Vera Neves Menezes

Genética Humana

Visita de estudo:
As atividades a desenvolver decorrem em
diferentes espaços do Instituto Bento da
Rocha Cabral correspondentes à evolução
de ambientes de trabalho ao longo da
história da Ciência e da Tecnologia nas
Ciências Biomédicas.

1. Na histórica sala de conferências será

dado a conhecer como o Instituto Bento da
Rocha Cabral se tornou uma referência na
Ciência do início do séc. XX.
2. Visita guiada aos Laboratórios
históricos e atuais numa sequência
cronológica com referências a alguns dos
mais emblemáticos Investigadores que aí
trabalharam.
3. Atividade prática associada a
procedimentos laboratoriais e
Genética Humana interpretação de resultados de algumas
técnicas utilizadas correntemente na
Da Citogenética à Biologia Molecular
análise genética:
3.1. PCR (Polymerase Chain Reaction) –
Biologia molecular
3.2. Análise de cariótipos – Citogenética
Table of Contents
Instituto Bento da Rocha Cabral.....................................................................................................................................3

História..........................................................................................................................................................................3

Biblioteca.......................................................................................................................................................................4

PCR (Polymerase Chain Reaction) – Biologia molecular.............................................................................................5

DNA polimerase Termotestável....................................................................................................................................5

Limitações da PCR........................................................................................................................................................8

Aplicações da PCR........................................................................................................................................................8

Atividade laboratorial – PCR (Polymerase Chain Reaction)......................................................................................9

Reação de amplificação de uma porção de DNA......................................................................................................9
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) – Reação em cadeia da polimerase..................................................9
Reação de restrição do produto de amplificação anterior.......................................................................................10
PCR-RFLP (POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGHT
POLYMORPHISM)................................................................................................................................................10

Eletroforese em gel de agarose.......................................................................................................................................11

Como é que os fragmentos de DNA se movem através do gel?.................................................................................11

Visualização dos fragmentos de DNA........................................................................................................................12

Análise de cariótipos – Citogenética..............................................................................................................................13

Para que serve?...........................................................................................................................................................13

O que identifica o exame?..........................................................................................................................................14

Como é realizado?.......................................................................................................................................................14

Tipos de exames de citogenética.................................................................................................................................15

1. Bandeamento G.................................................................................................................................................15
2. Técnica de FISH................................................................................................................................................15

1
Figura 1- Instituto Bento da Rocha Cabral.........................................................................................3
Figura 2- Placa do instituto.................................................................................................................3
Figura 3- Laboratórios........................................................................................................................4
Figura 4 - Laboratórios.......................................................................................................................4
Figura 5- Biblioteca............................................................................................................................4
Figura 6 – Ampliação DNA................................................................................................................5
Figura 7- PCR.....................................................................................................................................6
Figura 8- Etapas da PCR.....................................................................................................................6
Figura 9 – Etapas da PCR...................................................................................................................6
Figura 10 - Número de cópias formadas.............................................................................................7
Figura 11- Análise produto amplificado.............................................................................................9
Figura 12- Observação fragmentos...................................................................................................12
Figura 13- Análise.............................................................................................................................12
Figura 14 - Amostra..........................................................................................................................13
Figura 15- Preparação citogenética...................................................................................................14
Figura 16 - Bandamento G................................................................................................................15
Figura 17- Ideograma........................................................................................................................15
Figura 19 - FISH...............................................................................................................................15
Figura 18 - FISH...............................................................................................................................15

2
 Instituto Bento da Rocha Cabral
O Instituto Bento da Rocha Cabral é um Instituto de Investigação Científica na área das Ciências
Biomédicas, abrangendo temas como a Genética e a Bioquímica.
Trabalham no Instituto Investigadores e estudantes pós-graduados.
O Instituto é sede da Sociedade Portuguesa de Biologia, do Núcleo Português para o Estudo da
Hipertensão da Grávida e da Sociedade Portuguesa do Papilomavírus Humano. Existe também
uma seção dedicada à História e Filosofia da Ciência.
O Instituto é uma instituição pública sem fins lucrativos, com preocupações de comunicação e
divulgação científica.

História
O Instituto Rocha Cabral foi fundado em 1923 com base no testamento de B. Rocha Cabral, que
deixou a maior parte de sua fortuna para a criação de uma instituição de pesquisa. Dirigido por
Matias Boleto Ferreira de Mira, professor de Química Fisiológica na Universidade de Lisboa, o
instituto começou suas atividades de pesquisa em novembro de 1925, com quatro pesquisadores. O
foco principal do instituto era a pesquisa pura, embora também deste suporte à pesquisa aplicada.

O instituto consistia em quatro seções dedicadas à Fisiologia, Histologia, Química Biológica e

Bacteriologia. Ao longo dos anos, o instituto acolheu e apoiou uma variedade de pesquisadores
notáveis, incluindo Egas Moniz, que realizou pesquisas pioneiras em Angiografia e
Angiopneumografia. Outros pesquisadores destacados incluíram Carlos França, Matilde Bensaúde
e Padre Joaquim da Silva Tavares, S.J.

O trabalho realizado no Instituto Rocha Cabral foi documentado nos volumes anuais dos "Travaux
de Laboratoire de l'Institut Rocha Cabral", que continham os artigos originais dos pesquisadores,
bem como nas "Actualidades Biológicas", que incluíam as conferências realizadas na sede do
instituto.

Figura 1- Instituto Bento da Rocha Cabral Figura 2- Placa do instituto

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Laboratórios

O laboratório do Instituto Rocha Cabral está totalmente equipado para apoiar os pesquisadores em
suas investigações, fornecendo o necessário para a obtenção de dados bioquímicos e genéticos. As
linhas de pesquisa abrangem uma ampla gama de patologias, incluindo Hipertensão, Surdez,
Drepanocitose, Leiomiomas, Osteoporose e Cancro.

Figura 3- Laboratórios Figura 4 - Laboratórios

Biblioteca
A Biblioteca do Instituto Rocha Cabral (BIRC) tem como objetivos principais promover a cultura
científica, divulgar o patrimônio documental do instituto e
disponibilizar informações para consulta de seus usuários,
incluindo professores, alunos e instituições. Com uma vasta
coleção de publicações periódicas, incluindo contribuições de
renomados cientistas como Ferreira de Mira, Kurt Jacobson e
conferencistas como Flávio Resende e Matilde Bensaúde, a
biblioteca também conta com novas publicações atualizadas
regularmente e uma variedade de monografias relevantes para o
campo científico.
Destaca-se na coleção o acervo dos manuais Beilstein de Química
Orgânica, contribuindo para o desenvolvimento do maior banco
de dados de química orgânica atualmente mantido pela Elsevier.
Sob a direção do Prof. Manuel Bicho, o foco atual da biblioteca é
promover a ciência e atrair jovens para a pesquisa científica. Além
de uma sala de catalogação e uma extensa coleção de publicações,
a biblioteca oferece um espaço de consulta e estudo para seus Figura 5- Biblioteca
usuários.

4
PCR (Polymerase Chain Reaction) – Biologia molecular
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica utilizada para fazer várias cópias de uma
região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um organismo)..
- Técnica da Biologia Molecular utilizada para obter-se uma amplificação exponencial de um
fragmento específico e com uma sequência conhecida da molécula de DNA, aproveitando
elementos do processo natural de replicação do DNA.
- O conceito de amplificação do DNA já é utilizado há muito tempo, porém, a amplificação é feita
in vivo, e não in vitro como na PCR.
Histórico: O processo de amplificação do DNA in vitro foi inventado por Kary Mullis, em 1983 (o
que lhe conferiu o Prêmio Nobel em 1993), e a primeira amplificação realizada foi a da
betaglobulina humana; o termociclador foi projetado em 1985, para que a DNA polimerase
pudesteser adicionada a cada ciclo, porém após a descoberta da DNA polimerase termoestável foi
necessário ter máquinas com ciclagem mais rápida entre diferentes temperaturas.
- Qualquer sequência de DNA pode ser amplificada por PCR; a localização da sequência que se
deseja amplificar é realizada por primers; oligonucleotídeos com 20 a 24 pares de base são
usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta
complexidade; o pareamento dos primers à sequência-alvo ocorre pelo estabelecimento de pontes
de hidrogênio (A = T e C ≡ G).
- A polimerização ocorre sempre no sentido 5’- 3’.

Figura 6 – Ampliação DNA

DNA polimerase Termotestável

- Em 1969 T. Brock e H Freeze descobriram uma nova espécie de bactéria termofílica, Thermus
aquaticus, que sobrevive em água à temperatura média de 75ºC; várias enzimas foram extraídas
desta bactéria, inclusive a DNA polimerase em 1976.
- A taq DNA polimerase tem uma temperatura ótima de atuação de 72ºC, mas mantém-se estável
até temperaturas superiores a 94ºC.

5
 Componentes da PCR

- Água Mili-Q (meio onde ocorre a reação; livre de íons e

contaminação).
- Tampão (controla o pH).
- Cátion divalente (marca o primer para que o sítio de ação
seja encontrado; geralmente é usado o MgCl+2)
- Par de primers (localizam e ligam-se à sequência-alvo).
- Deoxinucleotídeos trifosfato ou dNTPs (nucleotídeos
usados na extensão das novas fitas).
- DNA molde, amostra de DNA ou TEMPLATE (DNA que Figura 7- PCR
possui a sequência que vai ser amplificada).
- DNA polimerase termoestável (enzima responsável pela polimerização/construção das novas fitas
de DNA).

Etapas da PCR

- Desnaturação: Desnaturação do DNA molde (template) pelo aumento da temperatura; ocorre

entre os 94ºC e 96ºC; ocorre a separação da dupla fita do DNA molde em duas fitas simples; a
enzima está desativada.
- Paramento: Paramento dos primers às sequências-alvo de cada fita simples formada; ocorre entre
os 37ºC e 65ºC; os primers ligam-se aos seus locais específicos nas fitas moldes; a enzima está
desativada.
- Extensão: Extensão da nova fita pela DNA polimerase termoestável; a DNA polimerase
termoestável usa os nucleótidos (dNTPs) adicionando-os à nova fita, de acordo com sua
complementaridade.

Figura 8 – Etapas da PCR

Figura 9- Etapas da PCR

6
Número de cópias formadas

- Cada uma das novas fitas formadas em cada ciclo da PCR serve como template para o grupo de
novas fitas, o que garante um aumento no número de fitas.
- 30 ciclos no termociclador geram 1 073 741 824 cópias.

Figura 10 - Número de cópias formadas

Cinética da PCR

- Fase de Screening:
Ocorre nos ciclos iniciais, onde os primers procuram as sequências complementares na amostra;
este processo não é difícil, pois os primers estão em excesso em relação ao template.

- Fase intermediária:
O processo de amplificação está a ocorrer, de modo a que os primers permitam o acúmulo do
fragmento de DNA desejável; o paramento do primer com a sequência-alvo já́ é facilitado, pois
existem várias cópias do template.

- Fase de platô:
A amplificação já́ é sub-ótima, e a reação deve ser encerrada antes que esta etapa comece a ocorrer
(pois ocorre multiplicação de sequências não desejadas); as causas são a perda da atividade da taq
DNA polimerase, a ocupação de todas as taq DNA polimerase disponíveis com a síntese de DNA,
o acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si e a limitação dos reagentes.
- O aumento exponencial ocorre até determinado ciclo, sendo variável de reação para reação.

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Limitações da PCR
- É preciso conhecer parte da sequência de DNA a ser amplificada, para construir os primers. – As
contaminações são problemas significativos.
- Deve haver precisão, e nem sempre é possível.
- O tamanho do fragmento a ser amplificado geralmente é menor que 2000 pares de base.

Aplicações da PCR
- Estudo do padrão da expressão genética.
- Seleções de clones recombinantes, com primers complementares à sequências de vetor, em
ambos os lados do lugar da clonagem.
- Sequenciamento direto de produtos amplificados.
- Deteção de mutações em genes específicos (diagnóstico precoce em estudos de cancro e doenças
genéticas).
- Estudos diagnósticos de doenças infeciosas, deteção de bactérias, vírus e protozoários parasitas.
- Diagnóstico pré́-natal de riscos.
- Elucidação de relações evolutivas entre espécies, utilizando material arqueológico.
- Medicina forense (impressão digital do DNA).

8
Atividade laboratorial – PCR (Polymerase Chain Reaction)
Reação de amplificação de uma porção de DNA
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) – Reação em cadeia da polimerase

Soluções necessárias:

· DNA
· Água desionizada
· GreenMix (contém: Tampão; MgCl2, DNA polymerase e dNTPs)
· Primers (sequências iniciadoras)

Reação de amplificação (PCR)

Usar uma ponta de pipeta nova para cada pipetagem.

Descartar sempre as pontas de pipetas após utilização.
Usar luvas.
Agitar a solução de GreenMix antes de utilizar utilizando um agitador.
1. Pipetar para o tubo de PCR os seguintes volumes de reagentes:
 10 ml DNA
 5 ml Primers
 20 ml GreenMix
 10 ml H2O

2. Centrifugar os tubos numa microcentrífuga para garantir que todos os reagentes ficam bem
misturados e concentrados no fundo do tubo.
3. Colocar os tubos no termociclador e programar o aparelho com o seguinte programa de
amplificação:
 94ºC 2min – Hot Start
 94ºC 45s - Desnaturação
 55ºC 45s – Emparelhamento 35x
 72ºC 45s - Extensão
 72ºC 10 min – Extensão final

4. Iniciar o programa e quando este

acabar colocar os tubos a 4ºC.

Figura 11- Análise produto amplificado

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Reação de restrição do produto de amplificação anterior
PCR-RFLP (POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT
LENGHT POLYMORPHISM)
Soluções necessárias
· Produto de amplificação obtido anteriormente
· Água desionizada
· Solução tampão
· Enzima de restrição
Reação de restrição
Usar uma ponta de pipeta nova para cada pipetagem.
Descartar sempre as pontas de pipetas após utilização.
Usar luvas.
1. Pipetar para o tubo de PCR os seguintes volumes de reagentes:
· 10 ml Produto de amplificação obtido anteriormente
· 20 ml Tampão
· 10 ml H2O
· 5 ml Enzima de restrição
2. Colocar os tubos no termociclador e programar o aparelho com o seguinte programa de
restrição:
· 37 ºC, 16h
3. Iniciar o programa e quando este acabar colocar os tubos a 4ºC.

10
Eletroforese em gel de agarose

A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA com base no tamanho
e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente através de um gel contendo as
moléculas de interesse. Em função do seu tamanho e carga, as moléculas movem-se através do gel
em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das
outras.

Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa. Por esta razão, a
eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação baseando-se apenas no tamanho.
Através do uso da eletroforese, podemos ver quantos diferentes fragmentos de DNA estão
presentes numa amostra, e o quão grandes eles são em relação aos outros. Podemos também
determinar o tamanho absoluto de um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA
"padrão", composto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos.

Como é que os fragmentos de DNA se movem através do gel?

Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma das amostras de DNA que queremos examinar (por
exemplo, cada reação de PCR ou cada plasmídeo digerido por restrição) é cuidadosamente
transferida para um dos poços. Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de
referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos. As escadas de DNA
comerciais vêm em diferentes intervalos de tamanho, então podemos escolher uma que tenha uma
boa "cobertura" para a faixa de tamanho esperada dos nossos fragmentos.

A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel. As moléculas de DNA têm
carga negativa devido aos grupos fosfato nos seus esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas
começam a mover-se através da matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a
corrente passa através do gel, diz-se que o gel está a correr.

11
Visualização dos fragmentos de
DNA
Com os fragmentos já separados, podemos
examinar o gel e ver quais tamanhos de faixas são
encontrados. Quando um gel é pigmentado com um
corante que se liga ao DNA e depois colocado sob
luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que
permite-nos visualizar o DNA presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.

Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é Figura 12- Observação fragmentos
chamada de banda. Cada banda contém um grande
número de fragmentos de DNA do mesmo tamanho e
todos os que viajaram, como um grupo, para a
mesma posição. Um fragmento único de DNA (ou
até mesmo um pequeno grupo de fragmentos de
DNA) não seria visível por si só em um gel.

Ao comparar as bandas de uma amostra à escada de

Figura 13- Análise
DNA, podemos determinar os tamanhos
aproximados. Por exemplo, a banda brilhante no gel acima tem, aproximadamente, o tamanho dos
pares de bases (bp).

Atividade laboratorial - ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

1. Preparar o tampão de eletroforese (TBE 1X). Para isso, adicionar 900mL água purificada
Milli-Q a 100mL de TBE 10X e agitar.
2. Preparar o gel de agarose (2%), adicionando 50mL de TBE 1x a 1g de agarose. Levar ao
micro-ondas, agitando algumas vezes, até dissolver completamente a agarose. Adicionar
5μL de agente intercalante (RedSafe), agitando cuidadosamente. Verter o gel sobre o berço,
colocando o pente para formar os poços e esperar cerca de 20 minutos para solidificar.
3. Depois de solidificar retirar cuidadosamente o pente e em seguida o gel do berço e passar
para a tina de eletroforese (nesta etapa foi utilizado um gel solidificado previamente).
4. Aplicar 5μL de cada amostra (neste caso de produto de PCR + digestão) cuidadosamente
nos poços.
5. Ligar a fonte de alimentação e deixar correr por 60 minutos, 110V.

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 6. Utilizar o transiluminador para visualizar os resultados (nesta etapa foi visualizado um gel
obtido previamente depois de uma corrida de eletroforese com amostras de produto de PCR
e os 3 diferentes genótipos obtidos por digestão usando uma enzima de restrição).

Análise de cariótipos – Citogenética

A citogenética é um exame que tem como objetivo

analisar os cromossomas e, assim, identificar alterações na
estrutura e número de cromossomas, sendo geralmente
indicado para diagnosticar doenças genéticas ou alguns
tipos de cancro.
Este exame é feito recolhendo uma amostra de sangue,
tecido ou medula óssea e pode ser feito em qualquer
idade, até mesmo durante a gravidez para verificar
possíveis alterações genéticas no bebé.
A citogenética permite que o médico e o paciente
possuam uma visão geral do genoma, auxiliando o
médico a realizar um diagnóstico e direcionar o Figura 14 - Amostra
tratamento, se necessário. Este exame não necessita de nenhuma preparação e a recolha não
demora a ser feita, no entanto o resultado pode demorar entre 3 e 10 dias a chegar, dependendo do
laboratório.

Para que serve?

O exame de citogenética humana é indicado para investigar possíveis alterações cromossômicas,
tanto em crianças quanto em adultos, como:
 Síndrome de Down;
 Síndrome de Edwards;
 Síndrome de Patau;
 Síndrome DiGeorge;
 Síndrome Cri-Du-Chat;
 Síndrome de Klinefelter;
 Hermafroditismo ou pseudo-hermafroditismo;

 Leucemias;

 Linfomas.

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Geralmente, este exame é indicado nos casos onde existe um histórico familiar de alguma alteração
genética, alterações na ecografia obstétrica, idade materna avançada, abortos recorrentes ou
alterações em exames bioquímicos.

Além disso, o exame de citogenética no caso de cancro, pode ajudar na classificação do tipo de
leucemia, além de avaliar o melhor tratamento, assim como a resposta ao tratamento.

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O que identifica o exame?
O exame de citogenética permite identificar alterações nos cromossomas, como:
 Alterações numéricas, que são caracterizadas pelo aumento ou diminuição na quantidade
de cromossomas, como o que acontece no síndrome de Down, em que é verificada a
presença de três cromossomas 21, tendo a pessoa 47 cromossomas no total;
 Alterações estruturais, que são caracterizadas pela substituição, troca ou eliminação de
uma determinada região de um cromossoma, como por exemplo o síndrome de Cri-du-
Chat, em que ocorre uma perda de um pedaço do cromossoma 5.
Assim, este exame avalia o cromossoma, que é uma estrutura constituída por DNA e proteínas que
está distribuído nas células em pares, existindo 23 pares.
Desta forma, a partir do cariograma, que corresponde ao esquema de organização dos
cromossomas, é possível identificar alterações no número e estrutura dos cromossomas.

Como é realizado?
O exame de citogenética normalmente é realizado a
partir de amostras de sangue, mas também pode ser
feito com amostras de tecido ou da medula óssea.
No caso do exame em grávidas, cujo objetivo é
avaliar os cromossomas do feto, é recolhido o
líquido amniótico, as vilosidades coriônicas, ou até
mesmo pequenas quantidades de sangue.
Após a recolha das amostras e envio para o
laboratório, é feito o cultivo das células para que
elas se multipliquem e depois é adicionada uma
substância que inibe a divisão das células, fazendo
com que o cromossoma se encontre na sua forma
mais condensada e de melhor visualização.

Figura 15- Preparação citogenética

15
Tipos de exames de citogenética
Dependendo do objetivo do exame, podem ser aplicadas técnicas moleculares diferentes para que
se obtenha informação do cariótipo da pessoa, sendo as mais utilizadas:

1. Bandeamento G

A técnica de bandeamento G, ou cariotipagem, consiste na aplicação do corante Giemsa, que

permite a visualização dos cromossomas.
Esta técnica é muito eficaz para detetar alterações numéricas e estruturais do cromossoma, sendo a
principal técnica molecular aplicada na citogenética para o diagnóstico e confirmação do síndrome
de Down que é caracterizado pela presença de um cromossoma extra

Figura 17 - Bandamento G Figura 16- Ideograma

2. Técnica de FISH

A técnica de FISH é mais específica e sensível, sendo mais utilizada para auxílio no diagnóstico de
cancro, pois permite identificar pequenas alterações nos cromossomas e rearranjos, além de
identificar também alterações numéricas dos cromossomas.
Apesar de ser bastante eficaz, a técnica de FISH é mais cara, pois utiliza sondas de DNA com
fluorescência, sendo necessário um aparelho para captar a fluorescência e permitir a visualização
dos cromossomas. Além disso, há técnicas mais acessíveis na biologia molecular que permitem o
diagnóstico de cancro.

Figura 18 - FISH
Figura 19 - FISH

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