Vera Neves Menezes

Genética Humana

Visita de estudo:
As atividades a desenvolver decorrem em
diferentes espaços do Instituto Bento da
Rocha Cabral correspondentes à evolução
de ambientes de trabalho ao longo da
história da Ciência e da Tecnologia nas
Ciências Biomédicas.

1. Na histórica sala de conferências será

dado a conhecer como o Instituto Bento da
Rocha Cabral se tornou uma referência na
Ciência do início do séc. XX.
2. Visita guiada aos Laboratórios
históricos e atuais numa sequência
cronológica com referências a alguns dos
mais emblemáticos Investigadores que aí
trabalharam.
3. Atividade prática associada a
procedimentos laboratoriais e
Genética Humana interpretação de resultados de algumas
técnicas utilizadas correntemente na
Da Citogenética à Biologia Molecular
análise genética:
3.1. PCR (Polymerase Chain Reaction) –
Biologia molecular
3.2. Análise de cariótipos – Citogenética
Table of Contents
Instituto Bento da Rocha Cabral.....................................................................................................................................2

História..........................................................................................................................................................................2

Laboratórios..................................................................................................................................................................2

Biblioteca.......................................................................................................................................................................3

PCR (Polymerase Chain Reaction) – Biologia molecular.............................................................................................4

DNA polimerase Termotestável....................................................................................................................................4

Componentes da PCR...................................................................................................................................................5

Etapas da PCR..............................................................................................................................................................5

Número de cópias formadas.........................................................................................................................................5

Cinética da PCR............................................................................................................................................................6

Limitações da PCR........................................................................................................................................................6

Aplicações da PCR........................................................................................................................................................6

Atividade laboratorial – PCR (Polymerase Chain Reaction)......................................................................................7

Reação de amplificação de uma porção de DNA......................................................................................................7
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) – Reação em cadeia da polimerase..................................................7
Reação de restrição do produto de amplificação anterior........................................................................................8
PCR-RFLP (POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGHT
POLYMORPHISM)..................................................................................................................................................8

Eletroforese em gel de agarose.........................................................................................................................................9

Como os fragmentos de DNA movem-se através do gel?............................................................................................9

Análise de cariótipos – Citogenética..............................................................................................................................11

Para que serve ?..........................................................................................................................................................11

O que o exame identifica ?.........................................................................................................................................12

Como é feito ?.............................................................................................................................................................12

Tipos de exame de citogenética..................................................................................................................................12

1. Bandeamento G.................................................................................................................................................12
2. Técnica de FISH................................................................................................................................................13

1
Instituto Bento da Rocha Cabral a
O Instituto Bento da Rocha Cabral é um Instituto de Investigação Científica na área das Ciências
Biomédicas, abrangendo temas como a Genética e a Bioquímica.
Trabalham no Instituto Investigadores e estudantes pós-graduados.
O Instituto é sede da Sociedade Portuguesa de Biologia, do Núcleo Português para o Estudo da
Hipertensão da Grávida e da Sociedade Portuguesa do Papilomavírus Humano. Existe também
uma seção dedicada à História e Filosofia da Ciência.
O Instituto é uma instituição pública sem fins lucrativos, com preocupações de comunicação e
divulgação científica.

História
O Instituto Rocha Cabral foi fundado em 1923 com base no testamento de B. Rocha Cabral, que
deixou a maior parte de sua fortuna para a criação de uma instituição de pesquisa. Dirigido por
Matias Boleto Ferreira de Mira, professor de Química Fisiológica na Universidade de Lisboa, o
instituto começou suas atividades de pesquisa em novembro de 1925, com quatro pesquisadores. O
foco principal do instituto era a pesquisa pura, embora também desse suporte à pesquisa aplicada.

O instituto consistia em quatro seções dedicadas à Fisiologia, Histologia, Química Biológica e

Bacteriologia. Ao longo dos anos, o instituto acolheu e apoiou uma variedade de pesquisadores
notáveis, incluindo Egas Moniz, que realizou pesquisas pioneiras em Angiografia e
Angiopneumografia. Outros pesquisadores destacados incluíram Carlos França, Matilde Bensaúde
e Padre Joaquim da Silva Tavares, S.J.

O trabalho realizado no Instituto Rocha Cabral foi documentado nos volumes anuais dos "Travaux
de Laboratoire de l'Institut Rocha Cabral", que continham os artigos originais dos pesquisadores,
bem como nas "Actualidades Biológicas", que incluíam as conferências realizadas na sede do
instituto.

Laboratórios
O laboratório do Instituto Rocha Cabral está totalmente equipado para apoiar os pesquisadores em
suas investigações, fornecendo o necessário para a obtenção de dados bioquímicos e genéticos. As
linhas de pesquisa abrangem uma ampla gama de patologias, incluindo Hipertensão, Surdez,
Drepanocitose, Leiomiomas, Osteoporose e Cancro.

2
Biblioteca
A Biblioteca do Instituto Rocha Cabral (BIRC) tem como objetivos principais promover a cultura
científica, divulgar o patrimônio documental do instituto e disponibilizar informações para consulta
de seus usuários, incluindo professores, alunos e instituições. Com uma vasta coleção de
publicações periódicas, incluindo contribuições de renomados cientistas como Ferreira de Mira,
Kurt Jacobson e conferencistas como Flávio Resende e Matilde Bensaúde, a biblioteca também
conta com novas publicações atualizadas regularmente e uma variedade de monografias relevantes
para o campo científico.

Destaca-se na coleção o acervo dos manuais Beilstein de Química Orgânica, contribuindo para o
desenvolvimento do maior banco de dados de química orgânica atualmente mantido pela Elsevier.
Sob a direção do Prof. Manuel Bicho, o foco atual da biblioteca é promover a ciência e atrair
jovens para a pesquisa científica. Além de uma sala de catalogação e uma extensa coleção de
publicações, a biblioteca oferece um espaço de consulta e estudo para seus usuários.

3
PCR (Polymerase Chain Reaction) – Biologia
molecular
A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias de uma região
específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um organismo)..
- Técnica da Biologia Molecular empregada para obter-se amplificação exponencial de um
fragmento específico e com sequência conhecida da molécula de DNA in vitro, empregando
elementos do processo natural de replicação do DNA.
- O conceito de amplificação do DNA sempre foi utilizado; porém, a amplificação é feita in vivo, e
não in vitro como na PCR.
- histórico: o processo de amplificação do DNA in vitro foi inventado por Kary Mullis, em 1983 (o
que lhe conferiu o Prêmio Nobel em 1993), e a primeira amplificação realizada foi a da
betaglobulina humana; o termociclador (aparelho responsável por fornecer as variações de
temperatura necessárias para a realização da PCR) foi projetado em 1985, para que a DNA
polimerase pudesse ser adicionada a cada ciclo, porém após a descoberta da DNA polimerase
termoestável foi necessário ter máquinas com ciclagem mais rápida entre diferentes temperaturas.
- Qualquer sequência de DNA pode ser amplificada por PCR; a localização da sequência que se
deseja amplificar é realizada por primers; oligonucleotídeos com 20 a 24 pares de base são
usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta
complexidade; o pareamento dos primers à sequência-alvo ocorre pelo estabelecimento de pontes
de hidrogênio (A = T e C ≡ G).
- A polimerização ocorre sempre no sentido 5’3’.

DNA polimerase Termotestável

- Em 1969 T. Brock e H Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria
termofílica, Thermus aquaticus, que sobrevive em água à temperatura média de 75oC; várias
enzimas foram extraídas dessa bactéria, inclusive a DNA polimerase em 1976 (denominada então
de taq DNA polimerase).
- A taq DNA polimerase tem temperatura ótima de atuação de 72oC, mas se mantém estável até
temperaturas superiores a 94oC.

- Não possui atividade corretiva 3’5’.

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Componentes da PCR
- Água Mili-Q (meio onde ocorre a reação; livre de íons e contaminação).
- Tampão (controla o pH).
- Cátion divalente (marca o primer para que o sítio de ação seja encontrado; geralmente é usado o
MgCl+2).
- Par de primers (localizam e se ligam à sequência-alvo).
- Deoxinucleotídeos trifosfato ou dNTPs (nucleotídeos usados na extensão das novas fitas).
- DNA molde, amostra de DNA ou TEMPLATE (DNA que possui a sequência a ser amplificada).
- DNA polimerase termoestável (enzima responsável pela polimerização/construção das novas fitas
de DNA).

Etapas da PCR
- Desnaturação: desnaturação do DNA molde (template) pelo aumento da temperatura; ocorre entre
94oC a 96oC; ocorre a separação da dupla fita do DNA molde em duas fitas simples; a enzima está
desativada.
- Pareamento: pareamento dos primers às sequências-alvo de cada fita simples formada; ocorre
entre 37oC a 65oC; os primers se ligam à seus locais específicos nas fitas moldes; a enzima está
desativada.

- Extensão: extensão da nova fita pela DNA polimerase termoestável; a DNA polimerase
termoestável usa os nucleotídeos (dNTPs) adicionando-os à nova fita, de acordo com sua
complementariedade.

Número de cópias formadas

- Cada uma das novas fitas formadas em cada ciclo da PCR serve como template para a geração de
novas fitas, o que garante um aumento exponencial no número de fitas.
- 30 ciclos no termociclador geram 1 073 741 824 cópias.

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Cinética da PCR
- Fase de Screening: ocorre nos ciclos iniciais, onde os primers procuram as sequências
complementares na amostra; este processo não é difícil, pois os primers estão em considerável
excesso em relação ao template.
- Fase intermediária: o processo de amplificação está ocorrendo, de modo que os primers permitem
o acúmulo exponencial do fragmento de DNA desejado; o pareamento do primer com a sequência-
alvo já é bem facilitado, pois já existem várias cópias do template.
- Fase de platô: a amplificação já é sub-ótima, e a reação deve ser encerrada antes que esta estapa
comece a ocorrer (pois ocorre multiplicação de sequências não desejadas); suas causas são perda
da atividade da taq DNA polimerase, ocupação de todas as taq DNA polimerase disponíveis com a
síntese de DNA, acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si e limitação dos
reagentes.
- O aumento exponencial ocorre até determinado ciclo, sendo variável de reação para reação.

Limitações da PCR
- Precisa-se conhecer parte da sequência de DNA a ser amplificada, para construir os primers. -
Contaminações são problemas significativos.
- Deve-se haver precisão, e nem sempre é possível.
- O tamanho do fragmento a ser amplificado geralmente é menor que 2000 pares de base.

Aplicações da PCR
- Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros).
- Seleções de clones recombinantes, com primers complementares à sequências de vetor, em
ambos os lados do sítio de clonagem.
- Sequenciamento direto de produtos amplificados.
- Detecção de mutações em genes específicos (diagnóstico precoce em estudos de câncer e doenças
genéticas, estudos terapêuticos para determinação do mecanismo de ação de substâncias
mutagênicas).
- Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários
parasitos.
- Diagnóstico pré-natal de riscos.
- Elucidação de relações evolutivas entre espécies, utilizando material arqueológico.
- Medicina forense (impressão digital de DNA).

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Atividade laboratorial – PCR (Polymerase Chain Reaction)
Reação de amplificação de uma porção de DNA
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) – Reação em cadeia da polimerase

Soluções necessárias:

· DNA
· Água desionisada
· GreenMix (contém: Tampão; MgCl2, DNA polymerase e dNTPs)
· Primers (sequências iniciadoras)

Reação de amplificação (PCR)

Usar uma ponta de pipeta nova para cada pipetagem.

Descartar sempre as pontas de pipetas após utilização.
Usar luvas.
Agitar a solução de GreenMix antes de utilizar utilizando um agitador.
1. Pipetar para o tubo de PCR os seguintes volumes de reagentes:
 10 ml DNA
 5 ml Primers
 20 ml GreenMix
 10 ml H2O

2. Centrifugar os tubos numa microcentrífuga para garantir que todos os reagentes ficam bem
misturados e concentrados no fundo do tubo.
3. Colocar os tubos no termociclador e programar o aparelho com o seguinte programa de
amplificação:
 94ºC 2min – Hot Start
 94ºC 45s - Desnaturação
 55ºC 45s – Emparelhamento 35x
 72ºC 45s - Extensão
 72ºC 10 min – Extensão final

4. Iniciar o programa e quando este acabar colocar os tubos a 4ºC.

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Reação de restrição do produto de amplificação anterior
PCR-RFLP (POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT
LENGHT POLYMORPHISM)
Soluções necessárias
· Produto de amplificação obtido anteriormente
· Água desionisada
· Solução tampão
· Enzima de restrição
Reação de restrição
Usar uma ponta de pipeta nova para cada pipetagem.
Descartar sempre as pontas de pipetas após utilização.
Usar luvas.
1. Pipetar para o tubo de PCR os seguintes volumes de reagentes:
· 10 ml Produto de amplificação obtido anteriormente
· 20 ml Tampão
· 10 ml H2O
· 5 ml Enzima de restrição
2. Colocar os tubos no termociclador e programar o aparelho com o seguinte programa de
restrição:
· 37 ºC, 16h
3. Iniciar o programa e quando este acabar colocar os tubos a 4ºC.

8
Eletroforese em gel de agarose

A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA (ou outras
macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a
passagem de uma corrente através de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu
tamanho e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes
velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras.

A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA (ou outras
macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a
passagem de uma corrente através de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu
tamanho e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes
velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras.

Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa. Por essa razão, a
eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação baseada apenas no tamanho. Através do
uso da eletroforese, podemos ver quantos diferentes fragmentos de DNA estão presentes em uma
amostra, e o quão grandes eles são em relação aos outros. Podemos também determinar o tamanho
absoluto de um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA "padrão", composto de
fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos.

Como os fragmentos de DNA movem-se através do gel?

Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma das amostras de DNA que queremos examinar (por
exemplo, cada reação de PCR ou cada plasmídeo digerido por restrição) é cuidadosamente
transferida para um dos poços. Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de
referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos. As escadas de DNA
comerciais vêm em diferentes intervalos de tamanho, então podemos escolher uma que tenha boa
"cobertura" para a faixa de tamanho esperada de nossos fragmentos.

A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel. As moléculas de DNA têm
carga negativa devido aos grupos fosfato em seus esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas
começam a se mover através da matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a
corrente passa através do gel, diz-se que o gel está correndo.

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10
Visualização dos fragmentos de DNA
Uma vez que os fragmentos tenham sido separados, podemos examinar o gel e ver quais tamanhos
de faixas são encontrados. Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA e
depois colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA
presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.

Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é chamada de banda. Cada banda contém um
grande número de fragmentos de DNA do mesmo tamanho e todos os que viajaram, como um
grupo, para a mesma posição. Um fragmento único de DNA (ou até mesmo um pequeno grupo de
fragmentos de DNA) não seria visível por si só em um gel.

Ao comparar as bandas em uma amostra à escada de DNA, podemos determinar os tamanhos

aproximados. Por exemplo, a banda brilhante no gel acima tem, aproximadamente, o tamanho
de pares de bases (bp).

Atividade laboratorial - ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

1. Preparar o tampão de eletroforese (TBE 1X). Para isso, adicionar 900mL água purificada
Milli-Q a 100mL de TBE 10X e agitar.
2. Preparar o gel de agarose (2%), adicionando 50mL de TBE 1x a 1g de agarose. Levar ao
micro-ondas, agitando algumas vezes, até dissolver completamente a agarose. Adicionar
5μL de agente intercalante (RedSafe), agitando cuidadosamente. Verter o gel sobre o berço,
colocando o pente para formar os poços e esperar cerca de 20 minutos para solidificar.
3. Depois de solidificar retirar cuidadosamente o pente e em seguida o gel do berço e passar
para a tina de eletroforese (nesta etapa foi utilizado um gel solidificado previamente).
4. Aplicar 5μL de cada amostra (neste caso de produto de PCR + digestão) cuidadosamente
nos poços.
5. Ligar a fonte de alimentação e deixar correr por 60 minutos, 110V.
6. Utilizar o transiluminador para visualizar os resultados (nesta etapa foi visualizado um gel
obtido previamente depois de uma corrida de eletroforese com amostras de produto de PCR
e os 3 diferentes genótipos obtidos por digestão usando uma enzima de restrição).

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Análise de cariótipos – Citogenética

A citogenética é um exame que tem como objetivo analisar os cromossomos e, assim, identificar
alterações na estrutura e número de cromossomos, sendo geralmente indicado para diagnosticar
doenças genéticas ou alguns tipos de câncer.
Esse exame é feito recolhendo uma amostra de sangue, tecido ou medula óssea e pode ser feito em
qualquer idade, até mesmo durante a gravidez para verificar possíveis alterações genéticas no bebê.
A citogenética permite que o médico e o paciente possuam uma visão geral do genoma, auxiliando
o médico a realizar o diagnóstico e direcionar o tratamento, se necessário. Esse exame não
necessita de nenhum preparo e a coleta não demora a ser feita, no entanto o resultado pode demorar
entre 3 e 10 dias para ser liberado de acordo com o laboratório.

Para que serve ?

O exame de citogenética humana é indicado para investigar possíveis alterações cromossômicas,
tanto em crianças quanto em adultos, como:
 Síndrome de Down;
 Síndrome de Edwards;
 Síndrome de Patau;
 Síndrome DiGeorge;
 Síndrome Cri-Du-Chat;
 Síndrome de Klinefelter;
 Hermafroditismo ou pseudo-hermafroditismo;

 Leucemias;

 Linfomas.

Geralmente, esse exame é indicado nos casos de histórico familiar de alguma alteração genética,
alterações no ultrassom obstétrico, idade materna avançada, abortos recorrentes ou alterações em
exames bioquímicos.

Além disso, o exame de citogenética no caso de câncer, pode ajudar na classificação do tipo de
leucemia, além de avaliar o melhor tratamento, assim como a resposta ao tratamento, por exemplo.

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O que o exame identifica ?
O exame de citogenética permite identificar alterações nos cromossomos, como:
 Alterações numéricas, que são caracterizadas pelo aumento ou diminuição na quantidade
de cromossomos, como o que acontece na síndrome de Down, em que é verificada a
presença de três cromossomos 21, possuindo a pessoa 47 cromossomos no total;
 Alterações estruturais, que são caracterizadas pela substituição, troca ou eliminação de
determinada região de um cromossomo, como por exemplo a síndrome de Cri-du-Chat, em
que ocorre uma perda de um pedaço do cromossomo 5.
Assim, esse exame avalia o cromossomo, que é uma estrutura constituída por DNA e proteínas que
está distribuído nas células em pares, sendo 23 pares.
Desta forma, a partir do cariograma, que corresponde ao esquema de organização dos
cromossomos, é possível identificar alterações no número e estrutura dos cromossomos.

Como é feito ?
O exame de citogenética normalmente é feito a partir de amostra de sangue, mas também pode ser
feito com amostras de tecido ou medula óssea.
No caso do exame em gestantes, cujo objetivo é avaliar os cromossomos do feto, é coletado o
líquido amniótico, as vilosidades coriônicas, ou até mesmo pequenas quantidades de sangue.
Após a coleta das amostras e envio para o laboratório, é feito o cultivo das células para que elas se
multipliquem e depois é adicionado um uma substância que inibe a divisão das células, fazendo
com que o cromossomo se encontre na sua forma mais condensada e de melhor visualização.

Tipos de exame de citogenética

Dependendo do objetivo do exame, podem ser aplicadas técnicas moleculares diferentes para se
obter informação do cariótipo da pessoa, sendo as mais utilizadas:

1. Bandeamento G

A técnica de bandeamento G, ou cariotipagem, consiste na aplicação do corante Giemsa, que

permite a visualização dos cromossomos.
Essa técnica é muito eficaz para detectar alterações numéricas, principalmente, e estruturais do
cromossomo, sendo a principal técnica molecular aplicada na citogenética para diagnóstico e
confirmação da síndrome de Down, por exemplo, que é caracterizada pela presença de um
cromossomo extra

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2. Técnica de FISH

A técnica de FISH é mais específica e sensível, sendo mais utilizada para auxiliar no diagnóstico
de câncer, pois permite identificar pequenas alterações nos cromossomos e rearranjos, além de
identificar também alterações numéricas dos cromossomos.
Apesar de ser bastante eficaz, a técnica de FISH é mais cara, pois utiliza sondas de DNA marcadas
com fluorescência, sendo necessário um aparelho para captar a fluorescência e permitir a
visualização dos cromossomos. Além disso, há técnicas mais acessíveis na biologia molecular que
permitem o diagnóstico de câncer.

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