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Na vanguarda

Neuroendocrinologia 2023;113:168–178 Recebido: 30 de junho de 2021

Aceito: 23 de agosto de 2021
DOI: 10.1159/000519233

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Publicado on-line: 26 de agosto de 2021

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Imagem do hipotálamo
Sistema Neurohipofisário
Soledad Barez-Lopez Liam Scanlon David Murphy
Michael Paul Greenwood
Ciências Translacionais da Saúde, Bristol Medical School, Universidade de Bristol, Bristol, Reino Unido

Palavras-chave transcriptômica. Nesta revisão, ilustramos como estas

Vasopressina · Oxitocina · Neurônios magnocelulares · Diagnóstico por imagem abordagens mais recentes melhoraram a nossa compreensão
da estrutura e função do HNS e como poderão contribuir ainda
mais nos próximos anos. © 2021 S. Karger AG, Basileia

Abstrato
O sistema hipotálamo-neurohipofisário (HNS) é um aparelho
neurossecretor peptidérgico cerebral que é composto por
neurônios magnocelulares de arginina vasopressina (AVP) e
oxitocina (OXT) e seus processos neuronais na hipófise
posterior (PP). Em resposta a estímulos específicos, AVP e
OXT são secretados na circulação sistêmica na interface
neurovascular do PP, onde atuam como hormônios, mas
também podem se comportar como neurotransmissores quando
liberados no compartimento somatodendrítico ou por axônios
colaterais para outros regiões cerebrais. Como esses peptídeos
são cruciais para vários processos fisiológicos, incluindo a
homeostase de fluidos e a reprodução, é de grande importância
mapear o conectoma HNS em sua totalidade para compreender
suas funções. Nos últimos anos, os avanços nas tecnologias de
imagem forneceram novas informações consideráveis sobre o
HNS. Essas abordagens incluem o uso de proteínas repórteres
sob o controle de promotores específicos, traçadores virais,
métodos de limpeza cerebral, indicadores geneticamente
codificados, células farejadoras, imagens de espectrometria de massa
Introdução
O sistema hipotálamo-neurohipofisário (HNS) é um
aparelho neurossecretor peptidérgico cerebral responsável
pela produção dos hormônios peptídicos arginina va
sopressina (AVP) e oxitocina (OXT). Consiste em
neurônios magnocelulares (MCNs) do núcleo supra-
óptico hipotalâmico (SON) e do núcleo paraventricular
(PVN), cujos axônios se projetam através da zona interna
da eminência mediana e terminam nos capilares
sanguíneos da hipófise posterior (PP). ) glândula. Dois
grupos distintos de HNS MCNs sintetizam os peptídeos
AVP e OXT, que são transportados pelos axônios e
armazenados na interface neurovascular do PP [1]. Após
a estimulação, AVP e OXT são secretados na circulação
sistêmica, onde atuam como hormônios, atingindo alvos
remotos
e regulando
e soluções processos
espacialmente essenciais para a sobrevivência, inc
resolvidas.

karger@karger.com © 2021 S. Karger AG, Basileia Correspondência para:

www.karger.com/nen Soledad Bárez-López, ze18625@bristol.ac.uk
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Figura 1. Representação esquemática do HNS. AVP e OXT MCNs

do hipotálamo SON e PVN projetam seus axônios para a glândula
PP, onde AVP e OXT são liberados na circulação sistêmica atuando
como hormônios, e também enviam projeções neuronais para outras
regiões cerebrais onde AVP e OXT atuam como neurotransmissores .
Além disso, as MCNs medeiam a liberação somatodendrítica de AVP
e OXT. No PVN também existem genes que expressam AVP e OXT

moeostase, comportamento reprodutivo e funções sociais.

Além da secreção dos terminais PP na circulação sistêmica,
AVP e OXT também são liberados no SON hipotalâmico e no
PVN a partir de dendritos e corpos celulares de MCNs, agindo,
portanto, como neurotransmissores.
Esses mecanismos são geralmente independentes da liberação
axonal de AVP e OXT na corrente sanguínea, pois a liberação
dendrítica pode ser alcançada pela mobilização intracelular de
Ca2+ sem disparo elétrico desses neurônios [2, 3].
A liberação somatodendrítica de AVP e OXT tem importantes

Imagem do hipotálamo
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neurônios parvocelulares que enviam suas projeções para outras
regiões do SNC (principalmente para o tronco cerebral e medula
espinhal) e para a zona externa do ME. Criado com BioRender.com.
AVP, argi nove vasopressina; OXT, ocitocina; MCNs, neurônios
magnocelulares; FILHO, núcleo supraóptico; PVN, núcleo
paraventricular; PP, hipófise posterior; CO, quiasma óptico; ME,
eminência mediana; HNS, sistema hipotálamo-neurohipofisário.

células, por exemplo, regulando a pressão arterial [4] ou o reflexo

de ejeção de leite [5]. Além disso, os MCNs do SON e do PVN
também enviam projeções colaterais extra-neuro-hipofisárias para
outras áreas do cérebro para formar circuitos cerebrais centrais
que regulam a percepção da dor [6], estados afetivos/emocionais
[7, 8], comportamento social [9, 10] e medo [11, 12].
No PVN, além dos MCNs que se projetam para o PP, existe
outra população neuronal na parte póstero-lateral do núcleo que
corresponde aos neurônios parvocelulares. Esses neurônios
enviam suas projeções para outras regiões do SNC, principalmente
efeitos autócrinos em MCNs e efeitos parácrinos em regiões próximaspara centros autônomos.

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no tronco cerebral e na medula espinhal [13–15], onde estão envolvidos
na regulação da produção autonômica [16, 17]. Além disso, os neurônios
parvocelulares também se projetam para a zona externa da eminência
mediana, de onde o CRH e o AVP são secretados na circulação portal
hipofisária para mediar a secreção do hormônio adrenocorticotrófico, com
implicações importantes para a resposta ao estresse [18, 19].
A complexidade do HNS está resumida na Figura 1.
Para compreender sua função e regulação, é essencial uma descrição
completa e fiel da estrutura e conectividade do HNS. As relações entre
estrutura e função cerebral têm sido classicamente estudadas por
técnicas histoquímicas e imuno-histoquímicas, mas o surgimento de novas
tecnologias de imagem gerou uma quantidade sem precedentes de
pesquisas para detalhar a estrutura e a função do HNS. Nesta revisão,
fornecemos uma visão geral de novas abordagens de imagem que irão
avançar a nossa compreensão do HNS nos próximos anos.
Métodos de rotulagem genética
Promotores Específicos
A maioria dos achados relativos às projeções neuronais de AVP e
OXT para outras estruturas cerebrais (incluindo amígdala, hipocampo e
medula espinhal) foram obtidos a partir de estudos de rastreamento
histológico do trato décadas atrás [20–24]. O desenvolvimento de técnicas
avançadas de fluorescência e métodos de marcação genética permitiu o
direcionamento e a marcação de populações específicas de células
neurais, o que é uma abordagem muito útil para mapear as projeções e
conexões de neurônios individuais. Uma dessas abordagens é a utilização
de proteínas repórteres fluorescentes sob o controle de promotores
específicos de interesse, cuja expressão é restrita aos tipos de células
de interesse. Por muitos anos, a comunidade científica pesquisou
avidamente os domínios genômicos reguladores cis que são necessários
para a expressão específica do tipo celular de MCNs AVP ou OXT por
meio de diversas abordagens [25]. Em 2012, uma descrição precisa das
regiões reguladoras cis de OXT e AVP que são responsáveis por conferir
expressão específica do tipo de célula em MCNs OXT ou AVP foi
alcançada usando estudos de deleção de promotor que forneceram
construções repórter in vivo usando vírus adeno-associados (AAV) [25].
As ligas Gainer e col concluíram que um comprimento de promotor de 2 e
563 kpb a montante do local de início da transcrição AVP e OXT,
respectivamente, era suficiente para direcionar a expressão específica
do tipo de célula. Outros estudos demonstraram que essas células
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sequências específicas do tipo poderiam ser reduzidas para 116 pb
localizadas entre 216 e -100 pb a montante do local de início da
transcrição OXT [26] e para 288 pb a montante do local de início da
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transcrição AVP [27].
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Este conhecimento desencadeou o uso dos promotores OXT e AVP
para avançar ainda mais na nossa compreensão do HNS. Por exemplo,
esta abordagem foi usada para obter mais informações sobre as projeções
axonais de longo alcance dos neurônios OXT hipotalâmicos para a
amígdala e outras regiões do prosencéfalo distantes do hipotálamo. Ao
direcionar a expressão do marcador fluorescente Vênus para neurônios
OXT no PVN e SON, Knobloch et al. [28]
foram capazes de mapear projeções axonais de OXT para estruturas do
prosencéfalo, incluindo taenia tecta, núcleo accumbens, septo lateral,
amígdala e hipocampo. Além disso, conseguiram identificar as fontes
dessas projeções demonstrando que a maioria delas surge de neurônios
PVN OXT. Suas descobertas confirmaram que a liberação de OXT a partir
de terminações axonais locais pode controlar especificamente
comportamentos associados à região, como o medo na amígdala [28].
Com a mesma abordagem, um estudo adicional demonstrou que os
neurônios OXT do PVN se projetam para o SON ipsi e contralateral,
enquanto nenhuma conexão intra-hipotalâmica foi detectada dentro do
sistema AVP [6]. Além disso, utilizando um repórter de fosfatase alcalina
sob o controle do promotor OXT, foi possível confirmar a presença de
fibras OXT em diversas regiões extra-hipotalâmicas, incluindo áreas
corticais e olfativas, o sistema límbico e o rombencéfalo, enquanto os
corpos celulares foram detectados exclusivamente no hipotálamo e no
núcleo do leito da estria terminal [29].
Traçado retrógrado
O uso de abordagens de rastreamento retrógrado permitiu a
identificação das fontes das projeções OXT e AVP. Por exemplo, usando
corantes fluorescentes de gripe transportados retrogradamente, foi
possível identificar as populações neuronais que se projetam para o PP,
o complexo vagal dorsal e a medula espinhal do PVN [13, 14] e,
marcando tanto o mRNA do AVP e subunidade b da toxina da cólera
transportada retrogradamente, observou-se que as projeções neuronais
de AVP para a medula espinhal surgem principalmente de neurônios
parvocelares no PVN (30). Além disso, pelo traçado retrógrado de
fluorogold, projeções axonais extra-neuro-hipofisárias foram identificadas
no hipocampo de MCNs AVP [24] e no núcleo accumbens de MCNs
OXT [31].
O uso de vírus transportados retrogradamente, como a
pseudo-raiva ou o adenovírus canino 2 (CAV2), provou ser
uma abordagem útil para rastrear sinais neuronais de AVP e OXT.
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Floresta Verde

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Figura 2. Marcação retrógrada de neurônios que se projetam para o FILHO.
Os ratos foram injetados com uma mistura de um AAV retrógrado
(AAV-ret ro-hSyn.Ruby) e um eGFP que expressa AAV (AAV1/2-CMV.
eGFP). A imagem do local da injeção do SON (a) e os neurônios
projetados no SFO (b) e NTS são visíveis (c). d Maior magnifica
circuitos. Por exemplo, ao injetar o vírus da raiva pseudotipado no
núcleo central da amígdala, foi demonstrado que alguns MCNs OXT
projetam seus axônios tanto para o PP quanto para o núcleo central da
amígdala [28]. Em outro estudo, ao injetar o CAV2 transportado
retrogradamente no SON, Eliava et al. [6], identificaram quais neurônios retro-Ruby (para rastrear projeções neuronais) e proteína
do PVN se projetam para o SON. Além disso, a administração sistêmica
de fluorogold, além da injeção de CAV2 no SON, demonstrou que
esses neurônios PVN são principalmente de origem parvocelular [6].
Numa abordagem semelhante, Menon et al. [32], usaram uma
abordagem de vírus duplo, em que CAV2 entregando Cre foi injetado
no septo lateral de camundongos e um mCherry que expressa vírus
dependente de Cre sob o controle do promotor OXT foi injetado no PVN
e SON. Eles descobriram que os aferentes OXT-érgicos do MCN ao
septo lateral se originam principalmente no SON.
Além disso, eles foram capazes de mostrar que essas projeções
medeiam a redução do medo social em camundongos lactantes [32].
Um importante avanço recente foi o desenvolvimento de
um sistema AAV retrógrado eficaz baseado em uma proteína
do capsídeo projetada (retro-AAVs) que permite acesso
retrógrado robusto aos neurônios de projeção [33].
Recentemente, a fim de mapear completamente a
conectividade exclusivamente de neurônios magnocelulares-
OXT (evitando projeções la belling de neurônios parvocelulares- para expressar uma proteína sensível à luz ou um Receptor
OXT), um traçador viral retrógrado dependente de cre foi
injetado no PP de uma linhagem de ratos expressando Cre
sob o controle de OXT [10]. Esses autores descobriram que
os MCNs OXT enviam projeções para o núcleo accumbens,
amígdala, septo lateral, córtex piriforme e, pela primeira vez,
projeções também foram identificadas no putâmen caudado,
o que sugere que a liberação de OXT facilita comportamentos permitiu a expressão direcionada de atuadores ópticos e
sociais e locomoção. Estas descobertas também demonstraram que
Imagem do hipotálamo
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imagem de referência das projeções observadas no NTS em (c). OC,
quiasma óptico; FILHO, núcleo supraóptico; AAV, vírus adeno-
associado; eGFP, proteína fluorescente verde melhorada; SFO, órgão
subfornical; NTS, núcleo do trato solitário. Barras de escala, 100 ÿm.
população de multinacionais OXT projeta-se colateralmente
para PP e múltiplas áreas do cérebro [10]. Usando AAVs
retrógrados, obtivemos recentemente alguns dados
preliminares de estudos onde injetamos uma mistura de AAV-
fluorescente verde aprimorada por AAV (eGFP) (para mapear
o local da injeção). ) no FILHO. Usando esta abordagem,
encontramos marcação retrógrada de neurônios que se
projetam do órgão subfornical e do núcleo do trato solitário,
confirmando que as MCNs no SON recebem informações
dessas estruturas cerebrais (Fig. 2).
Tudo o que foi dito acima ilustra que o uso de promotores
específicos e traçadores virais, em particular vírus
transportados retrogradamente, é uma abordagem muito
poderosa para mapear a estrutura e a conectividade dos
circuitos cerebrais. Esta abordagem adicionou um novo
entendimento sobre a conectividade do HNS, em particular o
sistema OXT, e proporcionou melhor resolução das
populações de células envolvidas. Embora esteja fora do
escopo principal da presente revisão, vale a pena mencionar
que o uso de promotores específicos e abordagens de
distribuição viral permitiu a exploração da diversidade das
EMNs por meio da optogenética e da quimiogenética. Nessas
abordagens, os neurônios são geneticamente manipulados
Designer Ativado Exclusivamente por Drogas Designer que,
quando ativados pela luz ou por uma droga projetada,
respectivamente, levam a alterações no potencial de
membrana, resultando consequentemente em ativação
neuronal. ou inibição. O uso de promotores AVP e OXT em
combinação com vírus transportados retrogradamente
quimiogenéticos
uma para populações neuronais específicas que, por exemp
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decifrar seu papel fisiológico [6, 9, 10, 12, 34–36]. Devido ao
enorme potencial destas ferramentas para fornecer mais
informações sobre os circuitos neuronais e para compreender a
diversidade de células individuais, elas já foram amplamente
utilizadas no estudo do HNS, e espera-se que possam lançar mais
luz sobre este assunto. sistema num futuro próximo.
Limpeza Cerebral
Uma descrição detalhada dos mapas tridimensionais (3-D) das
redes neurais é essencial para compreender a estrutura e a função
dos circuitos neuronais. No entanto, a imagem 3D de cérebros de
mamíferos é bastante desafiadora devido à dispersão da luz por
todo esse tecido, à medida que a luz é dispersa por moléculas,
como água e lipídios [37].
Tornar os cérebros transparentes oferece a possibilidade de obter
uma visão 3D das redes neurais, melhorando a penetração da luz.
Por esse motivo, nos últimos anos, várias técnicas com o objetivo
de limpar o cérebro (incluindo coquetéis de imagens cerebrais
claras e desobstruídas e análise computacional] [38]; imagens 3-D
de órgãos limpos com solvente] [39] habilitadas para marcação
imunológica Foram desenvolvidas imagens 3-D de órgãos limpos
com solvente (iDISCO) [40] e transparente, com troca lipídica,
hibridizado com acrilamida, compatível com imagem/imunocoloração, hipocampo e o sistema límbico do rato já no nascimento. Em
tecido hYdrogel [CLARITY] [41]). Entre estes, CLARITY é
provavelmente o mais popular. O princípio do CLARITY reside na
remoção das bicamadas lipídicas, responsáveis por tornar o
tecido pouco acessível à luz e às macromoléculas, mantendo ao
mesmo tempo a sua estrutura original e assinatura molecular.
Depois de limpar o tecido, toda a estrutura 3D é visualizada. Isto
pode ser conseguido por microscopia confocal padrão ou
microscópios de 2 fótons; entretanto, como o seccionamento óptico
é obtido por varredura ponto a ponto, o tempo de processamento
é bastante lento e longos tempos de exposição podem levar ao
fotodegradação. Os microscópios light sheet são a opção preferida,
pois podem iluminar todo um plano focal ao mesmo tempo, o que
proporciona maior velocidade de imagem [42].
Tendo em conta as abundantes projeções centrais dos
neurônios magnocelulares e parvocelulares AVP e OXT, esta
tecnologia é particularmente atraente, pois permite que as projeções caudais (incluindo o SON, PVN, área retroquiasmática e núcleo
axonais sejam seguidas por todo o cérebro. Alguns estudos que
utilizaram abordagens de limpeza cerebral forneceram alguns
insights sobre as redes neuronais no hipotálamo.
O uso de CLARITY em combinação com imuno-histoquímica
permitiu a representação da estrutura 3-D e distribuição dos
neurônios hipotalâmicos OXT no nascimento (no dia pós-natal 0,
P0) e no cérebro de rato juvenil (P24)
[43]. Em outro estudo, a distribuição de OXT e AVP
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as populações neuronais foram avaliadas no cérebro perinatal do
camundongo em P5, combinando a imunocoloração de montagem
total com o método de compensação iDISCO. Os autores
B
descobriram que, em P5, a distribuição dos neurônios OXT e AVP
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ao longo do SON não é homogênea, pois tanto os corpos celulares
OXT quanto os AVP podem ser encontrados na parte rostral,
enquanto os neurônios OXT são mais abundantes na parte dorsal
deste núcleo. No PVN em P5, enquanto os neurônios OXT eram
mais abundantes que os neurônios AVP, o volume soma dos
primeiros era metade do tamanho. Isto sugere que, em contraste
com as células AVPérgicas, os neurônios OXT não estão totalmente
maduros no início do período pós-natal [44].
Spoljaric et al. [45], também rotularam neurônios AVP e suas
projeções, neste caso no cérebro de ratos recém-nascidos em P0,
combinando imunocoloração de tecido inteiro e a abordagem de
limpeza CLARITY. Os corpos celulares dos neurônios AVP foram
detectados no PVN, SON e núcleos acessórios do hipotálamo.
Além disso, foram encontradas projeções de AVP em diversas
partes do sistema límbico, incluindo a amígdala, e na formação
do hipocampo, incluindo a fissura, o alvéolo e a fímbria do
hipocampo.
Estas descobertas indicaram que as fibras AVP inervam o
combinação com outras descobertas, os autores concluíram que a
AVP suprime eventos de rede espontânea no hipocampo perinatal
como um mecanismo neuroprotetor contra o fornecimento reduzido
de oxigênio no nascimento [45].
Em um estudo recente, Madrigal e Jurado [46] usaram o método
de compensação iDISCO em combinação com imunocoloração
de tecido inteiro seguida de microscopia fluorescente de folha de
luz, para gerar reconstruções 3-D dos sistemas OXT e AVP no
cérebro de camundongos a partir de embriões e fases adultas.
Eles descobriram que os neurônios OXT e AVP aparecem primeiro
nos núcleos caudais, incluindo o PVN, SON e a área
retroquiasmática (pelo menos E16.5), seguidos pelas áreas
rostrais. Eles também descobriram que os núcleos rostrais
geralmente apresentam maior grau de homogeneidade (com o
núcleo pré-óptico ântero-dorsal e o núcleo do leito da estria terminal
contendo principalmente neurônios OXT e o núcleo supraquiasmático
contendo exclusivamente neurônios AVP), enquanto os núcleos
acessório) são mais heterogêneos e contêm neurônios OXT e
AVP. Curiosamente, eles observaram que, na maioria dos núcleos,
o número de neurônios OXT aumenta, de modo que a porcentagem
de neurônios AVP para OXT é maior nos estágios iniciais de
desenvolvimento mental e diminui progressivamente ao longo da
idade adulta. De acordo com descobertas anteriores [44, 47], esses
resultados sugerem que o sistema AVP-érgico amadurece mais
cedo que o OXT-érgico [46].
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Biossensores geneticamente codificados
Embora a microscopia óptica tradicional tenha permitido estudos
estruturais e anatômicos, nos últimos anos, a combinação da microscopia
óptica e de indicadores fluorescentes geneticamente codificados permitiu-
nos ir além da anatomia e explorar respostas funcionais e fisiológicas. Em
particular, a possibilidade de registrar a atividade neural em milhares de
neurônios simultaneamente em animais inteiros intactos [48] revolucionou
a pesquisa em neurociência, incluindo o campo da neuroendocrinologia,
de uma forma que era inimaginável há duas décadas.
Indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), em particular
GCaMP, são amplamente utilizados pela comunidade neurocientífica.
Como a ativação neuronal leva ao aumento dos níveis intracelulares de
cálcio, o uso de GECIs permite o monitoramento direto da atividade
neuronal [48].
Além disso, as melhorias na instrumentação permitiram a possibilidade de
realizar imagens de cálcio em áreas cerebrais subcorticais profundas,
como o hipotálamo.
As lentes de índice gradiente (GRIN) possuem propriedades ópticas
exclusivas que as tornam uma ferramenta ideal para imagens de regiões
cerebrais profundas in vivo [49]. Uma vez que as lentes GRIN são
implantadas cronicamente nos animais, os registros dos sinais de cálcio
podem ser realizados em animais com tensão de cabeça usando um
microscópio de bancada [50] ou em animais que se movem livremente
usando microscópios em miniatura ou miniscópios [49, 51] .
A disponibilidade de camundongos AVP-Cre e OXT-Cre permitiu o
direcionamento seletivo de biossensores geneticamente codificados para
populações neuronais AVP e OXT. Em estudos recentes, Resendez et al.
[35], injetaram um vírus que codifica GCaMP6s induzíveis por Cre no PVN
de camundongos OXT-Cre para expressar seletivamente GCaMP6s em
neurônios OXT do PVN. Ao monitorar a atividade neuronal desses
neurônios pelo uso de lentes GRIN em animais com restrição de cabeça,
os autores conseguiram verificar que os neurônios OXT-PVN respondem
a estímulos sociais e que a ativação desses neurônios é necessária para
o comportamento social [35 ]. Em outro estudo, um vírus que codifica
GCaMP induzível por Cre foi injetado no FILHO de camundongos AVP-
Cre, levando à expressão de GCaMP6s em neurônios AVP exclusivamente
no SON. Registros de atividade neuronal de animais em movimento livre
implantados com lentes GRIN e miniscópios Inscopix colocados acima das
lentes mostraram que esses neurônios foram ativados por aumentos na
molaridade sanguínea (em resposta à injeção de NaCl) e rapidamente
inibidos durante a ingestão. Eles mostraram que esse mecanismo faz parte
de um sistema de homeostase de fluidos que detecta a osmolaridade dos
fluidos ingeridos e controla o comportamento de beber de acordo [52].
Uma das limitações do Cre
Imagem do hipotálamo
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linhagens de camundongos transgênicos é a possibilidade de efeitos fora
do alvo [53], que foram relatados para camundongos AVP-Cre [54]. Além
disso, um estudo recente de camundongos AVP-IRES2-Cre descobriu que
B
a expressão de AVP foi significativamente diminuída no SON, PVN e
d
núcleo supraquiasmático em comparação com irmãos de ninhada de tipo
selvagem (55). Essas descobertas sugerem que deve-se ter cautela ao
usar modelos específicos de camundongos.
Outra classe interessante de indicadores geneticamente codificados
são os sensores de cloreto. A capacidade de monitorizar alterações no
cloreto em tempo real é de grande interesse, uma vez que o cloreto regula
processos essenciais como a proliferação celular, o metabolismo, a
transmissão sináptica e a capacidade de excitação no cérebro. Um
desses sensores de cloreto é o ClopHen sorN, um sensor raciométrico
de cloreto geneticamente codificado que é adequado para investigar o
sistema nervoso [56].
ClopHensorN foi usado com sucesso para explorar os efeitos da
neurotransmissão mediada pelo ácido ÿ-aminobutírico (GABA) em
neurônios SON AVP. Em condições de repouso, o GABA geralmente
inibe os neurônios AVP. No entanto, em resposta ao estresse hiperosmótico
crônico, o GABA se torna um neurotransmissor excitatório para os
neurônios AVP através de alterações no gradiente transmembrana de
cloreto, o que em última análise leva à liberação sustentada de AVP [57].
Ao entregar um ClopHensorN que expressa vírus sob o controle do
promotor AVP, Balapattabi et al. [58] demonstraram que a regulação
negativa do transportador K+/Clÿ co2 e a regulação positiva do co-trans
porter1 Na+/K+/Clÿ em neurônios SON AVP aumentam o cloreto
intracelular após estresse hiperosmótico. Em outras palavras, eles
apontaram para os mecanismos que medeiam a mudança inibitória para
excitatória da transmissão mediada por GABA em neurônios AVP [58].
Um biossensor interessante que forneceu uma compreensão muito
valiosa sobre a interface neurovascular entre os terminais axonais AVP e
OXT e a circulação expressa uma proteína de ligação à vitamina D
fundida com proteína fluorescente verde aprimorada (DBP-eGFP). DBP-
eGFP transgênico que expressa peixe-zebra sob o controle do promotor
da proteína de ligação a ácidos graxos do tipo fígado, secreta DBP-eGFP
para o plasma sanguíneo [59]. Usando este sistema, Anbalagan et al.
[60] exploraram os sinais moleculares que impulsionam o desenvolvimento
de capilares fenestrados de vedação de neurohipófia ou, em outras
palavras, como os capilares na hipófise se tornam permeáveis e permitem
a transferência de hormônios HNS entre o cérebro e a circulação através
da barreira hematoencefálica. Eles descobriram que os fatores pituicíticos
Vegf e Tgfÿ promovem o destino endotelial fenestrado, enquanto Cyp26b
reprime o destino não permeável. Além disso, o mesmo grupo também
demonstrou que a estrutura
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A proteína estrutural do diafragma fenestral, Plvap, regula a entrada
de proteínas plasmáticas na hipófise através do endotélio fenestrado
(61).
Além dos GECIs e sensores de cloreto, existem indicadores
adicionais codificados geneticamente que podem ser usados para
explorar ainda mais as funções dos sistemas AVP e OXT. Estes
incluem indicadores de AMPc para estudar a dinâmica do AMPc
[62], indicadores de voltagem geneticamente codificados que
permitem visualizar potenciais de ação, indicadores de glicose para
estudar o metabolismo neuronal ou mesmo indicadores de
neurotransmissores geneticamente codificados que monitoram a
liberação de neurotransmissores [48, 63]. Os indicadores de
neurotransmissores geneticamente codificados foram categorizados
por sua estrutura de ligação ao ligante em proteínas de ligação
periplasmáticas bacterianas (PBPs) e receptores acoplados à proteína Gsemelhante, Pitra et al. [72], células geneticamente modificadas de
Os primeiros indicadores de neurotransmissores baseados em PBP
foram derivados de PBPs de ligação ao glutamato de E. coli e
esses sensores de glutamato foram rapidamente projetados para
gerar diversas variantes de cores, oferecendo a possibilidade de
multiplexação com outras sondas [65]. Posteriormente, foram
gerados indicadores adicionais baseados em PBP para monitorar
também GABA, acetilcolina e serotonina [66]. Os indicadores
baseados em GPCR incluem sensores dLight1 [67] e GRAB [68] que
inicialmente detectaram dopamina, mas que foram projetados para
expandir os ligantes e agora podem detectar serotonina, nem
epinefrina e acetilcolina [64]. Com base nos desenvolvimentos de
engenharia de sensores baseados em PBP e GPCR, espera-se que
em breve também seja possível medir a dinâmica espaço-temporal
dos neuropeptídeos in vivo, com implicações importantes para o
campo da neuroendo crinologia.
Células farejadoras
A maioria das técnicas disponíveis usadas para detectar e medir
a liberação de peptídeos ou neurotransmissores de preparações
biológicas, como microdiálise, cromatografia líquida de alta pressão sugere que a facilitação dos neurônios vagais cardíacos
ou técnicas eletroquímicas, oferecem grandes níveis de sensibilidade, mediada pelo receptor OXT pode ser um alvo para mitigar
mas carecem da resolução temporal e espacial necessária para
estudar a liberação quântica. de células únicas [69, 70]. Células
farejadoras podem ser usadas como biossensores para detectar a
liberação de peptídeos ou neurotransmissores com ótima
sensibilidade e resolução espaço-temporal. A abordagem de células
farejadoras é baseada em uma linha celular que expressa o receptor
cognato do peptídeo de interesse e um indicador fluorescente
geneticamente codificado.
Levando em consideração que OXT e AVP podem ser liberados do
PP como hormônios e também podem ser liberados centralmente
como neurotransmissores, a abordagem das células farejadoras é
uma das mais promissoras para detectar e quantificar esses
processos distintos. Revestindo células farejadoras no topo do ex
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Os explantes vivos da hipófise ou do cérebro permitem a
quantificação direta da liberação de peptídeos em tempo real na
região hipotalâmica ou extra-hipotalâmica.
B
Zaelzer et al. [71] geraram células farejadoras transfectando
d
células renais embrionárias humanas com o receptor AVP humano,
receptor V1a VP (V1aR), juntamente com GCaMP6. Como a ligação
do AVP ao seu receptor leva a aumentos no cálcio intracelular,
essas células farejadoras servem como biossensores de AVP,
monitorando as alterações na fluorescência do GCaMP6. Ao cultivar
células farejadoras em fatias hipotalâmicas de ratos, os autores
demonstraram que a estimulação elétrica de um único MCN no SON
pode levar à liberação significativa de AVP do compartimento
somatodendrítico do neurônio, destacando a relevância fisiológica
da liberação somatodendrítica de AVP [ 71]. Numa abordagem
(GPCRs) (64).
ovário de hamster chinês expressando V1aR e o indicador de cálcio
geneticamente codificado fluorescente vermelho R-GECO e as
cultivaram no topo de fatias hipotalâmicas de ratos. Com este
sistema, eles demonstraram que, diferentemente da liberação axonal
de AVP, a liberação somatodendrítica de AVP depende da atividade
de disparo evocada pela ativação do receptor NMDA. Com base
nessas descobertas, eles postularam que os receptores NMDA
poderiam servir como um “mecanismo de controle” para regular a
liberação de neuropeptídeos dos compartimentos dendríticos e
axonais de maneira compartimentalizada [72].
A abordagem de células farejadoras também tem sido
usada para estudar a liberação de OXT a partir de projeções
neuronais do PVN para núcleos parassimpáticos. Pinol et al.
[73], células geneticamente modificadas de ovário de hamster
chinês para expressar receptor OXT humano e R-GECO. Eles
ativaram projeções neuronais hipotalâmicas do PVN nos
núcleos parassimpáticos do tronco cerebral e detectaram a
liberação local de OXT, o que facilita a excitação dos neurônios
vagais cardíacos. Isto tem implicações importantes, pois
riscos cardiovasculares deletérios [73].
Gizowski et al. [74], também usaram células renais embrionárias
humanas co-expressando V1aR e GCaMP6 como biossensores.
Eles mostraram que a estimulação elétrica do núcleo
supraquiasmático leva a aumentos na fluorescência das células
farejadoras que cobrem a lâmina terminal do organum vasculosum
em fatias hipotalâmicas de ratos, indicando que a liberação de AVP
dos terminais axonais do núcleo supraquiasmático ativa neurônios
na lâmina do organum vasculosum. terminalis. Com experiências
complementares, demonstraram que este mecanismo é responsável
por estimular a ingestão de água antes de dormir [74].
Bárez-López/Scanlon/Murphy/
Floresta Verde
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Imagens de espectrometria de massa MALDI MSI também foi usado com sucesso para detectar AVP e OXT
A imagem por espectrometria de massa (MSI) é uma ferramenta em diferentes regiões do cérebro. Num estudo recente com o objetivo de

B
poderosa usada para visualizar a distribuição espacial de moléculas por meio identificar a distribuição de vários peptídeos nos gânglios da base de modelos

d
de suas massas moleculares. Ele permite a imagem de milhares de de doença de Parkinson, observou-se que AVP e OXT estavam presentes
moléculas, incluindo metabólitos, peptídeos, proteínas, lipídios e glicanos em uma área discreta do hipotálamo lateral no cérebro de primatas e AVP
em um único experimento, sem a necessidade de rotulagem (75). Após a também foi detectada no cérebro de primatas. núcleo arqueado do hipotálamo
preparação da amostra, o espectrômetro de massa ioniza as moléculas em no cérebro de ratos [80]. Embora o MSI não tenha sido extensivamente
sua superfície e coleta um espectro de massa em cada pixel. Desta forma, utilizado para mapear a anatomia do HNS, a possibilidade de fornecer mapas
um espectro completo é coletado para cada localização de pixel em toda a reproduzíveis de várias distribuições de neuropeptídeos simultaneamente
superfície da amostra. As moléculas são então identificadas com base nos e de caracterizar possíveis alterações de neuropeptídeos aponta o MSI
valores individuais de massa para carga coletados em cada pixel. Existem como uma abordagem inovadora para explorar a estrutura e função. ção do
diversas técnicas de ionização compatíveis com MSI que oferecem HNS.
capacidades complementares. As abordagens de ionização mais comuns
incluem espectrometria de massa de íons secundários, dessorção/ionização
a laser, ionização por eletrospray de dessorção e dessorção/ionização a
laser assistida por matriz. Transcriptômica espacialmente resolvida
Houve uma explosão de abordagens de transcriptômica unicelular
baseadas em imagens que permitem a quantificação da expressão gênica
ionização (MALDI) [75, 76]. por meio de imagens diretas de moléculas de RNA individuais dentro de
Guenter et al. [77], realizaram MSI de neuropeptídeos células e tecidos intactos. Essas abordagens incluem novas tecnologias de
na hipófise de camundongos com resolução celular. Como hibridização in situ, tecnologias de sequenciamento in situ e tecnologias de
esperado, encontraram AVP e OXT no lobo posterior da captura in situ. Para uma visão geral de todas as técnicas disponíveis e
hipófise; entretanto, apresentaram distribuição diferente seus princípios, o leitor deve consultar uma revisão recente [81].
desses peptídeos, com OXT localizado na região externa Resumidamente, as novas tecnologias de hibridização in situ permitem a
do lobo, enquanto AVP foi detectado principalmente no meio. detecção simultânea de múltiplas moléculas de RNA no seu ambiente
Além disso, eles também detectaram 2 fragmentos original utilizando sondas marcadas.
diferentes do peptídeo copeptina, que é o peptídeo C-
terminal do pró-hormônio AVP (78), colocalizando-se com Embora a capacidade de detectar simultaneamente um grande número de
AVP no centro do lobo posterior. A distribuição de todos transcrições tenha sido historicamente uma limitação, hoje em dia é possível
os peptídeos está de acordo com achados anteriores sobre atingir quase toda a capacidade de leitura de transcrições, embora seja
a estrutura anatômica da hipófise, demonstrando o potencial necessário ter conhecimento prévio dos alvos. As tecnologias de
do MSI em identificar a distribuição de um elevado número sequenciamento in situ permitem o sequenciamento de RNA diretamente em
de peptídeos em um determinado tecido, e a capacidade células e seções de tecido morfologicamente preservadas; no entanto, o
da técnica para detectar pós-hipófise. -modificações número de transcrições que podem ser detectadas simultaneamente é
traducionais. De fato, a análise da distribuição de diferentes limitado devido à limitação espacial inerente ao tamanho das células. As
peptídeos na hipófise usando MSI pode ter implicações tecnologias de captura in situ contornam essa limitação capturando as
importantes na prática clínica para detecção e delineamento transcrições in situ com sondas de captura de mRNA com código de barras,
de tumores hipofisários e na tomada de decisões durante para então realizar o sequenciamento ex situ [81].
a cirurgia. Calligaris et al. [79] exploraram a possibilidade
de aplicar MAL DI MSI para detectar e delinear os limites
dos ad enomas hipofisários, que são tumores localizados Devido ao recente desenvolvimento destas técnicas, à necessidade de
na glândula pituitária anterior. Eles descobriram que é equipamentos especializados e, em muitos casos, aos custos elevados, o
possível detectar a produção hormonal excessiva uso destas abordagens não tem sido extensivamente utilizado para o estudo
associada aos ad enomas hipofisários na hipófise anterior do HNS. Em 2018, pelo uso de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-
e identificar o PP caracterizando a distribuição de AVP. seq) seguido por uma abordagem transcriptômica unicelular baseada em
Isto oferece a possibilidade de remover os adenomas imagem, foi possível resolver espacialmente o atlas celular da região pré-
preservando as células da glândula posterior que secretam óptica hipotalâmica de camundongo. Neste trabalho, os autores realizaram
AVP. Além disso, salientaram que a possibilidade de scRNA-seq na região pré-óptica do hipotálamo de camundongo, o que
detectar a expressão de AVP também pode ter significado permitiu o tipo de célula
clínico, uma vez que a lesão das células secretoras de AVP pode levar ao diabetes insipidus [79].

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Sistema Neurohipofisário
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identificação e agrupamento de células em classes. No neurônios celulares e parvocelulares do HNS, desvendando a
entanto, como a etapa de dissociação celular necessária para complexidade deste sistema, especialmente para OXT.
scRNA-seq resulta na perda do contexto espacial, eles Outras abordagens, como o uso de indicadores geneticamente

exploraram ainda a expressão in situ de 155 genes identificados
por scRNA-seq na área pré-óptica por fluorescência
multiplexada de erro-ro busto em hibridização situ [82]. A
hibridização in situ por fluorescência robusta a erros multiplexada
é baseada em várias rodadas de hibridização, imagem e
inativação de sinal em combinação com codificação robusta a
erros para levar em conta a detecção de erros, resultando na
detecção simultânea de um grande número de transcrições em
um contexto espacial [83]. Como resultado, 70 populações
neuronais diferentes foram identificadas na área pré-óptica do
hipotálamo, expandindo os tipos de células anteriormente
conhecidos nesta região, e foi possível mapear essas
populações neuronais em núcleos hipotalâmicos específicos [82].
É digno de nota que o scRNA-seq também foi aplicado para
estudar a diversidade neuronal no hipotálamo (84), no PVN
(85) e em outros núcleos hipotalâmicos, como o núcleo
supraquiasmático (86) e o PP (87). No entanto, embora esta
B
d
codificados ou células farejadoras, evidenciaram como as
técnicas de imagem podem ser usadas para avaliar diretamente
a função dos sistemas e forneceram dados funcionais valiosos
em relação ao HNS. Além disso, a capacidade de detectar um
grande número de moléculas sem a necessidade de marcação
usando MSI, bem como a possibilidade de detectar
espacialmente um grande número de transcrições por
transcriptômica espacialmente resolvida, terá um impacto na
forma como entendemos e pesquisamos. o HNS. A utilização
destas tecnologias lançará uma nova luz sobre a forma como
o HNS regula processos bem caracterizados, tais como o
equilíbrio hídrico e os comportamentos reprodutivos, ao mesmo
tempo que permitirá a exploração de respostas e
comportamentos mais novos e complexos mediados por este sistema.
Declaração de conflito de interesse

abordagem seja extremamente útil para descobrir tipos

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
neuronais anteriormente desconhecidos, falta-lhe resolução
espacial. Espera-se que nos próximos anos testemunhemos
um uso prolongado dessas abordagens para aumentar o
Fontes de financiamento
conhecimento de sistemas biológicos multicelulares complexos,
incluindo a estrutura e função do HNS. Esta pesquisa foi apoiada pelo BBSRC (número de concessão BB/R016879/1)
para DM, SB-L, e pelo Leverhulme (número de concessão para RPG-2017-287)
para DM, MPG
Observações Finais

Contribuições do autor
Os avanços nas técnicas de imagem aprimoraram o
conhecimento dos sistemas neuronais de uma forma sem precedentes.
SB-L. preparou o rascunho original. MPG e LS realizaram a parte
Abordagens como o uso de proteínas repórteres sob o controle
experimental. DM, MPG e LS contribuíram com a revisão e edição do manuscrito.
de promotores específicos, traçadores virais e métodos de Todos os coautores aprovaram a versão final submetida.
limpeza cerebral já forneceram informações muito detalhadas
sobre as projeções neuronais de magno.

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