejuno com a sua
associação com o probiótico na água de bebida con-
tendo Lactobacillus reuteri e Lactobacillus johnsonii;
para o probiótico administrado na ração, contendo a
 Pelicano, E.R.L. et al. RPCV (2003) 98 (547) 125-134

Figura 1 - Eletronmicrografias de varredura das vilosidade intestinais do duodeno (D), jejuno (J) e íleo (I), de frangos de corte, aos 42 dias de idade,
alimentados com probiótico na ração durante toda a fase experimental, a base de Bacillus subtilis (1010 UFC/g do produto)

mistura de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis,
maiores profundidades de cripta (P<0,01) são obtidas
no duodeno, jejuno e íleo sem o uso do probiótico na
água de bebida e; para o probiótico da ração contendo
Saccharomyces cerevisiae, maiores profundidades de
cripta (P<0,01) são obtidas no jejuno com a sua asso-
ciação com o probiótico na água de bebida contendo
Lactobacillus reuteri e Lactobacillus johnsonii.
A Tabela 6 apresenta os valores da densidade de
vilos (número de vilo/1.145.306 µm2), dos segmentos
do intestino delgado de frangos de corte submetidos a
dietas contendo diferentes probióticos, aos 42 dias de
idade. Observa-se que as aves pertencentes ao grupo
controle não diferiram (P>0,05) na densidade de vilos/
área em relação àquelas que receberam os probióticos.
Os diferentes probióticos administrados na ração não
afectaram (P>0,05) a densidade de vilos/área nos dife-
rentes segmentos intestinais.
A não administração do probiótico na água de bebida
proporcionou significativamente maiores densidades
de vilo, em todos os segmentos do intestino delgado
(Figuras 1, 2 e 3).
Discussão
Através dos resultados observou-se que as aves
pertencentes ao grupo controle apresentaram signi-

Tabela 2 - Valores médios de altura de vilo no intestino delgado de frangos de corte alimentados com probióticos na ração e na água
de bebida aos 42 dias de idade
Altura de Vilo (µm)
Parâmetro Avaliado
Duodeno Jejuno Íleo
Controle vs Probióticos
Controle 794,21 b 928,20 a 616,95 a
Probióticos 1109,86 a
943,40 a
691,17 a
Teste F 16,22 ** 0,06 ns 2,36 ns
Teste F para Interacção R x A 0,82 ns 2,46 ns 1,90 ns
Probiótico na Ração (R)
Bacillus subtilis (1)
1128,55 a
954,79 a 732,37 a
Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis (2)
1139,40 a 957,54 a 692,61 a
Saccharomyces cerevisiae (3)
1061,62 a
917,86 a
648,54 a
Teste F 0,67 ns 0,30 ns 1,76 ns
Diferença Mínima Significativa (5%) 182,95 143,62 112,86
Probiótico na Água de Bebida (A)
Sem Probiótico na Água de Bebida 1028,25 b
898,71 a 726,58 a
Com Probiótico na Água de Bebida
Lactobacillus reuteri + Lactobacillus johnsonii (4) 1191,46 a 988,08 a 655,76 a
Teste F 7,59 * 3,69 ns 3,75 ns
Diferença Mínima Significativa (5%) 123,23 96,73 76,02
Coeficiente de Variação (%) 13,63 12,10 13,16
a,b
Dentro de um mesmo factor, índices distintos na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05) entre médias pelo teste de Tukey
(1)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1010 UFC/g do produto)
(2)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1,6 x 109 UFC/g do produto) e Bacillus licheniformis (1,6
x 109 UFC/g)
(3)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Saccharomyces cerevisiae (8 x 109 UFC/g do produto)
(4)
Probiótico fornecido na água de bebida, apenas no 1o dia de vida, a base de Lactobacillus reuteri (6,6 x 109 UFC/g) e Lactobacillus johnsonii (3,3
x 109 UFC/g)

129
Pelicano, E.R.L. et al. RPCV (2003) 98 (547) 125-134

Figura 2 - Eletronmicrografias de varredura das vilosidade intestinais do duodeno (D), jejuno (J) e íleo (I), de frangos de corte, aos 42 dias de idade,
alimentados com probiótico na ração durante toda a fase experimental, a base de Bacillus subtilis (1010 UFC/g do produto) e Bacillus licheniformis (1,6
x 109 UFC/g)

ficativamente (P<0,01) menor altura e perímetro de
vilo no duodeno, em relação àquelas que receberam
os probióticos. Esses resultados discordam dos obti-
dos por Loddi (1998), Sato (2001) e Chiquieri et al.
(2003), que não observaram diferença na morfometria
dos vilos entre os animais do grupo controle e os que
receberam probióticos. Pedroso (1999) ao administrar
probiótico na ração de galinhas poedeiras contendo
Bacillus subtilis observou que a maior altura de vilo
foi proveniente do tratamento cuja administração do
probiótico foi contínua, e que a menor altura foi decor-
rente de sua não administração.
Sabe-se que o equilíbrio entre 2 processos: renova-
ção celular (proliferação e diferenciação), resultante
das divisões mitóticas sofridas por células totepotentes
(stem cels) localizadas na cripta e ao longo dos vilos
(Uni et al., 1998; Applegate et al., 1999; Uni et al.,
2000) e perda de células (extrusão) que ocorre nor-
malmente no ápice dos vilos, determinam um turno-
ver celular (síntese-migração-extrusão) constante, ou
seja, a manutenção do tamanho dos vilos e, portanto,
a manutenção da capacidade digestiva e de absorção
intestinal. Entretanto, quando o intestino responde a
algum agente (microrganismos, por exemplo), com um
desequilíbrio no turnover a favor de um dos processos
citados acima, ocorre uma modificação na altura, bem

Tabela 3 - Valores médios de perímetro de vilo no intestino delgado de frangos de corte alimentados com probióticos na ração e na
água de bebida aos 42 dias de idade
Perímetro de Vilo (µm)
Parâmetro Avaliado
Duodeno Jejuno Íleo
Controle vs Probióticos
Controle 2851,50 b 3259,41 a 2312,45 a
Probióticos 3852,22 a
3320,25 a
2558,71 a
Teste F 18,48 ** 0,14 ns 2,81 ns
Teste F para Interacção R x A 1,77 ns 2,73 ns 1,75 ns
Probiótico na Ração (R)
Bacillus subtilis (1)
4025,48 a
3462,91 a 2722,13 a
Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis (2) 3967,98 a 3406,94 a 2525,24 a
Saccharomyces cerevisiae (3)
3563,20 a
3090,90 a
2428,75 a
Teste F 2,73 ns 3,64 * 2,42 ns
Diferença Mínima Significativa (5%) 543,87 374,84 342,90
Probiótico na Água de Bebida (A)
Sem Probiótico na Água de Bebida 3646,94 b
3184,43 b 2658,59 a
Com Probiótico na Água de Bebida
Lactobacillus reuteri + Lactobacillus johnsonii (4)
4057,49 a 3456,07 a 2458,83 a
Teste F 5,43 * 5,01 * 3,24 ns
Diferença Mínima Significativa (5%) 366,32 252,47 230,96
Coeficiente de Variação (%) 11,63 8,98 10,78
a,b
Dentro de um mesmo factor, índices distintos na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05) entre médias pelo teste de Tukey
(1)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1010 UFC/g do produto)
(2)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1,6 x 109 UFC/g do produto) e Bacillus licheniformis (1,6
x 109 UFC/g)
(3)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Saccharomyces cerevisiae (8 x 109 UFC/g do produto)
(4)
Probiótico fornecido na água de bebida, apenas no 1o dia de vida, a base de Lactobacillus reuteri (6,6 x 109 UFC/g) e Lactobacillus johnsonii (3,3 x
109 UFC/g)

130
 Pelicano, E.R.L. et al. RPCV (2003) 98 (547) 125-134

Figura 3 - Eletronmicrografias de varredura das vilosidade intestinais do duodeno (D), jejuno (J) e íleo (I), de frangos de corte, aos 42 dias de idade,
alimentados com probiótico na ração durante toda a fase experimental, a base de Saccharomyces cerevisiae (8 x 109 UFC/g do produto)

como no perímetro dos vilos. Assim, se ocorrer um de adesão na mucosa intestinal, diminuindo a incidên-
aumento na taxa de mitose com ausência, diminuição cia de diarreias e melhorando a absorção dos nutrien-
ou manutenção da taxa de extrusão, deverá haver um tes disponíveis, sendo que esse mecanismo interfere
aumento no número de células e consequentemente um directamente no restabelecimento da mucosa intestinal,
aumento na altura e no perímetro dos vilos e até pre- aumentando a altura das vilosidades.
gueamento da parede dos mesmos. Se o estímulo levar O uso do probiótico na água de bebida contendo uma
a um aumento na taxa de extrusão, havendo manuten- mistura de Lactobacillus sp., proporcionou uma maior
ção ou diminuição na taxa de proliferação, o intestino altura de vilo no duodeno, bem como um maior perí-
deverá responder com uma redução na altura dos vilos metro de vilo no duodeno e no jejuno (P<0,05), sendo
e, consequentemente diminuição em sua capacidade esses resultados semelhantes aos obtidos por Dobro-
de digestão e absorção (Pluske et al., 1997). Segundo gosz et al. (1991), ao adicionarem Lactobacillus reu-
Ribeiro (1996), as células viáveis (probióticos) com- teri na ração de frangos de corte aos 42 dias de idade.
petem com os microrganismos patogénicos pelos sítios Com relação a profundidade de cripta, não foram
Tabela 4 - Valores médios de profundidade de cripta no intestino delgado de frangos de corte alimentados com probióticos na ração
e na água de bebida aos 42 dias de idade
Profundidade de Cripta (µm)
Parâmetro Avaliado
Duodeno Jejuno Íleo
Controle vs Probióticos
Controle 122,51 a
97,25 a 88,38 a
Probióticos 139,10 a
103,26 a
97,40 a
Teste F 2,27 ns 1,17 ns 1,45 ns
Teste F para Interacção R x A (5)
49,04 ** 40,20 ** 8,63 **
Probiótico na Ração (R)
Bacillus subtilis (1) 165,64 a 112,79 a 114,95 a
Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis (2)
152,80 a 114,03 a 100,71 a
Saccharomyces cerevisiae (3)
98,85 b
82,96 b
76,53 b
Teste F 24,22 ** 23,47 ** 15,65 **
Diferença Mínima Significativa (5%) 25,68 12,95 17,50
Probiótico na Água de Bebida (A)
Sem Probiótico na Água de Bebida 140,27 a
102,67 a 98,61 a
Com Probiótico na Água de Bebida 137,92 a 103,86 a 96,18 a
Lactobacillus reuteri + Lactobacillus johnsonii (4)
Teste F 0,08 ns 0,08 ns 0,18 ns
Diferença Mínima Significativa (5%) 17,30 8,72 11,79
Coeficiente de Variação (%) 14,90 10,03 14,45
a,b
Dentro de um mesmo factor, índices distintos na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05) entre médias pelo teste de Tukey
(1)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1010 UFC/g do produto)
(2)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1,6 x 109 UFC/g do produto) e Bacillus licheniformis (1,6
x 109 UFC/g)
(3)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Saccharomyces cerevisiae (8 x 109 UFC/g do produto)
(4)
Probiótico fornecido na água de bebida, apenas no 1o dia de vida, a base de Lactobacillus reuteri (6,6 x 109 UFC/g) e Lactobacillus johnsonii (3,3
x 109 UFC/g)
(5)
Desdobramento da Interacção apresentado na Tabela 5

131
Pelicano, E.R.L. et al. RPCV (2003) 98 (547) 125-134

Tabela 5 - Valores médios do desdobramento da interacção (Probiótico na Ração x Probiótico na Água de Bebida) para profundidade
de cripta no intestino delgado de frangos de corte aos 42 dias de idade
Parâmetro Avaliado Profundidade de Cripta (µm)
Probiótico na Ração (R)
Bacillus subtilis (R1) B. subtilis + Saccharomyces cerevi-
Probiótico na Água de Bebida (A) B. licheniformis (R2) siae (R3)
Duodeno
Sem Probiótico na Água de Bebida(A0) 124,97 Bb* 209,97 Aa 85,87 Ac

Com Probiótico na Água de Bebida 206,31 Aa 95,63 Bb 111,82 Ab

L. Reuteri + L. johnsonii (A1)
Jejuno
Sem Probiótico na Água de Bebida(A0) 94,46 Bb 139,46 Aa 74,09 Bc

Com Probiótico na Água de Bebida 131,13 Aa 88,61 Bb 91,83 Ab

L. Reuteri + L. johnsonii (A1)
Íleo
Sem Probiótico na Água de Bebida(A0) 106,22 Aa 118,47 Aa 71,15 Ab

Com Probiótico na Água de Bebida 123,67 Aa 82,95 Bb 81,91 Ab

L. Reuteri + L. johnsonii (A1)

* Médias com letras distintas diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05); maiúsculas na vertical e minúsculas na horizontal
( )

(R1)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1010 UFC/g do produto)
(R2)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1,6 x 109 UFC/g do produto) e Bacillus licheniformis (1,6
x 109 UFC/g)
(R3)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Saccharomyces cerevisiae (8 x 109 UFC/g do produto)
(A1)
Probiótico fornecido na água de bebida, apenas no 1o dia de vida, a base de Lactobacillus reuteri (6,6 x 109 UFC/g) e Lactobacillus johnsonii (3,3
x 109 UFC/g)

observadas diferenças neste parâmetro entre o grupo
controle e os tratamentos que receberam os probióti-
cos, sendo esses resultados semelhantes aos obtidos
por Loddi (1998), entretanto contrários aos de Bradley
et al. (1994).
Houve interacção significativa entre os factores
estudados (probiótico na ração x probiótico na água
de bebida), onde a associação de Bacillus subtilis e
Saccharomyces cerevisiae à culturas de Lactobacillus
reuteri e Lactobacillus johnsonii foram decisivos para
ocasionar maiores profundidades de cripta. Esses
resultados corroboram em partes aos obtidos por
Dobrogosz et al. (1991) e Schwarz et al. (2002), que
também relataram maiores profundidades de cripta em
aves suplementadas com culturas de Lactobacillus sp.
Menores profundidades de cripta (P<0,01) foram
obtidas no duodeno, jejuno e íleo, das aves que rece-
beram probiótico na ração a base da levedura Sac-
charomyces cerevisiae, sendo que esses resultados
concordam com os obtidos por Bradley et al. (1994).
Entretanto, Schwarz et al. (2002), observou que maio-
res profundidades de cripta foram obtidas com o uso
de Saccharomyces cerevisiae em relação ao uso de cul-
turas de Bacillus subtilis. De acordo com Pluske et al.
(1997), maior valor de profundidade de cripta indica
maior actividade proliferativa celular, para garantir
adequada taxa de renovação epitelial, compensando as
perdas nas alturas das vilosidades, facto este contradi-
tório ao que se observou neste experimento, uma vez
que não houve diferença na altura dos vilos com o uso
de diferentes probióticos na ração, no duodeno, jejuno
e íleo.
A densidade de vilos por segmento intestinal foi
decrescente na seguinte ordem: íleo, jejuno e duodeno,
sendo que esses resultados corroboram aos descritos
na literatura por Yamauchi e Ishiki (1991). De acordo
com Macari (1995), a densidade e tamanho de vilos,
bem como de microvilos, em cada segmento do
intestino delgado, confere características próprias aos
mesmos, sendo que na presença de nutrientes a capa-
cidade absortiva é proporcional a densidade e tamanho
dos vilos ou seja, à área de superfície disponível para
absorção.
Independente da utilização de probióticos, a forma
dos vilos observada neste experimento reflectiu a
encontrada na literatura. Para o duodeno, as vilosida-
des apresentaram-se mais esparsas, em menor número
e em formato de folhas, sendo o mesmo também rela-
tado por Yamauchi e Ishiki (1991) e Sato (2001). O
jejuno apresentou um arranjo de vilosidades em forma
de ziguezague, sugerindo às vezes um formato de
onda, sendo esses resultados semelhantes aos obtidos
por Loddi (1998) e Loddi (2003). Segundo Yamauchi e
Ishiki (1991) esta forma de organização entre os vilos
pode possibilitar uma estrutura mais eficiente de absor-
ção de nutrientes do que quando os vilos se apresentam
em uma organização paralela ou aleatória. Isto ocorre-
ria porque o caminho percorrido pelo bolo alimentar

132
 Pelicano, E.R.L. et al. RPCV (2003) 98 (547) 125-134

Tabela 6 - Valores médios da densidade de vilos (número de vilo/1.145.306 µm2) por segmento de intestino delgado de frangos de
corte alimentados com probióticos na ração e na água de bebida aos 42 dias de idade
Densidade de Vilos
Parâmetro Avaliado Duodeno Jejuno Íleo
Controle vs Probióticos
Controle 17 a 20 a 24 a
Probióticos 13 a 22 a 29 a
Teste F 2,65 ns 0,36 ns 2,84 ns
Teste F para a Interacção R x A 0,87 ns 0,02 ns 2,20 ns
Probiótico na Ração (R)
Bacillus Subtilis (1) 17 a 28 a 38 a
Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis (2)
14 a
27 a
33 a
Saccharomyces cerevisiae (3) 18 a 27 a 36 a
Teste F 1,42 ns 0,05 ns 2,21 ns
Diferença Mínima Significativa (5%) 6,33 7,59 7,09
Probiótico na Água de Bebida (A)
Sem Probiótico na Água de Bebida 20 a 31 a 39 a
Com Probiótico na Água de Bebida
Lactobacillus Reuteri + Lactobacillus johnsonii (4)
14 b 24 b 32 b
Teste F 8,09 ** 7,53 * 9,07 **
Diferença Mínima Significativa (5%) 4,27 5,11 4,78
Coeficiente de Variação (%) 29,18 22,37 16,12
a,b
Dentro de um mesmo factor, índices distintos na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05) entre médias pelo teste de Tukey
(1)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1010 UFC/g do produto)
(2)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Bacillus subtilis (1,6 x 109 UFC/g do produto) e Bacillus licheniformis (1,6
x 109 UFC/g)
(3)
Probiótico fornecido na ração durante toda a fase experimental a base de Saccharomyces cerevisiae (8 x 109 UFC/g do produto)
(4)
Probiótico fornecido na água de bebida, apenas no 1o dia de vida, a base de Lactobacillus reuteri (6,6 x 109 UFC/g) e Lactobacillus johnsonii (3,3 x
109 UFC/g)

seria maior no fluxo em ziguezague do que no fluxo
recto, possibilitando assim, um maior contacto entre os
nutrientes e a superfície absortiva do epitélio intestinal.
Para o íleo, todos os tratamentos apresentaram uma
grande densidade de vilos, dificultando até sua indi-
vidualização, sendo que os mesmos apresentaram um
formato de língua.
As aves pertencentes ao grupo controle não diferi-
ram na contagem de vilosidades intestinais em relação
àquelas que receberam probióticos, sendo que esses
resultados corroboram com os obtidos por Sato (2001)
e Loddi (2003).
Já o uso do probiótico na água de bebida proporcio-
nou significativamente menores densidades de vilo, em
todos os segmentos do intestino delgado; entretanto,
segundo Macari (1999) o fato de se possuir uma menor
contagem de vilos por área não implica em menor
capacidade absortiva por segmento, mas sim que
possa ter ocorrido um maior desenvolvimento do vilo
(altura), através do processo de estimulação directa ou
indirecta existente na mucosa, conforme observado
neste experimento.
Como conclusão final, neste experimento, o uso de
probióticos para frangos de corte não se mostrou van-
tajoso, mediante a observação de melhora nos índices
morfométricos intestinais apenas do duodeno.
Agradecimentos
À Universidade Estadual Paulista - FCAV/
Jaboticabal, pela oportunidade de desenvolver o expe-
rimento.
À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.
À FAPESP pelo recurso financeiro.
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RPCV (2003) 98 (547) 135-138
Vaginal cytology in queens with estrus induced with equine
chorionic gonadotrophin
Citologia vaginal em gatas com estro induzido por gonadotrofina
coriônica eqüina
Marcos Renato Franzosi Mattos*a, Lucilene Simões-Mattosb, Lúcia Daniel Machado da Silvab
Universidade Estadual do Ceará (UECE), Faculdade de Veterinária (FAVET), Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) Av.
Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza, Ceará, Brazil. CEP 60.715-100
Summary: In order to determine the indirect influence of seve-
ral doses of equine chorionic gonadotrophin (eCG) on vaginal
cytology, 42 queens were randomly allotted to four groups for
treatment with 0.9% saline (control) or with 25, 40 or 60 IU/Kg
of eCG injected IM. Epithelial and blood cells examined in 135
vaginal smears showed the normal cell pattern of feline estrus.
Mucus was seen in all smears. However, small intermediate cells
were rarely found and the presence of erythrocytes and neutro-
phils was considered negligible. In conclusion, the cell pattern
of the vaginal epithelium of queens with estrus induced with
different doses of eCG was similar to that of queens with natu-
ral estrus. Thus, we may speculate that the hormonal stimulus
occurring in the vaginal epithelium of eCG-induced queens is
the same as that occurring in natural estrus, or that this epithe-
lium responds similarly to different dose of eCG. On this basis,
vaginal cytology may be not an efficient tool for the assessment
of the hormonal environment of queens with induced estrus.
Resumo: Para determinar a influência indirecta de várias doses
de gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) na citologia vaginal,
42 gatas foram distribuídas aleatoriamente em quatro grupos
tratados com solução salina 0,9% (controle) ou com 25, 40 ou
60 UI/Kg de eCG via IM. De 135 esfregaços vaginais, foram
examinadas as células epiteliais e sangüíneas, que apresenta-
ram padrão celular normal para o estro felino. Houve presença
de muco em todos os esfregaços. Por outro lado, células do
tipo pequena intermediária foram raramente encontradas, e a
presença de eritrócitos e neutrófilos foi considerada irrelevante.
Podemos concluir que o padrão celular do epitélio vaginal de
gatas com o estro induzido por diferentes doses de eCG foi
semelhante ao de gatas em estro natural. Assim, podemos espe-
cular que o estímulo hormonal sobre o epitélio vaginal em gatas
que receberam eCG é o mesmo do das gatas em estro natural, ou
que este epitélio responde da mesma maneira frente a diferentes
doses de eCG. Neste sentido, a citologia vaginal pode não ser
uma ferramenta eficiente para a avaliação do ambiente hormonal
de gatas com estro induzido.
* Corresponding author: e-mail mattos@latinmail.com,
telephone. +55-85-299-2760, fax +55-85-299-2740.
a
FUNCAP fellowship
b
CNPq fellowship
REVISTA PORTUGUESA
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Introduction
In feline and mainly canine species, vaginal cyto-
logy examination is a current method for the assess-
ment of the stage of estrous cycle and of endocrine or
reproductive pathologies (Herron, 1977; Roszel, 1977;
Toniollo et al., 1995; Vannucchi et al., 1997; Nasci-
mento e Lopez, 1999; Erunal-Maral et al., 2000). This
is due to the high responsiveness of the vaginal epi-
thelium to hormonal fluctuations, especially estrogens,
causing changes in the cellular profile. Increasing
estrogen concentrations determine cell proliferation,
with thickening of the vaginal epithelium layers and
consequent cell differentiation (Papanicolaou, 1942;
Roszel, 1977; Concannon e Digregorio, 1986; Johns-
ton et al., 2001).
Currently, assisted reproductive technologies (ART)
such as estrus synchronization, ovulation induction
and/or superovulation have been developed using the
domestic cat as model for wild felids (Dresser et al.,
1987; Wildt et al., 1992; Swanson et al., 1995. 1998;
Mattos et al., 2001a; Aguiar et al., 2002). However,
low reproductive success is obtained in domestic cats
submitted to ART (Pope, 2000) mainly with gona-
dotrophin therapy (Verstegen et al., 1993; Graham
et al., 2000; Mattos et al., 2001a). It is known that
plasma estradiol-17β concentrations are enhanced
in queens with gonadotrophin-induced estrus, toge-
ther with an early increase in plasma progesterone
concentrations causing hormonal disruption. These
hormonal alterations are considered to be responsible
for the low reproductive success by interfering with
physiological status (Goodrowe et al., 1986; Roth et
al., 1997; Barnes, 2000; Graham et al., 2000). Several
studies using different evaluation methods to deter-
mine how and where this hormonal alteration causes
a low reproductive success have obtained different and
inconclusive results (Herron and Sis, 1974; Goodrowe
et al., 1986; Orosz et al., 1992; Verstegen et al., 1993;
Schramm and Bavister, 1995; Roth et al., 1995,1997;
Barnes, 2000; Graham et al., 2000; Silva et al., 2001).
135
Mattos, M.R.F. et al.
In rats, the vaginal epithelium is highly sensitive to
hormone administration, permitting a reliable endpoint
assessment of hormonal imbalance (Banik and Herr,
1969; Nagaoka et al., 2002). In contrast, the indirect
influence of exogenous gonadotrophins causing the
steroidal hormones imbalance after ART procedures
on the cellular pattern of the vaginal epithelium of
cats is poorly known. Indeed, due to the sensitivity of
the vaginal epithelium to steroid hormones, vaginal
cytology may be an indirect parameter for the deter-
mination of the hormonal environment of gonadotro-
phin-induced estrus in cats. Thus, it is very important
to establish reliable endpoints for the assessment of
the individual hormonal milieu of queens with gona-
dotrophin-induced estrus queens in order to assess the
consequences of ART procedures.
Thus, as the action of equine chorionic gonadotro-
phin (eCG) and FSH are similar concerning the relea-
sing of estrogens, the purpose of the present study was
to access the possibility of the indirect influence on the
vaginal cellular profile of queens by ovarian stimula-
tion with progressive increasing doses of eCG.
Materials and Methods
Animals and treatments
Forty-seven adult intact undefined breed cats (Felis
catus) were used in this trial, 42 queens (body weight
2.5 to 4.8 kg), and five toms (3.5 to 5.8 kg). The ani-
mals were housed in individual cages (80 x 60 x 60
cm) and fed a dry maintenance cat food (Eukanuba
Chiken and Rice Formula, Kitekat and Gatsy) and
water ad libitum throughout the study. In addition, they
were kept free in a commun solarium with sufficient
material for distraction for at least four hours/day. The
experiment was accomplished from February to June
of 2002, in the Fortaleza city, Northeastern Brazil,
situated at 3º 43’ 47” South and 38º 30’ 37” West. In
this region there are few differences in number of hour
per day along the year and the queens show estrous
cycle during all year. In this work, the queens were
Figure 1 - Percentage of epithelial vaginal cells (mean ± SEM) of the
vaginal smears from 42 domestic queen (Felis catus) in natural (control)
or induced estrus at different doses of eCG. PB - Parabasal; SI - Small
intermediate; LI - Large intermediate; NS - Nucleated superficial; AS -
Anucleated superficial. p ≤ 0.01.
136
RPCV (2003) 98 (547) 135-138
maintained in natural light (approximately 12 h light /
12 h dark). The queens were randomly allotted to four
groups receiving different doses of eCG (IU/kg/IM) as
follows: 0 (control group), 25, 40 and 60. The estrous
cycles were daily monitored, with evaluation of the
peculiar signs of each phase according to previous
studies (Banks, 1986; Johnston et al., 2001; Silva et
al., 2001). On the fifth day of interestrus, the queens
received a single injection of eCG. The control group
was considered as natural estrus and received only
1 mL of saline solution (0.9%). After hormonal or
placebo injection, the queens were exposed daily to
the toms until male acceptance, although at that time
mating was prevented by us. Twenty-four and 48 h
after the first day of male acceptance by queens, four
mating episodes were allowed to occur over a period
of two hours. It is important to point out that this study
is part of a wide trial which evaluates the effects of
gonadotrophins on different reproductive parameters
(data not shown). This explains the mating procedures
cited above. Thus, only vaginal cytology findings will
be mentioned.
Vaginal cytology
Ten to 15 minutes after the last mating, vaginal cells
were obtained by gently passing a sterile cotton-tipped
swab into the vaginal canal followed by a quick 180º
rotation. The cells were transferred to one or two
slides, air dried, and immediately fixed with 100%
ethanol. The smears were stained with hematoxylin
and eosin, modified (Mattos et al., 2001b). A total
of 135 vaginal smears were obtained from the four
different treatments on the second and third days of
permitted mating. Twenty-six slides were prepared for
the control group, 36 for the 25 IU group, 34 for the 40
IU group, and 39 for the 60 IU group.
Evaluation of vaginal cells
Smears were examined under a light microscope at
magnifications of X32, X100, X400 and X1000. Two-
Figure 2 - Percentage of epithelial vaginal cells (mean ± SEM) of exfo-
liates vaginal smears of domestic queen (Felis catus) at first and second
days of mating. PB - Parabasal; SI - Small intermediate; LI - Large
intermediate; NS - Nucleated superficial; AS - Anucleated superficial. p
≤ 0.01.
Mattos, M.R.F. et al.
hundred epithelial cells from each slide were evaluated
and classified according to previous studies (Concan-
non e Digregorio, 1986; Shille et al., 1979; Mattos et
al., 2001b) as: parabasal (PB), small intermediate (SI),
large intermediate (LI), nucleated superficial (NS)
and anucleated superficial (AS). Blood cells, mainly
erythrocytes and neutrophils, as well as the presence of
the mucus and cellular debris were also recorded.
Statistical analysis
All data were analyzed by SAS. Cell type data were
log transformed and were reported as mean ± SEM.
The effect of the different doses of eCG on the vaginal
cell profile was analyzed by General Linear Model
(GLM). Data for the control group and treated groups
were compared by Dunnett’s test. Student’s t test was
performed to compare each treatment as well as the
mean of all groups on the first and second days of
mating acceptance. Values were considered statistically
significant when p<0.01.
Results
Figure 1 shows that there was no difference in the
percentage of epithelial vaginal cells from the vaginal
smears obtained for each treatment. Similarly, no diffe-
rences in cell type were detected between the first and
second day of mating within each group or when the
mean for all groups were compared (Figure 2). Few
parabasal cells and small and large intermediate cells
were present, in contrast to nucleated and anucleated
superficial cells. No cell debris were found in any
smear. In contrast, mucus and spermatozoa were detec-
ted in all smears. Concerning blood cells, neutrophils
were not found in any smear and only one erythrocyte
was seen on one slide obtained on the second day of
mating from the 40 IU group. Thus, the presence of
neutrophils and erythrocyte was considered negligible
in this trial.
The elapsed time, in days, between the application of
the treatment and the mating acceptance was of 18.03
± 7.69 for control group; 2.68 ± 1.12 for 25 UI group;
2.89 ± 1.36 for 40 UI; and 2.37 ± 1,65 for 60 UI.
Discussion
Exogenous gonadotropin administration to cats
causes several pathological alterations such as altered
cyclicity, exacerbated estrous behavior, follicular cysts,
feline mammary fibroadenoma, pyometra, and other
alterations (Dresser et al., 1987; Silva et al., 2001).
On this basis, we speculated that gonadotropin would
have an indirect action on the differentiation of vaginal
epithelial cells observed by vaginal cytology. However,
our findings rejected this hypothesis since each gona-
dotropin dose yielded the same results (Figure 1). In
RPCV (2003) 98 (547) 135-138
this respect, examination of the cell profile by vaginal
cytology during the estrous cycle may be an inefficient
tool for the evaluation of the hormonal environment in
cats with induced estrus.
In this trial, the profile of the epithelial cells detected
on vaginal smears for feline estrus was similar to the
findings reported by other authors for feline natural
cycles (Mowrer et al., 1975; Herron, 1977; Mills et
al., 1979; Shille et al., 1979; Toniollo et al., 1995.
Nascimento and Lopez, 1999; Aragão and Ferreira,
2000; Johnston et al., 2001). According to Johnston
et al. (2001), no cell debris were found. The presence
of mucus and spermatozoa in all smears has also been
reported in previous studies (Mowrer et al., 1975;
Herron, 1977).
The vaginal epithelial profile was the same for the
first and second day of mating (Figure 2), suggesting
that collection of a vaginal smear with a swab and
mating do not alter exfoliated cells. In addition, the
interval of one day during estrus also caused no chan-
ges in cell profile. Interestingly, some cat breeders
believe that mating causes vaginal bleeding which
is necessary for conception. However, in the present
trial as well as in all the available scientific literature
the erythrocytes were absent (Mowrer et al., 1975;
Herron, 1977; Shille et al., 1979; Mills et al., 1979;
Nascimento and Lopez, 1999; Johnston et al., 2001).
In addition, according to Johnston et al. (2001), exclu-
ding anestrus and the pregnancy/pseudopregnancy
phases of the estrous cycle, white blood cells are
usually absent or rarely found in vaginal smears from
queens. In addition, in contrast to canine vaginal
smears, no erythrocytes are observed in queens during
proestrus/estrus.
In conclusion, the cellular pattern of the vaginal epi-
thelium of queens with eCG- ovarian stimulation at the
schedule and dose used in the present study was simi-
lar to that of natural estrus. Thus, the indirect hormonal
stimulus of the vaginal epithelium was the same, even
with progressive increasing doses of eCG.
Acknowledgements
The authors wish to thank FUNCAP and CNPq for
fellowships, and EFFEM do Brasil for supplying Kite
Kat food. We also wish to thank Dr. Manuel Odorico
de Morais, Departamento de Farmacologia, Universi-
dade Federal do Ceará (UFC), and Margarida Maria de
Lima Pompeu, Núcleo de Medicina Tropical – UFC,
for facilities.
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COMUNICAÇÃO BREVE
Um caso de adenocarcinoma prostático canino de baixa agressividade:
estudo dos AgNORsa
A case of low-grade canine prostate adenocarcinoma: AgNOR studya
J.F. Silva * e J.J. Correia
SEPAT, DEMOC, Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos (Polo Universitário - Alto da Ajuda), 1300-477 Lisboa, Portugal.
Resumo: Estuda-se um caso de carcinoma prostático (CaP) num
cão (Canis familiaris) de raça indeterminada com mais de 6 anos
(idade exacta não determinada). As características anatómicas,
histológicas e relativas à contagem dos organizadores nucleola-
res corados pela prata (AgNORs) indicam que o CaP é de baixa
agressividade, o que é pouco frequente no cão. A próstata tinha
um aspecto macroscópico normal, não foram detectadas metás-
tases macroscópicas nas vísceras toraco-abdominais, o CaP
era ao exame histológico moderadamente diferenciado (grau
de Gleason 6) e o número médio de AgNORs por núcleo (NM
AgNORs) era de 2,16 ± 1,01, significativamente menor do que
a média dos NM AgNORs de oito outros CaP caninos (3,61 ±
0,67). Notaram-se também lesões de displasia intraductal prostá-
tica (prostatic intraepithelial neoplasia – PIN). A comparação do
NM AgNORs das áreas de PIN, igual a 2,02 ± 0,85, com os NM
AgNORs obtidos em áreas de atrofia dos tubuloalvéolos (1,22 ±
0,52), de hiperplasia benigna (1,35 ± 0,58) e de CaP, indica que
a PIN canina, tal como a humana, é muito possivelmente uma
lesão pré-cancerosa.
Palavras-chave: cão; próstata; carcinoma; organizadores nucle-
olares; AgNOR; displasia intraductal prostática.
Summary: A case of prostatic carcinoma (PCa) in a more than
six year-old mongrel dog (Canis familiaris) is reported. The
anatomical, histological and argyrophilic nucleolar organizer
regions (AgNOR) – related characteristics suggest that this PCa
may have low biologic agressivity, which is rather infrequent in
the dog. As a matter of fact, the gross morphology of the gland
was apparently normal, no metastases were macroscopically
detected in the thoracoabdominal organs, the PCa was moder-
ately differentiated (Gleason grade 6) and the AgNOR mean
number per nucleus (NM AgNORs) was 2,16 ± 1,01, which was
significantly lower than the mean of the NM AgNORs found in
other eight canine PCa (3,61 ± 0,67). There were also lesions
of prostatic intraepithelial neoplasia (PIN). Comparing the NM
AgNORs of PIN (2,02 ± 0,85) with the NM AgNORs of atrophic
alveoli (1,22 ± 0,52), glandular benign hyperplasia (1,35 ± 0,58)
and PCa, it is inferred that canine PIN, like the human counter-
part, is most possibly a precancerous lesion.
Keywords: canine; prostate; carcinoma; argyrophilic nucleolar
organizer regions; AgNOR; prostatic intraepithelial neoplasia.
a
Estudo apresentado a 10 de Outubro de 2002 no Congresso de
Ciências Veterinárias, realizado no Tagus Park (Oeiras).
* Correspondente: e-mail jfsilva@fmv.utl.pt, telefone 213 652
888
REVISTA PORTUGUESA
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
A partir de estudos necrópsicos e estatísticos, cal-
cula-se que uma percentagem significativa de carci-
nomas prostáticos (CaP) humanos não se manifesta
clinicamente, sendo aquelas neoplasias achados de
necrópsia (“carcinomas latentes” ou “histológicos”)
(Gittes, 1991). Cerca de 65,8 % dos casos são bem
diferenciados, os restantes moderadamente diferencia-
dos (Brawn et al., 1995). Nos CaP clinicamente detec-
tados, há uma percentagem significativa com um prog-
nóstico relativamente favorável (Lu-Yao e Yao, 1997),
ao contrário do CaP canino, que se reveste, na grande
maioria dos casos, de grande agressividade biológica e
clínica, quer a nível local, quer a nível sistémico, apre-
sentando o animal metástases em 70 a 80 % dos casos
na altura do diagnóstico (Hall et al., 1976; Basinger
e Luther, 1993; Cornell et al., 2000). Além disso,
contrariamente ao que se passa na espécie humana, o
CaP do cão é, normalmente, sob o ponto de vista his-
tológico, moderadamente ou pouco diferenciado. Os
autores deste estudo não têm conhecimento de casos
de CaP canino histologicamente bem diferenciado.
Um cão (Canis familiaris) vadio (portanto, com his-
tória pregressa desconhecida), de raça indeterminada,
sexo masculino, mais de 6 anos de idade (de acordo
com os critérios de exame da dentição de Bourdelle
e Bressou (1953) e de Cornevin e Lesbre (1894)), foi
eutanasiado e o cadáver submetido a uma necrópsia
sumária, cuja finalidade principal era a colheita da
próstata. Esta apresentava uma forma aproximada-
mente esférica, era simétrica em relação ao plano
sagital (Figura 1), a sua superfície era lisa e, em corte
transversal, a uretra prostática não apresentava qual-
quer deformação. Em apreciação qualitativa, o seu
volume era normal ou estava ligeiramente diminuído
tendo em conta a idade aproximada e a corpulência
do animal. As vísceras toraco-abdominais foram ins-
peccionadas superficialmente, não tendo o seu exame
mostrado lesões do tipo metastásico.
A próstata foi cortada segundo vários planos trans-
versais e os fragmentos foram fixados em formol a 10
% neutro tamponado (pH = 7). Alguns foram incluídos
em parafina e os cortes histológicos respectivos, com 5
139
Silva, J.F. e Correia, J.J.
Figura 1 – Corte transversal da próstata passando aproximadamente pelo
ponto médio da uretra prostática. Notar a simetria dos lobos (num deles,
à direita, parte da massa prostática foi retirada). A uretra prostática apre-
senta a sua forma normal em “V”, devido à crista uretral.
µm de espessura, foram corados pela técnica da hema-
toxilina de Ehrlich – eritrosina, sendo os resultados do
exame de rotina os seguintes:
A periferia da glândula apresentava, em todo o seu
perímetro, atrofia dos tubuloalvéolos secretores com
concomitante hiperplasia das células basais, que se
apresentavam vacuolizadas (Figura 2). Nesta orla peri-
férica, notavam-se pequenos focos de tubuloalvéolos
normais ou (mais frequentemente) com hiperplasia
benigna do tipo glandular. Interiormente à zona de
atrofia – HBP, notavam-se áreas de CaP moderada-
mente diferenciado (adenocarcinoma alveolar papilí-
fero da classificação da O.M.S. (Hall et al., 1976) e do
grau 6 da classificação de Gleason (Gleason, 1992))
– Figura 3 – e zonas adjacentes de PIN de alto grau de
padrão micropapilar (Bostwick et al., 1993) situadas
nos ductos excretores (Figura 4). O epitélio da uretra
prostática apresentava morfologia semelhante à do epi-
télio ductal, sem invasão da lâmina própria adjacente.
Figura 2 – Tubuloalvéolos atróficos com concomitante hiperplasia das
células basais, que têm um aspecto vacuolizado. Objectiva 40x.
Para contagem dos organizadores nucleolares
impregnados pela prata (AgNORs), um corte de 5 µm
de espessura foi depositado numa lâmina revestida de
poli-L-lisina e corado segundo a técnica de Ploton et
140
RPCV (2003) 98 (547) 139-143
Figura 3 – Adenocarcinoma prostático. Ácinos de tamanhos diferentes,
revestidos por um epitélio prismático simples ou epitélio estratificado,
que forma papilas sólidas para o lúmen dos ácinos. Objectiva 10x.
Figura 4 – Lesão de PIN de alto grau (padrão micropapilar) num ducto
excretor na metade esquerda da microfotografia. A parte direita desta é
ocupada por ácinos do adenocarcinoma. Objectiva 10x.
al. (Ploton et al., 1986; Derenzini e Ploton, 1991);
a coloração dos AgNORs pela solução coloidal de
AgNO3 durou 25 minutos; a passagem pela solução
de hipossulfito de sódio 3 minutos e não os 10 preco-
nizados por Derenzini e Ploton (1991), já que tempos
maiores levam à descoloração excessiva dos AgNORs
(Silva, 1996). A observação microscópica processou-se
com ocular de x10 e objectiva de x100 com imersão
em óleo. Utilizou-se o processo de contagem de Howat
et al. (1989), aplicado à próstata humana por Ghazi-
zadeh et al. (1991), segundo o qual são considerados
AgNORs todos os pontos argirófilos intranucleares
distintos. Contaram-se os AgNORs de 120 núcleos
interfásicos de células epiteliais prostáticas de áreas
de tubuloalvéolos atróficos, de tubuloalvéolos com
hiperplasia benigna (HBP), de displasia intraductal
prostática (PIN – prostatic intraepithelial neoplasia) e
de CaP, perfazendo um total de 480 núcleos. O número
médio de AgNORs por núcleo (NM AgNORs) em cada
área referida era igual a Σ AgNORs / 120. Os NM
AgNORs por núcleo interfásico obtidos foram (média
± desvio padrão): Atrofia: 1,22 ± 0,52; HBP / normal:
1,35 ± 0,58 (Figura 5); PIN: 2,02 ± 0,85; CaP: 2,16 ±
1,01 (Figura 6).
Silva, J.F. e Correia, J.J.
Figura 5 – Coloração dos AgNORs em núcleos de células glandula-
res prostáticas numa zona de hiperplasia benigna. Nota-se um a dois
AgNORs pequenos na maioria dos núcleos. Objectiva 100x.
Figura 6 – Coloração dos AgNORs em células neoplásicas. Muitos
núcleos encerram numerosos AgNORs. O tamanho de muitos destes é
maior do que o observado na Figura 5. Objectiva 100x.
Compararam-se por meio de um teste “t” de Student
(programa Microsoft ® Excel 2000) as médias dos
seguintes pares, utilizando-se o nível de significância
de 0,05: NM AgNORs Atrofia versus NM AgNORs
HBP; NM AgNORs Atrofia versus NM AgNORs
PIN; NM AgNORs Atrofia versus NM AgNORs
CaP; NM AgNORs HBP versus NM AgNORs PIN;
NM AgNORs HBP versus NM AgNORs CaP; NM
AgNORs PIN versus NM AgNORs CaP.
Os pares com diferença significativa de NM
AgNORs (p < 0,05) foram: Atrofia versus PIN (p <
0,000 1); Atrofia versus CaP (p < 0,0001); HBP versus
PIN (p < 0,0001); HBP versus CaP (p < 0,0001). É
interessante notar-se que o membro da esquerda de
cada par é uma condição benigna, enquanto que o da
direita é uma alteração maligna (CaP) ou presumivel-
mente maligna (PIN). Não houve diferença signifi-
cativa de médias nos pares: Atrofia versus HBP (p =
0,061); PIN versus CaP (p = 0,242).
Também se comparou o NM AgNORs do CaP com
RPCV (2003) 98 (547) 139-143
a média obtida a partir dos NM AgNORs de outros
oito CaP caninos (Spiegel, 1971). Nestes, seis apre-
sentavam metástases, um não as tinha e, no último, os
dados necrópsicos eram insuficientes. Contudo, estes
dois casos apresentavam prostatomegália e a superfí-
cie externa da glândula era rugosa e irregular. Os NM
AgNORs de cada um destes oito casos foram divulga-
dos noutro estudo (Silva e Peleteiro, 2000) e a média ±
desvio-padrão foi de 3,61 ± 0,67, sendo a amplitude de
2,76 a 4,68. No que respeita à comparação desta média
com o NM AgNORs do CaP a diferença era significa-
tiva (p < 0,0001).
Em vários tecidos, o aumento da área e do NM
AgNORs está associado, entre outras situações, a pato-
logia tumoral maligna (Aubele et al., 1994; Hittmair
et al., 1994; Minkus et al., 1997). É este o caso dos
CaP humanos (Gillen et al., 1990; Hansen e Østergård,
1990; Mamaeva et al., 1991; Kobayashi et al., 1992;
Pavlakis et al., 1992; Sakr et al., 1993; Bittinger et
al., 1994) e caninos (Silva e Peleteiro, 2000). Os CaP
humanos com NM AgNORs mais elevados estão asso-
ciados a maior agressividade (Ghazizadeh et al., 1991;
Botticelli et al., 1996; Chiusa et al., 1997). No cão,
não há estudos deste tipo feitos com o CaP, embora a
influência do NM AgNORs no que respeita ao poder
de invasão local ou ao prognóstico tenha sido estabe-
lecida no mastocitoma (Bostock et al., 1989; Simões
et al., 1994), linfoma (Kiupel et al., 1998), carcinoma
mamário (Bostock et al., 1992 - embora haja opiniões
opostas - Bratulić et al., 1996), seminoma (De Vico et
al., 1994) e, talvez, tumor venéreo transmissível (Har-
melin et al., 1995).
O carcinoma deste estudo é moderadamente diferen-
ciado e o NM AgNORs é significativamente inferior
à média dos oito CaP caninos de referência. Devido
ao aspecto macroscópico, estrutura histológica e NM
AgNORs, este CaP é, possivelmente, de malignidade
atenuada. Os autores não se inclinam para a possível
inclusão deste carcinoma no grupo dos carcinomas
latentes, porque o crescimento intraprostático era do
tipo infiltrativo (sem, contudo, atingir a cápsula) e
porque as lesões de displasia intraductal se estendiam
ao urotélio da uretra prostática.
Não se procedeu a uma pesquisa exaustiva de metás-
tases, pois o exame macroscópico da próstata não fazia
suspeitar de CaP: a sua forma esférica (Berg, 1958), o
volume, a simetria e aspecto normal da uretra prostá-
tica em corte transversal da glândula. Assim, não se
pode afirmar com segurança a ausência absoluta de
depósitos metastásicos, até mesmo porque poderia
haver metástases microscópicas (micrometástases).
Além disso, o encéfalo não foi examinado.
Já foram descritos carcinomas do epitélio da uretra
prostática com expansão à próstata (O’Shea, 1967;
Nikula et al., 1989; Kennedy, 1995; Kennedy et al.,
1998). Tem sido sugerido por alguns autores (Kennedy,
1995; Kennedy et al., 1998) que muitos dos CaP cani-
nos descritos são na realidade carcinomas do urotélio
141
Silva, J.F. e Correia, J.J.
da uretra prostática ou da bexiga. Com efeito, notam-se
semelhanças de estrutura histológica entre alguns tipos
de adenocarcinoma alveolar papilífero prostático (Leav
e Ling, 1968; Hall et al., 1976) e o carcinoma vesical
(Pamukcu, 1974). Contudo, outros estudos (Waters e
Bostwick, 1997; Waters et al., 1997) consideram o ade-
nocarcinoma alveolar papilífero canino como genuina-
mente prostático. Os epitélios dos alvéolos prostáticos
e da mucosa da bexiga têm a mesma origem embrioló-
gica (Moore, 1988), sendo possível que alguns tumores
deles derivados possam diferenciar-se numa linha con-
vergente (Clark e English, 1966; Lindeman e Weidner,
1996). No presente caso, a hipótese de a lesão primária
ser uretral e expandir-se secundariamente aos ductos
excretores e massa prostática não parece ser viável,
pois as lesões de PIN eram mais desenvolvidas nos
ductos e o tumor era histologicamente um adenocar-
cinoma típico (Figuras 3 e 4) e não uma neoplasia do
tipo urotelial.
As propriedades imunocitoquímicas da neoplasia
presentemente estudada também apontam para a sua
exclusão dos tumores uroteliais. Com efeito, o epi-
télio displásico da uretra prostática não foi marcado
pelo soro monoclonal 34βE12 (Dako), dirigido contra
citoqueratinas de alto peso molecular (Silva, 1996).
No urotélio de catorze próstatas caninas normais ou
hiperplásicas, treze apresentaram marcação das células
do estrato basal e uma não mostrou qualquer marcação
(Silva, 1996). No homem, os carcinomas do urotélio
são, na grande maioria dos casos, marcados por este
soro (Lindeman e Weidner, 1996).
Este caso apresentava lesões histológicas inequívocas
de PIN, que foram referidas pela primeira vez no cão
por Waters e Bostwick em 1995 (Waters e Bostwick,
1997; Waters e Bostwick, 1997a; Waters et al., 1997;
Aquilina et al., 1998), se bem que com uma frequên-
cia muito superior à notada em outros estudos (Silva,
1996; Silva e Peleteiro, 2000; Rossignol, 2001). A PIN
humana foi histologicamente caracterizada há cerca
de quinze anos por McNeal e Bostwick (1986) e Bos-
twick e Brawer (1987). No caso do presente estudo: a)
a proximidade histológica das áreas de PIN e de CaP;
b) o NM AgNORs da área de PIN, quando comparado
com o NM AgNORs das áreas de atrofia acinosa e
de HBP, por um lado, e o NM AgNORs do CaP, por
outro; fazem pressupor que, tal como no homem, a
PIN é uma lesão pré-cancerosa no cão. Poucos estudos
estão feitos no que respeita aos AgNORs de lesões
prostáticas no cão (Silva, 1996; Silva e Peleteiro, 2000;
Silva, 2001).
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer à D. Maria do Rosário
Luís a execução dos cortes histológicos e a coloração
pela hematoxilina de Ehrlich – eritrosina. Este estudo
está integrado no projecto financiado pelo CIISA com
o código CIISA 4 - Neoplasias (1993).
142
RPCV (2003) 98 (547) 139-143
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143
COMUNICAÇÃO BREVE
O papel da inspecção sanitária post mortem em matadouro na detecção de
lesões e processos patológicos em aves. Quatro casos de lesões compatíveis
com a doença de Marek em carcaças de aves rejeitadas
The role of post mortem sanitary inspection in slaughterhouse on the detec-
tion of poultry lesions and pathological processes. Four cases of Marek
compatible lesions in condemned poultry
Madalena Vieira-Pinto1, T. Mateus1, F. Seixas 2, M. C. Fontes 1 e C. Martins 1
1
Secção dos Produtos Animais. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Apartado 1013.
5001-911 Vila Real. Portugal. mmvpinto@utad.pt
2
Departamento de Patologia e Clínica Veterinária. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Apartado 1013. 5001-911 Vila Real. Portugal.
Resumo: O presente trabalho baseou-se no acompanhamento
da Inspecção Sanitária post mortem de 49121 aves abatidas em
matadouro, durante o qual se procedeu ao registo das causas de
rejeição total e à necropsia de uma amostra das aves rejeitadas
no exame post mortem, com registo e exame histopatológico das
lesões encontradas. O principal objectivo deste trabalho consistiu
no estudo da relação existente entre as causas que conduziram à
rejeição total de carcaças de aves, no decurso da sua inspecção
post mortem na linha de abate, e o quadro lesional identificado
no decurso da sua necropsia após terem sido rejeitadas. A
necropsia de três aves, rejeitadas no exame post mortem pela
presença de caquexia (n = 2) e de traumatismos (n = 1), eviden-
ciou a presença de lesões compatíveis com a Doença de Marek.
Este e outros resultados encontrados, enfatizam a importância da
necropsia de uma amostra de aves rejeitadas por causas inespe-
cíficas (caquexia, má sangria, ascite) em inspecção post mortem,
uma vez que permite a identificação de quadros lesionais, alguns
indicativos de entidades patológicas (ex. Colibacilose, Marek),
que podem passar despercebidos à inspecção sanitária efectuada
na linha de abate. Este procedimento contribui para uma melho-
ria do rigor de informação relativa ao perfil sanitário das aves
abatidas, que é canalizada para os técnicos responsáveis pelo
controlo sanitário dos efectivos avícolas.
Summary: The aim of this research was the analysis of the
relationship between causes of total condemnation of poultry
carcasses during post mortem inspection in the slaughter line,
and associated lesions identified in the necropsy examination of
a sample of rejected carcasses. For this purpose, the causes of
total condemnation during post mortem inspection of a sample
of 49121 poultry were examined, as well as data collected
during necropsy and histopathological examination of lesions
observed in a sample of the condemned animals. Marek dise-
ase compatible lesions were detected in 3 animals along the
necropsy, after their post mortem condemnation for cachexia
(n = 2) and for traumatic processes (n = 1). These and others
results emphasise the importance of meticulous examination of
condemned animals in post mortem inspection for lesions and
pathological processes identification (examples: Colibacilosis,
Marek), which could pass unperceived during the inspection at
the slaughter line. This procedure contributes to an improvement
of the information about poultry’s sanitary profile which is used
by the technicians responsible for the avian sanitary control.
REVISTA PORTUGUESA
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
A identificação, caracterização e registo de proces-
sos patológicos dos animais abatidos em matadouro,
constitui uma fonte de dados importante para a ava-
liação da condição sanitária das explorações, uma vez
que permite identificar a ocorrência de doenças subclí-
nicas nos efectivos e quantificar a gravidade de lesões
que representem manifestações de doenças (Pointon
et al., 1992 e Morés et al., 2000). No entanto, alguns
processos patológicos e algumas lesões que se mani-
festam a nível das vísceras e do interior da carcaça de
aves, podem passar despercebidos durante a inspecção
post mortem efectuada na linha de abate. Esta situação
pode estar relacionada com dois factores principais: i)
a elevada cadência de abate dos modernos matadouros
(Watkins et al., 2000); ii) a possibilidade dos proces-
sos patológicos serem acompanhados de alterações da
conformação corporal, nomeadamente de ascite e de
caquexia, sendo estes motivos suficientes para rejei-
ção imediata da ave, mesmo antes da sua evisceração,
evitando a visualização das lesões a nível dos órgãos
internos.
Por estes motivos, para um melhor conhecimento
das condições patológicas que podem acompanhar
os animais abatidos, considera-se necessário efectuar
não só o registo das causas de rejeição post mortem,
mas também submeter a necropsia uma amostra dos
animais rejeitados na inspecção post mortem na linha
de abate, estando este procedimento em concordân-
cia com o exposto no Decreto-lei Nº 167/96 (Diário
da República – I Série – Nº 208 – 7 de Setembro),
legislação que regulamenta as condições sanitárias
em matéria de produção e colocação no mercado de
carnes frescas de aves de capoeira.
Este estudo teve como principal objectivo o conheci-
mento da relação entre as causas que conduzem a uma
rejeição total das carcaças de aves durante a inspecção
145
Vieira-Pinto, M. et al. RPCV (2003) 98 (547) 145-148

post mortem na linha de abate e o quadro lesional iden-
tificado no decurso da necropsia das aves rejeitadas.
Para atingir este objectivo, efectuaram-se 12 visitas,
durante um mês, a um matadouro de aves da Região
Norte, tendo-se acompanhado a inspecção sanitária
post mortem de 49121 aves, realizada na linha de abate
(35700 broilers, 10000 frangos do campo e 3421 gali-
nhas poedeiras). Registaram-se as causas de rejeição
total das aves abatidas e efectuaram-se necropsias a
uma amostra (duas a três aves por dia) das aves rejei-
tadas (18 broilers e 8 frangos do campo) seleccionadas
aleatoriamente. Durante a necropsia registaram-se
as lesões encontradas e recolheram-se amostras para
diagnóstico histopatológico. Este material foi fixado
com formalina a 10% e os tecidos assim tratados foram
processados pelos métodos standard para a observação
ao microscópio. Os preparados de parafina foram cora-
dos com Hematoxilina e Eosina (HE).
Da inspecção post mortem resultou a rejeição de 247
(0,69%) broilers, de 84 (0,84 %) frangos do campo e
de 13 (0,38%) galinhas poedeiras. As causas de rejei-
ção encontram-se descritas na Tabela 1.
Pela análise desta tabela constata-se que as causas
que contribuíram para uma maior rejeição post mortem
a nível da linha de abate foram: i) os traumatismos, a
caquexia e a ascite, nos broilers; ii) a má sangria, nos
frangos do campo; iii) a salpingite, nas galinhas poe-
deiras.
Apenas esta última situação (salpingite) é iden-
tificada no decurso da evisceração, contrariamente
às anteriores que são detectadas antes desta etapa,
podendo as carcaças ser rejeitadas e retiradas, por evis-
cerar, da linha de abate, não permitindo a inspecção de
rotina das vísceras e a identificação de eventuais lesões
existentes. As lesões compatíveis com a doença de
Marek, nomeadamente espleno e hepatomegália com
infiltrações nodulares tumorais, foram identificadas
apenas num animal.
As lesões macroscópicas registadas e o resultado
histopatológico das amostras recolhidas no decurso da
necropsia de 18 broilers (13,7% dos broilers rejeitados)
e de 8 frangos do campo (10,5% dos frangos do campo
rejeitados) rejeitados em exame post mortem na linha
de abate, encontram-se apresentados na Tabela 2.
A necropsia dos 8 broilers rejeitados post mortem
pela presença de ascite, os quais foram retirados da
linha de abate por eviscerar, evidenciou, em todas as
aves, a presença de lesões viscerais, principalmente
a nível do fígado (n = 4) e do coração (n = 1) ou em
ambos (n = 2). Este resultado está de acordo com o
exposto por Riddell (1997) o qual refere que, nas aves,
dois dos principais factores que conduzem ao apareci-
mento de ascite são lesões hepáticas, que dificultam o
retorno venoso, e lesões cardíacas.
Segundo Stuart (1993) a caquexia é uma das prin-
cipais causas de rejeição post mortem de carcaças em
matadouro. Tal facto está de acordo com os resultados
obtidos no nosso trabalho, no qual a caquexia repre-
sentou a segunda maior causa de rejeição (22,67%),
conforme já foi referido anteriormente. Para este autor,
a caquexia pode estar associada à presença de artropa-
tias, doença crónica e parasitismo. A necropsia de 13
aves (9 broilers e 4 frangos de campo) rejeitadas post
mortem por caquexia, revelou a presença de lesões a
nível dos órgãos internos (ex. Hepatite parasitária -1,
Enterite necrótica bacteriana -1, Colangiohepatite cró-
nica-1, lesões compatíveis com a doença de Marek -2).
Neste trabalho, atribuímos especial destaque à
doença de Marek, devido à importância que esta
assume nos efectivos avícolas, e porque a sua detec-
ção no matadouro (Figura 1), através da necropsia dos
animais rejeitados, espelha o interesse desta prática
no melhor conhecimento do perfil sanitário das aves
abatidas.
Segundo Calnek (1997) as aves com Doença de
Marek podem apresentar sinais não específicos tais
como perda de peso, palidez, anorexia e diarreia e, se
estes animais forem sujeitos durante algum período a
uma má nutrição, podem evidenciar caquexia.
Na fase aguda da Doença de Marek, os tumores
linfóides podem ocorrer em vários órgãos. As gónadas
são dos órgãos mais afectados, mas as lesões linfo-
matosas também podem ser observadas no pulmão,
coração, mesentério, rim, fígado, baço, timo, glândula

Tabela 1 Causas de rejeição total de 344 aves no decurso de inspecção post mortem em matadouro.

Causas de rejeição Broilers Frangos do campo Galinhas poedeiras TOTAL

post mortem n n n n (%)
Traumatismo 103 - - 103 (29,94)
Caquexia 62 15 1 78 (22,67)
Ascite 70 - - 70 (20,35)
Má sangria 8 56 - 64 (18,6)
Dermatite/lesão de pele 4 12 2 18 (5,23)
Salpingite - - 8 8 (2,33)
Peritonite não específica - - 2 2 (0,58)
Lesões compatíveis com Doença de Marek - 1 - 1 (0,29)
TOTAL 247 84 13 344 (100)

146
Vieira-Pinto, M. et al. RPCV (2003) 98 (547) 145-148

Tabela 2 Causas de rejeição post mortem, lesões macroscópicas e diagnóstico histopatológico das amostras recolhidas no decurso da
necropsia de 18 broilers e de 8 frangos do campo rejeitados em exame post mortem na linha de abate.

Causas de rejeição n Lesões Diagnóstico

macroscópicas histopatológico
Broilers
1 Hemorragia do pericárdio Pericardite granulomatosa
1 Alteração da coloração do fígado e petéquias Hepatite e Perihepatite fibrinosa. Enterite catarral
intestinais
1 Ascite e hepatite fibrinosa Perihepatite fibrinosa

Ascite 1 Divertículo intestinal Enterite catarral e granuloma parasitário

1 Alteração da coloração e textura do fígado e peté- Enterite catarral, hepatite e peritonite
quias intestinais
1 Petéquias intestinais e hepáticas. Alteração da
coloração e textura do fígado
1 Alteração da coloração e textura do fígado. Peté-
quias cardíacas e hidropericárdio
1 Alteração de coloração do fígado. Pericardite
Ascite e trauma-
tismo
1 Alteração da coloração do fígado
1 Massas de consistência dura no intestino
1 Má sangria. Dilatação da parte anterior do intes-
tino
1 Hepatomegália e fígado pálido e friável
1 Alteração da coloração do fígado.
Caquexia 1 Peritonite e alteração da coloração do fígado
1 Espleno e hepatomegália com infiltrações de cor
esbranquiçada no parênquima hepático e esplé-
nico
1 Espleno e hepatomegália com infiltrações de cor
esbranquiçada no parênquima hepático e esplé-
nico
1 Fígado pálido e com aumento de volume
Má sangria 1 Peritonite, alteração da coloração do fígado e
congestão intestinal
Frangos do campo
1 Área pálida no coração. Lesão focal no baço.
Traqueia com muita espuma
1 Artrites. Músculo pálido e edematoso. Fígado
Caquexia
pálido e friável .
1 Massa encapsulada adjacente à cabeça, que ao
corte contém material amorfo em estratos e de
diferentes colorações
1 Hepatomegália
1 Edema e hemorragia subcutânea. Esplenome-
Traumatismo gália. Hepatomegália e fígado com alteração da
coloração
1 Artrites. Fígado com alteração da coloração.
Má sangria Enterite
1 Alteração da coloração do fígado
Lesões compatíveis Hepato e esplenomegália com infiltrações de cor
com Doença de 1 esbranquiçada no parênquima hepático e esplé-
Marek nico
Esteatose e colestase. Enterite catarral
Pericardite subaguda e esteatose hepática
Pericardite fibrinosa. Hepatite e Perihepatite
necrótica – Lesões compatíveis com Colisepticé-
mia.
Hepatite parasitária
Enterite catarral e granuloma parasitário
Enterite necrótica bacteriana e granuloma parasi-
tário
Esteatose hepática
Hepatite e microtrombose sinusoidal
Hepatite subaguda
Lesões linfoproliferativas, compatíveis com
Doença de Marek
Lesões linfoproliferativas, compatíveis com
Doença de Marek
Esteatose e hepatite subaguda
Pericolangite, enterite parasitária (coccidiose)
Miocardite focal. Esplenite granulomatosa. Tra-
queite catarral
Degenerescência muscular e hepática
Dermatite granulomatosa bacteriana.
Colangiohepatite crónica
Lesões linfoproliferativas compatíveis com
Doença de Marek
Hepatite subaguda. Enterite
Colestase e hepatite subaguda
Lesões linfoproliferativas compatíveis com
Doença de Marek

147
Vieira-Pinto, M. et al.
Figura 1 – Lesões compatíveis com Doença de Marek. Hepato
e esplenomegália com descoloração difusa do parênquima e neo-
formações nodulares tumorais.
adrenal, pâncreas, proventrículo, intestino, íris, mús-
culo esquelético e pele. Os órgãos afectados encon-
tram-se frequentemente aumentados (Powell e Payne,
1993; Ritchie, 1995; Bremner e Mac Johnson, 1996 e
Calnek, 1997).
Na presença destas lesões, é necessário estabelecer
diagnósticos diferenciais. Esta doença pode ser facil-
mente confundida com a leucose linfóide, mas esta
última ocorre entre os 5 e os 9 meses de idade, contra-
riamente à primeira que ocorre por volta da 6ª semana
de vida (Beyer et al., 1980 e Payne, 1993). Por outro
lado, a bolsa de Fabricius, normalmente, apresenta-se
apenas atrofiada, raramente desenvolvendo tumores,
contrariamente ao que acontece no caso da leucose
(Beyer et al., 1980, Fadly e Crittenden, 1987 e Calnek,
1997).
Também se deve fazer o diagnóstico diferencial com
a reticuloendoteliose e com a histiocitose multicên-
trica, assim como com outras doenças que apresentem
lesões semelhantes ou sinais de parésia, nomeada-
mente a mieloblastose, a eritroblastose, o carcinoma
do ovário, a deficiência em riboflabina, a tuberculose, a
histomonose, a Doença de Newcasttle e a encefalomie-
lite aviar (Hafner et al., 1996 e Calnek, 1997).
Os resultados das rejeições post mortem na linha
de abate, observados neste estudo, indicam-nos que
dos 344 animais rejeitados apenas 11 (3,2 %) o foram
após evisceração das carcaças, tendo os restantes 333
(96,8 %) sido rejeitados antes desta etapa. Tal facto
pode impedir a identificação de eventuais lesões vis-
cerais associadas, as quais podem traduzir a presença
de entidades patológicas, como comprovam os três
casos de lesões compatíveis com a Doença de Marek
(forma visceral) encontrados neste estudo, que foram
identificados apenas no decurso da necropsia das aves
que tinham sido rejeitadas no exame post mortem,
duas por apresentarem caquexia e uma por evidenciar
traumatismos. Outras lesões como pericardites, hepa-
tites, peritonites, degenerescência muscular, enterites,
também foram encontradas em carcaças rejeitadas
antes da evisceração. A informação acrescida, relativa
aos animais rejeitados no matadouro, que pode ser
148
RPCV (2003) 98 (547) 145-148
obtida através da necropsia, permite alertar os respon-
sáveis pela sanidade do efectivo avícola para a existên-
cia de potenciais problemas, permitindo-lhes tomar as
decisões que julgarem convenientes para um melhor
entendimento do problema (ex. necropsia de uma
maior quantidade de aves, análises microbiológicas e
serológicas) e para a resolução do mesmo.
A análise histopatológica revelou-se de grande auxí-
lio na caracterização das lesões observadas (ex. pro-
cesso inflamatório, degenerativo ou neoplásico; lesão
aguda ou crónica; envolvimento bacteriano ou parasi-
tário), permitindo uma melhor orientação do técnico
para o diagnóstico do processo subjacente.
Os quatro casos de lesões compatíveis com a Doença
de Marek, detectados neste trabalho, apresentavam a
forma visceral da doença evidenciando uma hepato e
esplenomegália com infiltrados de um tecido de cor
esbranquiçada compatível com lesão neoplásica. Os
tumores a nível visceral são especialmente comuns em
formas agudas da doença e podem ser encontrados sem
haver lesão dos nervos e sem sintomatologia, razão
pela qual podem passar despercebidos na produção e
no exame ante mortem (Dorn, 1973; Powell e Payne,
1993; Ritchie, 1995 e Calnek, 1997). Segundo Fadly
e Crittenden (1987) e Calnek (1997) apenas uma
pequena percentagem de frangos infectados desen-
volvem a doença clínica, o que pode comprometer o
diagnóstico da doença em vida. Por estes motivos o
seu despiste a nível do matadouro pode revelar-se de
grande interesse para o controlo da incidência desta
doença nos efectivos avícolas.
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149
CASO CLÍNICO REVISTA PORTUGUESA
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

Cinco casos clínicos de intoxicação por contacto com a larva Thaumetopoea

pityocampa em cães

Report of poison in five dogs after contact with Thaumetopoea pityocampa

P. Oliveira1*, P. S. Arnaldo2, M. Araújo3, M. Ginja1, A. P. Sousa1, O. Almeida1 e A. Colaço1

CECAV- Departamento de Patologia e Clínicas Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, 5000-911 Vila Real-Portugal
1

2
Departemento de Protecção de Plantas, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, 5000-911 Vila Real-Portugal
3
Laboratório de Farmacologia, Departamento de Imunofisiologia e Farmacologia, ICBAS, Universidade do Porto, Largo Professor Abel Salazar, nº.2,
4099-003 Porto-Portugal

Resumo: Na literatura científica existem alguns trabalhos que
documentam os efeitos nocivos de Thaumetopoea pityocampa,
processionária do pinheiro, nesta espécie vegetal e no Homem.
No entanto, os artigos sobre este tema em Medicina Veterinária
são escassos. Neste trabalho descrevemos cinco casos clínicos de
intoxicação por Thaumetopoea pityocampa em pequenos animais
e relacionamo-los com o ciclo de vida do insecto na região de
Trás-os-Montes e Alto Douro.
Palavras chave: Thaumetopoea pityocampa, cão, intoxicação,
processionária do pinheiro
Abstract: There are several scientific papers describing the
harmful effects of Thaumetopoea pityocampa in man and pines.
However, papers about the effects of pine processionary in dogs
are uncommon. The aim of this paper is to analyze the biological
cycle of caterpillar with clinical signs observed in five cases pre-
sented to the Veterinary Hospital at Universtity of Trás-os-Montes
and Alto Douro.
Key Words: Thaumetopoea pityocampa, dog, pine processionary
caterpillar, poison
Introdução
Os animais domésticos, e em especial o cão, são
muito curiosos, sendo frequentemente vítimas do seu
comportamento. Nas suas incursões farejam e cheiram
espécies animais possuidoras de propriedades tóxicas,
como é o caso de insectos, serpentes, sapos, processio-
nárias, entre outros (Poisson et al., 1994; Bernal et al.,
2000).
A processionária do pinheiro, designada também
como lagarta do pinheiro, é denominada pelo nome
científico de Thaumetopoea pityocampa, pertence à
ordem lepidóptera, à família Thaumatopoidea e ao
género Thaumetopoea. Esta espécie, conhecida desde a
antiguidade, começou a ser estudada com o objectivo de
melhor compreender o seu papel devastador na floresta.
Considera-se hoje que, após os incêndios florestais, é
* Correspondente: mginja@utad.pt
Tel. 259350632, Fax. 259350480
a praga mais destrutiva para o pinheiro (Contreras e
Figueroa, 1997).
Thaumetopoea pityocampa é uma espécie mediterrâ-
nea que se distribui pela Península Ibérica estendendo-
se à Turquia e ao Norte de África. As espécies animais
susceptíveis de serem afectadas na fauna selvagem
são as raposas, as ginetas e os texugos, e nos animais
domésticos os cavalos, as ovelhas, as aves, os suínos, o
cão e o gato (Lorgue et al., 1996; Contreras e Figueroa,
1997).
O ciclo de vida da processionária do pinheiro (Figura
1) inclui duas fases que decorrem em estratos diferen-
tes do ecossistema florestal. A fase aérea na copa do
hospedeiro, inclui a postura e o desenvolvimento larvar
e a fase subterrânea a pré- pupação, pupação e desen-
volvimento do adulto. A passagem de uma fase à outra
verifica-se entre Fevereiro e Maio com a migração
colectiva das lagartas, que abandonam o hospedeiro
em procissão (Figura 2) para se enterrarem no solo a
alguns centímetros de profundidade.
A fase aérea inicia-se em Junho prolongando-se até
Agosto com a emergência dos adultos e posterior aca-
salamento. As fêmeas, depois de fecundadas procuram
o local mais adequado para a postura (Arnaldo, 1997).
Em meados de Setembro, e uma vez completo o
desenvolvimento embrionário, nascem as lagartas.
Decorrido o primeiro estádio de desenvolvimento,
as lagartas sofrem a primeira muda. Nesta fase, as
lagartas apresentam pêlos brancos na região lateral e
alaranjados na região dorsal, destacando-se já peque-
nas manchas negras em cada segmento, que corres-
pondem aos receptáculos dos futuros pêlos urticantes.
A duração deste estádio é de cerca de quinze a vinte
dias, após o que as lagartas sofrem a segunda muda
(Arnaldo et al., 1999). A partir do terceiro estádio,
as lagartas tecem ninhos definitivos onde se agrupam
grande número de indivíduos provenientes de várias
posturas (Demolin, 1965). A estrutura destes ninhos
permite a acumulação do calor necessário à sobrevi-
vência das colónias durante o Inverno (Figura 3). As
151
Oliveira, P. et al.
Figura 1 – Ciclo de vida da processionária.
Figura 2 – Lagartas de Thaumetopoea pytiocampa em procissão.
lagartas abandonam os ninhos a partir do crepúsculo
para se alimentarem durante a noite, ficando presas
por um fio sedoso que lhes permite regressaram ao
ninho (Arnaldo et al., 1999). Nestes dois últimos está-
dios do desenvolvimento, o aparelho defensivo das
lagartas, perante a actuação de predadores naturais,
está completamente formado e é composto por oito
receptáculos localizados entre o primeiro e o oitavo
segmentos abdominais, cada um dos quais compreende
aproximadamente 120000 pêlos urticantes de coloração
alaranjada e com propriedades urticantes (Lamy et al.,
1985; Contreras e Figueroa, 1997). Quando a lagarta
se move os receptáculos abrem-se, libertando milhares
de pêlos que se dispersam no ambiente. Os pêlos retêm
no seu interior uma haloproteína, cujo peso molecular é
de 28000 daltons, designada de taumatopoína, e que é
capaz de desencadear a libertação na pele e mucosas, de
histamina, acetilcolina ou proteínas (Lamy et al., 1985;
Pineau e Romanoff; 1995; Veja et al., 1999; Miranda et
al., 2001).
As lagartas terminam o desenvolvimento larvar e ini-
ciam a procissão em busca de um local para puparem.
A procissão de enterramento é normalmente encabe-
çada por uma fêmea (Demolin, 1962; Bertucci; 1983;
Dajoz, 1991). A procissão de pupação pode prolongar-
se durante vários dias com protecções provisórias noc-
turnas ou perante condições atmosféricas desfavoráveis
(Pinto et al., 1998).
A intoxicação por contacto com esta espécie assume
152
RPCV (2003) 98 (547) 151-156
Figura 3 – Ninho de processionárias.
um carácter sazonal, dependente do clima da região,
verificando-se uma maior percentagem de casos durante
a Primavera e Verão. No cão a parte do corpo mais afec-
tada é a cabeça, em especial os lábios, a mucosa oral e a
língua. O diagnóstico desta intoxicação pode ser difícil,
particularmente nos casos em que não estão disponíveis
informações sobre os antecedentes da exposição.
Casos clínicos
O presente trabalho descreve cinco casos clínicos
observados no Hospital Veterinário da Universidade de
Trás-os-Montes e Alto Douro. Estes animais pertenciam
a vários proprietários residentes em freguesias distintas
do concelho de Vila Real. Em comum os cinco casos
clínicos têm o passeio por pinhais e o aparecimento
súbito e violento dos sinais clínicos. Os proprietários
quando questionados referiam que residiam em locais
próximos de pinhais e que na zona existiam numerosos
ninhos de processionárias. No quadro 1 descrevem-se
a anamnese, os sinais clínicos (apenas os parâmetros
alterados), os exames complementares, o tratamento e
a evolução, de cada um dos casos. As figuras 4, 5, 6 e 7
documentam os casos clínicos por nós observados.
O diagnóstico de envenenamento pela processionária
foi realizado através da interpretação dos dados obtidos
da anamnese detalhada e dos sinais clínicos observados.
O caso clínico número 5 foi alvo de uma análise exaus-
Oliveira, P. et al. RPCV (2003) 98 (547) 151-156

tiva, porque os sinais clínicos apresentados pelo animal
eram compatíveis com outras intoxicações, mas perante
a anamnese e os conhecimentos apresentados pelo pro-
prietário admitimos tratar-se de um caso de intoxicação
por contacto ocular com a larva da processionária.
A evolução destas situações depende da precocidade
com que o tratamento é instaurado. A cadela do caso
clínico número 1 não conseguia ingerir água ou ali-
mento, foi-lhe aplicada uma sonda nasogástrica (Figura
9) e alimentada 4 vezes por dia com uma dieta comer-
cial diluída em água. Quinze dias após o início do
internamento caiu-lhe a língua, parte do lábio superior
e a totalidade do lábio inferior (Figura 10). O proprie-
tário optou pela eutanásia. No caso do Doberman após
o internamento também lhe foi aplicada uma sonda
nasogástrica, com regime alimentar idêntico. Devido
ao prognóstico ser reservado, vinte e quatro horas após
a sua admissão o proprietário optou por eutanasiar o
animal. Os restantes recuperaram, tendo no entanto os
animais dos casos número 2 e 3 perdido parte da língua,
por necrose irregular do seu bordo (Figuras 11 e 12).
Discussão
A principal via de contacto dos animais domésticos
com a processionária é na maioria dos casos cutânea,
podendo ser também digestiva e ocular (Arditti et al.,
1988). Os pêlos das processionárias funcionam como
finas agulhas, através das quais a taumatopoína é injec-
tada na pele ou mucosas (Lorgue et al., 1996). Não
sendo por isto fundamental um contacto directo entre a
larva e o animal para este último ser afectado (Contre-
ras e Figueroa, 1997).
Tal como nós observámos, e é referido na biblio-
grafia, os sinais clínicos e lesões desta doença têm um

Quadro 1-Registo dos 5 casos clínicos observados.

Caso clínico 1 2 3 4 5
Sexo Fêmea Macho Fêmea Macho Fêmea
Raça Indeterminada Husky Siberiano Indeterminada Doberman Retrivier do Labarador
Idade 1 ano 2 anos 1 ano 4 meses 2 anos
Anamnese 3 dias de evolução, 12 horas de evolução, 1 dia de evolução, 2 dias de evolução, < 6 horas após o con-
abatimento, incapaci- abatimento e incapaci- abatimento e inca- abatimento e incapaci- tacto
dade de abeberamento. dade de abeberamento. pacidade de abebe- dade de abeberamento.
ramento.
Sinais clínicos Face edemaciada, Intenso prurido facial, Edema da face, Edema da face, Intenso prurido facial,
macroglossia, língua ulceração da língua salivação intensa. macroglossia, edema edema generalizado da
com coloração azul, (Figura 5). Hipertrofia Intenso prurido sublingual, língua com córnea (Figura 8), epí-
glossite, edema sublin- dos gânglios submandi- facial, hipertrofia coloração azul, pros- fora, blefaroespasmo,
gual, úlceras focais bulares. dos gânglios sub- tração (Figuras 6 e 7). fotofobia, prurido
na língua, estomatite mandibulares e Intenso prurido facial, ocular moderado.
e vómitos (Figura 4). vómitos. hipertrofia dos gânglios
Intenso prurido facial, submandibulares.
hipertrofia dos gânglios
submandibulares.
Exames com- Hematologia e bioquí- Hematologia e bioquí- Hematologia e bio- Hematologia e bioquí- Teste da fluoresceína
plementares mica normal mica normal química normal mica normal normal, pressão intrao-
cular 8 mm de Hg.
Tratamento Lavagens cutâneas Lavagens cutâneas Lavagens cutâneas Lavagens cutâneas Colírio oftálmico
com soro fisiológico, com soro fisiológico, com soro fisioló- com soro fisiológico, com fosfato de dexa-
succinato de metilpred- succinato de metilpred- gico, succinato de succinato de metilpred- metasona a 0,1%,
nisolona (1 mg/Kg, nisolona (1 mg/Kg, metilprednisolona nisolona (1 mg/Kg, QID, 1 gota. Sulfato
BID, IM), cefradina BID, IM), cefradina (40 (1 mg/Kg, BID, BID, IM), cefradina de neomicina a 0,5%
(40 mg/Kg, TID, IV), mg/Kg, TID, IV), pro- IM), cefradina (40 (40 mg/Kg, TID, IV), em asscociação com
prometazina (1 mg/Kg, metazina (1 mg/Kg, BID, mg/Kg, TID, IV), prometazina (1 mg/Kg, sulfato de polimixina
BID, SC), espiramicina SC), espiramicina (10 prometazina (1 BID, SC), espiramicina B, 1 gota QID. 1 gota
(10 mg/Kg, BID, SC), mg/Kg, BID, SC). mg/Kg, BID, SC), (10 mg/Kg, BID, SC). de atropina a 1%, BID,
metoclopramida (1 mg/ espiramicina (10 durante 2 dias.
Kg, infusão contínua). mg/Kg, BID, SC),
metoclopramida
(1 mg/Kg, infusão
contínua).
Evolução Queda da língua, parte Perda dos bordos linguais Perda de um dos Eutanasiado Recuperação completa.
do lábio superior, tota- e parte da região apical bordos laterais da
lidade do lábio inferior. da língua. língua.
Eutanasiado.

Legenda: BID- de 12 em 12 horas; TID- de 8 em 8 horas; QID- de 6 em 6 horas; IM- intramuscular; SC- subcutânea; IV- intavenosa.

153
Oliveira, P. et al.
Figura 4 - Caso clínico n.º 1, observar o edema Figura 5 - Caso clínico n.º 2, observar as úlce-
da face, macroglossia e coloração azulada da ras linguais e o edema sublingual.
língua.
Figura 7 - Caso clínico n.º 4, observar o edema Figura 8 - Edema da córnea secundário a
da língua e a coloração azul da língua. uveíte, caso clínico número 5.
carácter evolutivo. Podem ser classificados em locais e
sistémicos. Na sintomatologia local a língua é o órgão
mais afectado, aumenta de volume, torna-se azulada
e com a evolução surgem áreas de necrose podendo
ocorrer, no local de contacto, perda dos tecidos num
período de 6 a 10 dias. A glossite e a estomatite desen-
cadeiam um quadro clínico de disfagia com ptialismo
(Arditti et al., 1988; Pineau e Romanoff, 1995). Por
vezes, observam-se sinais oculares, como conjuntivite
e queratite ulcerativa, ou sinais cutâneos como o edema
facial, a urticária e o prurido facial intenso (Bernal et
al., 2000). Do contacto da processionária com a laringe
ou a mucosa nasal podem ocorrer, tosse, dificuldades
respiratórias e asfixia por edema (Contreras e Figueroa,
1997). O proprietário e o Médico Veterinário podem
apresentar um intenso prurido nas mãos e braços como
consequência da manipulação dos animais (Pineau e
Romanoff, 1995).
Os sinais clínicos sistémicos são mais raros, porém
possíveis, existindo relatos de choques anafiláticos,
tremores musculares, coma e mesmo morte do animal
(Contreras e Figueroa, 1997). Observámos dois casos
clínicos com vómitos, Grundmann et al. (2000) referem
a possibilidade de surgirem outros transtornos gastrin-
testinais nomeadamente a diarreia.
Nas aves pode ocorrer uma enterite grave após a
ingestão de processionárias, enquanto que no cavalo
podem observar-se erosões alongadas na mucosa oral,
cólicas e agitação que evolui para agressão, seguido de
um intenso prurido na região do dorso (Lorgue et al.,
1996).
No Homem são as crianças as mais afectadas, em
especial os rapazes, pela sua curiosidade em explora-
rem ambientes desconhecidos e treparem às árvores.
As afecções por ingestão são raras (Pineau e Romanoff,
1995). O quadro clínico começa por prurido intenso
154
RPCV (2003) 98 (547) 151-156
Figura 6 - Caso clínico n.º 4, observar o
edema da face.
Figura 9 - Caso clínico n.º1 entubação naso-
gástrica.
evoluindo rapidamente para uma dermatite, também
podem surgir conjuntivite, queratite e uveíte. Se os pul-
mões estão afectados surgem dificuldades respiratórias
que evoluem para asma (Ducombs, et al., 1981; Pineau
e Romanoff, 1995).
O edema, secundário a reacção anafiláctica, e a urti-
cária são comuns a várias patologias, é difícil reconhe-
cer a etiologia precisa destes sinais clínicos, sendo por
isto importante estabelecer diagnósticos diferenciais
(Bernal et al., 2000). Os diagnósticos diferenciais
do quadro clínico de intoxicação por contacto com a
processionária incluem reacções de hipersensibilidade
provocadas pela ingestão de alimentos, aditivos alimen-
tares, medicamentos, soros, parasitas gastrintestinais,
mordidelas de serpentes, picadelas de insectos e aracní-
deos ou inalação de alergenos, afecção dentária, corpos
estranhos, bem como a suspeita de intoxicação química
(Blanchard, 1994). O edema característico destas pato-
logias afecta os lábios, o focinho, as pálpebras e as
orelhas, surgindo também pápulas urticantes espalhadas
pela cabeça pescoço e tronco. Nestas circunstâncias a
língua não é atingida. Nas mordeduras por serpentes
e picadas por insectos heminópteros, as reacções de
hipersensibilidade localizam-se apenas no local de ino-
culação do veneno (Poisson et al., 1994).
Recomenda-se o tratamento sintomático. A primeira
medida terapêutica consiste na lavagem cutânea abun-
dante da zona afectada, por pulverização, com soro
fisiológico ou água de javel a 1%, com o objectivo de
eliminar os pêlos da processionária que não estejam
encravados na pele e/ou mucosas. A região afectada não
deve ser friccionada, para evitar a ruptura dos pêlos e a
libertação da taumatopoína (Pineau e Romanoff, 1995).
No combate à hipersensibilidade aguda deve aplicar-
se de imediato um tratamento de urgência à base de
corticosteróides (dexametasona) por via endovenosa
Oliveira, P. et al.
Figura 10 - Queda do lábio superior e inferior, Figura 11 - Necrose e perda de porção rostral
animal do caso clínico n.º 1. da língua no, Husky siberiano, caso n.º 2.
e anti-histamínicos (prometazina) por via subcutânea.
Os antibióticos são úteis na prevenção das infecções
secundárias (Poisson et al., 1994; Grundmann et al.,
2000). Para o tratamento das lesões oculares os dife-
rentes autores seguem o protocolo terapêutico por nós
utilizado (Quadro 1).
A sedação ligeira é aconselhada para combater a dor
intensa e nos casos com transtornos gastrintestinais,
vómitos e diarreia, recomenda-se a administração de
metoclopramida (Grundman et al., 2000). Poisson et
al. (1994) e Bernal et al. (2000) aconselham a admi-
nistração de aprotinina, substância activa inibidora das
enzimas proteolíticas, com efeito antifibrinolítico, que
actua sobre os mediadores plasmáticos da inflamação
(plasmina e calicreína). Bernal et al. (2000) utilizaram e
obtiveram resultados satisfatórios com a administração
intralingual de heparina, 200 a 500 UI/Kg de oito em
oito horas, para controlar a evolução da glossite necró-
tica da ponta da língua, desencadeada pelos microen-
fartes. No caso das glossites superficiais uma plastia
da língua pode ser utilizada com o objectivo de corrigir,
pela cirurgia, os defeitos linguais e facilitar a ingestão
de água e alimento (Grundman et al., 2000).
Os animais debilitados, com dificuldade na preensão
dos alimentos ou na ingestão de água, devem ser inter-
nados para realizar fluidoterapia e normalizar a função
renal. Em circunstâncias especiais pode ser necessário
alimentar o animal através de uma sonda gástrica ou
nasogástrica. A duração do tratamento depende do
estado geral do animal, normalmente os animais recu-
peram até aos 10 dias.
O prognóstico é reservado, apesar da maioria dos
casos apresentar uma evolução favorável (Poisson et al.,
1994). Contudo, depende do grau de afecção e da pre-
cocidade com que o tratamento inicial é instaurado. De
acordo com Bernal et al. (2000), os animais com sinais
clínicos de urticária e edema recuperam num período
de 24 horas, no entanto nos que apresentam estomatite
e glossite a recuperação demora cerca de 3 dias. Nos
casos em que o contacto lingual com a processionária
é intenso está referido por vários autores que pode
ocorrer necrose de uma porção, mais ou menos extensa
(Poisson et al., 1994; Lorgue et al., 1996; Bernal et al.,
2000). Dos casos clínicos por nós acompanhados obser-
vámos que os animais com pior evolução foram aqueles
cujo tempo compreendido entre a intervenção médica e
o contacto com a larva da processionária era igual ou
superior a 2 dias. Nenhum dos cães morreu na sequên-
RPCV (2003) 98 (547) 151-156
Figura 12 - Perda do bordo lateral da língua,
caso clínico n.º 3.
cia do contacto com a processionária, dois proprietários
optaram pela eutanásia, porque as lesões resultantes do
contacto com este insecto punham em causa a quali-
dade de vida dos animais.
Durante a fase de procissão das larvas deve impedir-
se que os cães tenham livre acesso aos pinhais onde
existam ninhos de processionárias. Na fase de larva,
especialmente antes da segunda muda, as processio-
nárias são sensíveis a insecticidas. As fumigações com
triclorfon a 5% ou piretrinas são eficazes (Bernal et al.,
2000). Nas zonas endémicas para destruir a processio-
nária recomenda-se a utilização de diflubenzuron como
antiquinizante (Poisson et al., 1994). Os ninhos podem
destruir-se com injecções de petróleo ou de insectici-
das, ou por queimadas (Bernal et al., 2000).
Em Portugal não existem registos epidemiológicos
sobre o número de animais afectados anualmente pela
processionária, mas estudos realizados em França
demonstram que a processionária do pinheiro é a prin-
cipal causa de envenenamento dos animais domésticos.
Em Trás-os-Montes, a processionária do pinheiro,
representa uma ameaça para a saúde humana e animal
entre Fevereiro e Maio. De referir que, para além do
contacto directo com as lagartas, também o manusea-
mento dos ninhos pode ser perigoso, uma vez que estes
se encontram recheados de excrementos e de pêlos
que ao serem transportados pelo vento, contaminam o
ambiente e em contacto com a pele ou com as mucosas
originam reacções alérgicas.
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SUPLEMENTO
Cartas ao editor
Bem-estar-animal – uma questão veterinária!
1. O interesse suscitado pelo tema do texto editado
no Suplemento (nº 122, Abr. Jun. 2003) da Revista
Portuguesa de Ciências Veterinárias (Vol. XCVIII, nº
546, p. 51-100), na rubrica “Cartas ao editor”, sob o
título “Direitos dos animais – uma questão jurídica?”,
aliado ao conjunto de questões afloradas, motivam as
presentes considerações; mesmo correndo o risco de
poderem ser consideradas polémicas, subjaz a intenção
de contribuir, ainda que de forma singela, para a refle-
xão que o referido texto sugere.
Apresentado sob a forma de uma acta ou relatório
do colóquio referido, que teve lugar entre 13 e 14 de
Maio, do corrente ano, na Faculdade de Direito da
Universidade do Porto, reunião a que infelizmente não
assisti, a missiva deixa em aberto algumas interroga-
ções e aborda um conjunto de conceitos (muito embora
não expresse de forma clara a opinião da sua autora),
só por si suficientes para provocar e prolongar a refle-
xão sobre o tema.
2. Parece pois, mais do que justificável, clarificar
a priori, alguns aspectos e conceitos subjacentes na
apresentação a começar pela designação de “animais
não-humanos”. Se sob o ponto de vista estritamente
biológico, a inclusão dos humanos (homo sapiens
sapiens) no “reino animal”, não sugere qualquer tipo
de objecção, não é menos verdade que, quer sob o
ponto de vista moral e civilizacional, quer sob o ponto
de vista do psicológico, emocional e cognitivo, a dis-
tinção entre animais e humanos estaria mais do que
justificada. Mesmo sob o ponto de vista da filosofia
do Direito, a qualidade de tudo o que é jurídico, diria
respeito apenas às coisas da conduta humana: apenas
o Homem, único detentor de espírito, existencial ou
transcendental, poderá criar e vivenciar aquela quali-
dade.
Ora a designação de “animais não-humanos”, parece
querer confundir ou pelo menos tornar difusa aquela
distinção, ao aliar as duas designações em oposição;
tal circunstância é inaceitável, sendo inclusivamente,
susceptível de criar dificuldades, justamente junto dos
principais destinatários da regulamentação sobre “Pro-
tecção dos animais”, fruto de uma percepção distorcida
que possam vir a ter os fundamentos daquela legisla-
ção, perdendo-se, desse modo, a capacidade de suscitar
a sua motivação e empenho.
A designação de “animal” é aliás frequentemente
utilizada, sob o ponto de vista da semântica, como
sinónimo de “não-humano”: grosseiro, irracional, rude,
ignorante. Embora tal alusão resulte de um discurso
REVISTA PORTUGUESA
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
que visa desvalorizar o comportamento de certos espé-
cimes humanos e não tanto da incapacidade de reco-
nhecer a afectividade e inteligência de algumas espé-
cies animais, torna-se, igualmente, por esse motivo,
inaceitável.
Por outro lado, a designação de “animal não-
humano”, mesmo que pretendendo diluir a distinção
entre humanos e animais (pelas razões antes expos-
tas), acaba por ter, em muitas circunstâncias, o efeito
oposto, visto tratar-se de uma designação redundante:
se não houvesse realmente diferença entre humanos e
animais, não haveria razão para a subdivisão sugerida
entre “humanos” e “não-humanos”.
Tal contradição poderia ser evidenciada pelo próprio
texto, se uma das interrogações colocadas fosse refra-
seada, utilizando o termo “não-humano”: “…sendo a
capacidade de sofrer comum a todos os seres huma-
nos, não será também que nos aproxima dos outros
animais [não-humanos]?”.
Assim sendo, porque não manter a distinção na base
definida: humanos e animais? Parece suficientemente
razoável, tecnicamente correcta e “legitimada” pelo
uso.
3. O segundo aspecto, que julgo merecer clarifi-
cação, relaciona-se com os “direitos dos animais”,
por não ser de todo compreensível, em que ponto da
“escala de valores” se situa esse “direito”: se sim-
plesmente na adopção e cumprimento de legislação
de protecção dos animais (sendo essencial crer que a
mesma dimana de um sentimento generalizado e de
um consenso alargado da comunidade a que se dirige
essa legislação) ou se, no outro extremo da escala,
considerando que aos “animais” deve ser reconhecida,
de alguma forma, personalidade jurídica, fruto da sua
incapacidade em “reciprocar” ou por se considerar que
em certas circunstâncias existe um “…prolongamento
de características humanas.”.
Esta questão desperta, antes de mais, uma crítica à
formulação antropomórfica, várias vezes enunciada ao
longo da exposição, como argumento que sustentaria
o reconhecimento dos “direitos dos animais” e, con-
sequentemente o estabelecimento de legislação e san-
ções adequadas: os “…estudos de capacidades cogniti-
vas…” dos animais; a “…atribuição de alguns direitos
aos animais perante circunstâncias que se pudessem
considerar como um prolongamento de característi-
cas humanas…”; “…a capacidade de sofrer comum
a todos os seres humanos…”; “…atribuir direitos a
todos os animais que se saiba passarem o patamar
cognitivo…” ou a “…perspectiva mais próxima do
estatuto da pessoa jurídica.”
O mimetismo com os Direitos consagrados aos
humanos não parece, de facto, aceitável, exactamente
27
SUPLEMENTO
por não se focalizar na questão essencial: a protecção
dos animais deverá resultar exclusivamente da natureza
dos seus perfis fisiológicos, cuja avaliação científica e
experiência acumulada ditarão as regras relativamente
às cinco componentes enunciadas: fome e sede, con-
forto, dor, comportamento natural, medo e stress.
Por outras palavras se dirá que, qualquer que seja a
expressão jurídica, ou melhor, legal, dos “direitos dos
animais”, nunca a mesma poderá decorrer por compa-
ração, mesmo que absurda, com outro tipo de legisla-
ção, mas exclusivamente estatuindo um conjunto de
regras (garantidas por meio de uma acção coercitiva
do Estado), que sejam o reflexo exacto da ciência e
da experiência, quanto às exigências fisiológicas dos
animais.
Quanto a este aspecto, a expressão “direitos dos
animais” não poderá ser reconhecida como alusiva à
natureza intrínseca dos animais, também aqui deverá
ser obviado o paralelismo com os “Direitos Humanos”.
Ao contrário, e como referi, qualquer legislação
sobre a protecção dos animais, deverá derivar exclusi-
vamente das cinco componentes antes referidas, enqua-
drando-se em outras áreas do Direito, nos domínios
da Saúde Animal, da Higiene Pública Veterinária, do
Melhoramento Animal, etc. parecendo portanto mais
sensato, falar de Direito Veterinário, identificando-se
os animais em quanto coisa jurídica, como um recurso
da Humanidade.
Constituindo-se assim, como um ramo do Direito,
resultante da diversidade e evolução da vida social e
portanto mais coerente, eficiente e eficaz quanto à sua
aplicação, o enquadramento das diferentes disposições
legais num Código Veterinário, está aliás plasmado no
edifício legislativo comunitário, que incluí toda a regu-
lamentação em apreço sob a designação de “legislação
veterinária e zootécnica”.
Julgo que a designação “direitos dos animais” deverá
ser obviada, a favor da legislação, de que a protecção
dos animais constituiria um importante pilar, geradora
de obrigações jurídicas aos humanos, particularmente
aos donos e detentores dos animais (cuja responsa-
bilidade deriva da sua personalidade jurídica), mas
também às entidades e pessoas (igualmente detento-
res de personalidade jurídica), que de algum modo
interferem no cumprimento daquela legislação, a cujo
conjunto deverá ser atribuída a designação de Direito
Veterinário ou de Código Veterinário se assumir esse
modelo.
4. O problema anterior coloca, justamente, um outro,
estritamente relacionado com a filosofia do Direito:
o de saber se os animais poderiam ser detentores de
qualidade jurídica. Não detendo qualquer competência
na área do Direito, parece-me, ainda assim, que aquela
qualidade apenas poderá ser atribuída às coisas de
conduta humana, sendo que nestas circunstâncias os
animais constituiriam o objecto, o recurso, o bem, con-
substanciando um determinado Direito.
Será bom registar que a protecção dos animais, não
28
RPCV (2003) SUPL. 123: 27-32
merece, quer sob o ponto de vista ético, quer sob o
ponto de vista religioso, quer ainda sob o ponto de
vista dos costumes, uma unanimidade de opiniões; não
existe tão-pouco um consenso social generalizado, das
regras a cumprir, pelo que os fundamentos das mesmas
não poderão em qualquer circunstância ultrapassar os
limites daquelas que forem as referências de natureza
fisiológica e experiência acumulada.
É nesta perspectiva que me parece deva ser man-
tida pela profissão veterinária uma posição de fiel da
balança, não assente em costumes, dogmas ou crenças,
resultando na clarificação legal de um conjunto de
circunstâncias de que são exemplo: o confinamento de
animais de produção, o transporte de animais, a occi-
são ou abate, o abate religioso, a competição despor-
tiva, o espectáculo envolvendo animais, a caça, etc.
5. Para finalizar e repescando algumas das expres-
sões utilizadas em referência aos animais: “estatuto
moral”; “direitos dos animais”; “estatuto jurídico”;
“protecção jurídica”; “sujeito jurídico” e tendo em
conta a interrogação que o título da carta ao editor
encerra, parece-me óbvio estarmos perante uma ques-
tão veterinária.
Miguel Ângelo
Apartado 78
5374 - 909 MIRANDELA
supervet@sapo.pt
Notas sobre publicações
O Diamante
Revista editada pela Associação do Pessoal
da Diamang
A história começa em Angola em 1907, quando
foi encontrado o primeiro diamante, no então Congo
Belga do grande protector dos nativos Rei Leopoldo
dos belgas, o qual, como se sabe não se poupou a
esforços para o desenvolvimento da extensa concessão
que lhe coubera na partilha do continente africano,
na Conferência de Berlim, tudo realizado a bem da
“civilização”, evidentemente. Essa descoberta deve ter
feito nascer a ideia de que onde existia um, existiriam
muitos mais. Para dar continuidade às prospecções foi
então criada uma empresa denominada “Societè Inter-
nationale Forestiére et Miniére du Congo”, abrevia-
damente designada por “Forminière”. Ao seu serviço
ficaram os dois prospectores americanos chamados
Jhonson e Mac Vey que já operavam na área e que,
em 1912, na margem direita do rio Chiumbe, encon-
SUPLEMENTO
traram mais sete pedras, concluindo portanto que as
jazidas descobertas no Congo tinham continuidade em
território angolano. Isso obrigou à formação de uma
outra sociedade associada da belga, com algum capital
português, que tinha nos seus objectivos a prospecção
das jazidas de diamantes presumivelmente existentes
em Angola e que se chamou “Companhia de Pesquisas
Mineiras de Angola” – a PEMA, em 4 de Setembro de
1912, depois substituída pela constituição da “Compa-
nhia de Diamantes de Angola” – a “Diamang” em 16
de Outubro de 1917.
Assim principia a história intitulada “Pioneiros” que
nos conta o nosso colega, amigo e condiscípulo Victor
d’Albuquerque Matos, a abrir uma interessantíssima
publicação intitulada “O Diamante” editada pela
“Associação do Pessoal da Diamang” a propósito do
XXI encontro de confraternização e convívio dos ex-
empregados da Companhia e seus familiares, realizado
em 14 de junho último, em Manique do Intendente.
Direi, antes de mais, que essa publicação de 82 pági-
nas, com formato de “revista tipo A4”, tem excelente e
cuidada apresentação gráfica, com numerosas reprodu-
ções fotográficas, quase todas inéditas, não pode deixar
de interessar a todos os que se interessem pela História
de Angola. A sua tiragem foi limitada e julgo que não
esteve, nem está à venda. Pelo menos não a encontrei
nas livrarias de Lisboa e o exemplar que possuo foi-me
oferecido pelo acima citado amigo e colega. Também
não encontrei qualquer referência a preço, ou director,
presumindo tratar-se de publicação avulso, não perió-
dica, portanto. Para confirmar essa ideia é indicado
apenas como seu coordenador o Dr. Bernardo José
Ferreira Reis, que foi o último administrador da Dia-
mang residente no Dundo, o qual também descreve o
último arrear da bandeira portuguesa, feito ao pôr-do-
sol no dia 10 de Novembro de 1975, frente à sede da
Direcção Geral da Companhia na Praça Henrique de
Carvalho, com todo o cerimonial e guarda de honra
prestada pelos “cipais” ou “capitas” da policia mineira
com bombos, fanfarra e bandeiras, como sucedia todos
os domingos e feriados.
A independência de Angola seria declarada no dia
seguinte, 11 de Novembro, por cada um dos três movi-
mentos que pretendiam governar o novo país, incapa-
zes de se entenderem em conjunto, respectivamente,
em Luanda, no Huambo e no Ambriz.
Essa publicação é, uma evocação a quantos trabalha-
ram na Diamang, abordando factos, situações, aconte-
cimentos gerais vividos, mas também homenageando
alguns elementos de uma pequenina comunidade
perdida no nordeste de Angola que, pelo seu trabalho
continuam na lembrança dos vivos e refiro: o médico
Dr. João da Rocha Afonso, que durante 15 anos foi o
Director dos Serviços de Saúde da Diamang, prestando
“incomensurável contribuição na tentativa de solu-
cionar três magnas questões da Lunda: a assistência
materno-infantil e o combate às graves endemias da
lepra e da tuberculose”, na área dos concelhos de Por-
RPCV (2003) SUPL. 123: 27-32
tugália, Cambulo e Verissimo Sarmento, corresponden-
tes a 45 483 Km2, qualquer coisa como, aproximada-
mente, metade da superfície de Portugal metropolitano,
realçando a obra realizada e o grande Hospital que sob
sua orientação se construiu no Savacula, para a luta
anti-tuberculose, assinado julgo, por quem o substituiu
o Dr. José Henrique Santos David; ao Doutor Antó-
nio Barros Machado, neto de Bernardino Machado, o
cientista, Doutor Honoris causa pela Universidade do
Porto, criador do Laboratório de Investigações Bio-
lógicas do Dundo e biólogo especialista de renome
internacional, em insectos, aranhas, mamíferos, des-
crevendo novos géneros e espécies e seus comporta-
mentos, enriquecendo os conhecimentos sobre a fauna
angolana e obrigando a que as “Publicações Culturais
da Diamang” passassem a ser de consulta obrigatória
por especialistas de todo o mundo, sem esquecer os
seus originais trabalhos sobre a biologia da Glossina
ou tsé-tsé (a mosca transmissora da doença do sono)
assinados pelo Doutor Eduardo Luna de Carvalho e
pelo seu filho David; ao Dr. David Bernardino, assassi-
nado pela UNITA, quando saía do Centro de Saúde que
construíra com as suas próprias economias no bairro
de Cacilhas na sua cidade do Huambo onde nascera,
publicando o discurso do Doutor Barros Machado na
homenagem prestada à sua memória no Teatro Villa-
ret, em Lisboa, focando as suas diversas facetas de
médico, de melómano, de escritor, de actor, de poeta
e jornalista “um elo de ligação entre as culturas dos
povos angolano e português”, “os mandantes dos seus
executores, destruíram com este crime um dos valores
humanos mais altos do seu próprio país”, “mas o que
não puderam destruir foi exemplo que o David nos
deixou de toda uma vida de abnegação e de coragem,
simbolicamente aniquilada no limiar do seu posto de
trabalho de assistência humanitária, que se recusou a
desertar, não obstante os perigos que o ameaçavam”.
E ainda outra colaboração talvez menos específica,
mas de situações vividas tais como “Quando a vio-
lência chega ao paraíso” (o paraíso era obviamente o
Dundo) pelo Dr. Américo Botelho ou simples postais
de vários autores que já não podemos referenciar, por
falta de espaço.
Deixei, propositadamente para o fim a colaboração
do meu amigo d’ Albuquerque Matos. A ele pertence o
valioso trabalho sobre as origens e a formação da Dia-
mang e dos seus Serviços Veterinários, intitulado “Pio-
neiros”. Nesse trabalho mostra-nos como a Companhia
cresceu rapidamente, avaliando esse desenvolvimento
pelo número de engenheiros e profissões ligadas às
actividades mineiras, logo seguido pelos agentes agrí-
colas – boeres e ingleses – os quais representam o
interesse e o esforço que a Companhia sempre dedicou
à produção de bens alimentares, numa zona difícil e
carenciada.
Por esse tempo a língua falada era quase exclusi-
vamente a inglesa, pois a comunidade existente era
dominantemente anglo-saxónica. A parte administra-
29
SUPLEMENTO
tiva estava entregue aos belgas.
Nesse artigo aborda a visita que o Alto Comissário,
General Norton de Matos acompanhado pela esposa e
a filha em 7 de Janeiro de 1922, viajando de automóvel
, realiza à Lunda. O General mostrou-se bem impres-
sionado com o que observou, mas não deixou de regis-
tar que não se falasse português, que não houvesse
uma única bandeira portuguesa hasteada e que não
existisse um serviço de veterinária e zootecnia, dado o
desenvolvimento das manadas de gado bovino.
Assim veio a nascer o primeiro Serviço Veterinário
da Diamang para o qual foi contratado o Dr. Abel Lima
do Sacramento Pratas. A presença do colega Pratas na
Lunda foi muito curta, pois na sequência de desenten-
dimento com o “Acting Manager Engineer Retie, foi-
lhe imposto o fim do contrato, nos termos do art.12, ou
seja: “quando isso conviesse à Companhia, sem aviso
prévio e sem justificar a sua demissão, mediante o
pagamento de uma indemnização igual a três meses de
ordenado”. Na mesma data foram dados por findos os
contratos a mais três empregados portugueses, que se
solidarizaram com o Dr. Pratas.
Quando passaram por Luanda, em 2 de Fevereiro
de 1922, os portugueses demitidos apresentaram suas
queixas ao General Norton de Matos e em consequên-
cia dos acontecimentos, foi publicado em 20 de Feve-
reiro do mesmo ano o Decreto nº 241, o qual, logo no
art. 1º estipulava: “Todas as sociedades, companhias
ou empresas, nacionais ou estrangeiras...” são obriga-
das: “a) O empregado mais graduado, com residência
na Província será sempre cidadão português; b) O
administrador ou director geral “in loco” será sempre
cidadão português; c) Será constituída por cidadãos
portugueses metade pelo menos, quer do pessoal téc-
nico, quer do pessoal de carteira e contabilidade; d)
O pessoal médico e de enfermagem, será todo portu-
guês”... O 20º e último artigo concedia o prazo de um
ano, a contar da data de publicação do Decreto, para
que lhe fosse dada execução.
Quanto ao Eng. Rettie, a direcção da Companhia
considerou que a sua actuação fora precipitada e reco-
mendou-lhe especial cuidado na recepção e tratamento
dos empregados portugueses.
O Dr. Abel Pratas veio depois a ser contratado para
os Serviços Veterinários de Angola, em 1924, sendo
colocado como Director interino da Estação Zootéc-
nica da Humpata, acumulando com a chefia da Repar-
tição Distrital de Veterinária do Distrito da Huíla.
Depois, em 1939, foi nomeado para dirigir a Reparti-
ção de Pecuária da Direcção dos Serviços de Fomento
de Angola. Com a remodelação dos Serviços Adminis-
trativos de Angola ocupou então o lugar de Director da
Repartição Central dos Serviços de Veterinária e da
Industria Animal, no qual permaneceu até aos 62 anos,
quando foi promovido a Inspector Provincial e aposen-
tado, por ter atingido o limite de idade. Escreve então
o colega d’Albuquerque Matos: “Durante a sua longa
permanência em Angola, quer na Humpata, quer à
30
RPCV (2003) SUPL. 123: 27-32
frente dos Serviços Veterinários só voltou à Lunda, de
onde fora expulso na sua juventude, trinta anos depois,
em 1950, sendo recebido com a deferência devida ao
seu cargo.”
O Colega Victor Matos escreve que “O contrato,
impresso em papel selado com $30 que todos os
empregados tinham que assinar...era mais que leonino,
era diamantino!” e foi “melhorando” pela aposição de
mais cláusulas e novas exigências...” E concluí: “mas
ou se tinha necessidade e espirito de aventura ou se
rejeitava!” e acrescenta: “Desses contrato assinei eu
cinco! Mas de trinta meses, além dos prolongamen-
tos...”
O que ele não diz mas eu acrescento, pois ainda me
recordo de assistir à sua passagem pela estação do
Caminho de Ferro de Nova Lisboa, “comandando a
operação” “Arca de Noé” o comboio de gado de várias
espécies, com destino à Lunda, para reforço e melho-
ramento das explorações pecuárias da Diamang. De
facto foi ele o sucessor do Dr. Pratas na Companhia de
Diamantes de Angola. Durante 26 anos nunca os diri-
gentes da Companhia entenderam necessário disporem
de Serviços Veterinários próprios e recorriam ao Dele-
gado de Sanidade de Pecuária de Malange.
Nunca visitei a Lunda mas sei que o trabalho reali-
zado pelo colega Matos foi verdadeiramente notável.
Partindo do zero, levantou as estruturas de um Ser-
viço que chegou a ocupar cinco médicos veterinários,
além de reestruturar em novas bases as estratégias
das deslocações de bovinos para abate, que por vezes
ultrapassavam as duas mil cabeças de animais adquiri-
das no Sudoeste de Angola e percorriam “a pé-de-boi
mais de 2000 quilómetros, como ele gosta de dizer. A
História de todo esse trabalho e estudo, de um médico
veterinário “pioneiro” na Lunda, numa Companhia que
explorava Diamantes, mas que se preocupava também,
e isso é preciso que se diga, com o bem estar dos seus
empregados e das populações que habitavam as áreas
concessionadas, é praticamente desconhecida. As situa-
ções vividas nesses tempos são abordadas vagamente
(diria mesmo “talvez desportivamente”) em outro
artigo do mesmo autor que ele intitulou de “Aponta-
mentos”. Mas isso não chega. Tudo isso é, de facto,
uma parte (desconhecida!) da História da Profissão em
Angola que seria bom não se perdesse.
Tenho elementos, na minha posse que esse Amigo
me tem enviado, mas falta-me a vivência dos aconte-
cimentos ... o conhecimento do meio, falhas, desinfor-
mações e outras insuficiências...
Até porque, tal como escreve um dos elementos
da Comissão Organizadora do Encontro: “Hoje não
restam mais que vestígios de tudo o que ali fizemos,
por exemplo no domínio da cultura e da ciência (e
podíamos falar do Museu, do Laboratório de Biologia,
dos Estudos Antropológicos, dos trabalhos permanen-
tes do combate ao paludismo, à doença do sono, à
tuberculose, etc.). Esta é a nossa grande mágoa.”
E mais não digo! Meus parabéns ao Coordenador, à
SUPLEMENTO
Comissão Organizadora e a todos quantos colaboraram
nesta, que considero, importante publicação, como um
contributo para a necessária e esclarecedora História de
Angola, pois na Colonização nem tudo foi condenável,
nem tudo foi exploração desenfreada e sem limites..
A. Martins Mendes
Alto da Ajuda, Setembro 2003
Reuniões científicas e cursos
Curso de Mestrado em Ciência Animal em Meio
Tropical: No âmbito das acções de formação pós-
graduada da Faculdade de Medicina Veterinária da
UTL, decorre actualmente a programação do Curso
de Mestrado em Ciência Animal em Meio Tropical,
organizado por aquela Faculdade com a colaboração
do Centro de Veterinária e Zootecnia do Instituto de
Investigação Científica Tropical.
O Curso que se iniciará em Janeiro de 2004, tem por
objectivo facultar formação técnico-científica aprofun-
dada em temas relevantes para a pecuária nas regiões
tropicais relacionados com:
- As suas particularidades edafo-climáticas, sanitá-
rias, zootécnicas e sociológicas;
- Aspectos da transformação e qualidade de alimen-
tos;
- A utilização de biotecnologias apropriadas em pro-
dução e sanidade animal;
- O estabelecimento de estratégias de planeamento
de economia e de produção pecuária baseadas no
desenvolvimento sustentável daquelas regiões.
As inscrições estarão abertas até ao dia 30 dia
Novembro. Informações detalhadas sobre o referido
Curso podem ser obtidas no “site” da Faculdade de
Medicina Veterinária www.fmv.utl.pt (Ensino pós-gra-
duado).
15th International Congress of Animal Reproduc-
tion (ICAR 2004): a decorrer em Porto Seguro, Baia,
Brasil, de 8 a 12 de Agosto de 2004. O programa inclui
sessões plenárias: Genomics, Cloning and Transgenic
Strategies; Reproduction and Conservation of Endan-
gered Wildlife; New Developments in Reproductive
Technology; Microenvironment and Reproduction;
Simpósios: Nutrition and Reproduction; Canine and
Feline Reproduction; Small Ruminants; Immuno-
Reproduction; Reproduction and Fertility in Males;
Reproduction in Bos Indicus; Pathology; Endocrine
and Paracrine Control of Reproductive Processes;
The Control of Oestrus, Ovulation and Anoestrus in
Cattle; The Control of Oestrus, Ovulation and Anoes-
trus in Cattle; Gene Expression; Equine Reproduction;
Workshops: Buffalo, Animal Welfare, Reproduction of
Camelids, Pig Reproduction, Active Immunization and
Reproductive Control, Spermatogonial Transplants and
Testis Graft in Mammals, Transvaginal Oocyte Retrie-
val (Ovum Pick-Up) and it’s Applications, New Insight
RPCV (2003) SUPL. 123: 27-32
in Brucellosis, Manipulation of Marsurpial Reproduc-
tion, Reproductive Disorders in the Postpartum Period
of Dairy Cows, Experimental Design. Informações:
icar2004@cbra.org.br, www.cbra.org.br/icar2004
Vida associativa
Sessão solene comemorativa da abertura do ano
académico: A cerimónia terá lugar na Universidade de
Trás os Montes e Alto Douro, no dia 11 de Dezembro
de 2003, 5ª feira, pelas 16 horas. A oração de sapiên-
cia será proferida pelo Professor Doutor Alexandre
Quintanilha e será subordinada ao tema “Como é que
as sociedades lidam com o risco”. Foi convidada para
presidir à cerimónia a Senhora Ministra da Ciência
e do Ensino Superior, Professora Doutora Maria da
Graça Carvalho.
Palestras na sede da SPCV: Será anunciado breve-
mente um conjunto de actividades científicas e culturais
para o período que vai do presente até ao fim de 2004 e
que se iniciarão com uma palestra, no dia 20 de Novem-
bro p.f. pelas 17h e 30m na sede da SPCV (antiga
biblioteca da FMV nas instalações da rua Gomes
Freire) proferida pelo Doutor Michael Parkhouse, do
Instituto Gulbenkian de Ciência, subordinada ao tema
“Rational strategies for pathogen control”.
Sítio da Sociedade Portuguesa de Ciências Vete-
rinárias na Internet: a SPCV pode ser encontrada
em www.spcvet.pt e dispõe já de um endereço de
correio electrónico, spcvet@spcvet.pt, que pretende-
mos usar para manter os sócios informados das nossas
iniciativas e através do qual nos poderão fazer chegar
sugestões, comentários e críticas para que possamos
melhorar e dignificar a nossa sociedade. Pedimos a
todos os sócios que nos enviem para esta morada o seu
endereço de correio electrónico.
Movimento de sócios: de 1 de Julho a 30 de Setem-
bro de 2003 foram admitidos ou readmitidos os sócios
que a seguir se indicam. Efectivos: 1457 João António
Lannas da Silva, 2213 Maria de S. José Centeno, 2214
Maria Teresa Filipe da Costa, 2215 Manuel Ferreira
Joaquim, 2216 Maria Helena Monteiro. Estudantes:
2208 Francisco Mendes Machado da Silva, 2209 Rita
Calado da Silva, 2210 Paula Alexandra Guerra, 2211
José Miguel Novo de Matos, 2212 Ana Luisa da Silva
Pinto, 2217 Mafalda Aragonez Bacalhau, 2218 Joana
Gonçalves da Silva, 2219 Sofia Isabel Costa, 2220
Pedro David Carvalho, 2221 Ana Sofia Pisco, 2222
Rita Soraia Campos, 2223 João Lucena Afonso, 2224
Ary Hugo de Abreu, 2225 Luís Carlos Simão, 2226
Telmo Ricardo Ferraz Fernandes, 2227 Pedro de
Morais Julião, 2228 Ana Catarina Gascon Migueis,
2229 Carlos Manuel Nery Norte, 2230 João Manuel
Monteiro da Costa.
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SUPLEMENTO RPCV (2003) SUPL. 123: 27-32

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