VET-182 Fisiopatologia da Reprodução e Processamento de sêmen

CINÉTICA
ESPERMÁTICA E
FERTILIDADE

Isabel Guigon
Joana Resende
Letícia Morais
Renato Philomeno
Tatiany Fernandes
 Introdução
 Avaliação de fertilidade de touros através de programas
de inseminação artificial, método caro e demorado.

 Métodos in vitro “simples” e confiáveis.

 Parâmetros cinéticos X métodos de análise X fertilidade

 Motilidade, motilidade progressiva, vigor, morfologia,

concentração, integridade da cromatina, status de
membrana, teste de penetração em muco cervical,
porcentagem de vivos e mortos, etc.
Modelo desenvolvido por Gillan et al.(2008) correlacionando parâmetros
cinéticos do sêmen e fertilidade. Foi utilizado análise de regressão stepwise
em todos os testes de diagnóstico in vitro de modo a produzir um modelo
combinando àqueles que possuem alta correlação com fertilidade.
PARÂMETROS CINÉTICOS DO
SÊMEN

Motilidade
Morfologia espermática
Concentração espermática
 Motilidade

 Objetivo: fertilizar o ovócito;

 Necessário: motilidade, energia, membrana acrossomal

intacta, receptores, membrana plasmática que permita
fusão, núcleo;

 Movimentoatividade motora dos braços de Dineína;

 DINEÍNA

Fonte: http://www.scielo.br/img/fbpe/jpneu/v27n5/a06fig1b.gif

Fonte:http://2.bp.blogspot.com/_8tRxq5DT_zI/SXOAMs8WIMI/AAAA
AAAAB74/5IEIWfJTt54/s400/espermatogenese3.jpg
 Fosforilação/Desfosforilação + Eventos em cascata;

 Canais de cálcio;

 Hipermotilidade;

 O cálcio influencia na capacitação, reação acrossômica, motilidade e hipermotilidade.

Fonte:http://images.google.com.br/imgres?
imgurl=http://www.socesp.org.br/revistasocesp/imagens/i_edicoes/v13_n01_txt09
_f03.jpg&imgrefurl
 Critérios de avaliação

 De acordo com Graham e Mocé (2008) existe uma

correlação entre fertilidade e motilidade.

 Motilidade progressiva é o fator que mais se fideliza a

fertilidade quando falamos em qualidade de sêmen para
fertilidade. (Druet, et al., 2008)

 Ao contrário, Brahmkshhtri et. al. (1998) afirma que os

parâmetros convencionais, como a motilidade
espermática individual, viabilidade e integridade
acrossômica são indicadores pobres da fertilidade
quando comparados com testes de bioensaio (SPB) do
sêmen do touro .
 CONSERVAÇÃO
Efeitos na criopreservação do sêmen para a motilidade espermática.

Fonte: O’Conell et. al. (2002)

 Fertilidade in vitro

 Complicadores
 Indicações
 Estudos
CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA

 Relacionada à produtividade dos touros doadores de

sêmen em centrais de inseminação artificial.

 Anzar et al. (2009) comparando técnicas convencionais

e modernas para quantificar as células presentes em
amostras de sêmen.

 Hemocitômetro (Câmara de Newbauer), citometria de

fluxo e NucleoCounter SP-100.
HEMOCITÔMETRO

Contagem de células espermáticas na

Câmara de Newbauer. São 25 grandes
quadrados centrais. No interior de cada um
destes tem-se 16 quadrados menores.
Fonte: Adaptado de Anzar et al.(2009)
 NucleoCounter SP-100

 É um método recente utilizado para este tipo de análise,

baseado na análise da imagem produzida microscopia
por fluorescência.

 Utiliza-se sondas de iodeto de propídio que cora as

células com membrana comprometida, permitindo a
determinação do número de células presente na
amostra, bem como determinar a porcentagem de
células com lesões de membrana.
 Citometria de fluxo

 Análise de milhares de células através do uso de sondas

fluorescentes a fim de verificar a viabilidade
espermática.
 Iodeto de Propídio (PI), SYBR-14, FITC-PNA, PE-PSA,
FITC-PSA e combinações entre eles (Celeghini et al.,
2007)
 Concentração espermática e integridade de membrana
(Azar et al., 2009).
 Anzar et al. (2009) obteve resultados significativamente
correlacionados (P<0,01) para os três métodos na
análise de regressão.

 No teste de Tukey houve diferença significativa entre os

testes modernos e o convencional (P<0,01).

 Contudo entre a citometria de fluxo e NucleoCounter SP-

100 não obteve diferença significativa, para (P<0,05).
METÓDOS DE AVALIAÇÃO DE
FERTILIDADE

CASA
BSL
FIV
 BIOSPECKLE LASER
 Luz laser → alta direcionalidade, permite a formação de
uma imagem de interferência, chamada de speckle.

 O objeto iluminado apresenta algum tipo de atividade,

este terá um comportamento de rede de difração
dinâmica, provocando mudança na imagem formada ou
mudança no padrão de interferência. → biospeckle

Formação do fenômeno do
speckle. Adaptado de Braga et al.
(2003).
 Câmara CCD (Charge Coupled detector).

 A análise estatística pode-se obter o padrão do speckle

correlacionando-o ao tipo de movimento detectado,
sendo possível, enfim, determinar a atividade do objeto
iluminado.

Amostra de baixa
atividade

Amostra de alta
atividade

Fonte:Adaptadas de Braga et al. (2003).

 Durante a análise da imagem formada é possível obter
um índice chamado momento de inércia (MI), capaz de
mensurar a atividade biológica do material iluminado.

Valores médios de Motilidade (Mot), e Momento de

Inércia (MI) das amostras de sêmen dos 6 touros
testados.
1
Médias
Animais
Mot Vig IND MI
A 25,0 d 2,2 c 34,50 d 108,6 b
B 35,0 b 3,1 b 48,00 b 158,3 b
C 31,5 c 2,9 b 44,25 c 168,7 b
D 38,5 b 3,3 b 51,75 b 204,3 a
E 28,5 c 2,5 c 38,75 d 148,8 b
F 45,0 a 3,6 a 58,50 a 219,8 a
EP
2
1,40 0,11 1,63 17,92
1
Médias seguidas de mesma letra minúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste
de Scott-Knott, com um nível nominal de significância de 5%. 2EP é o erro padrão das
médias.

Fonte: Carvalho et al., (2009)

 FIV (FERTILIZAÇÃO IN VITRO)
 Técnica como meio de investigação para as diferentes
etapas do processo de fertilização.

 Tentativa de fazê-la como um método para predizer a

fertilidade de touros doadores de sêmen.

 Grupos de animais a serem testados ele necessita

apresentar resultados na FIV superiores a 60% (Tanghe
et al., 2002).
 Método que simula a interação que ocorre entre os
gametas, além de permitir um acompanhamento do
início do desenvolvimento embrionário.

 Resultados controversos quanto a relação estabelecida

entre fertilidade in vitro e fertilidade in vivo X exigência
da técnica em uma padronização entre os laboratórios.

 Relação oócito- espermatozóide estabelecida nos

ensaios in vitro muitas vezes leva à avaliações não
fisiológicas (Rodriguez-Martinez, 2007).
 A técnica
 Segundo Targlione et al. (2002) e Tanghe et al. (2002)

MATURAÇÃO
Lavados com TCM199 +
Coleta de folículos soro fetal bovino 20%
solução
de 2-6mm, agulha 5%CO2,
tampão HEPES
18. 100%umidade,
TALP
38,5ºC
18-26 horas

OVÓCITOS + SPTZ JÁ
CAPACITADOS.
5%CO2,
100%umidade,
38,5ºC,
20 HORAS.
 Taxa de formação de pró-núcleos, correlacionando-os
com os métodos usualmente utilizados para predizer a
fertilidade de touros.

 Puglisi et al. (2004) em um ensaio para avaliar a

capacidade fecundante de amostras de sêmen de touros
realizou dois experimentos relacionando FIV e
parâmetros cinéticos do sêmen de touros com alta e
baixa fertilidade.
 No primeiro experimento este autor estabeleceu uma
relação de 3000 células espermáticas para cada oócito
por 5, 10, 15 e 18 horas pós inseminação (hpi).

 No segundo experimento a relação estabelecida foi de

1000 células por oócito durante 8 e 10 hpi.

 Para 15 hpi e 8hpi houve resultado significativo (P<0,

001).

 Os touros considerados com alta fertilidade obtiveram

melhores resultados quando houve redução da relação
oócito:espermatozóide.
PARÂMETROS CINÉTICOS
DAS SUBPOPULAÇÕES DE
ESPERMATOZÓIDES
 Introdução

Hoje já é aceito pela comunidade científica a existência

de subpopulações espermáticas em ejaculados de
mamíferos (Muiño et al. 2009 e 2008, Pérez-Llano et al.
2009, Ramió et al. 2008, Guillén-Rubio et al. 2007,
Quintero-Moreno et al. 2004 e 2003).
 Subpopulação Espermática
 De acordo com Quintero-Moreno et al. 2004, podem ser
definidas por diferentes parâmetros:

 Características de movimento;
 Comportamento frente á citometria de fluxo;
 Padrão específico de glicoconjugados de membrana;

 De acordo com Flores et al. 2009, podem ser definidas

pela avaliação quantitativa de parâmetros morfométricos
e de motilidade, utilizando o CASA e ASMA.
 Subpopulação Espermática

 Objetivos

 Demonstrar a presença de espermatozóides

funcionalmente diferentes em um mesmo ejaculado;

 Analisar as diferentes percentagens de cada

subpopulação e sua relação com a capacidade de
fertilização de cada ejaculado;
 Subpopulação Espermática

 Guillén-Rubio et al. (2007), determinou três

subpopulações com características morfométricas
diferentes ejaculado.

 Espermatozóides grandes, médios e pequenos.

 Subpopulação Espermática
 Subpopulação I: comprimento e diâmetro de cabeça
maior;
 Subpopulação II: menores dimensões de cabeça.
Amostras frescas: 8,7%
Amostras descongeladas: 34%
 Subpopulação III: dimensões médias de cabeça, sendo
esse grupo mais representativo.
Amostras frescas: 39%
Amostras descongeladas: 50%
 Subpopulação Espermática
 Muiño et al. 2009 e 2008, determinou a existência de quatro
subpopulações de acordo com seus parâmetros cinéticos.

 VCL, velocidade curvilínea;

 VSL, velocidade retilínea;
 VAP, velocidade média;
 LIN, percentagem de linearidade;
 STR, percentagem de retilinearidade;
 WOB, coeficiente wooble;
 ALH, amplitude lateral média de movimento de cabeça;
 BCF, frequencia de batimentos de cauda;
 Subpopulação Espermática
 Subpopulação I: representada por espermatozóides com
velocidade relativamente baixa (média VCL, VSL e VAP),
porém com alta progressividade (alta LIN, STR, WOB E
BCF e baixa ALH). Essa representou 23% do total de
espermatozóides móveis.

 Subpopulação II: continha espermatozóides altamente

ativos, porém não progressivos indicados por altos valores
de VCL e ALH juntos a baixos valores de LIN e STR, com
valores moderados de BCF. Essa representou 16% do
total de espermatozóides móveis.
 Subpopulação Espermática
 Subpopulação III: possuíam baixa motilidade e não
progressivos, indicado por valores menores de VCL, VSL,
VAP, ALH e BCF junto com os menores LIN, STR e WOB.
Essa representou 35% do total de espermatozóides
móveis.

 Subpopulação IV: continha aqueles espermatozóides

altamente móveis e progressivos, com valores maiores de
VCL, VSL, VAP e BCF juntos com os maiores LIN, STR e
WOB e moderado ALH. Essa representou 25% do total de
espermatozóides móveis.
 Subpopulação Espermática
 Quando analisado a frequencia de distribuíção das
subpopulações antes e após o pro cesso de
descongelamento observou-se que:

As subpopulações mudam significativamente durante

esse processo;

A motilidade espermática média total de sêmen fresco e

recém descongelado diminui à medida que se aumenta
o tempo após o descongelamento;
 Distribuição da freqüência relativa de espermatozóides móveis (percentegens médias; n=54) dentre as
subpopulações (1: colunas pretas, 2: colunas brancas, 3: colunas cinzas, 4: colunas pontilhadas) amostras
frescos e descongeladas de sêmen. Letras diferentes (a-c) dentro das colunas indicam diferenças
significantes dentre as subpopulações e tempo de avaliação (fresco, 0, 2 ou 4 horas após descongelamento).
Letras acima das colunas (a-c) indicam diferenças significativas na motilidade espermática total entre
diferentes tempos de avaliação.

Fonte: Muiño et al. 2008

 (a-d) Distribuição de freqüência relativa de espermatozóides móveis (percentagens médias; n=6) dentre as
subpopulações (1: colunas pretas, 2: colunas brancas, 3: colunas cinzas, 4: colunas pontilhadas) entre
touros em sêmen fresco (a) e descongelado após 0 (b), 2 (c), 4h (d) de incubação após descongelamento a
37°C. Letras diferentes (a,b e c) dentro ou ao lado das colunas indicam diferenças significativas dentre as
subpopulações entre touros. Letras diferentes (a e b) acima das colunas indicam diferenças significativas na
motilidade total entre touros.
 Valores médios ( e amplitudes) dos parâmetros cinéticos definido as quatro
subpopulações identificadas em amostras de sêmen fresco e descongeladas de
touros. As letras diferentes (a-d) indicam diferenças significativas entre
subpopulações (P<0.05).

Fonte: Muiño et al., (2008)

 Em geral essas diferenças indicam que nas quatro
subpopulações, os parâmetros de velocidade
espermática (VCL,VSL e VAP) decresceram após
criopreservação e também durante a incubação após
descongelamento.

 Os autores também relataram que a trajetória do

movimento espermático mudou de maneira diferente
dependendo da subpoppulação.

 Nas subpopulações 2 e 4, as trajetórias espermáticas

foram mais progressivas após descongelamento e
durante a incubação após o descongelamento (altos
LIN, STR e BCF), e enquanto as subpopulações 1 e 3
tiveram suas trajetórias espermáticas menos
progressivas imediatamente após o descongelamento
do que antes da criopreservação, e passou a oscilar
mais durante a incubação após o descongelamento.
 Considerações finais

 Os estudos dos parâmetros cinéticos do

sêmen de bovinos são de suma
importância para o desenvolvimento e
aprimoramento de tecnologias para
indústria de processamento de sêmen.
MUITO OBRIGADO!!!

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