Esterilizao por calor e a cintica de morte microbiana

por Gerson Roberto Luqueta Introduo: Embora a esterilizao por calor no seja nenhuma novidade aos profissionais mais experientes, tenho observado ao longo destes anos como acadmico e palestrante que ainda existem aspectos tcnicos que no esto amplamente compreendidos pelos usurios, levando-os a utilizarem seus equipamentos sem uma noo ampla de suas variveis e efeitos, culminando muitas vezes em processos pouco otimizados. O presente artigo tem o objetivo de justificar, de forma simples, o porqu da escolha do processo de esterilizao a calor como primeira alternativa como mtodo de controle de contaminao em ambientes e produtos relacionados sade humana, abordando nesta primeira fase alguns aspectos normativos e, principalmente, a teoria mecanstica que envolve a cintica de morte microbiana. Dentro desta teoria, vamos desenvolver o modelo matemtico semilogartmico da cintica de morte microbiana e firmar o conceito de letalidade do processo, que uma ferramenta muito importante quando partimos para a definio das variveis a serem utilizadas e validadas no processo de esterilizao. Definio da esterilizao Segundo as farmacopias, a esterilidade de um produto baseada no fato de que o mesmo tenha sido processado em condies ideais e que a amostra representativa submetida ao teste, indique a ausncia de microorganismos viveis. Como o nvel de esterilidade absoluta no pode ser garantido graas a uma srie de variveis, devemos trabalhar de forma a considerar que a esterilidade um conceito probabilstico. Para produtos farmacuticos e correlatos, considera-se um artigo estril quando, depois de submetido a um processo de esterilizao, a probabilidade de sobrevivncia de microorganismos viveis esteja na ordem de 10-6. Este nvel de esterilidade recebe a designao SAL (Sterile Assurance Level). Escolha do processo de esterilizao A definio do processo de esterilizao depende basicamente do artigo a ser processado. Os mtodos de esterilizao mais empregados atualmente so aqueles que utilizam como agente esterilizante os seguintes produtos: Vapor de gua saturada. Ar estril (calor seco). xido de etileno. Mistura de vapor e formaldedo. Plasma de perxido. Irradiaes ionizantes. Filtrao esterilizante. A RDC 210/2003 da ANVISA, no item 17.11.1 cita o seguinte: A esterilizao pode ser feita mediante a aplicao de calor seco ou mido, agentes gasosos, por filtrao esterilizante com subseqente enchimento assptico dos recipientes finais estreis, ou atravs de irradiao com radiaes ionizantes. Cada mtodo tem suas aplicaes e limitaes particulares. Quando for possvel e praticvel, a escolha do mtodo deve ser a esterilizao por calor. A preferncia pela esterilizao por calor pode ser justificada por apresentar uma srie de vantagens como eficcia, velocidade, disponibilidade de metodologias de validao amplamente difundidas, menor risco operacional, boa relao custo/benefcio e o baixo impacto ambiental. Um pouco mais adiante, no mesmo documento, o uso da esterilizao por vapor saturado colocado como primeira escolha quando aplicvel: 17.17.1 - Sempre que possvel, os produtos devem ser esterilizados nos recipientes finais, preferencialmente por esterilizao por calor mido. Determinao do microorganismo alvo Uma vez definido o agente esterilizante compatvel com o produto a ser processado, devemos tambm definir o bioindicador a ser utilizado no processo de esterilizao para assegurar o SAL. A escolha do microorganismo alvo (ou biocarga alvo) deve ser feita levando-se em considerao alguns fatores como: Resistncia do MO ao agente esterilizante Biomassa do contaminante (LogN/g) Idade do MO Fatores de proteo externa Atividade metablica Quando o mtodo de esterilizao leva em considerao a sobre-exposio do produto ao agente esterilizante sem degrad-lo, o microorganismo utilizado como bioindicador deve ser aquele que,

reconhecidamente, mais resistente ao processo, com a maior biomassa e com a menor atividade metablica. Estes fatores, para o bioindicador, devem ser maiores que qualquer outro microorganismo presente no produto a ser processado. Tipicamente, para os processos de esterilizao a calor, utilizamos como bioindicadores os microorganismos esporulados secos de Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 e Bacillus atrophaeus ATCC 9372 (da mesma famlia do Bacillus subitilis) para esterilizao a vapor saturado e a ar estril, respectivamente. A cintica de morte microbiana o modelo semilogartmico A aplicao da teoria cintica qumica trouxe resultados positivos para a compreenso mais profunda da esterilizao, bem como para o desenvolvimento industrial do processo. Embora a teoria seja tambm aplicvel esterilizao por radiao e por agentes qumicos, estaremos considerando por enquanto, apenas os fatores envolvidos na esterilizao pelo calor. Embora saibamos que a cintica de morte microbiana no segue necessariamente um modelo linear em toda a sua gama de aplicaes (e que no existe um modelo puramente linear), nas aplicaes prticas assumimos que a morte da maioria dos microorganismos pela ao do calor seja a resultante de uma reao de primeira ordem. Para elucidarmos esta tratativa, desenvolvemos o modelo proposto por Rahn (1945) que trata da lei de ao da massa na cintica de morte de um microorganismo, dada por:

Onde: N = n de MO sobreviventes aps o tratamento; t = tempo de tratado; K = constante (taxa de reao).

dN = KN dt

Rearranjando a equao e integrando a equao diferencial teremos:

dN = K dt dt

O que resulta: ln N = Kt + C Se considerarmos que no tempo t0 a populao inicial igual a N0 e desde que a equao esteja na forma logartmica, podemos ajustar a constante C para lnN0, ficando a equao anterior igual a:

ln N = Kt + ln N 0
Este o modelo de curva de sobrevivncia semilogartmica de Kahn. Se adotarmos lnN = y e t = x , teremos uma equao linear:

y = Kx + y 0
A partir deste modelo linear, poderemos desenvolver duas das principais variveis no tratamento matemtico de destruio dos microorganismos: o Valor DT e o valor Z. Para alcanarmos nosso objetivo, vamos inicialmente re-arranjar a equao anterior, levando-se em considerao a presena de uma populao inicial de microorganismos que chamaremos de N0, e de uma populao final N:

N ln N = Kt + ln N 0 ln 0 = Kt N
Considerando que ln x = 2,303 . logx teremos:

N log 0 = Kt N

ou ainda

N log 0 = 0,4343.Kt N

(equao A)

Onde K representa o grau de inclinao da curva de sobrevivncia.

 justamente a curva de sobrevivncia que demonstra o nmero de sobreviventes em intervalos de tempos aps o incio da exposio dos microorganismos ao agente esterilizante. A destruio dos microorganismos pelo calor no se produz de forma instantnea, pois existe uma relao temperatura / tempo / condies gerais do produto a esterilizar (pH, idade das clulas, grau de contaminao, etc.). Assim, no podemos falar em temperatura letal ou em uma curva de sobrevivncia constante sem levar em conta todas as variveis dentro do estudo Tempo-Temperatura.

Grfico semilogartmico representando uma curva de sobrevivncia Pela curva de sobrevivncia:

tg =
Considerando

log N t

log N em um nico ciclo logartmico teremos:

tg =

1 t

Ainda considerando que a varivel K representa o grau de inclinao da curva, conforme equao A poderemos re-escrever a equao acima como sendo:

K=

2,303 t

Notem que a expresso acima pode no ser muito amigvel, pois sua unidade de medida -min-1. O termo mais utilizado o chamado valor D que se relaciona com K da seguinte forma: portanto:

D = t = t 2 t1 ,

D=

2,303 K

Como o valor D um nmero positivo para um ciclo de um log , utilizado como nmero positivo. importante ressaltar que o valor D varia em funo da temperatura. Logo sua notao normalmente feita na forma D T, por exemplo: D 121 = 1 min. Definimos o valor D como: O tempo (em minutos) necessrio para reduzir, numa determinada temperatura, uma populao microbiana a um dcimo da populao inicial. Se plotarmos o valor de log DT em diferentes temperaturas em um grfico semilogartmico, obteremos uma reta. inclinao desta reta para um ciclo log damos o nome de valor Z:

A principal aplicabilidade desse modelo obtido de forma emprica por Bigelow (1921) relacionar o decaimento logartmico da populao em funo da temperatura, ou seja, o valor Z definido como sendo a variao de temperatura necessria para reduzir a populao microbiana em um logN. O valor Z utilizado na determinao da letalidade de processo. O clculo e a determinao do valor Z no muito adequado acima de 135C e no aconselhada sua extrapolao. Quando se deseja calcular o processo de esterilizao, pode-se basear na cintica das reaes qumicas. Neste caso, o modelo mais usado, que explica a relao do efeito da temperatura com a velocidade de reao o modelo de Arrehenius. A relao entre o modelo da cintica de Arrhenius e Bigelow dado por:

E = 4,6.
Onde: E = energia de ativao (cal/K.mol) T = temperatura absoluta (K) Z = Valor Z (C).

T2 Z

Clculo do fator e da velocidade de letalidade em esterilizadores a vapor saturado Normalmente, quando pergunto s pessoas sobre os fatores mais relevantes em um processo de esterilizao a calor por vapor saturado obtenho como resposta o binmio tempo-temperatura. O problema que muitas vezes os usurios no entendem como estas duas variveis se relacionam e como pequenas variaes de temperatura podem implicar em grandes variaes de tempo para que se possa atingir o objetivo final: considerar o artigo estril. A chave para a compreenso desta relao est no uso do conceito da letalidade. Embora o termo letalidade tenha uma boa gama de definies acadmicas, costumo defin-lo como sendo a quantidade de energia total a ser transferida a ponto de obtermos o nvel de esterilidade requerido considerando o tempo de ao do agente esterilizante sobre o microorganismo a uma determinada temperatura. Para determinarmos o tempo mnimo que um dado microorganismo deve ser exposto ao agente esterilizante para considerarmos o artigo estril devemos conhecer o valor DT para a temperatura de trabalho, a populao inicial N0 e a populao estimada aps o processo de esterilizao N. O tempo calculado da seguinte forma:

F = DT .[log( N 0 ) log( N )]
Matematicamente podemos considerar N=10 -6 quando a meta for a obteno do nvel SAL (Sterile Assurance Level). O fator F, que foi introduzido pela industria alimentcia, mede a letalidade total de um processo de esterilizao em relao a um determinado microorganismo. Uma vez que o valor F considera efeitos letais a diferentes temperaturas, devemos conhecer o valor Z do microorganismo. Quando a temperatura de esterilizao de 121C e o valor Z de 10C, chamamos este fator de F0. Nos sistemas reais, consideramos que temperaturas na ordem de 90C j produzem algum efeito letal e portanto, podem ser consideradas dentro do perfil de aquecimento e resfriamento em um ciclo de

esterilizao. Desta forma, para obtermos a letalidade total do processo, basta integrarmos a velocidade de letalidade atravs do processo para as diferentes temperaturas T, obtendo-se assim o F0 integrado:

F0 = 10

(T 121,1 ) 10

dt

Este conceito demonstra que pode-se obter o mesmo efeito letal variando-se as variveis de temperatura e tempo, mas que esta relao exponencial. Esterilizao por calor seco O mesmo estudo de letalidade utilizado para a esterilizao por vapor saturado pode ser aplicado esterilizao por calor seco, com o desenvolvimento dos valores de D T e Z tpicos. A diferena, neste caso, que a letalidade de processo chamada de fator FH. O valor FH conceitualmente idntico ao valor F da esterilizao por vapor saturado, porm utiliza como referncia a temperatura de 170C e valor Z de 20C . Concluso A esterilizao por calor o mtodo de esterilizao mais recomendado para o controle de contaminao em produtos relacionados sade humana, uma vez que ele engloba uma srie de vantagens, se comparado a outros mtodos tais como velocidade, compatibilidade, uso de agentes esterilizantes seguros e abundantes (gua e ar), facilidade na monitorao e validao, etc. As principais publicaes normativas e orientativas colocam a esterilizao por calor como primeira escolha, sempre que aplicvel. O estudo da morte microbiana de fundamental importncia para o desenvolvimento do modelo matemtico a ser utilizado para a escolha das variveis de processo e na obteno dos valores D e Z. A determinao da letalidade da esterilizao demonstra, sobretudo, a importncia da estabilidade da temperatura ao longo do processo para que se possa garantir o nvel de esterilidade adequado. Um exemplo tpico est na esterilizao por vapor saturado, onde a variao de apenas 1C na temperatura pode variar a letalidade em at 25%. No prximo artigo, discutiremos como os equipamentos devem ser projetados para atender aos requisitos de estabilidade e performance, garantindo a letalidade calculada.

P reparo de solucao com microorganismos para o levantamento do valor D

Tubos de ensaio onde sao feitos os fracionamentos do microorganismo estudado (em triplicata)

Sensores de temperatura sendo calibrados para o o levantamento da curva morte microbiana

Referncias: CENTRO DE INFORMAO EM ALIMENTOS-CIAL/ITAL, (1995), Manual Tcnico: Princpios de Esterilizao de Alimentos . Campinas. 2 Ed. CHARM. S.E. (1958). The Kinetics of bacterial inactivation by heat. Food Technol., 12,4-8. DEINDOERFER P. H. and Humphrey. A.E.,(1959). Analytical method for calculating heat sterilization times. Appl. Microbiol., 7, 256-264 HELDMAN, D. R.; NEWSOME , (2003) R. L., Kinetic Models For Microbial Survival During Processing . Food Technology magazine, Vol.57, n 8. PINTO, T.J.A.; KANEKO, T. M.; OHARA , M.T.;(2003), Controle Biolgico de Qualidade de Produtos Farmacuticos, Correlatos e Cosmticos. So Paulo.Editora Atheneu. PFLUG, I. J.,(1999) Ph.D. Microbiology and Engineering of Sterilization Processes. Tenth Edition. Dados do autor: Eng. Gerson Roberto Luqueta ( gerson.i8@gmail.com) graduado em engenharia eltrica, professor de mecatrnica do Centro Estadual de Educao Tecnolgica Paula Souza (CEETEPS So Paulo), ps-graduado em termobacteriologia e MBA em gesto empresarial pela FGV-Rio. Atualmente gerente de vendas da linha Pharma da Baumer S.A.