HEMOGLOBINA
: 43
Instruções de Uso
Finalidade . Sistema para a determinação da hemoglobina em
amostras de sangue total por reação colorimétrica de ponto final.
[Somente para uso diagnóstico in vitro.]
Princípio . O Fe (II) do grupo heme da hemoglobina, oxihemoglobina e
carboxihemoglobina é oxidado ao estado férrico pelo ferricianeto
formando hemiglobina (Hi), que se combina com o cianeto ionizado para
produzir cianeto de hemiglobina (HiCN), o qual é medido em 540 nm.
Características do sistema . O pH do Reagente de Cor é baixo
para acelerar a velocidade da reação. Foi também adicionado um
detergente não iônico para prevenir aparecimento de turvação.
A comparação entre as imprecisões encontradas na repetitividade e na
reprodutibilidade demonstra que o sistema de medição é bastante
robusto nas regiões de concentrações significativas para uso clínico,
indicando um desempenho muito seguro no dia a dia.
O sistema é facilmente aplicável à analisadores automáticos e semi-
automáticos capazes de medir com exatidão a absorbância em 540 nm.
Metodologia . Cianeto de hemiglobina (HiCN).
Reagentes
1. 1 - Reagente de Cor - Estoque - Armazenar entre 15 - 25 ºC.
Contém ferricianeto de potássio 60,7 mmol/L, cianeto de potássio
76,8 mmol/L e surfactante.
Não refrigerar. Veneno - Manusear com cautela.
O reagente não aberto, quando armazenado nas condições indicadas, é
estável até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, o
reagente está sujeito à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
Precauções e cuidados especiais
Não utilizar o Reagente de Cor de Uso quando este mostrar-se turvo ou
descorado.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação de reagentes.
O Reagente de Cor contém cianeto de potássio que é venenoso. Deve-se
tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com os olhos
deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar
auxílio médico.
Não desprezar o Reagente de Cor Estoque, de Uso, ou o utilizado na
dosagem, em pias e recipientes que contenham resíduos de ácido
sulfúrico.
01 Português - Ref.: 43
Ref.
MS 10009010037
Não refrigerar o reagente. Não armazenar em frasco plástico.
O reagente não aberto, quando armazenado nas condições indicadas, é
estável até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, o
reagente está sujeito à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
Material necessário e não fornecido
1. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre 520 e
550 nm.
2. Pipetas para medir amostras e reagente.
3. Cronômetro.
4. Padrão de Hemoglobina Ref. 47.
Amostra
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) que
estabeleça procedimentos adequados para colheita, preparação e
armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra
podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento
analítico.
Usar sangue total (citrato, EDTA ou oxalato), que pode ser armazenado
pelo menos por 7 dias a 4 ºC.
Valores de hemoglobina falsamente elevados podem ocorrer com o uso
de torniquete por tempo prolongado.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue
não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como
potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las deve-se seguir as
normas estabelecidas para biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as
normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental.
Interferências
Valores de Bilirrubina até 38 mg/dL e Triglicérides até 250 mg/dL não
produzem interferências significativas.
Valores de Triglicérides maiores que 250 mg/dL produzem resultados
falsamente elevados.
Preparo do reagente de cor . Adicionar o conteúdo de um frasco
(10 mL) a 990 mL de água destilada ou deionizada e misturar. Estável 6
meses em frasco âmbar, entre 15 - 25 ºC.
A água deve ter uma resistividade ≥1 megaohms ou uma condutividade
≤1 microsiemens e concentração de silicatos <0,1 mg/L.
Não refrigerar. Não armazenar em frasco plástico.
 Procedimento Calibração
Rastreabilidade do Sistema
A absortividade milimolar da hemoglobina é utilizada como sistema de
Teste referência para a calibração do ensaio. A calibração do fotômetro utilizado
Reagente de cor de uso 5,0 mL é rastreável ao Standard Reference Material (SRM) 931 do National
Sangue total 0,02 mL Institute of Standards and Technology (NIST).

Homogeneizar e esperar 5 minutos. Determinar a absorbância do teste
em 540 nm ou filtro verde (520 a 550) acertando o zero com água
destilada. A cor é estável várias horas. Obter o valor em g/dL utilizando o
fator de calibração obtido com o Padrão de Hemoglobina Labtest
(Ref. 47).
O procedimento sugerido para a medição é adequado para fotômetros
cujo volume mínimo de solução para leitura é igual ou menor que 5,0 mL.
Deve ser feita uma verificação da necessidade de ajuste do volume para o
fotômetro utilizado. Os volumes de amostra e reagente podem ser
modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do
teste e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de
redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo
necessário para a leitura fotométrica. Volumes da amostra menores que
0,01 mL são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com
cautela porque aumentam a imprecisão da medição.
Calibrações manuais
Calibração de 2 pontos:
Quando o controle interno da qualidade indicar;
Quando utilizar novo lote de Reagentes ou quando mudar de frasco;
Linearidade
O resultado da medição é linear até 25 g/dL.
Controle interno da qualidade . O laboratório deve manter um
programa de controle interno da qualidade que defina claramente os
regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para
especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e
registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para
avaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que as
especificações para o coeficiente de variação e o erro total sejam
baseadas nos componentes da variação biológica (VB) .
4,5

Cálculos Valores de referência . Estes valores devem ser usados apenas

como orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça na
O cálculo deve ser feito utilizando o produto Padrão de Hemoglobina população atendida sua própria faixa de valores de referência.
Labtest (Ref. 47).
Homens . 12,5 a 17,5 g/dL
Absorbância do teste
Hemoglobina (g/dL) = x 10 Mulheres . 11,5 a 15,5 g/dL
Absorbância do padrão
Conversão . Unidades Convencionais (g/dL) x 0,621 = mmol/L
Exemplo
Características do desempenho6
Abs. do teste = 0,364 Abs. do padrão = 0,280
Exatidão . Em duas amostras com valores iguais a 7,3 e 8,0 g/dL
0,364
foram adicionadas quantidades diferentes do analito obtendo-se
Hemoglobina (g/dL) = x 10 = 13
0,280 recuperações entre 99 e 103%. O erro sistemático proporcional médio
obtido em um valor de 10 g/dL foi igual a 0,1 g/dL ou 1%.
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a metodologia
pode-se utilizar o método do fator. Especificidade . O método proposto foi comparado com um método
similar utilizando 80 amostras com valores situados entre 5,0 e
10 24,9 g/dL. A comparação resultou na equação da regressão: y = 1,03x -
Fator de Calibração = 0,23 e um coeficiente de correlação (r) igual a 0,986. O erro sistemático
Absorbância do padrão total (constante e proporcional) verificado no limite de decisão (10 g/dL)
foi igual a 0,07 g/dL ou 0,7%. Como as amostras foram selecionadas
Hemoglobina (g/dL) = Absorbância do teste x Fator
aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes hospitalizados,
pode-se inferir que o método tem uma especificidade metodológica
Exemplo adequada.
10
Fator = = 35,7
0,280

Hemoglobina (g/dL) = 0,364 x 35,7 = 13

02 Português - Ref.: 43
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio Referências
N Média DP CV (%)
1. Drabkin DL., Austin JH. J Biol Chem 1935:112:51.
Amostra 1 20 9,6 0,12 1,2
Amostra 2 20 17,1 0,23 1,4 2. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry, Principles
and Technics, 2nd Ed. New York, Harper & Row, 1974.

Reprodutibilidade - Imprecisão total 3. Westgard Jo, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501.

N Média DP CV (%) 4. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular,

Amostra 1 20 9,1 0,15 1,5 B a s e d e D a t o s d e Va r i a c i ó n B i o l ó g i c a . D i s p o n í v e l
Amostra 2 20 16,5 0,23 1,4 em:<http://www.seqc.es/ar ticle/ar ticleview/330/1/170>
(acesso em 04/2006).
Sensibilidade metodológica . Uma amostra protéica não 5. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest
contendo Hemoglobina foi utilizada para calcular o limite de detecção do Diagnóstica 2005.
ensaio tendo sido encontrado um valor igual a 0,39 g/dL, equivalente à
média de 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se a 6. Labtest: Dados de arquivo.
absorbância do padrão como parâmetro, o limite de detecção fotométrica
é 0,04 g/dL, correspondendo a uma absorbância igual a 0,001.
Apresentação
Efeitos da diluição da matriz . Duas amostras com valores
Produto Referência Conteúdo
iguais a 27,4 e 24,0 g/dL foram utilizadas para avaliar a resposta do
Hemoglobina 43 1 2 X 10 mL
sistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando
fatores de diluição que variaram de 2 a 4 foram encontradas
recuperações entre 100 e 109%.
Informações ao consumidor
Significado clínico . A hemoglobina é o principal componente das
[Termos e Condições de Garantia]
hemácias e tem como função o transporte de oxigênio. A determinação
dos níveis de hemoglobina é impor tante no diagnóstico e A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das
acompanhamento das anemias e policitemias, sendo seu valor utilizado especificações até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os
no cálculo da Hemoglobina Corpuscular Média (HCM), Concentração da cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas
Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM) e índices hematimétricos instruções sejam seguidos corretamente.
empregados na classificação das anemias.

Observações Labtest Diagnóstica S.A.

CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre - CEP 33400-000
fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados Lagoa Santa . Minas Gerais Brasil - www.labtest.com.br
corretos. Serviço de Apoio ao Cliente 0800 031 34 11 (Ligação Gratuita)
e-mail: sac@labtest.com.br
2. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e
precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa
potencial de erros analíticos. A água deionizada ou destilada utilizada no Revisão: Junho, 2009 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Ref.: 010414 Reprodução sob prévia autorização
laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para
preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágüe final da
vidraria, deve ter resistividade ≥1 megaohm.cm ou condutividade
≤1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/L. Quando a
coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre produção
de água alcalina com liberação de vários íons, silicatos e substâncias
com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo
imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle
da qualidade da água.

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04 Português - Ref.: 43