UNIVERSIDADE DO ESTADO DE MINAS GERAIS

UNIDADE FRUTAL

GABRIEL DE MORAIS GIANFREDO

ISOLAMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS TERMOFÍLICOS PRODUTORES

DE β-GLICOSIDASE EM RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

FRUTAL
2023
 GABRIEL DE MORAIS GIANFREDO

ISOLAMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS TERMOFÍLICOS PRODUTORES

DE β-GLICOSIDASE EM RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

ao Curso de Graduação em Engenharia
Agronômica da Universidade do Estado de
Minas Gerais, Unidade Frutal, como requisito
parcial para obtenção do grau de Bacharel em
Engenharia Agronômica. Orientador: Prof. Dr.
Eduardo da Silva Martins

FRUTAL
2023
 GOVERNO DO ESTADO DE MINAS GERAIS

Ata da Banca de Defesa de Trabalho de Conclusão de Curso

Aos dezenove dias do mês de outubro de dois mil e vinte e três, realizou-se na
Universidade do Estado de Minas Gerais - Unidade Frutal, a Defesa de Trabalho de
Conclusão de Curso (TCC) intitulado: "Isolamento de Fungos Filamentosos Termofílicos
Produtores de β-glicosidase em Resíduos Agroindustriais" apresentado pelo acadêmico
Gabriel de Morais Gianfredo do curso de Engenharia Agronômica. A banca
examinadora foi composta pelos(as) docentes Eduardo da Silva Martins
(Orientador), Osania Emerenciano Ferreira (Avaliadora) e Rodrigo Ney Millan (Avaliador).
Ao final do processo, o trabalho foi aprovado.
Frutal, 19 de outubro de 2023.

Eduardo da Silva Martins

(Orientador)

Osania Emerenciano Ferreira

Avaliadora

Rodrigo Ney Millan

Avaliador

Documento assinado eletronicamente por Rodrigo Ney Millan, Professor de

Educação Superior , em 31/10/2023, às 17:45, conforme horário oficial de Brasília,
com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 47.222, de 26 de julho de 2017.

Documento assinado eletronicamente por Eduardo da Silva Martins , Professor de

Educação Superior, em 12/11/2023, às 19:30, conforme horário oficial de Brasília,
com fundamento no art. 6º, §1º, do Decreto nº 47.222, de 26 de julho de 2017 .

Documento assinado eletronicamente por Osania Emerenciano Ferreira,

Professora de Educação Superior, em 13/11/2023, às 10:45, conforme horário
oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, §1º, do Decreto nº 47.222, de 26 de
julho de 2017 .

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Referência: Processo nº 2350.01.0015122/2023-84 SEI nº 75643231

Ata Defesa TCC - Gabriel de Morais Gianfredo (75643231) SEI 2350.01.0015122/2023-84 / pg.
1
Dedico o presente trabalho primeiramente a
Deus e aos meus pais, que desde o início
sempre me incentivaram e deram todo apoio,
ao meu orientador por todo conhecimento a
mim depositado e a todos amigos e familiares
que são de suma importância na minha vida.
 AGRADECIMENTOS

À minha querida mãe Solange Raquel Cardoso de Morais Gianfredo, que

sempre foi o pilar da nossa família, mulher forte e amorosa, sempre ao meu lado,
incentivando e dando forças para conseguir executar meus objetivos.
Ao meu pai Antônio Donizete Gianfredo, homem honesto e guerreiro, que
sempre esteve presente, sendo minha fonte de inspiração e forças.
Aos meus irmãos Giovanni de Morais Gianfredo e Guilherme de Morais
Gianfredo, por compartilharem comigo essa incrível experiência e convivermos juntos
até nossa formação acadêmica.
Ao meu orientador Eduardo da Silva Martins, por todo conhecimento a mim
depositado e por ser considerado por mim um pai.
A bolsa de pesquisa fomentada pelo programa PAPq/UEMG.
Agradeço em especial aos meus amigos:
Ana Júlia Arruda Postale, Leonara Bruna Lemes, Gabriel Henrique Bilória,
Pedro Sabione de Amorim, Luis Fernando Massimino de Oliveira, Bárbara Augusta
Queiroz Longo, Guilherme Israel Scarpini Honório, Fábio Henrique de Souza Azevedo,
Fabio Augusto Moro, Juliano Francisco Moro, Marcelo Ricardo Prestes Caramoni,
Maddjer Castanheira Nascimento, Marco Aurelio Silva Lemos, Vinicius Reis Silva,
Raulean Cláudio Rocha, Dannilo dos Santos Ribeiro, Pedro Canada Amorim, João
Marcelo Maioli Rangel, Edson Aparecido Brás Filho, Antonio Augusto Moschioni
Gonçalves, Guilherme Borges Gonçalves, Isabele Lopes de Oliveira, Victor Ribeiro
Pansani de Haro, Gustavo Henrique Saconato, José Henrique Alcântara.
“Nesta longa estrada da vida, vou correndo e
não posso parar na esperança de ser
campeão, alcançando o primeiro lugar.”
Milionário e José Rico
 RESUMO

Uma das mais importantes aplicações das enzimas do complexo celulolítico é a

hidrólise de biomassas, com os monossacarídeos resultantes podendo ser utilizados
como bloco de construção para a obtenção de uma imensa gama de produtos, que
abrange desde biocombustíveis até polímeros. O objetivo deste trabalho foi isolar
fungos filamentosos termofílicos/termotolerantes provenientes de amostras de solo
com cultivo convencional e agroecológico, com potencial de produção de β-
glicosidase utilizando resíduos agroindustriais. As coletas de solo foram realizadas na
Fazenda Horta Rio Grande, no município de Fronteira/MG, em três pontos distintos,
sendo: área 1 com cultivo agroecológico de hortaliças; área 2 com cultivo
convencional de abacaxi; e área 3 com cultivo convencional de cana-de-açúcar. Para
o cultivo de fungos foi utilizado meio Sabouraud, com o inóculo incubado a 45ºC
durante 5 dias. Para o isolamento de fungos termofílicos, foi utilizado meio contendo
3% de farinha de aveia e 1,5% de ágar bacteriológico, com o inóculo incubado a 45°C,
até completo crescimento. Foram isoladas 19 linhagens fúngicas, sendo 9 com
potencial de produção de β-glicosidase. Destas, uma linhagem foi selecionada para o
presente estudo. A atividade enzimática máxima ocorreu 3 dias após o cultivo a 45ºC.
A β-glicosidase apresentou ótima atividade em pH entre 4,0 e 5,0, sendo estável em
uma ampla faixa de pH. A temperatura ótima foi de 65ºC, com estabilidade até 55ºC.
Os resultados mostraram o fungo avaliado é capaz de produzir β-glicosidase nos
resíduos agroindustriais, com características interessantes para aplicação industrial,
tais como atividade em altas temperaturas e elevada estabilidade frente a variações
de pH e temperatura.

Palavras-chave: cultivo em estado sólido; enzima; celulase.

 ABSTRACT

One of the most important applications of cellulolytic complex enzymes is the

hydrolysis of biomass, with the resulting monosaccharides being used as building
blocks for a vast range of products, spanning from biofuels to polymers. The aim of
this work was to isolate thermophilic/thermotolerant filamentous fungi from soil
samples under conventional and agroecological cultivation, with the potential for β-
glucosidase production using agroindustrial residues. Soil collections were conducted
at Horta Rio Grande Farm, in the municipality of Fronteira/MG, at three distinct points:
area 1 with agroecological cultivation of vegetables; area 2 with conventional
cultivation of pineapples; and area 3 with conventional cultivation of sugarcane. For
fungal cultivation, Sabouraud medium was used, with the inoculum incubated at 45°C
for 5 days. For the isolation of thermophilic fungi, a medium containing 3% oat flour
and 1.5% bacteriological agar was used, with the inoculum incubated at 45°C until
complete growth. Nineteen fungal strains were isolated, with 9 showing potential for β-
glucosidase production. Among these, one strain was selected for the present study.
The maximum enzymatic activity occurred 3 days after cultivation at 45°C. β-
Glucosidase showed optimal activity at pH between 4.0 and 5.0, being stable over a
broad pH range. The optimum temperature was 65°C, with stability up to 55°C. The
results demonstrated that the evaluated fungus is capable of producing β-glucosidase
in agroindustrial residues, with characteristics suitable for industrial application, such
as activity at high temperatures and high stability against variations in pH and
temperature.

Keywords: Solid-state cultivation; enzyme; celullase.

 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 09
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 11
2.1 Geral ................................................................................................................. 11
2.1 Específicos ......................................................................................................... 11
3 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................. 12
3.1 A biomassa lignocelulósica ................................................................................ 12
3.2 Celulases e hemicelulases na degradação da biomassa lignocelulósica ........... 15
3.3 Produção de celulases e hemicelulases fúngicas em fermentação em estado
sólido com o aproveitamento de resíduos agroindustriais ....................................... 18
3.4 Produção de enzimas por microrganismos termofílicos...................................... 22
3.5 Isolamento de fungos termofílicos com potencial de produção de cululases, em
solos submetidos a diferentes tipos de manejo ........................................................ 23
3.6 Aplicações das β-glicosidases fúngicas ............................................................ 24
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 27
4.1 Coletas ............................................................................................................... 27
4.2 Meios de cultivo ................................................................................................. 29
4.2.1 Meio nutriente líquido para as coletas de amostras e isolamento de fungos ... 29
4.2.2 Substrato para o cultivo em estado sólido ....................................................... 30
4.3 Pré-inóculo para as fermentações em estado sólido .......................................... 30
4.4 Produção das celulases por fermentação em estado sólido ............................... 30
4.5 Determinação das atividades enzimáticas ......................................................... 31
5 RESULTADOS .................................................................................................... 32
5.1 Isolamento de fungos do solo com potencial de produção de β-glicosidase ....... 32
5.2 Caracterização da β-glicosidase produzida pelo fungo ...................................... 34
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 37
7 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 38
 9

1 INTRODUÇÃO

O manejo do solo exerce grande influência sobre a população microbiana,

quantitativa e qualitativamente (Silva et al., 2021). Solos produtivos apresentam
grande diversidade de espécies de microrganismos que são responsáveis pela
decomposição da matéria orgânica, mineralização e transferência de nutrientes entre
os diferentes compartimentos do solo, controle biológico de patógenos, produção de
substâncias promotoras de crescimento, fixação biológica de nitrogênio atmosférico e
degradação de substâncias tóxicas no solo (Moreira; Siqueira, 2006).
Junto a outros microrganismos, os fungos desempenham importante papel na
formação do solo, ciclagem de nutrientes e evolução da fertilidade, nutrição de
plantas, e degradação e depuração de substâncias tóxicas. Além da importância
ambiental, fungos e seus produtos apresentam grande potencial biotecnológico, tais
como inoculantes, agentes de controle biológico, fármacos, biossurfactantes,
aminoácidos, enzimas, dentre outros (Orgiazzi et al., 2016).
Devido às suas características de reprodução e crescimento, os fungos
filamentosos adaptam-se a uma grande variedade de substratos, sendo
decompositores naturais de material vegetal, com a secreção de uma grande
variedade de enzimas (Leite et al., 2007; Ahirvar et al., 2019; Cerda et al., 2019).
Para a produção de enzimas, o cultivo em estado sólido (CES) é um processo
que possibilita o uso de resíduos agroindustriais como substratos para o crescimento
microbiano, o que agrega valor a estes materiais (Asgher et al., 2016; Gaete; Teodoro;
Martinazo, 2020). O baixo custo e a grande disponibilidade desses materiais fazem
dos mesmos excelentes substratos alternativos para obtenção de produtos utilizados
em processos industriais (Lizardi-Jiménez; Hernandez-Martinéz, 2017).
Dentre as enzimas com aplicações industriais, destacam-se as celulases, que
formam um complexo de enzimas que atua na conversão do polímero insolúvel de
celulose em açúcares fermentescíveis. O mecanismo de hidrólise enzimática da
celulose envolve três classes de enzimas: as endoglucanases, as exoglucanases e as
β-glicosidases. Estas enzimas possuem uma ampla variedade de aplicações
biotecnológicas nas indústrias de alimentos, ração animal, têxteis, papel e celulose e
biocombustíveis (Zhang; Lynd, 2004).
Vários subprodutos agrícolas e agroindustriais são usados em processos de
CES para a produção de celulases, tais como bagaço de cana-de-açúcar, farelo de
 10

trigo, palha de milho, casca de arroz, entre outros (Luz, 2012; Zoppas et al., 2013; El-
Nagar et al., 2014; Garcia et al., 2015; Santos et al., 2016; Martins et al., 2019).
No município de Frutal-MG, onde se encontra a unidade da UEMG em que foi
desenvolvido o presente projeto, um dos setores que mais se destacam é o
sucroenergético, especialmente nas duas últimas décadas, na qual duas usinas
sucroenergéticas se instalaram (Oliveira; Mendes, 2014). Assim, é uma região de
grande geração de resíduos da cana, como o bagaço, substrato potencial para ser
aproveitado na obtenção de enzimas celulolíticas.
Outro setor da economia que atualmente se destaca no município de Frutal é
o de produção de bebidas, pela instalação de uma das maiores cervejarias do país.
Nesta indústria, a produção de cerveja está sendo ampliada atualmente e,
consequentemente, a geração de resíduos, como o bagaço de malte, terá seu volume
expressivamente aumentado. Segundo Mussato, Dragone e Roberto (2007) o bagaço
de malte tem grande potencial para aplicação biotecnológica, pois o hidrolisado
hemicelulósico obtido é rico em açúcares fermentáveis, como a glicose.
Nos últimos anos, microrganismos termofílicos (que se desenvolvem melhor
em temperaturas elevadas, com temperaturas ótimas geralmente entre 45ºC e 60ºC)
têm sido de grande interesse científico, principalmente em relação ao seu potencial
biotecnológico com a produção de enzimas termoestáveis, as quais têm sido
estudadas com vistas à sua aplicação em bioprocessos, além de servirem como
modelos para estudos bioquímicos. Muitas pesquisas têm focado a identificação de
linhagens microbianas termofílicas capazes de produzir enzimas específicas ou o
estudo de suas propriedades (Rigoldi et al., 2018; Martins;Martins; Martins, 2020).
Neste contexto, este trabalho avaliou o isolamento de fungos termofílicos
produtores de celulase provenientes de solos com manejo convencional e
agroecológico, com a aproveitamento de resíduos agroindustriais, sendo selecionada
uma linhagem para o estudo da produção e caracterização bioquímica da enzima.
 11

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Isolar fungos filamentosos termofílicos produtores de β-glicosidases, com o

aproveitamento de resíduos agroindustriais como substratos.

2.2 Específicos

- Avaliar a produção de β-glicosidase pelas linhagens fúngicas isoladas e

selecionar as linhagens com maior produção de celulases, para estudos posteriores;
- Utilizar como substrato para o crescimento fúngico resíduos de produção
cervejeira e produção sucroenergética;
- Caracterizar a β-glicosidase da linhagem selecionada.
 12

3 REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 A biomassa lignocelulósica

A biomassa lignocelulósica constitui a maior fonte de carboidratos naturais do
planeta. A dificuldade de converter a biomassa lignocelulósica em insumos químicos
é atribuída às suas características químicas e morfológicas. Esses materiais são
constituídos de fibras de celulose envolvidas em uma matriz amorfa de polioses e
lignina (Figura 1). Essa matriz amorfa age como uma barreira natural ao ataque de
microrganismos e/ou enzimas e torna esses materiais estruturalmente rígidos e pouco
reativos (Santos et al., 2012; Santos, 2013). A composição química da biomassa
lignocelulósica, geralmente contém 35-50% de celulose, seguido de 20-35% de
hemicelulose, 10-25% de lignina e uma pequena quantidade de cinzas e extrativos
(Santos et al., 2012).

Figura 1. Biomassa lignocelulósica

Fonte: (Menon; Rao, 2012 apud Anwar et al., 2014).

A celulose (Figura 2) é o principal componente da lignocelulose e o polímero

de carboidratos mais abundante do planeta (Guo et al., 2008). É um polímero
estrutural linear composto exclusivamente por monômeros de D-glicose ligados por
ligações glicosídicas β,1-4 (Lynd, 1996).
A celulose apresenta uma estrutura química relativamente simples, entretanto
não é facilmente degradável, pois a configuração das ligações glicosídicas, formadas
 13

entre as moléculas de glicose, favorece a formação de pontes de hidrogênio intra e

intermoleculares (Figura 2). Como resultado, as cadeias celulósicas se agregam
conferindo elevado grau de cristalinidade à molécula, o que explica sua insolubilidade
num grande número de solventes e, em parte, sua resistência à degradação
microbiana (Perez et al., 2002; Canilha et al., 2010).

Figura 2. Representação das ligações de hidrogênio intra e intermoleculares na estrutura da

celulose

Fonte: Silva, 2010

A hemicelulose (Figura 3) abrange um conjunto de polissacarídeos não

celulósicos, compostos em variadas proporções por unidades monossacarídicas,
como D-xilose, D-manose, D-glicose, L-arabinose, D- galactose, ácido D-glucurônico
e ácido D-galacturônico. São estruturalmente mais semelhantes à celulose do que a
lignina. Sua estrutura apresenta ramificações que interagem facilmente com a
celulose, dando estabilidade e flexibilidade ao agregado (Silva, 2012).
Comparadas com a celulose, as hemiceluloses apresentam maior
susceptibilidade à hidrólise ácida, pois oferecem uma maior acessibilidade aos ácidos
minerais comumente utilizados como catalisadores. Esta reatividade é usualmente
atribuída ao caráter amorfo destes polissacarídeos (Santos et al., 2012).
 14

Figura 3. Representação esquemática da hemicelulose

Fonte: Santos et al. (2012).

A lignina é um heteropolímero amorfo e polifenólico derivado da polimerização

de três estruturas fenilpropanóides: álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e álcool
sinapílico (Figura 4). A principal função da lignina é dar à planta apoio estrutural,
impermeabilidade, resistência contra o ataque microbiano e o estresse oxidativo
(Fengel; Wegener, 1989 apud Santos, 2013).

Figura 4. Representação esquemática da lignina

Fonte: Santos et al. (2012).

Devido à íntima associação recalcitrante existente entre os três componentes

poliméricos da biomassa lignocelulósica, a liberação dos polissacarídeos como fonte
 15

de açúcares fermentescíveis para produção de etanol e outros produtos está entre as

mais importantes prioridades nas áreas de pesquisa e desenvolvimento da
biodegradação de material lignocelulósico (Zhang, 2008 apud Santos, 2012).
A hidrólise enzimática desses materiais é conduzida através de enzimas como
as celulases, que são altamente específicas. Para uma hidrólise enzimática eficiente,
é necessário primeiramente submeter o material lignocelulósico a um pré-tratamento,
para disponibilizar a celulose ao ataque enzimático. Os processos de pré-tratamentos
de materiais lignocelulósicos podem ser térmicos, químicos, físicos, biológicos ou uma
combinação de todos esses, o que dependerá do grau de separação requerido e do
fim proposto. Dos vários processos descritos na literatura, os mais comuns são
baseados no emprego de hidrólise ácida e alcalina, explosão a vapor, água quente,
fluido supercrítico, amônia líquida (Ammonia Fibre Explosion ou AFEX) e hidróxido de
sódio, todos com o propósito de desagregar a estrutura associativa da lignocelulose
para produzir combustíveis renováveis ou insumos químicos a partir da biomassa
(Gámex et al., 2006).

3.2 Celulases e hemicelulases na degradação da biomassa lignocelulósica

As celulases representam um complexo enzimático, cujas enzimas atuam
sinergicamente na transformação da molécula em monômeros e dímeros de glicose,
sendo, de maneira geral, subdivididas em três classes: endo-1,4-β-D- glucanases ou
endoglucanases (que quebram as ligações glicosídicas das cadeias de celulose
criando novos terminais); exo-1,4-β-D-glucanases ou celobio-hidrolases
(responsáveis pela ação nos terminais levando à celobiose); e 1,4-β-D-glucosidades
(que hidrolisam a celobiose à glicose) (Yoon et al., 2014).
As endo-1,4-β-glucanases ou 1,4-β-D-glucana-4-glucano-hidrolases (EC
3.2.1.4) atuam randomicamente nas regiões amorfas da celulose e de seus derivados,
hidrolisando ligações glicosídicas β-(1,4). Sua atividade catalítica pode ser medida
através da diminuição da viscosidade do meio decorrente da diminuição de massa
molar média de celulose ou derivados de celulose. As celobio-hidrolases (exo-1,4-β-
D-glucanases, EC 3.2.1.91) atuam nos terminais redutores das cadeias de celulose,
liberando D-celobiose. Já as “β-D- glicosidases” ou β-D-glucoside gluco-hidrolases
(EC 3.2.1.21) catalisam a liberação de unidades monoméricas de D-glicose a partir da
celobiose e celodextrinas solúveis (Ogeda; Petri, 2010).
Com base na especificidade dos substratos, as β-glucosidases são divididas
 16

em três classes: 1) aril-β-glucosidases, que hidrolisam apenas a ligação aril-β-

glicosídica; 2) celobiases, que hidrolisam apenas celobiose; e 3) β- glucosidases de
ampla especificidade de substratos, que hidrolisam substratos com ligações
diferentes, como ligações β (1 → 4), β (1 → 3), β (1 → 6), α (1 →4), α (1 → 3) e α (1
→ 6). A maioria das β-glucosidases microbianas relatadas mostram ampla
especificidade de substrato (Ahmed et al., 2017).
A figura 5 representa a ação de cada tipo de celulase na quebra da molécula
de celulose.

Figura 5. Mecanismo de hidrólise da celulose por celulases.

Fonte: Yoon et al. (2014).

Nas últimas décadas, açúcar solúvel e outros produtos obtidos a partir da

conversão de materiais celulósicos são posteriormente utilizados como precursores
para a produção de combustíveis, etanol ou outros importantes produtos (Sher et al.,
2021).
Uma das mais importantes aplicações das enzimas do complexo celulolítico é
a hidrólise de biomassas. As matérias-primas de origem lignocelulósica, que contém
de 20 a 60% de celulose, podem ser totalmente convertidas em glicose, por ação
enzimática. Em etapas seguintes, esse monossacarídeo pode ser utilizado como
bloco de construção para a obtenção de uma imensa gama de produtos, que abrange
desde biocombustíveis até polímeros, sendo o etanol uma das moléculas de maior
interesse. Tais tecnologias se enquadram no conceito de biorrefinarias celulósicas, as
 17

quais visam o aproveitamento integral e integrado dos resíduos agroindustriais

gerados em uma determinada cadeia produtiva, de modo a agregar valor à mesma
(Castro et al., 2010).
Com relação à degradação das hemiceluloses, esta necessita não apenas da
ação de uma enzima, mas também de um complexo enzimático, devido à sua natureza
heterogênea. Sua completa degradação requer a ação de um sistema de enzimas
com diferentes especificidades e modos de ação (Ryabova et al., 2009).
O complexo hemicelulolítico é composto por: Endo-1,4-β-D-xilanases (EC
3.2.1.8 – hidrolisam as ligações β-1,4 da cadeia principal de resíduos de xilose); 1,4-
β-D-xilosidases (EC 3.2.1.37 – catalisam a hidrólise da xilobiose e de alguns 1,4-β-D-
xilooligossacarídeos a partir da extremidade não redutora); α-L- arabinofuranosidases
(EC 3.2.1.55 – hidrolisam os grupos α-L-arabinofuranosil terminais; α-glucoronidases
(EC 3.2.1.1 – requeridas para a hidrólise das ligações α-1,2 glicosídicas entre xilose
e ácido glucurônico ou sua ligação 4-O- metil-éster; acetil xilana esterases (EC
3.1.1.72 – hidrolisam as ligações entre xilose, ácido acético e ácido ferúlico; e p-
coumárico esterases (EC 3.1.1- removem ácidos pirúvico e cumárico dos resíduos de
arabinose das cadeias laterais (Wong; Tan; Saddler, 1988).
As endoxilanases catalisam a hidrólise de ligações 1,4-β-D-xilosídicas de
maneira aleatória, liberando xilobiose e outros xilo-oligossacarídeos, diminuindo o
grau de polimerização do polissacarídeo. As β-xilosidases podem ter afinidade por
xilobiose e xilo-oligossacarídeos. Essas enzimas catalisam a clivagem de xilobiose e
atacam extremidades não redutoras em xilo-oligossacarídeos, liberando xilose. As β-
xilosidases são importantes na degradação da xilana, pois removem produtos finais
que poderiam inibir as endoxilanases e, com isso limitar a hidrólise do polissacarídeo
(Kolonova; Vranska, 2006; Dodd; Cann, 2009).
A figura 6 representa a ação de cada tipo de hemicelulase na quebra das
hemiceluloses.
 18

Figura 6. Mecanismo de hidrólise da hemicelulose por hemicelulases

Fonte: Shallow; Shoham (2003).

3.3 Produção de celulases e hemicelulases fúngicas em fermentação em estado

sólido com o aproveitamento de resíduos agroindustriais

As matérias-primas lignocelulósicas são as fontes renováveis mais

abundantemente encontradas na natureza, sendo compreendidas, majoritariamente,
pelos materiais agroindustriais, pelos resíduos urbanos e pelas madeiras. Dentre
essas, os materiais agroindustriais se destacam pelo caráter de resíduo, conferido por
sua obtenção após o processamento de matérias-primas que apresentam maior valor
agregado, e pela vocação natural que o Brasil possui para sua geração (Castro, 2010).
Diversos resíduos agroindustriais podem ser utilizados para a produção de
celulases microbianas, tal como apresentado na tabela 1.
 19

Tabela 1. – Tipos de biomassa lignocelulósica e sua composição química .

Fonte: Gaete, Teodoro e Martinazo (2020).

A fermentação em estado sólido (FES), também chamada de fermentação

semissólida, ou fermentação em meio semissólido, é o nome dado ao processo de
crescimento de microrganismos em substratos sólidos. A água existente nesses
sistemas encontra-se ligada à fase sólida, formando uma fina camada na superfície
das partículas (Lizardi-Jiménez; Hernandez-Martinéz, 2017).
Nesse processo, o substrato sólido além de servir como suporte inerte para o
crescimento dos microrganismos, serve como fonte de nutrientes. Além do que, simula
as condições ambientais em que muitos fungos filamentosos vivem. Assim, trata-se
de uma forma muito útil como método de cultivo, já que permite a penetração das hifas
nos poros entre as partículas de substratos, auxiliando as trocas gasosas entre as
células, para manutenção metabólica (Garcia et al., 2015).
Os fungos, devido às suas características de reprodução e crescimento,
adaptam-se a uma grande variedade de substratos, sendo decompositores naturais
de material vegetal, pois podem secretar uma grande variedade de enzimas, dentre
elas as celulases, as quais têm sido produzidas e aplicadas industrialmente (LEITE et
al., 2007). Vários subprodutos agrícolas e agroindustriais são usados em processos
de FES para a produção de celulases (Luz, 2012; Zoppas et al., 2013; El-Nagar et al.,
2014; Garcia et al., 2015; Santos et al., 2016; Martins et al., 2019).
A fermentação em estado sólido tem-se mostrado promissora no
desenvolvimento de vários bioprocessos, como na biorremediação e biodegradação
de compostos tóxicos, desintoxificação de resíduos agroindustriais, biotransformação
 20

de resíduos de colheitas para enriquecimento nutricional e na obtenção de produtos

de alto valor agregado, como metabólitos secundários (antibióticos, alcalóides, fatores
de crescimento vegetal), ácidos orgânicos, biopesticidas, biocombustíveis, compostos
aromáticos e enzimas (Cerda et al., 2019).
A utilização de resíduos agroindustriais e de matérias-primas renováveis
oriundas de biomassa de diversas origens, tem fundamental importância para a
construção de diversos setores da bioeconomia, baseada em inovações nas áreas de
alimentos, biocombustíveis saúde, meio ambiente, nas quais diferentes bioprodutos
podem ser utilizados (Rodrigues, 2011). Mundialmente, o aproveitamento de
biomassas residuais vem sendo cada vez mais explorado. O desenvolvimento de
processos biotecnológicos que utilizam estes materiais permite agregar valor a uma
matéria-prima subutilizada, bem como prevenir problemas ambientais decorrentes do
seu manejo e/ou descartes inadequados (Cinelli, 2012).
O bagaço de cana-de-açúcar in natura é definido como resíduo dos colmos
da cana-de-açúcar, resultado da extração máxima do conteúdo celular rico em
açúcares solúveis. Assim, o bagaço de cana-de-açúcar reúne fragmentos grosseiros
da parede celular e conteúdo celular não extraído na moagem da cana-de-açúcar,
cujo componente principal é representado pela sacarose não extraído durante o
processo de moagem, aproximadamente 2 a 3%, e alto teor de componentes da
parede celular (carboidratos estruturais), em torno de 70 a 85%, dos quais a celulose
é o principal (44 a 50%), seguida da hemicelulose (24 a 30%) e da lignina (10 a 20%)
(Geron et al., 2010).
O bagaço de cana-de-açúcar possui diversas aplicações como: forragem, na
utilização de ração animal, especialmente para ruminantes, e na cogeração de energia
elétrica (Costa; Bocchi, 2012). Porém, na tentativa de evitar o descarte de uma parte
importante do bagaço e, ao mesmo tempo minimizar os impactos ambientais, este
material é foco de vários estudos para produção de etanol e outros compostos, por
possuir uma quantidade considerável de celulose e outros componentes de interesse
para a indústria de biorrefinaria (Nunes et al., 2013).
O bagaço de malte consiste basicamente da casca do grão de cevada obtida
após o preparo do mosto cervejeiro. A cevada é um cereal empregado como matéria-
prima para a elaboração de cerveja, rico em material hemicelulósico, amido e
proteínas, composto basicamente por casca externa, endosperma amiláceo e germe.
Nas cervejarias, o malte de cevada é moído e submetido à mosturação (adição de
 21

água e aquecimento a vários níveis de temperatura de 37 a 78°C). Esse processo tem

como objetivo promover a hidrólise enzimática principalmente do amido que compõe
o malte, o qual é convertido em açúcar fermentável (maltose e maltotriose) e não
fermentável (dextrinas). A fração líquida, denominada mosto, é separada por filtração
para posterior utilização na produção da cerveja. A fração sólida é o bagaço de malte
da cevada (Mussatto et al., 2007).
Como o processo de produção de cerveja ocorre o ano todo, a geração de
resíduos é contínua, em grandes quantidades e a um baixo custo. O bagaço de malte
é quantitativamente o maior resíduo do processo cervejeiro, gerando de 14 a 20 kg de
bagaço a cada 100 litros de cerveja produzida (Cordeiro et al., 2012). A maior parte
do bagaço de malte é comercializada para utilização em ração animal, porém pode
ser utilizado também para produção de energia por queima direta produção de biogás,
produção de carvão vegetal e obtenção de bioprodutos por microrganismos (Aliyu;
Bala, 2011).
Pelo fato de os resíduos cervejeiros apresentarem uma rica composição em
compostos orgânicos e com significativo poder nutricional, devem ser tratados antes
de dispensados ao ambiente, de forma a evitar alterações ao equilíbrio ecológico local.
Assim, há grande incentivo à redução da geração de resíduos ou seu aproveitamento
em outros processos. Nesse aspecto, visando à obtenção de produtos de maior valor
agregado e a destinação dos resíduos gerados para fins mais nobres, os bioprocessos
industriais apresentam-se como potenciais meios alternativos para destinação destes
materiais (Linhares, 2018), além de suas possíveis aplicações em alimentação animal
e humana.
A hemicelulose se trata de uma matéria-prima em qual tem muitas aplicações
de alto valor agregado e propriedades. Normalmente, os métodos de extração de
hemicelulose de materiais lignocelulósicos empregam agentes alcalinos, que são
prejudiciais à estrutura da biomassa e produzem resíduos poluentes, além de
aumentarem os custos do processo de obtenção de hemicelulose em grande escala.
Isso ocorre porque quanto maior a concentração do agente químico utilizado, maior é
o rendimento na extração de hemicelulose (Brienzo et al., 2016).
A biomassa derivada de material lignocelulósico é uma fonte abundante de
recursos, compreendendo uma variedade de resíduos vegetais, desde sobras de
produção agrícola até restos resultantes da poda de árvores. Essa biomassa é
constituída por três componentes principais: celulose, hemicelulose e lignina. A
 22

combinação desses elementos resulta em uma estrutura cristalina altamente estável,

que desempenha um papel crucial na proteção da planta contra processos físicos e
bioquímicos, garantindo a integridade do vegetal (Resende; Soccol, 2016).

3.4 Produção de enzimas por microrganismos termofílicos

Diferentes tipos de microrganismos podem crescer em substratos sólidos,
incluindo bactérias, fungos e leveduras. Porém, os mais aptos são os fungos
filamentosos pelo fato de serem capazes de crescer com pouca água e muitos sólidos
presentes, além de apresentarem forma de crescimento em hifas, favorecendo a
colonização (Ahirvar et al., 2017). Por estar com quantidades menores de água livre,
a FES reduz significativamente os riscos de contaminação bacteriana. Esta
propriedade se torna ainda mais notável quando se utilizam microrganismos
termofílicos, devido à redução da contaminação por mesofílicos (Martins et al., 2002).
Microrganismos termofílicos têm sido de grande interesse científico,
principalmente em relação ao seu potencial biotecnológico, como a produção de
enzimas termoestáveis, as quais têm sido estudadas com vistas à sua aplicação em
bioprocessos, além de servirem como modelos para estudos bioquímicos. Muitas
pesquisas têm focado a identificação de linhagens microbianas termofílicas capazes
de produzir enzimas específicas ou o estudo de suas propriedades (Rigoldi et al.,
2018). Microrganismos termofílicos produzem enzimas que atuam em atividades em
temperaturas geralmente bem acima em relação aos mesofílicos, possibilitando seu
uso em muitos processos industriais onde esta condição é necessária (Martins et al.,
2019).
A habilidade das enzimas termofílicas em atuar a altas temperaturas permite
que os bioprocessos ocorram em temperaturas mais altas e, com isso, várias
vantagens podem ser inferidas (Lee, 2018):
- Apresentam uma alta estabilidade à temperatura e são geralmente mais
resistentes a agentes detergentes e a enzimas proteolíticas.
- Como o processo ocorre a altas temperaturas, o risco de contaminação por
microrganismos mesofílicos é reduzido.
- Em processos com substratos fluidos, em altas temperaturas a viscosidade
do substrato é reduzida, facilitando o seu bombeamento, filtração e centrifugação,
permitindo o uso de menor quantidade de água;
- Mais substrato pode ser dissolvido em altas temperaturas, proporcionando
 23

um maior rendimento e menor tempo necessário para os processos.

No caso das celulases, a maioria das enzimas comerciais é obtida a partir de
microrganismos mesofílicos. Como os processos industriais que utilizam altas
temperaturas estão se tornando cada vez mais comuns, torna-se cada vez mais
necessário o fornecimento de enzimas termoestáveis para uso industrial (Pereira et
al., 2015).

3.5 Isolamento de fungos termofílicos com potencial de produção de celulases,

em solos submetidos a diferentes tipos de manejo
O sistema convencional de agricultura é considerado altamente dependente
de insumos externos, como fertilizantes químicos e agrotóxicos que, se utilizados de
maneira inadequada, podem provocar contaminação de solos, água e ar, além de
causar resistência de pragas e aumento das emissões de gases de efeito estufa
(Tscharntke et al., 2012). Em contraponto, os sistemas agroecológicos representam
um meio de mitigar os efeitos negativos da intensificação agrícola convencional. Nos
sistemas agroecológicos, não são utilizados agroquímicos ou fertilizantes inorgânicos.
Além disso, a manutenção da cobertura permanente do solo, integração da adubação
orgânica e verde, controle da erosão, manejo da fertilidade do solo, além do controle
biológico de pragas, são outras práticas amplamente utilizadas nestes sistemas
(Winqvist et al., 2012; Rosset et al., 2014).
O manejo do solo exerce grande influência sobre a população microbiana,
quantitativa e qualitativamente (Silva et al., 2011). Solos produtivos apresentam
grande diversidade de espécies de microrganismos que são responsáveis pela
decomposição da matéria orgânica, mineralização e transferência de nutrientes entre
os diferentes compartimentos do solo, controle biológico de patógenos, produção de
substâncias promotoras de crescimento, fixação biológica de nitrogênio atmosférico e
degradação de substâncias tóxicas no solo (Moreira; Siqueira, 2006).
A atividade microbiana é um dos grandes mediadores da formação do solo e
estabilização de seus agregados, de tal forma que a presença de microorganismos
faz parte da definição de “solo” (Bald et al., 2021). A maioria dos organismos do solo
utiliza a matéria orgânica como fonte de energia e nutrientes para a realização dos
processos de transformação do carbono, incluindo a mineralização, imobilização e a
formação de substâncias húmicas (Moreira; Siqueira, 2006).
 24

A microbiota do solo também contribui com a liberação gradativa e contínua

de nutrientes da matéria orgânica para as plantas e após a morte dos microrganismos,
parte do conteúdo celular também se torna disponível às plantas. O tipo de cobertura
vegetal e o manejo do solo promovem, ainda, alterações em suas propriedades físicas
e químicas, afetando também a atividade microbiana e consequentemente o potencial
de uso do solo para cultivo (Ramos et al., 2012). Neste contexto, índices de biomassa
microbiana têm sido utilizados como indicadores da qualidade do solo, uma vez que
tais atributos são sensíveis ao tipo de manejo e às alterações causadas no solo
(Cardoso; Andreote, 2016).
Embora plantas e animais também sejam fontes de enzimas do solo, os
microrganismos são sua fonte primária. Essas enzimas apresentam papel
fundamental na decomposição da matéria orgânica do solo e na ciclagem de
nutrientes. Por conta dessa relação com vários aspectos do funcionamento do solo,
as atividades das enzimas do solo são também consideradas excelentes indicadores
de qualidade do solo (Moghimian et al., 2017). Outra vantagem do uso de enzimas do
solo como indicadores de qualidade inclui sua sensibilidade e resposta a mudanças
no manejo agrícola (Mendes et al., 2021; Rodrigues et al., 2022).
Pela ação na liberação de glicose, as β-glicosidases ou β-D-glucoside gluco-
hidrolases (EC 3.2.1.21) são consideradas enzimas muito importantes como
indicadoras de decomposição da matéria orgânica no solo, atuando na ciclagem do
carbono (Ferreira; Stone; Martin-Digonet, 2017). Por isso, a mensuração da atividade
dessa enzima tem siso crescentemente recomendada como um bom indicador de
qualidade dos solos, principalmente pela alta sensibilidade dessas enzimas a
mudanças provocadas pelo seu uso e manejo (Pazutti et al., 2012).
Juntamente com outros microrganismos, os fungos desempenham importante
papel na formação do solo, ciclagem de nutrientes e evolução da fertilidade, nutrição
de plantas, e degradação e depuração de substâncias tóxicas. Além da importância
ambiental, fungos e seus produtos apresentam grande potencial biotecnológico, tais
como inoculantes, agentes de controle biológico, fármacos, biossurfactantes,
aminoácidos, enzimas, dentre outros (Ahirvar et al., 2017; Lee et al., 2018).

3.6 Aplicações das β-glicosidases fúngicas

Para uma conversão eficiente de celulose em açúcares fermentáveis, é
necessário um sistema enzimático constituído de pelo menos três grupos de enzimas:
 25

endoglucanases (EC 3.2.1.4), que hidrolisam internamente as cadeias de celulose,

resultando em uma rápida redução no grau de polimerização; exoglucanases (EC
3.2.1.91), que hidrolisam ligações glicosídicas nas extremidades das cadeias,
liberando principalmente celobiose; e β-glucosidases (EC 3.2.1.21), que finalizam a
hidrólise, convertendo celobiose em glicose (Santos et al., 2016).
A β-glicosidase tem a capacidade de aumentar o rendimento geral de
açúcares fermentáveis, enquanto reduz o efeito inibidor da celobiose em outras
enzimas celulolíticas, promovendo a continuidade do processo de hidrólise enzimática
(Rani et al., 2014). Essas enzimas têm muitas aplicações em processos industriais,
como na produção de biocombustíveis; conversão de glicosídeos de isoflavona em
agliconas, que possuem atividades antioxidantes e são mais facilmente absorvidas
pelo intestino humano; liberação de terpenos voláteis (desglicosilados pela ação da
enzima), contribuindo para a composição aromática de vinhos (Garcia et al., 2015).
A função desempenhada pela β-glicosidase no processo de degradação
enzimática da celulose, faz com que esta enzima apresente um grande potencial para
a indústria de etanol, podendo contribuir para viabilizar a obtenção de combustíveis a
partir de resíduos agroindustriais ricos em celulose (Lee et al., 2018). Também
apresentam aplicabilidade na indústria de sucos e bebidas. As enzimas celulolíticas
desestruturam a matriz da parede celular dos vegetais, o que facilita a ruptura de
célula vegetal aumentando a extração do suco. No processo de vinificação, a adição
dessas enzimas auxilia a extração de antocianinas e terpenos, que estão presentes
na casca da uva e são os compostos responsáveis pela coloração e aroma do vinho
(Garcia et al., 2015).
No presente trabalho, a enzima inicialmente proposta a ser estudada foi a β-
glicosidase. Assim, existem trabalhos na literatura que relatam a produção de β-
glicosidases por diferentes linhagens fúngicas em fermentação em estado sólido, com
o aproveitamento de diferentes resíduos agroindustriais como substratos. A tabela 2
sintetiza os resultados destes trabalhos, em relação à atividade máxima da enzima
encontrada em cada estudo.
 26

Tabela 2 – Produção de β-glicosidase por diferentes linhagens fúngicas, em fermentação em

estado sólido.

Microrganismo Substrato β-Glucosidase Autores

(U/g)
Aureobasidium pullulans Farelo de trigo 13,0 Leite et al. (2008)
Aspergillus terreus M11 Farelo de milho 119,0 Gao et al. (2008)
Thermoascus aurantiacus* Palha de trigo 61,6 Xin e Geng (2010)
Aspergillus fumigatus Farelo de trigo 40,4 Moretti et al. (2012)
Myceliophthora thermophila* 22,0
Lichtheimia ramosa Farelo de trigo 172,6 Gonçalves et al.
(2013)
Lichtheimia ramosa Pequi 0,61 Silva et al. (2013)
Colletotrichum graminicola Farelo de trigo 162,9 Zimbardi et al. (2013)
Gongronella sp. W5 Farelo de trigo 49,9 Fang et al. (2014)
Aspergillus niger Farelo de trigo 62,3 Pirota et al. (2015)
Leichtheimia ramosa Farelo de trigo 274,0 Garcia et al. (2015)
Aspergillus terreus AUMC Palha de milho 342,0 Isaac e Abu-Tahon
10138 (2015)
Thermomucor indicae- Farelo de soja e 41,8 Pereira et al. (2015)
seudaticae N31* Casca de arroz
Myceliophthora Bagaço de cana/ 10,9 Teixeira da Silva et
heterothallica* Farelo de trigo (1:1) al. (2016)
Gongronella butleri Farelo de trigo 215,4 Santos et al. (2016)
Aspergillus protuberus Casca de arroz 260,6 Yadav et al. (2016)
Aspergillus fumigatus Bagaço de cana 30,5 de Oliveira Rodrigues
et al. (2017)
Myceliophthora heterothallica* Mistura de farelo de 75,4 Martins, Martins e
trigo, bagaço e palha Martins (2020)
de cana (1:1:1)
Thermoascus crustaceus* Farelo de trigo 415,1 Garbin et al. (2021)
* Fungos termofílicos

Como pode ser observado, vários trabalhos têm sido feitos com o
aproveitamento de resíduos agroindustriais visando a produção da enzima β-
glicosidase por fungos. Porém, a maioria dos estudos reportados são com fungos
mesofílicos e, diante das propriedades interessantes do ponto de vista de sua
aplicação industrial, tornam-se fundamentais os estudos de prospecção de fungos
termofílicos e/ou termotolerantes produtores destas enzimas.
 27

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Coletas

As coletas de solo foram realizadas na Fazenda Horta Rio Grande e em uma

propriedade vizinha (Figura 7). A Horta está localizada no município de Fronteira na
região Sudeste do país, na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba e
Microrregião de Frutal. Possui latitude 20°16'04" sul, longitude 49°11'58" oeste e
altitude de 458 metros. Localiza-se às margens do Rio Grande.

Figura 7. Localização da área de estudo.

Fonte: Elaborada pelos autores com imagem do Google Earth (2019).

Foram realizadas três coletas de amostras de solo (meses de Fevereiro, Abril

e Junho), em três áreas distintas, sendo: área 1 (P1) com cultivo de hortaliças nos
princípios da agroecologia (os produtores têm certificação de cultivo orgânico); área 2
(P2) com cultivo convencional de abacaxi; e área 3 (P3) com cultivo convencional de
cana-de-açúcar, localizada na fazenda adjacente à Fazenda Horta Rio Grande. As
coletas nestas áreas com cultivos distintos visam uma verificação inicial sobre a
quantidade de fungos termofílicos isolados em relação ao tipo de uso do solo (a
depender dos resultados, poderá ser objeto de outros projetos).
 28

Figura 8. Área 1 (P1) com cultivo de hortaliças.

Fonte: Arquivo pessoal, 2022.

Figura 9. Área 2 (P2) com cultivo convencional de abacaxi.

Fonte: Arquivo pessoal, 2022.

 29

Figura 10. Área 3 (P3) com cultivo convencional de cana-de-açúcar.

Fonte: Arquivo pessoal, 2022.

4.2 Meios de cultivo

4.2.1 Meio nutriente líquido para as coletas de amostras e isolamento dos

fungos

Para o cultivo inicial dos fungos filamentosos foi utilizado o meio nutriente com
a seguinte composição (g/L): (NH4)2SO4 (1,4); KH2PO4 (2,0); CaCl2 (0,3);
MgSO4.7H2O (0,2); peptona (5,0); extrato de levedura (2,0); ureia (0,3); Tween 80
(1,0); solução de sais a 0,1%. Sendo a solução de sais composta por (mg/mL):
FeSO4.7H2O (5,0); MnSO4.H2O (1,6); ZnSO4 .7H2O (1,4); CoCl2 (2,0).
Aproximadamente 0,5 g de amostras de solo foram transferidas para frascos
Erlenmeyer de 50 mL, contendo 20 mL de meio nutriente, sendo vedados com rolha
de algodão e levados ao laboratório e mantidos em estufa a 45°C, por 24-48 horas.
Após este período, 0,1 mL deste pré-cultivo foi assepticamente transferido para o
centro de uma placa de Petri contendo o meio nutriente composto por farinha de aveia
(3%) e ágar (2%). O material foi espalhado com o auxílio de alça de Drigalski e a placa
incubada a 45°C, até o aparecimento das colônias.
As colônias de fungos filamentosos isoladas foram diferenciadas com base no
aspecto do anverso e reverso do micélio e cor dos esporos (quando presentes), e
 30

reinoculadas através de estrias de esgotamento, em meio de isolamento, até a

obtenção de culturas puras, as quais foram estocadas e utilizadas neste estudo.

4.2.2 Substrato para o Cultivo em Estado Sólido

Os fungos isolados foram cultivados em uma mistura de bagaço de cana-de-

açúcar, farelo de trigo e bagaço de malte (1:1:1 p/p). Os substratos foram lavados e
secos a 65°C. O bagaço de cana in natura foi triturado e peneirado, sendo utilizadas
partículas de 1 a 3 mm. A umidade do substrato foi determinada em estufa de
secagem, a 105ºC, conforme metodologia do Instituto Adolfo Lutz (2008).

4.3 Pré-inóculo para as fermentações em estado sólido

Para obtenção da suspensão fúngica a ser inoculada no substrato, o fungo foi

inicialmente inoculado na superfície do meio nutriente de aveia, em frascos
Erlenmeyer de 250 mL e incubado a 45 °C até completo crescimento.
Após este período, o microrganismo foi suspendido, com auxílio de alça de
inoculação, em uma solução composta por (g/L): (NH)4SO4 (3,5); KH2PO4 (3,0);
MgSO4.7H2O (0,5); CaCl2 (0,5), Tween 80 (10,0), com pH ajustado para 5,0, obtendo-
se assim uma suspensão micelial a ser inoculada no substrato citado no item 4.2.2.

4.4 Produção das celulases por fermentação em estado sólido

A produção de celulases pelos fungos foi feita em cultivo em estado sólido,

em frascos Erlenmeyer de 250 mL, utilizando-se 10 g do substrato (item 5.2.2). Foi
inoculado em cada embalagem um volume de suspensão micelial de modo que a
umidade inicial do substrato fique em 70% (o volume a ser colocado para isso
dependerá do resultado do teor de umidade de cada substrato seco, conforme análise
de umidade citada no item 5.2.2). O experimento foi feito com três repetições.
Os fungos foram inicialmente cultivados a 45°C e, a cada 48h, amostras foram
retiradas, até 240h (10 dias). A cada amostra retirada, foram adicionados 100 mL de
água destilada, sendo a mistura homogeneizada manualmente e mantida sob
agitação em shaker (100 rpm), por 30 minutos. Após este período, o material foi filtrado
em disco de tecido nylon, centrifugado a 10000 xg por 15 min, a 5ºC, e o sobrenadante
(extrato enzimático bruto) foi utilizado para determinação da atividade das enzimas. A
 31

linhagem selecionada para este trabalho foi posteriormente cultivada durante 10 dias,
com as amostras sendo retiradas a cada 24h, nas mesmas condições descritas.

4.5 Determinação da atividade enzimática

Para a determinação da atividade de β-glicosidase, 0,05 mL do extrato

enzimático foram adicionados à mistura de 0,25 mL de solução tampão acetato (0,1
M, pH 5,0) e 0,25 mL de 4-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (4 mM) – PNPG, Sigma. A
reação foi mantida a 60°C, por 10 minutos, e então interrompida com a adição de 2,0
mL de solução de Na2CO3 (2M). O nitrofenol liberado foi quantificado por
espectrofotometria a 410 nm. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como
a quantidade de enzima necessária para liberar 1,0 μmol de nitrofenol por minuto de
reação utilizando reta padrão obtida com solução de nitrofenol em variadas
concentrações (Santos et al., 2016).
 32

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Isolamento de fungos do solo com potencial de produção de β-glicosidase

No isolamento de fungos filamentosos termofílicos/termotolerantes com

potencial de produção de β-glicosidase, foram isoladas no total 19 linhagens, sendo
que 9 apresentaram potencial de produção da enzima na mistura de resíduos avaliada
(farelo de trigo, bagaço de cana e bagaço de malte).
Das 9 amostras, 7 foram isoladas de solo da horta agroecológica (linhagens 1,
2, 3, 5, 6, 7 e 8) e 2 da área com cana-de-açúcar (linhagens 4 a 9). Nenhuma linhagem
com potencial de produção da enzima foi selecionada da área com cultivo de abacaxi.
Este resultado sugere que as áreas com maior concentração de matéria orgânica
(palhada da cobertura de solo) favorecem a presença e desenvolvimento de fungos.
Além disso, no cultivo de abacaxi é utilizado diversas quantidades de produtos de
base fungicida, buscando seu manejo, o que pode afetar diretamente as populações
da biota existente na área.
A linhagem 4 apresentou os maiores valores de atividade enzimática, após 8 e
10 dias de cultivo (Figura 11). Porém, esta linhagem foi selecionada para um trabalho
paralelo em outro projeto. As demais linhagens apresentaram valores máximos de
atividade enzimática similares, que ocorreram principalmente entre 2 e 4 dias de
cultivo. Para o presente trabalho, a linhagem selecionada foi a 2, por apresentar as
seguintes características: produção da enzima em pouco tempo (em dois dias já
apresenta atividade enzimática) e também pelo fato de não ser um fungo com vigorosa
esporulação, diferente dos demais isolados. Esse fato faz com que a possibilidade de
contaminação de experimentos fosse reduzida e, dessa forma, esse fungo foi o
selecionado para os estudos de produção e caracterização enzimática.
Ressalta-se que os fungos estão classificados como
termofílicos/termotolerantes porque foram capazes de crescer a 45°C. Com a
posterior caracterização e identificação de cada linhagem, será possível classificá-las
como termofílicas ou como termotolerantes.
 33

Figura 11. Atividade de β-glicosidase pelas linhagens fúngicas isoladas do solo, em diferentes
tempo de cultivo do fungo.

2 dias 4 dias 6 dias 8 dias 10 dias

Atividade de β-glicosidase (U.g-1)
28
24
20
16
12
8
4
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Linhagens fúngicas

Visando estabelecer de forma mais específica o tempo de cultivo mais

adequado para a produção da β-glicosidase pela linhagem fúngica 2, foi feito um
experimento com retirada de amostras a cada 24h. Os resultados mostraram que a
maior atividade enzimática ocorreu após 3 dias de cultivo (Figura 12).
Oliveira et al. (2006) relatam o tempo reduzido para obtenção de enzimas de
origem microbiana, quando comparadas com enzimas vegetais e animais, o que
destaca a tendência do uso de enzimas microbianas em processos industriais.
Quando comparado com outras linhagens fúngicas, o tempo ótimo de cultivo
para a produção de β-glicosidase pelo fungo estudado no presente trabalho é menor
que o observado por alguns autores, tais como Pereira et al. (2015) que relataram
produção máxima de celulases após 192 h de cultivo em estado sólido do fungo
Thermomucor indicae-seudaticae N31 e Leite et al. (2008), que obtiveram maior
produção de β-glicosidase às 120 h de cultivo em estado sólido pela levedura
Aureobasidium pullulans. Dessa forma, o resultado encontrado no presente trabalho
é interessante do ponto de vista da produção da enzima para possível aplicação
industrial, uma vez que seu tempo de produção é curto.
 34

Figura 12. Atividade de β-glicosidase pela linhagem 2, isolada de solo proveniente da

Fazenda Horta Rio Grande em diferentes tempos de cultivo do fungo.

Atividade de β-glicosidase (U.g-1) 16

14

12

10

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dias de cultivo

5.2 Caracterização da β-glicosidase produzida pelo fungo

A β-glicosidase obtida pelo fungo, após 3 dias de cultivo a 45°C foi então
caracterizada quanto ao pH e temperatura ótimos para a sua atividade e quanto à
estabilidade a estes fatores. Os resultados mostraram que a enzima apresenta pH
ótimo entre 4,0 e 5,0, com a atividade decaindo em valores mais elevados (Figura
13).
Com relação à estabilidade ao pH, a enzima mostrou-se muito estável,
mantendo mais de 90% de sua atividade quando incubada sem substrato por 24h em
valores de pH entre 3,5 e 8,5. Dessa forma, apresenta potencial de utilização em
processos industriais com pHs variados, especialmente naqueles em que a atividade
é maior (pHs mais ácidos) (Figura 13).
 35

Figura 13. Efeito do pH sobre a atividade de β-glicosidase do fungo 2, quando cultivado a 45

°C durante 3 dias em substrato composto por bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de malte e
ferelo de trigo.

Atividade enzimática Estabilidade ao pH

Aividade de β-glicosidase (U.g-1)

Atividade enzimática residual (%)

25 100,00

20 80,00

15 60,00

10 40,00

5 20,00

0 ,00
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10
pH

Santos et al. (2016) relataram que a β-glicosidase produzida pelo fungo

Gongronella bluteri, que apresentou pH ótimo de 4,5, com a enzima mantendo mais
de 80% de atividade na faixa de pH entre 3,5 e 7,5. Já quando exposta por 24h em
valores de pH superiores, a atividade praticamente já não foi mais detectada. Baffi et
al. (2011) e Bathia, Mishra e Bisaria (2002) relatam que a maioria das β-glicosidases
fúngicas apresentam pH ótimo entre 4,0 e 6,0.
Em relação ao efeito da temperatura sobre a atividade enzimática, pode-se
observar que a enzima apresentou maior atividade entre 55°C e 70°C, sendo 65°C a
temperatura ótima (Figura 14). Este resultado também foi similar ao encontrado por
Garcia et al. (2015), Santos et al. (2016) e Garbin et al. (2021).
Quanto à estabilidade à temperatura, quando exposta a diferentes
temperaturas durante 1h, observou-se que a enzima é muito estável até 55°C (99%
de atividade residual). Em temperaturas superiores a esta, a atividade da β-
glicosidase foi decaindo progressivamente, mantendo 73%, 34% e 14% nas
temperaturas de 60 ºC, 65 ºC e 70 ºC, respectivamente (Figura 14).
 36

Figura 14. Efeito da temperatura sobre a atividade de β-glicosidase pela linhagem 2, quando
cultivada a 45 °C durante 3 dias em substrato composto por bagaço de cana-de-açúcar,
bagaço de malte e farelo de trigo (1:1:1).

Atividade enzimática Estabilidade à temperatura

Atividade enzimática residual (%)

Aividade de β-glicosidase (U.g-1)

25 120

20 100
80
15
60
10
40
5 20
0 0
40 45 50 55 60 65 70

Temperatura (° C)

A termoestabilidade é uma característica importante para enzimas industriais,

uma vez que a taxa de conversão do substrato aumenta em altas temperaturas e
nestas condições o risco de contaminação também é reduzido (Ahirvar et al., 2017;
Garbin et al., 2021). Experimentos preliminares indicam que o fungo avaliado no
presente trabalho é termotolerante. Assim, os resultados obtidos na termoestabilidade
da enzima indicam que ele possui adaptações em suas proteínas, criando condições
para que estas suportem elevadas temperaturas, o que pode ser objeto de estudos
posteriores.
Microrganismos termofílicos produzem enzimas que atuam em atividades em
temperaturas geralmente bem acima em relação aos mesofílicos, possibilitando seu
uso em muitos processos industriais onde esta condição é necessária (Martins et al.,
2019). A habilidade das enzimas termofílicas em atuar a altas temperaturas permite
que os bioprocessos ocorram em temperaturas mais altas e, com isso, várias
vantagens podem ser inferidas (Lee, 2018): apresentam uma alta estabilidade à
temperatura e são geralmente mais resistentes a agentes detergentes e a enzimas
proteolíticas; o risco de contaminação por microrganismos mesofílicos é reduzido; em
processos com substratos fluidos, em altas temperaturas a viscosidade do substrato
é reduzida, facilitando o seu bombeamento, filtração e centrifugação, permitindo o uso
de menor quantidade de água; mais substrato pode ser dissolvido em altas
temperaturas, com maior rendimento e menor tempo necessário para os processos.
 37

6 CONCLUSÃO

O presente estudo possibilitou o isolamento de linhagens fúngicas

termotolerantes ou termofílicos com potencial de produção de β-glicosidase,
especialmente provenientes da área de solo de cultivo agroecológico. A linhagem
selecionada para o estudo apresentou características muito interessantes do ponto de
vista para sua aplicação industrial, tais como o curto tempo de produção, alta atividade
enzimática em altas temperaturas, além de apresentar excelente estabilidade ao pH
e à temperatura.
 38

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