REVISTA FARMCIA BIOQUMICA UNIV. SO PAULO. (SUPL. 1): 1-5, 1997. Esterilizao trmica.

Conceitos Bsicos da Cintica de Morte Microbiana. THEREZA CHRISTINA VESSONI PENNA*, IRENE ALEXEEVNA MACHOSHVILI* Em decorrncia da enorme variedade e demanda de artigos esterilizados para fins farmacuticos e mdico - hospitalares, os mtodos de esterilizao crescem em importncia. Por ser a esterilizao por calor mido melhor estudada, os conceitos bsicos de cintica de morte microbiana (valor D, valor z, valor Ftr), foram revistos mediante sua utilizao. Para artigos que utilizam a esterilizao como estgio terminal foram discutidos nveis de segurana para o processo e garantia de esterilidade para o produto, assim como a importncia dos indicadores fsicos e biolgicos no controle de um ciclo de esterilizao. UNITERMOS: Esterilizao. Calor mido. Valor D. Valor z. Valor FTr. 1 Introduo Esterilizao o processo que objetiva destruir todas as formas de vida com capacidade de desenvolvimento durante os estgios de conservao e de utilizao do produto. Conservar manter as caractersticas do produto durante a vida til de armazenamento (vida de prateleira) temperatura ambiente. Esterilidade ou nvel de segurana a incapacidade de desenvolvimento das formas sobreviventes ao processo de esterilizao, durante a conservao e utilizao de um produto. A manuteno do nvel de esterilidade conferido a um produto garante o prolongamento da vida til de prateleira e depende das operaes pr-esterilizao, de esterilizao e ps-esterilizao. Os mtodos de esterilizao permitem assegurar nveis de esterilidade compatveis s caractersticas exigidas em produtos farmacuticos, mdicohospitalares e alimentcios. O mtodo escolhido depende da natureza e da carga microbiana inicialmente presente no item considerado. O calor, a filtrao, a radiao e o xido de etileno podem ser citados como agentes esterilizantes. O calor no somente o agente esterilizante mais usado como tambm o mais econmico e mais fcil de controlar. O calor mido quando comparado ao calor seco um processo efetivo em funo do uso de temperaturas mais baixas e, do curto perodo de tempo necessrio para garantir o nvel de esterilidade proposto2.

Sendo os esporos bacterianos altamente resistentes s condies ambientes adversas, eles so usados como indicadores biolgicos na avaliao do nvel de esterilidade atingido, e de possveis falhas operacionais. Esporos de Bacillus stearothermophilus so considerados convenientes indicadores biolgicos na esterilizao pelo calor mido, particularmente temperatura de referncia de 121 C. Os esporos de Bacillus subtilis so empregados nos processos de esterilizao pelo calor seco e pelo xido de etileno e os esporos de Bacillus pumilus indicados para validar processos cujo agente esterilizante a radiao inica1,6,7. No mtodo de esterilizao onde se emprega o calor mido, na forma de vapor saturado, o agente responsvel pelo aquecimento o vapor de gua saturado, ao qual correspondem valores de temperatura e de presso definidos. A completa retirada de ar da cmara de esterilizao assegura ao sistema atingir a temperatura de esterilizao definida, presso correspondente quela indicada no manmetro do equipamento5. A ao letal do calor uma relao tempo - temperatura, dependente de fatores que definem a intensidade do tratamento e do tempo de exposio ao calor para reduzir a populao microbiana a nveis estabelecidos. Os indicadores fsicos e biolgicos so recomendados para validar ciclos de esterilizao e condies de processamento: (i) os indicadores fsicos, termopares conectados a um registrador de temperatura, so distribudos em diferentes pontos da cmara e da carga, e medem a distribuio do calor, indicando os pontos frios; e (ii) os indicadores biolgicos, microrganismos resistentes ao agente esterilizante, so utilizados para verificar se as medidas fsicas garantem o nvel de esterilidade estabelecido3,6,7. O procedimento tempo - temperatura selecionado depende do produto, do tipo, do teor e da fonte dos contaminantes antes da esterilizao, da aplicao de mtodos para minimizar tal contaminao e preveni-la ps - processamento, contribuindo para assegurar o xito da esterilizao4,5. 2 CRESCIMENTO MICROBIANO s condies favorveis de crescimento, os microrganismos presentes nos produtos, iniciam sua multiplicao. Se forem realizadas contagens microbianas peridicas, estas podem ser representadas graficamente colocando o logaritmo decimal do nmero de microrganismos viveis por mililitro de diluio do produto em questo na ordenada (eixo de y) e a unidade de tempo de crescimento na abcissa (eixo de x). Obtm -se assim a curva de crescimento, que caracterizada por quatro fases distintas, denominadas de fase de latncia (lag), exponencial ou logartmica, estacionria e de declnio ou morte A fase de latncia caracteriza o tempo necessrio ao ajuste dos microrganismos ao novo ambiente fsico-qumico. O prolongamento mximo dessa fase aumenta a vida til de prateleira do produto.

Durante a fase logartmica ou exponencial, as clulas se dividem em ritmo constante, e o incremento do nmero de clulas diretamente proporcional ao tempo de gerao. A velocidade de multiplicao bacteriana proporcional ao nmero de clulas presentes, e pode ser representada pela equao1,4: Log N =Log N0 + (k/2.303)t (1), onde Log N o logartimo decimal da populao aps um tempo (t) de incubao (horas); Log N0 o logaritmo decimal da populao no tempo inicial (t =0 ); k a constante de velocidade especfica de crescimento por hora (h-1 ). A fase logartmica deve ser inibida antes, durante e aps o processamento do produto, definindo o nvel de esterilidade do produto final. O tempo necessrio para que o nmero de clulas dobre, isto N=2No denominado tempo de gerao ( g ). Substituindo N por 2No, a equao (1) pode ser representada por Log (2No)=LogNo+(k/2.303)g, ou por Log (2No) Log No= (k/2.303)g onde Log (2No/ No)= (k/2.303)g , e Log 2 = (k/2.303) g. Portanto g= (2.303/k)Log 2, ento g= 0.693/k. O tempo de gerao (g) expresso em horas. A velocidade de crescimento normalmente expressa em termos de tempo de gerao ou por seu recproco, a constante de velocidade exponencial de crescimento expressa em geraes por hora, obtida da relao: m =1/g . Na fase estacionria a velocidade de crescimento constante, o microrganismo mais resistente a qualquer agente fsico (calor, radiao) ou qumico (cloro, xido de etileno). Para bactrias do gnero Bacillus e Clostridium a fase de esporulao, dependendo da temperatura e do valor do pH do produto. Durante a fase de morte ou inibio do crescimento o nmero de clulas viveis decresce em ritmo constante, e logaritmicamente, frente s condies desfavorveis do meio ambiente. O processo de esporulao continua. Para acelerar a fase de morte microbiana, foi escolhido o calor mido como agente esterilizante fsico destrutivo. 3 DESTRUIO MICROBIANA O produto se mantm conservado se no houver a manifestao dos microrganismos presentes; isto significa dizer que, aps a exposio ao calor mido, poder haver microrganismos dormentes ou em estado latente de sobrevivncia, que no se multiplicaro durante a vida til de prateleira, porque o produto no oferece condies favorveis de germinao e reproduo. Os procedimentos de esterilizao, de pasteurizao e de higienizao utilizam o calor mido no controle da carga microbiana presente no produto. O nmero final de microrganismos sobreviventes expostos ao calor mido representa o efeito do processo. A destruio trmica de uma populao homognea de microrganismos considerada logartmica, equivalente cintica qumica de uma reao de 1a ordem. O fenmeno de destruio trmica pode ser representado pelo modelo de curva linearizada, semi -

logartmica de sobreviventes. A representao grfica do logaritmo decimal de sobreviventes, em relao ao tempo de exposio temperatura constante resulta em curva linearizada decrescente. A variao do nmero de sobreviventes, com o tempo de exposio, funo do nmero de microrganismos inicialmente presentes, e representada pela equao: Log Nf = Log N0 - (k/2.303)t (2), onde Log Nf o logaritmo decimal da populao sobrevivente aps um tempo (t) de exposio; Log No o logaritmo decimal da populao no tempo inicial (t=0); k a constante de velocidade especfica de destruio por unidade de tempo (t). Para um mesmo microrganismo todos os parmetros de tratamento devem ser mantidos constantes durante o tempo de exposio estabelecido; pois a resistncia trmica funo da concentrao de vapor mido presente. Para o modelo de curva semi - logartmica de sobreviventes, o tempo necessrio para a destruio de 90% da populao de esporos o intervalo de tempo exigido para a curva percorrer 1 (um) ciclo logartmico. O intervalo de tempo de reduo decimal (valor D) o principal parmetro de avaliao das caractersticas de termoresistncia da populao microbiana homognea. O valor D ou Tempo de Reduo Decimal o intervalo de tempo temperatura constante de tratamento para uma reduo de 90% da populao microbiana, inicialmente presente no produto. O valor D o inverso negativo do coeficiente angular da equao da reta calculada utilizando-se do mtodo da regresso linear, atravs dos mnimos quadrados, aplicado regio linear da curva de sobrevivncia. O valor D relaciona-se constante especfica de reao atravs da relao: D = (2.303/k) (3). Portanto a equao (2) pode ser igualmente representada por Log Nf = Log N0 (1/D)t (4). O nvel de destruio trmica (n) o nmero de ciclos logartmicos reduzidos [n = Log N0 - Log Nf = Log (N0 / Nf)] (5) na populao microbiana. Se o nvel de destruio trmica corresponder a um ciclo reduzido (n=1), ento o tempo total de processo (t) eqivalente ao tempo de reduo decimal valor D. Logo o tempo de processo temperatura de referncia (Tr) um mltiplo do tempo de reduo decimal: tTr = n x DTr = [Log (N0 / Nf)] x DTr (6). O bioindicador adequado deve apresentar uma populao de esporos e uma termoresistncia ao processo de esterilizao superiores quelas dos microrganismos originalmente presentes no produto a ser esterilizado. 4 NVEL DE ESTERILIDADE OU "STERILITY ASSURANCE LEVEL" (SAL) O nmero de ciclos logartmicos reduzidos na populao do bioindicador define o nvel de esterilidade ou "Sterility Assurance Level"(SAL) do produto final. O nvel de segurana do processo define a probabilidade de falha prevista para a operao, estabelece o nmero final de sobreviventes (Nf) por unidade de produto e define o tempo de processo temperatura de referncia. Os nveis de destruio e de nmero final (Nf) de esporos sobreviventes por unidade de produto, assumindo populao inicial unitria (N0= 1 UFC),

sugerem uma populao sobrevivente de Clostridium botulinum de Nf = 10-12 UFC (1 unidade contaminada para cada 1012 unidades do produto) equivalente a 12 ciclos reduzidos; para bactrias mesfilas no patognicas (Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes) uma populao final de Nf = 10-5 UFC (1 unidade contaminada para cada 105 unidades do produto) equivalente a 5 ciclos reduzidos; para bactrias termfilas no patognicas (Bacillus stearothermophilus, Clostridium thermosaccharolyticum), Nf = 10-3 UFC (1 unidade contaminada para cada 103 unidades do produto) equivalente a 3 ciclos reduzidos. O nvel de esterilidade o nvel de certeza de ausncia de multiplicao microbiana, durante a conservao e utilizao de um produto; e depende da populao inicial (No) do produto. O nvel de segurana definido em Nf = 10-6 (uma unidade de produto contaminada em cada 106 unidades expostas) equivalente reduo de 12 ciclos logartmicos na populao microbiana original do produto, admitindo No = 106 UFC por unidade. As medidas preventivas podem aumentar o nvel de segurana para um universo superior a Nf > 10-6 UFC por unidade do produto. 5 CURVA TDT. VALOR Z. A relao entre tempos de processo a diferentes temperaturas para um mesmo nvel de destruio microbiana definida atravs da curva do tempo de destruio trmica (TDT- thermal death time). A curva TDT representada pelo logaritmo decimal do tempo de reduo decimal (D) ou de seus mltiplos (t= n x D) em funo da temperatura de referncia. Para o modelo de curva TDT semi - logartmica, o intervalo de temperatura necessrio para a reduo de 90% do tempo de reduo decimal (valor D) denominado valor z. Se o valor DT1 temperatura T1 for conhecido, ento o valor DT2 temperatura T2 pode ser calculado, atravs da curva TDT representada pela equao: DT2 / DT1 = 10 (T1-T2)/z (7). Portanto, o valor "z" representa o intervalo de temperatura que ocasiona uma variao de 10 vezes na velocidade de destruio. Quanto menor o valor z, tanto maior a variao da velocidade de destruio com a temperatura de exposio. 6 EFEITO DO TRATAMENTO TRMICO. VALOR FTr. Na determinao dos parmetros de resistncia trmica de microrganismos, o tempo de aquecimento e de resfriamento so desprezados, e a temperatura de tratamento mantida constante. Na prtica, os tratamentos a temperaturas constantes so raros devido inrcia trmica dos materiais. Para avaliar o efeito do tratamento em termos de nmero de ciclos reduzidos na populao microbiana, as temperaturas variveis do produto em relao ao tempo de processo, o valor FTr ou o tempo equivalente, temperatura de referncia deve ser determinado.

Valor FTr o intervalo de tempo de aquecimento necessrio, temperatura de referncia constante, para se obter o nvel de destruio pr-estabelecido. O valor FTr o tempo equivalente, em minutos, temperatura de referncia que o produto permaneceria, considerando aquecimento e resfriamento instantneos. O nvel de destruio trmica ou letalidade do processo pode ser calculado a partir da multiplicao do nmero de redues logartmicas (n) pelo valor D especfico temperatura de referncia (FTr = n.D). A temperatura de referncia depende do tratamento trmico empregado, assim como do indicador biolgico escolhido. O valor FTr pode vir acompanhado por dois ndices FTr z, que indicam temperatura de referncia Tr e o valor z. Logo, F121 C10 C o tempo equivalente de processo temperatura de referncia de121 C, para valor "z" de 10 C. Para calcular o valor FTr necessrio conhecer a variao da temperatura do produto com o tempo de processo. A equao que relaciona o valor F e a variao da temperatura do produto com o tempo de processo simplificada para: FTr =( 10 (T-Tr)/z dt; sendo a taxa letal (L) representada por: L = 10 (T-Tr)/z . O valor FTr representa a rea sob a curva da relao da taxa letal com o tempo de tratamento. O mtodo mais utilizado para estimar a rea sob a curva e determinar o valor FTr aquele proposto por PATASHNIK, denominado mtodo trapezoidal. Sendo a taxa letal (L) adimensional, o produto da sua multiplicao com o tempo de tratamento tem unidade de tempo, e equacionado por: FTr = S (L1+L2+L3+L4...Ln-1) x /\t, onde /\t o intervalo de tempo entre duas medidas sucessivas de temperatura. O mtodo trapezoidal de PATASHNIK s pode ser utilizado quando o intervalo de tempo entre duas leituras sucessivas de temperatura for constante, inferior ou igual a dois minutos. Para este mtodo o nmero de medidas de temperatura do tempo de tratamento dever ser o mximo conseguido, para que o valor F seja muito prximo ao real.
ABSTRACT Thermal Sterilization. basic concepts of microbial inactivation kinetics. Since the variety and amounts of sterile materials required for health care have been increased, sterilization techniques have become increasingly important. This report attempts to review basic concepts of the first-order microbial inactivation kinetics: the decimal reduction time (Dvalue), the temperature interval (z- value), and the heat process time value FTr. Dealing with a wide array of terminally steam sterilized articles, the concepts of save assurance level (SAL), physical and biological indicators were discussed A state of sterility assurance can be established throughout the use of adequate sterilization cycles and subsequent aseptic processing procedure. UNITERMS: Moist heat. Sterilization. Decimal reduction time (D). Z-value. Sterility Assurance Level (SAL). Process time (FTr).

Referncias Bibliogrficas. 1. FARMACOPEIA brasileira. 4. ed. So Paulo, Atheneu, 1988. pt. 1, cap. X. 1 - 2

2. INTERNATIONAL FEDERATION OF THE PHARMACEUTICAL INDUSTRIES. Sterility assurance based on validation of the sterilization process steam under pressure. J. Parenter. Sci. Tecnol., Philadelphia, v. 43, n. 5, p. 226-230, 1989. 3. INTERNATIONAL FEDERATION OF THE PHARMACEUTICAL INDUSTRIES. Validation and control of non-standard sterilization process. J. Parenter. Sci. Tecnol. Philadelphia, v. 47, n. 1, p. 1- 15, 1993. 4. VESSONI PENNA, T. C. Validao de processos de esterilizao I. Conceitos bsicos Laes & Haes, So Paulo,v.15, n. 88, p. 46-48, 1994. 5. VESSONI PENNA, T. C., MACHOSHVILI, I. A., BASTON, L.M. Importncia da autoclave em lactrio hospitalar. Laes & Haes, So Paulo,v.16, n.91. p.68- 74. 1994. 6. UNITED States Pharmacopeia. 22 ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 1990., p.1706-1710, 1625-1626. 7.UNITED States pharmacopeia. 23. ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 1995. p. 1847-1849, 1976-1981.