Bioquímica Clínica

Aula 02
• 2.0 Introdução
• 2.1 Métodos de Avaliação Laboratorial espectrofotometria
• 2.2 Métodos de Avaliação Laboratorial Turbidimetria e Nefelometria
• 2.3 Métodos de Avaliação Laboratorial: Etapas do diagnóstico laboratorial
• 2.4 Atividades
2.0 Introdução
 De maneira simples, a bioquímica é a ciência e tecnologia
que estuda os processos metabólicos que acontecem nos
organismos vivos.

 No caso da bioquímica clínica, todos esses conceitos são

aplicados na investigação de materiais orgânicos para a
percepção de mudanças moleculares que acontecem nas
células humanas.
2.0 Introdução
 A Bioquímica clínica consiste em uma ciência que medeia
a química e a patologia, responsável por investigar
materiais orgânicos, como sangue e urina, em que seus
resultados refletem alterações metabólicas responsáveis
pelo desenvolvimento de doenças.

 Assim como todas as demais ciências, a bioquímica passou

por diversos processos, estudos e descobertas até chegar
ao status de hoje.
2.0 Introdução
 Estabelecer valores de referência bioquímicos em
amostras orgânicas é de suma importância, pois eles
servirão como parâmetros para avaliar as alterações
funcionais do indivíduo, e com isso contribuir com o
clínico diminuindo suas incertezas e propiciando a conduta
mais adequada de tratamento e predição de prognóstico.
2.0 Introdução
 O termo bioquímica foi cunhado no final do século XIX e
popularmente difundido já no século XX.

  Entretanto não quer dizer que conceitos como respiração,

fotossíntese e fermentação, por exemplo, demoraram
todo esse tempo para serem estudados.
2.0 Introdução
 Por volta de 3 mil a.C, os aldeões já produziam pão com
leveduras (fermento natural), em um trabalho rudimentar
que mais tarde seria aprofundado por Louis Pasteur, em
meados dos anos de 1900.

 A alquimia, uma das bases da química moderna e que

utilizava poções extraídas de plantas e minerais, também
surgiu nos primórdios da civilização, mais precisamente,
na Grécia Antiga.
2.0 Introdução
 Com o passar do tempo, outros fenômenos
químicos começaram a ser estudados, como o
metabolismo, por exemplo. (Base para estabelecer valores
de referência).

 Em seu livro “Ars de statica medicina”, lançado em

1614, Santorio Santorio registrou toda a sua alteração de
massa corpórea.
2.0 Introdução
 O autor fez anotações de como o seu peso ia mudando a
medida em que se alimentava, bebia, ia ao banheiro,
dormia, jejuava por longos períodos e praticava
exercícios.

 Logo, Santorio concluiu que boa parte do que comia era

eliminado pelo o que ele chamou de “perspiração
insensível”.
2.0 Introdução
 Outro pesquisador a contribuir com escritos sobre
metabolismo foi Franciscus Sylvius, detalhando o processo
digestivo humano.
 Sylvius determinou que o grande papel do nosso organismo
era neutralizar o conteúdo ácido com bases, através dos
nosso fluídos corporais, como o suco pancreático, por
exemplo.
 Com isso, determinou que a falta dessa neutralização
pode levar a inflamações e doenças.
2.0 Introdução
 Um dos grandes motivos que fez com que a bioquímica
demorasse tanto tempo para começar a ser estudada, de
fato, é que ela não é uma ciência que possa ser vista a
olho nu.

 Com a invenção do microscópio composto, os

pesquisadores começaram a enxergar os corpos
como composições formadas por pequenas partículas.
2.0 Introdução
 “Na natureza nada se cria, nada se perde e tudo se
transforma”.

 Antoine Laurent Lavoisier ficou conhecido pela sua Lei da

Conservação das Massas
2.0 Introdução
 Em qualquer sistema fechado, físico ou químico, nunca se
cria nem se elimina matéria, apenas é possível
transformá-la de uma forma em outra.

 Portanto, não se pode criar algo do nada nem transformar

algo em nada (Na natureza, nada se cria, nada se perde,
tudo se transforma).
2.0 Introdução
 “Você já existia neste mundo antes de chegar aqui”

 Logo, tudo que existe provém de matéria preexistente, só

que em outra forma, assim como tudo o que se consome
apenas perde a forma original, passando a adotar uma
outra.
2.0 Introdução
 Mais ou menos no mesmo período dos experimentos de
Lavoisier e muito em função das suas descobertas que, no
final do século XVIII, Jean Senebier e Jan Ingenhousz criar
a Teoria da Fotossíntese.

 Os dois adicionaram os conhecimentos acerca da

respiração celular à importância da luz do sol para a troca
de gases das plantas.
2.0 Introdução
 Por volta de 1833 o pesquisador francês Anselme
Payen descobriu e isolou a primeira enzima.

 Na época, ela foi chamada de diástase, mas, atualmente,

possui o nome de amilase.
2.0 Introdução
 Ela é encontrada na saliva, onde é denominada ptialina, e
também no pâncreas, conhecida como amilase
pancreática.

 Para muitos estudiosos, a descoberta de Payen foi um dos

principais marcos do surgimento da bioquímica moderna.
2.0 Introdução
 Descoberta da molécula de DNA

 Em 1869, o bioquímico alemão Johann Miescher descobriu

a molécula do ácido desoxirribonucleico (DNA).

 Foi ao realizar um experimento para tentar descobrir

quais componentes químicos integravam o núcleo das
células.
2.0 Introdução
 Isolamento das bases nitrogenadas

 A descoberta de Miescher, por sua vez, foi fundamental

para o desenvolvimento do próximo passo.

 Conhecidos os componentes que faziam parte do núcleo

das células, outro bioquímico, Albrecht Kossel, estudou
mais a fundo essas moléculas e percebeu que continham
nitrogênio em grandes quantidades.
2.0 Introdução
 Foi o suficiente para Kossel
isolar e nomear as cinco bases
nitrogenadas (adenina, guanina,
timina, citosina e uracila)
presentes nas estruturas do
DNA e do RNA.
2.0 Introdução
 A FERMENTAÇÃO

 Primeiro, Louis Pasteur descobriu que certas leveduras

faziam parte do processo de fermentação.

 Portanto, não se tratava apenas de algo químico,

mas também biológico, uma vez que está relacionado
com a vida e a organização celular dos fungos.
2.0 Introdução
 A entrada no século XX foi marcada pelo desenvolvimento
de novas tecnologias que revolucionaram a bioquímica.

 A partir da década de 1920, técnicas como a difração de

raios-X, a cromatografia, a microscopia eletrônica, a
turbidimetria, nefelometria entre outras, ajudaram na
avaliação mais detalhada de moléculas e processos
metabólicos, favorecendo descobertas como, por
exemplo, o Ciclo de Krebs.
2.1 Métodos de Avaliação Laboratorial:
espectrofotometria

 A espectrofotometria é o método de análises óptico.

 Baseia-se na medida quantitativa da absorção da luz pelas

soluções
2.1 Espectrofotometria
 Pode ser definida como toda técnica analítica que usa a
luz para medir as concentrações das soluções, através da
interação da luz com a matéria.

 A técnica espectroscópica é baseada no aumento de

energia em função do aumento da frequência da radiação
incidida.
2.1 Espectrofotometria
 Quando uma espécie química absorve energia na forma
de fótons, seus elétrons ficam excitados e ocorre uma
transição de um orbital de mais baixa energia para outro
de maior energia.

 Para entender como o espectrofotômetro funciona,

devemos estudar a luz
2.1 Espectrofotometria
 LUZ
 A radiação eletromagnética é um das várias maneiras
pelas quais a energia viaja no espaço.
 São formas de radiação eletromagnéticas:
 O calor de uma fogueira
 Luz do Sol
 Os raios X 
 A energia usada para aquecer alimentos em um micro-
ondas 
2.1 Espectrofotometria
 Todas estas energias estão relacionadas, uma vez que
todas elas exibem propriedades de ondas.

 Elas são apenas perturbações em um determinado meio ou

campo físico, resultando em vibrações ou oscilações.

 As ondas físicas são oscilações em um determinado meio,

água, ar, etc.
2.1 Espectrofotometria
 As ondas eletromagnéticas são semelhantes, mas elas
também diferem no fato de consistirem em 2 ondas que
oscilam perpendicularmente entre si.

 Uma das ondas é um campo magnético oscilante, a outra é

um campo elétrico oscilante.
2.1 Espectrofotometria
2.1 Espectrofotometria
 Propriedades básicas das ondas:

 Amplitude

 Comprimento de onda

 Frequência
2.1 Espectrofotometria
 Amplitude é a distância vertical entre a extremidade de
uma crista e o eixo central da onda
2.1 Espectrofotometria
 A distância horizontal entre dois vales ou cristas
consecutivas é conhecida como comprimento de onda da
onda. λ= c/f​
2.1 Espectrofotometria
 A grandeza conhecida como frequência da onda diz
respeito ao número de comprimentos de onda completos
que passam por um determinado ponto no espaço a cada
segundo.

 A unidade do SI para frequência é Hertz (H), que equivale

a "por segundo"
2.1 Espectrofotometria
 o comprimento de onda e a frequência são inversamente
proporcionais, isto é, quanto menor o comprimento de
onda, maior será a frequência, e vice-versa.
2.1 Espectrofotometria
 O espectro eletromagnético

 As ondas eletromagnéticas podem ser classificadas e

organizadas de acordo com seus diversos comprimentos de
onda/frequências

  Esta classificação é conhecida como o espectro

eletromagnético
2.1 Espectrofotometria
2.1 Espectrofotometria
 Quantização de energia

 O físico holandês Christiaan Huygens descreveu a natureza

de onda da luz pela primeira vez já no final do século
XVII. 

 Aproximadamente 200 anos após Huygens, alguns físicos

declararam que as ondas de luz e a matéria eram muito
distintas entre si.
2.1 Espectrofotometria
 De acordo com os físicos clássicos, a matéria seria
composta de partículas que tinham massa e cuja posição
no espaço poderia ser conhecida.

  Por outro lado, considerava-se que as ondas de luz tinham

massa igual a zero, e que sua posição no espaço não
poderia ser determinada.
2.1 Espectrofotometria
 Como elas eram classificadas em categorias diferentes, os
cientistas não tinham um bom entendimento de como a
luz e a matéria interagiam

 No entanto, tudo isso mudou em 1900, quando o físico Max

Planck começou a estudar os corpos negros, corpos que
são aquecidos até ficarem incandescentes.
2.1 Espectrofotometria
 Planck descobriu que a radiação eletromagnética emitida
por corpos negros não poderia ser explicada pela física
clássica, que considerava que a matéria poderia absorver
ou emitir qualquer grandeza de radiação
eletromagnética. 
2.1 Espectrofotometria
 Planck observou que, na verdade, a matéria absorvia ou
emitia energia, apenas em múltiplos de números inteiros
do valor hν,

 h é a constante de Planck, 6,626×10−34 J e ν é a

frequência da luz absorvida ou emitida. 

 Esta foi uma descoberta chocante, pois desafiou a ideia de

que a energia era contínua e que poderia ser transferida
em qualquer grandeza.
2.1 Espectrofotometria
 A realidade, descoberta por Planck, é que a energia não é
contínua, mas quantizada, o que significa que ela só pode
ser transferida em "pacotes" individuais (ou partes) do
tamanho hν.

 Cada um desses pacotes de energia é chamado de

quantum (plural: quanta).
2.1 Espectrofotometria
 O fóton

 As descobertas de Planck abriram caminho para a

descoberta do fóton. Um fóton é a partícula elementar,
ou quantum, da luz.

 Quando um fóton é absorvido, sua energia é transferida

para tal átomo ou molécula.

  
2.1 Espectrofotometria
 Como a energia é quantizada, toda a energia do fóton é
transferida (lembre-se de que não é possível transferir
frações de quanta, que são os menores "pacotes
individuais de energia" possíveis)
2.1 Espectrofotometria
 O inverso deste processo também é verdadeiro. Quando
um átomo ou molécula perde energia, ele(a) emite um
fóton que carrega uma energia exatamente igual à perda
de energia do átomo ou molécula.

 Esta mudança de energia é diretamente proporcional à

frequência do fóton emitido ou absorvido. 
 Esta relação é dada pela famosa equação de Planck:
 E=hν
2.1 Espectrofotometria
 Aminoácidos como a Fenilalanina, Tirosina e Triptofano
são os principais responsáveis pela absorção de luz das
proteínas em virtude de possuírem o anel benzênico em
sua estrutura química, além da ligação peptídica listada
acima.

 A luz é absorvida na faixa de 280nm

2.1 Espectrofotometria
 Lei de Lambert-Beer

 A “força vital” da espectrofotometria está fundamentada

na lei de Lambert-Beer

 A absorbância é diretamente proporcional a concentração

da solução de amostra
2.1 Espectrofotometria
2.1 Espectrofotometria
 Fonte de Luz: é composta por uma lâmpada de deutério e
uma lâmpada de tungstênio (semelhante à lâmpada de
carro). A lâmpada de deutério emite radiação UV e a de
tungstênio emite luz visível.
2.1 Espectrofotometria
 Monocromador: alguns espectrofotômetros ainda possuem
um prisma como monocromador, porém os mais modernos
possuem dispositivos eletrônicos que transformam a luz
incidida em vários comprimentos de onda, em um só
comprimento, ou seja, a luz monocromática.
2.1 Espectrofotometria
 Cubeta: é o recipiente propício para conter a amostra que
será utilizada na análise, as cubetas podem ser de
quartzo, vidro e acrílico, porém recomenda-se que seja
usada uma cubeta de quartzo por que o vidro e o plástico
absorvem UV e causa a reflexão da luz visível.
2.1 Espectrofotometria
 Detector: o detector é um dispositivo que detecta a
fração de luz que passou pela amostra e transfere para o
visor e para o computador acoplado ao aparelho.
2.1 Espectrofotometria
 É imprescindível que o equipamento seja calibrado e
manuseado de acordo com as instruções do fabricante, por
ele já trazer a margem de erro que o aparelho tem;

 Evitar erros de leitura, certificar-se de que o equipamento

esteja fechado, antes da leitura a luz do ambiente pode
interferir no resultado
2.1 Espectrofotometria
 Manter sempre limpo e fechado a fim de evitar o acumulo
de partículas de poeira que interferem na análise.

 Em hipótese alguma toque a cubeta com as mãos sem

luvas, a nossa mão contém gorduras e interferem na
leitura.

 Só podem ser analisados por espectrofotometria de

absorção compostos que absorvem luz.
2.1 Espectrofotometria
 Em caso de soluções fortemente coloridas como
permangantos, complexos altamente coloridos,
dicromatos, cromatos e outros compostos com cores
altamente acentuadas deverão ser feitas no mínimo 5
diluições de concentração conhecida e lidas no
espectrofotômetro e uma curva analítica deverá ser
traçada afim de determinar o coeficiente de extinção
molar.
2.1 Espectrofotometria
 Soluções muito concentradas tendem provocar
erros de leitura por que existem muitas moléculas
próximas umas das outra
2.2 Turbidimetria e Neflometria

A Turbidimetria e a Neflometria são métodos

analíticos inversos mas que são utilizados juntos.
 Dependendo da concentração e da turbidez da
amostra, parte da luz que é incidida é dispersada.
2.2 Turbidimetria e Neflometria

 Redução da transparência de uma amostra devido

a presença de partículas em suspensão que
interferem a passagem de luz pelo fluido.
 Quanto mais turva é a amostra mais concentrada
é esta.
2.2 Turbidimetria e Neflometria

 NTU (unidade de turbidez nefelométrica) é a

unidade de medição, que caracteriza a turbidez.
2.2 Turbidimetria e Neflometria

 Quanto mais turva for a amostra, maior será seu

NTU.
A água deve-se chegar a níveis de até 5,0 NTUs,
de acordo com as normas internacionais de
controle da água potável.
2.2 Turbidimetria e Neflometria

 Mede a luz não dispersada (a luz que passou)

determinando a turbidez da amostra.
É um método bem sensível e pode medir a
absorbância.
2.2 Turbidimetria e Neflometria

É um método bem mais sensível pois mede a luz

dispersada (inverso da turbidimetria) em ângulos
entre 45 a 90 graus.
 Pode medir reações de precipitação.
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial

 Os resultados dos exames laboratoriais são de

fundamental importância para a prática médica
diária.
 Estima-se que por volta de 70% das decisões e
diagnósticos médicos são realizados tomando-se
como base os testes de laboratório.
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Diante desse cenário, mostra-se imprescindível o
conhecimento das fases dos exames laboratoriais,
e as possíveis não conformidades em cada uma
delas.
 As etapas dos exames laboratoriais podem ser
divididas em três grandes categorias: a fase pré-
analítica, a analítica e a pós-analítica.
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
A fase pré-analítica (que engloba desde a
indicação pré-teste, passando pela
solicitação/requisição do exame, orientação ao
paciente, coleta da amostra biológica, sequência
de tubos, identificação, triagem,
acondicionamento, transporte, até a entrada do
material para a análise em si)
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 As potenciais inadequações dessa fase são:
 Solicitação equivocada do médico;
 Escrita ilegível ou abreviações grosseiras;
 Falta de indicação médica;
 Interpretação errada da solicitação médica;
 Perda da solicitação médica;
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Falta de orientação ou preparo incorreto do
paciente;
 Uso de drogas de abuso e de medicamentos;
 Não observância da influência do ritmo biológico;
 Erro na identificação do paciente;

 Garroteamento prolongado;

 Troca de tubos;
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Coleta da amostra inadequada;
 Coleta em tubo equivocado ou na sequência
incorreta;
 Tubo sem material;
 Proporção inadequada entre sangue e
anticoagulante;
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Hemólise e/ou lipemia;
 Processo de centrifugação equivocado;
 Acondicionamento fora da temperatura
recomendada;
 Perda ou contaminação do tubo
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Com o avanço da tecnologia, do controle da
qualidade das análises, da informatização, e da
automação dos processos, os erros laboratoriais
da fase analítica, isto é, àquela que se refere a
etapa de execução do exame propriamente dita,
foram bastante mitigados.
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Os erros mais comuns dessa etapa incluem:
 Falha na calibração e manutenção de
equipamentos;
 Variações de energia elétrica;
 Água reagente fora das especificações técnicas;

 Erros na diluição de calibradores e controles;

2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Insumos mal acondicionados e/ou degradados;
 Aspiração de bolhas de ar, microcoágulos ou
fibrina;
 Interferentes;
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Estabilidade da amostra prejudicada;
 Temperatura ambiente ou a de reação
inadequados;
 Erros em cálculos e em diluições da amostra
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Após a coleta e análise dos dados, os exames de
laboratório chegam a última etapa, a fase pós-
analítica.
 Assim que o resultado final é extraído do sistema
analítico, de forma manual ou informatizada, o
laudo é confeccionado e interpretado pelo
médico.
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 As principais não conformidades desse processo
englobam.
 Laudos incompletos;
 Resultados ilegíveis;
 Transcrição inadequada dos resultados;
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Falhas na impressão e/ou transmissão do laudo;
 Unidades erradas;
 Erros nos valores de referência;
 Interpretação equivocada dos resultados
2.3 Etapas do diagnóstico laboratorial
 Os laboratórios clínicos devem ser capazes de ter
o controle dos processos, com a implementação
de indicadores da qualidade e rastreabilidade de
todo o ciclo, reduzindo assim as chances de erros.